CN113637620B

CN113637620B - 一种克拉酸高产菌株构建方法和应用

Info

Publication number: CN113637620B
Application number: CN202110847458.0A
Authority: CN
Inventors: 张广华; 刘云; 陆阳; 区文彩; 阮月敏
Original assignee: Seebio Biotech (shanghai) Co ltd
Current assignee: Seebio Biotech (shanghai) Co ltd
Priority date: 2021-07-27
Filing date: 2021-07-27
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2041-07-27
Also published as: CN113637620A

Abstract

本发明涉及代谢工程技术领域，具体来说是一种克拉酸高产菌株及其构建方法和应用。所述构建方法包括：S1、将能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株，使用CRISPR/Cas9***分别将用于对UDP‑葡萄糖途径强化的galu基因片段、用于对UDP‑半乳糖途径强化的gale基因片段以及用于对GDP‑岩藻糖途径强化的gmd、manc和manb的基因片段，依次构建在同一个能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株内；S2、选取步骤S1中克拉酸产量最高的菌株，通过克拉酸调控机制强化克拉酸基因簇的转录，获取调控基因在所述菌株内排列组合，进一步提升克拉酸产量。本发明提供的克拉酸高产菌株，产量可达到13.2g/L，具有产量高，发酵时间短，发酵条件不易受限的优势，提供了一种低成本的克拉酸制造方法。

Description

一种克拉酸高产菌株构建方法和应用

技术领域

本发明涉及代谢工程技术领域，具体来说是一种克拉酸高产菌株及其构建方法和应用。

背景技术

随着医疗技术的发展，人类的平均寿命普遍延长，但随之带来的是人口老龄化的日益严重。因此，如何延缓人体衰老成为了国际上的研究热点之一。近期研究结果表明，肠道微生物能够分泌多种化合物来参与宿主的生理代谢，从而影响着宿主的健康。王萌教授团队近期发现，人体肠道内的大肠杆菌能够分泌某种化合物，延缓宿主细胞线粒体的破裂以及衰老，从而影响宿主的寿命。经过鉴定，此化合物为克拉酸（colanic acid），进一步通过饲喂秀丽隐杆线虫克拉酸，发现延长了其寿命30%，证明克拉酸在功能营养品和健康领域具有广泛的应用前景。

克拉酸，又称M抗原，是一种胞外阴离子杂多糖。于1936年首次被发现，纯化后的克拉酸呈现白色纤维状。Sutherland等通过红外光谱，酶解和甲基化等反应对其结构进行了解析，目前，国内外针对克拉酸的研究，主要集中于研究克拉酸在微生物中的代谢与调控途径，并发现克拉酸的合成往往需要外界极端环境的刺激且产量较低，例如低温、高盐、低PH、干燥以及洗涤剂等，因此通常认为克拉酸与菌株的抗逆性能有关。然而这种极端的合成途径，难以满足克拉酸大量生产的需求。因此，需要对微生物中克拉酸的代谢与调控途径进行改造，使微生物能够在常规的发酵条件下高效生产克拉酸。目前，克拉酸合成的调控机制已经相对清晰，因此可以使用代谢工程与基因工程的手段改变微生物中原有的克拉酸合成调控网络，从而实现克拉酸高效合成的目的。

目前国内外基于克拉酸代谢与合成调控机制构建了一些生产克拉酸的菌株。2020年，Han，Hyeong Min等人以大肠杆菌BL21（△waaf）为出发菌株，以M9为初始培养基，通过发酵优化的方式，将克拉酸产量提高到1.91 g/L，但其克拉酸产量仍然较低，不适合工业化大规模生产。2019年，Chenhui Wang等人通过改造大肠杆菌体内多羟基丁酸途径构建了一株克拉酸高产菌株，通过控制PH进行发酵优化并在发酵罐上发酵，克拉酸产量为10.58 g/L，但Chenhui Wang等人所构建的克拉酸高产菌株发酵需要维持低PH环境，对与菌株发酵相关的自动化控制***要求较高。

发明内容

为了实现上述目的，设计一种克拉酸高产菌株的构建方法，包括以下步骤：

S1、将能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株，使用CRISPR/Cas9***分别将用于对UDP-葡萄糖途径强化的galu基因片段、用于对UDP-半乳糖途径强化的gale基因片段以及用于对GDP-岩藻糖途径强化的gmd、manc和manb的基因片段，依次构建在同一个能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株内；

S2、选取步骤S1中克拉酸产量最高的菌株，通过克拉酸调控机制强化克拉酸基因簇的转录，获取调控基因在所述菌株内排列组合，进一步提升克拉酸产量。

进一步的，所述步骤S1之前，还包括以下步骤：

S0、通过薄层层析技术和离子液相色谱，验证筛选出能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株。

在某些实施方式中，所述步骤S1包括以下步骤：

S11、以原始大肠杆菌菌株为模板，在三个目标位置使用引物通过PCR方式回收三个目标DNA片段，将所述目标DNA片段融合为对UDP-葡萄糖途径强化的galu基因片段，将所述对UDP-葡萄糖途径强化的galu基因片段整合进入所述能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株中，获得大肠杆菌菌1。

进一步的，还包括以下步骤：

S12、在步骤S11获得的大肠杆菌菌1基因组中，将对UDP-半乳糖途径强化的gale基因片段整合入flgg位点构建成大肠杆菌菌2。

进一步的，还包括以下步骤：

S13、在步骤S12获得的大肠杆菌菌2基因组中，依次将基因片段gmd，manc，manb分别整合入flga位点，flit位点，flir位点，分别获得大肠杆菌菌3、大肠杆菌菌4和大肠杆菌菌5。

进一步的，所述步骤S2包括，

S21、在大肠杆菌菌3、大肠杆菌菌4和大肠杆菌菌5中，选择克拉酸产量最高的大肠杆菌菌株，通过电转化的方法将rcsa基因整合入所述大肠杆菌菌株基因组的mota位点，以获得大肠杆菌菌6。

进一步的，所述步骤S21后还包括，

S22、将步骤S21中获得的大肠杆菌菌6基因组中，通过电转化方法将基因片段lon敲除，以获得大肠杆菌菌7基因组，并在大肠杆菌菌7基因组的基础上敲除基因片段hns，获得大肠杆菌菌8。

本发明的另一方面，还包括一种用上述构建方法构建的克拉酸高产菌株。

本发明的另一方面，还包括了一种利用所述的克拉酸高产菌株制备克拉酸的方法，包括将所述克拉酸高产菌株的菌落挑取至TB培养基中，37℃发酵培养12小时作为种子液，向含有TB培养液的发酵中加入种子液，将种子液搅拌通气，添加葡萄糖，发酵温度为20℃~42℃，培养32~60小时后，收集分泌物。

进一步的，在所述发酵罐中，发酵温度为42℃，培养时间为32小时。

发明的有益效果

本发明所提供的一种克拉酸高产菌株及其构建方法和应用优点包括：

1.在本发明中成功构建了一株高产克拉酸的菌株，将菌株产量从初始20 mg/L提高到13.2 g/L，为初始产量的660倍。

2．在本发明中，将发酵生产克拉酸的温度由初始的20℃提高到42℃。

3.本发明的克拉酸发酵时间由初始的60小时缩短到32小时，缩短了28小时，节省了生产成本。

附图说明

图1为使用薄层层析技术验证了目的多糖的水解产物与克拉酸多糖组成相同的示意图。

图2为使用了离子液相色谱进一步检测并验证了目的多糖的水解产物与克拉酸多糖组成相同的示意图。

图3为证实了在菌株内成功整合了galu基因的核酸凝胶电泳图。

图4为K12 MG1655菌（野生菌）、K12-菌1（基因组内整合了galu基因）、K12-菌2（基因组内整合了galu和gale基因）、K12-菌3（基因组内整合了galu，gale和gmd基因）、K12-菌4（基因组内整合了galu，gale，gmd和manc基因）、K12-菌5（基因组内整合了galu，gale，gmd，manc和manb基因）的克拉酸产量示意图。

图5为K12-菌6（基因组内整合了galu，gale，gmd，manc，manb和rcsa基因），K12-菌7（基因组内整合了galu，gale，gmd，manc，manb和rcsa基因，敲除了lon基因），K12-菌8（基因组内整合了galu，gale，gmd，manc，manb和rcsa基因，敲除了lon和hns基因）的克拉酸产量示意图。

图6：K12-菌6在不同温度下克拉酸的产量示意图。

图7：K12-菌8在发酵罐上的克拉酸产量随时间变化图。

图8：K-12菌8与野生K-12菌相比的克拉酸转录强度对照图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 克拉酸的定性

（1）以获取自美国菌种典型保藏中心，编号ATCC25404的大肠杆菌K12 MG1655，全名为Escherichia coli K-12 MG1655 为初始菌株，选用M9为发酵培养基，于37℃，220 rpm发酵12小时，之后转入20℃，220 rpm发酵48小时。

（2）取步骤（1）中的发酵液，煮沸20分钟，离心去除菌体，取上清液，加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置12小时。离心，倒掉上清液，取沉淀并烘干。用适量水复溶，加入1%（体积比）的乙酸，煮沸1小时，离心去除脂多糖沉淀，取上清。向上清液中加入等体积的氯仿/甲醇（体积比2：1）溶液除去蛋白质。吸取水相，使用3500 KDa透析袋透析48小时。真空冻干，即可得到纯化后的克拉酸固体。

（3）取纯化后的克拉酸固体3 mg，加入2 mol/L的三氟乙酸150 uL，100℃水解2小时。氮气吹干，加入适量水溶解，制成单糖水溶液以便进一步检测。

（4）使用薄层层析技术检测克拉酸单糖组成，结果如图1所示，证明所纯化物质单糖组成与克拉酸一致。

（5）因薄层层析技术存在一定缺陷，因此使用离子液相色谱（参数：单糖组成分析默认参数）进一步证实纯化的物质为克拉酸。将克拉酸水解溶液稀释，使各个单糖浓度在5mg/L左右，离子液相色谱检测结果如图2所示，进一步证实纯化物质为克拉酸。

实施例2 克拉酸前体合成途径的强化

（1）将上述证明可以生产克拉酸的大肠杆菌K-12 MG1655为出发菌株，将出发菌株制作成感受态，并将购买自武汉淼灵生物科技有限公司，货号为P0762的Pcas9质粒转化进入菌株中构建菌株K12-Pcas9。为了将目的基因整合入K12-Pcas9菌株的基因组中，以K12MG1655为模板，使用如SEQ ID NO.12所示的引物T-galu-L和如SEQ ID NO.13所示的引物T-galu-R，如SEQ ID NO.14所示的引物Z-galu-L和如SEQ ID NO.15所示的引物Z-galu-R，如SEQ ID NO.16所示的引物B-galu-L和如SEQ ID NO.17所示的引物B-galu-R，通过PCR方式回收三个位置的目标DNA片段，使用融合PCR技术将三个目标DNA片段融合成如SEQ IDNO.67所示的对UDP-葡萄糖途径强化的galu基因片段。通过CHOPCHOP网站设计整合位点的N20区域。购买自武汉淼灵生物科技有限公司，货号为P0743的Ptarget质粒为模板，通过如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20的引物Ptar-flie-T和Ptar-flie-B进行质粒环形PCR，并回收目标质粒Ptarget-flie。将K12-Pcas9菌株制作成电转化感受态，在110 uL的感受态菌液内加入700 ng 的Z-galu片段和1400 ng 的Ptarget-flie质粒。设置电转仪参数（2000 V，200Ω，25 uF，1 mm），电转时间应在5 ms左右。加入700 uL LB培养液置于30℃后培养2小时，5000 rpm离心3分钟，倒掉部分上清液，留下100 uL上清液重悬菌体，涂布于含有硫酸卡那霉素（50 ng/L）和壮观霉素（100 ng/L）的固体LB平版。30℃培养24小时。挑取平板上的单菌落，利用如SEQ ID NO.11所示的ZgaluJCL和SEQ ID NO.18所示的ZgaluJCR为引物，进行菌落PCR，扩增获得大小为2510的验证片段，如图3所示，证明成功将融合片段整合进入大肠杆菌K-12 MG1655基因组，并将片段送往测序，测序正确的片段对应的菌株则为成功构建的菌株K-12-菌1-Pcas9-Ptarget-flie。从平板上挑取成功构建的菌株加入1 mL LB液体培养基中，所述LB液体含有40mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，30℃培养12小时。在含有硫酸卡那霉素（浓度为50 ng/L）的固体LB培养基中，30℃培养24小时。挑取单菌落分别在含有浓度为50 ng/L硫酸卡那霉素的LB固体培养基和浓度为100 ng/L壮观霉素的固体LB培养基点板上，30℃培养12小时，在硫酸卡那霉素上生长，在壮观霉素上无法生长的为成功消除Ptarget-flie的菌株K-12-菌1-Pcas9。挑取K-12-Pcas9菌株在1 mL液体LB培养基，37℃培养12小时。在没有抗性的LB固体培养基上培养12小时，挑取单菌落在没有抗性的LB和含有浓度为50 ng/L硫酸卡那霉素的LB固体培养基上点板。在硫酸卡那霉素平板上无法生长，而在没有抗性的LB培养基生长的为成功消除掉Pcas9质粒的K-12-菌1。

（2）将上述步骤中成功构建的K-12-菌1和初始K-12菌用于发酵，取单菌落于液体TB培养基中，于37℃发酵培养12小时作为种子液。取300 uL种子液加入30 mL TB培养液中，37℃，220 rpm培养12小时，向发酵液中加入葡萄糖使终浓度为20 g/L，之后置于20℃，220rpm发酵培养48小时。测量产量，初始K-12菌和K-12-菌1克拉酸产量分别为20 mg/L，82.1 mg/L，如图4所示，证明强化UDP-Glc的galu基因可以提高克拉酸的产量。

（3）在K-12-菌1的基础上强化UDP-Gal。以K-12菌液和实验室保藏的Ptarget质粒为模板，使用如SEQ ID NO.2所示的引物T-galE-L和如SEQ ID NO.3所示的引物T-galE-R，如SEQ ID NO.4所示的引物Z-galE-L和如SEQ ID NO.5所示的引物Z-galE-R，如SEQ IDNO.6所示的引物B-galE-L和如SEQ ID NO.7所示的引物B-galE-R，以及如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的Ptarget-flgg-T和Ptarget-flgg-B构建所需的整合DNA片段和相应的Ptarget-flgg质粒将UDP-Glc转化为UDP-Gal的如SEQ ID NO.68所示的关键基因片段gale整合入flgg位点构建成K-12-菌2，并使用如SEQ ID NO.1所示的引物ZgalEJCL和SEQ IDNO.8所示的ZgalEJCR验证基因整合成功。发酵验证产量为90.8 mg/L，如图4所示，提高了克拉酸的产量。

（4）接着，以K-12-菌2为出发菌株，分别以K-12菌液和实验室保藏的Ptarget质粒为模板，使用如序列表中如SEQ ID NO.22所示的引物T-Zgmd-L和如SEQ ID NO.23所示的引物T-Zgmd-R，如SEQ ID NO.24所示的引物Z-gmd-L和如SEQ ID NO.25所示的引物Z-gmd-R，如SEQ ID NO.26所示的引物B-Zgmd-L和如SEQ ID NO.27所示的引物B-Zgmd-R，如SEQ IDNO.29所示的引物Ptarget-flga-T和如SEQ ID NO.30所示的引物Ptarget-flga-B，如SEQID NO.42所示的引物T-Zmanc-L和如SEQ ID NO.43所示的引物T-Zmanc-R，如SEQ ID NO.44所示的引物Z-manc-L和如SEQ ID NO.45所示的引物Z-manc-R，如SEQ ID NO.46所示的引物B-Zmanc-L和如SEQ ID NO.47所示的引物B-Zmanc-R，如SEQ ID NO.49所示的引物Ptarget-flit-T和如SEQ ID NO.50所示的引物Ptarget-flit-B，如SEQ ID NO.32所示的引物T-Zmanb-L和如SEQ ID NO.33所示的引物T-Zmanb-R，SEQ ID NO.34所示的引物Z-manb-L和SEQ ID NO.35所示的引物Z-manb-R，如SEQ ID NO.36所示的引物B-Zmanb-L和如SEQ IDNO.37所示的引物B-Zmanb-R，如SEQ ID NO.39所示的引物Ptarget-flir-T和如SEQ IDNO.40所示的引物Ptarget-flir-B构建所需的整合DNA片段和相应的Ptarget-flga、Ptarget-flit和Ptarget-flir质粒。通过依次将gmd，manc，manb基因整合入同一菌株基因组中的flga位点，flit位点，flir位点，分别构建含有如SEQ ID NO.69所示的gmd基因片段的K-12-菌3，含有如SEQ ID NO.69 所示的gmd和如SEQ ID NO.70所示的manc基因片段的K-12-菌4，含有如SEQ ID NO.69 所示的gmd、如SEQ ID NO.70 所示的manc和如SEQ ID NO.71所示的manb基因片段的K-12-菌5，分别使用如SEQ ID NO.21所示的引物ZgmdJCL、如SEQ IDNO.28的引物ZgmdJCR，如SEQ ID NO.41的引物ZmancJCL、如SEQ ID NO.48所示的引物ZmancJCR，如SEQ ID NO.31所示的引物ZmanbJCL、如SEQ ID NO.38所示的引物ZmanbJCR三对引物验证整合成功。发酵验证，其产量分别为115.4 mg/L，141 mg/L，146.1 mg/L，如图4所示，提高了克拉酸的产量，证明上述基因片段对提高克拉酸产量有效。

实施例3 强化克拉酸基因簇转录

（1）以上述产量最高的K-12-菌5为出发菌株。以K-12菌液和实验室保藏的Ptarget质粒为模板，使用引物T-rcsa-L和T-rcsa-R，Z-rcsa-L和Z-rcsa-R，B-rcsa-L和B-rcsa-R，Ptarget-mota-T和Ptarget-mota-B，扩增目的DNA片段和Ptarget-mota质粒。通过电转化的方法将如SEQ ID NO.72 所示的rcsa基因整合入mota位点，使用引物ZrcsaJCL和ZrcsaJCR测序验证整合成功，消除Ptarget与Pcas9质粒后命名为K-12-菌6。发酵验证克拉酸产量为3.838 g/L，如图5所示，提高了克拉酸的产量。

（2）以上述K-12-菌6为发酵菌株。挑取单菌落于TB培养基中，37℃发酵12小时作为种子液。向8个含有30 mL TB培养液的挡板药瓶中加入300 uL种子液，每两个为一组，共4组。置于37℃，220rpm发酵培养12小时，添加葡萄糖至终浓度为20 g/L。将四组分别放置于20℃，30℃，37℃，42℃中发酵培养48小时。纯化后测量克拉酸产量分别为3.83 g/L，1.91g/L，1.023 g/L，1.369 g/L，如图5所示，K-12-菌6提高了克拉酸产量，和克拉酸生产的温度范围。

（3）进一步以K-12-菌6为初始菌株。以K-12为模板，使用如SEQ ID NO.60和SEQ IDNO.61所示的引物T-lon-L和T-lon-R，如SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63所示的引物B-lon-L和B-lon-R，如SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66所示的引物Ptarget-lon-T和Ptarget-lon-B，构建敲除lon基因所需的DNA片段和Ptarget-lon。使用之前电转化的方法将K-12-菌6基因组中的如SEQ ID NO.73所示的lon基因敲除。用如SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.64所示的引物QlonJCL和QlonJCR去验证并测序敲除成功。经过消除Ptarget与Pcas9质粒，获得的菌株命名为K-12-菌7，发酵验证克拉酸产量为5.9 g/L，如图6所示。

（4）以菌株K-12-菌7为初始菌株，以K-12为模板，使用如SEQ ID NO.52和SEQ IDNO.53所示的引物T-hns-L和T-hns-R，如SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55所示的引物B-hns-L和B-hns-R，如SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58所示的引物Ptarget-hns-T和Ptarget-hns-B，构建敲除hns基因所需的DNA片段和Ptarget-hns。使用之前电转化的方法将K-12-菌7基因组中的如SEQ ID NO.74所示的hns基因敲除。用如SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.56所示的引物QhnsJCL和QhnsJCR这对引物去验证并测序敲除成功。经过消除Ptarget与Pcas9质粒，获得的菌株命名为K-12-菌8，通过在摇瓶上发酵验证，克拉酸的产量为7.0 g/L，如图6所示。

（5）以K-12-菌8为发酵菌株，挑取单菌落于TB培养基中，37℃发酵培养12小时作为种子液。向含有1.2 L TB培养液的3 L发酵罐中加入120 mL种子液。搅拌桨转速700rpm，设置发酵温度为30℃，维持PH在6.0至7.0，通气速率1.5 L/min。发酵培养56小时，在12小时，向发酵罐中补加葡萄糖，使终浓度为20 g/L。在36小时，克拉酸产量达到13.2 g/L。克拉酸产量随时间变化曲线如图7。

由上述实施例可知，为获得能够高产克拉酸的菌株，并提高葡萄糖转化率，本发明通过对菌株中心代谢流进行调控，强化克拉酸单糖前体的供应，并根据探明的克拉酸基因簇转录机制，强化了基因簇的转录强度，最终获得了一株高产克拉酸的菌株。将菌株产量从初始20 mg/L提高到13.2 g/L，为初始产量的660倍。将发酵生产克拉酸的温度范围由初始的20℃提高到42℃，并将克拉酸发酵时间由初始的60小时缩短到32小时，缩短了28小时，节省了生产成本。

以上所述，仅为此发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案和新型的构思加于等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西宝生物科技（上海）股份有限公司

<120> 一种克拉酸高产菌株及其构建方法和应用

<130> 123

<160> 74

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 1

gttttcgcgc gcagttgaat 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 2

aaatcactat tgctgccgat ggc 23

<210> 3

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 3

tccttcttaa agttaaacaa aggtctgatc acattatacg agccgatgat taattgtcaa 60

aagtgcatat gtcttcttgc cgg 83

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 4

atcggctcgt ataatgtgat cagacctttg tttaacttta agaaggagat ataccatgag 60

agttctggtt accggtgg 78

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 5

cgccacgttg attaatcggg atatccctgt ggatggc 37

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 6

cacagggata tcccgattaa tcaacgtggc ggaagaactg 40

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 7

tagcgcggca cagtatcaaa g 21

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 8

gtagccattg cctacgtatt caatgc 26

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 9

gatgtcgcga ttaaagggca gttttagagc tagaaatagc aagtt 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 10

tgccctttaa tcgcgacatc actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 11

ggtgtaaact taccatttcc aagacaactg 30

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 12

attaaattat ccagaggtta ctgttgcgtc t 31

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 13

aagaagagat gggcattaag aagtaaggct acggcgatga gtgc 44

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 14

gccgtagcct tacttcttaa tgcccatctc ttcttcaagc 40

<210> 15

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 15

atcggctcgt ataatgtgat cagacctttg tttaacttta agaaggagat ataccatggc 60

tgccattaat acgaaagtca aaaaa 85

<210> 16

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 16

tccttcttaa agttaaacaa aggtctgatc acattatacg agccgatgat taattgtcaa 60

tctcgtctcc cggataattt ctgg 84

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 17

gcagacgcag ttcgtgaact tt 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 18

ctggaaacca gatgcacaat ggc 23

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 19

agcgatacag gggattgaag gttttagagc tagaaatagc aagtt 45

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 20

cttcaatccc ctgtatcgct actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 21

tgcgctcaat ctgtccttcc 20

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 22

gacgtgtcat acgatcagtt actctg 26

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 23

ctggagtcat aagaaggtca ggcgctgaac aatg 34

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 24

gttcagcgcc tgaccttctt atgactccag cgcgatcg 38

<210> 25

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 25

atcggctcgt ataatgtgat cagacctttg tttaacttta agaaggagat ataccatgtc 60

aaaagtcgct ctcatcacc 79

<210> 26

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 26

tccttcttaa agttaaacaa aggtctgatc acattatacg agccgatgat taattgtcaa 60

aaaaaagttg tgcaattgcg atgtg 85

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 27

aatacggtat tgcagttctg cgg 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 28

gaataccacc tgttttgccc gat 23

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 29

ttgatatcca gcaccgtacg gttttagagc tagaaatagc aagtt 45

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 30

cgtacggtgc tggatatcaa actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 31

tttattgcgt aacgcgctgg g 21

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 32

gattatcgac ctggtgatag ccag 24

<210> 33

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 33

tccttcttaa agttaaacaa aggtctgatc acattatacg agccgatgat taattgtcaa 60

cggccagaag tacaggttta acc 83

<210> 34

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 34

atcggctcgt ataatgtgat cagacctttg tttaacttta agaaggagat ataccatgaa 60

aaaattaacc tgctttaaag cctatgat 88

<210> 35

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 35

atacgattaa gtaaacctaa tgccattact cgttcagcaa cgtcagc 47

<210> 36

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 36

cgttgctgaa cgagtaatgg cattaggttt acttaatcgt atggcc 46

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 37

tccataataa tcgttgacat ggcataccc 29

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 38

cggcatattt aaaaacgagg ttatcgttgt 30

<210> 39

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 39

gtcagcagca gagtaatgag gttttagagc tagaaatagc aagtt 45

<210> 40

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 40

ctcattactc tgctgctgac actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 41

aactggatgc cgacaaactc ac 22

<210> 42

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 42

agcagttcga aaacaacagt aattccaag 29

<210> 43

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 43

tccttcttaa agttaaacaa aggtctgatc acattatacg agccgatgat taattgtcaa 60

gccaggcgaa atataaatgc gg 82

<210> 44

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 44

atcggctcgt ataatgtgat cagacctttg tttaacttta agaaggagat ataccatggc 60

gcagtcgaaa ctctatc 77

<210> 45

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 45

gccataggca cttaattaca cccgtccgta gcgatc 36

<210> 46

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 46

ctacggacgg gtgtaattaa gtgcctatgg cgatcaggg 39

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 47

atttacacgc tgcacgcgaa ta 22

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 48

aagacgaaaa ccgtcgcatt g 21

<210> 49

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 49

cgaaatggcg tatgtgaatg gttttagagc tagaaatagc aagtt 45

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 50

cattcacata cgccatttcg actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 51

cgttgcggga ttaggaacca g 21

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 52

gattgcaaag gcgttgaatt agc 23

<210> 53

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 53

caaaccaccc caatataagt ttgaggattg cacttgctta aaatcccg 48

<210> 54

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 54

cgggatttta agcaagtgca atcctcaaac ttatattggg gtggtttg 48

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 55

gtatatgcgt tctcccttac gaag 24

<210> 56

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 56

gtacgggtat atcgagttga tcgacaac 28

<210> 57

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 57

cgcgaaatgc tgatcgctga gttttagagc tagaaatagc aagtt 45

<210> 58

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 58

tcagcgatca gcatttcgcg actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 59

gtcagacaac ccgtccatta ccc 23

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 60

cgcaggttga accggaagat c 21

<210> 61

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 61

ttgcgcgagg tcaagagctc tctcttagtt taatttccgc c 41

<210> 62

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 62

gaaattaaac taagagagag ctcttgacct cgcgcaaaat gcac 44

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 63

gacaagaaac gggggcaatt gt 22

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 64

gctcggagta ttgatcgccc ag 22

<210> 65

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 65

tagaaccgat gtaagtacgg gttttagagc tagaaatagc aagtt 45

<210> 66

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(引物)

<400> 66

ccgtacttac atcggttcta actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 67

<211> 1977

<212> DNA

<213> 人工序列(人工基因)

<400> 67

attaaattat ccagaggtta ctgttgcgtc tgtggtcgta acaacatccg acgtggtgat 60

gtgtcaaatg agacgctctg atgttcaggg gggttatcgc gtatacggat cgtggatggc 120

agaaaacgtt caggatcagg tatccatttt aaaccagaaa ttgagtgagt ttgccccatc 180

catgccccac gcggtgagat cggatgtaat taacaacagg ttacaaaacc tacacctgca 240

tgctcatcac ttcctgatac gccgccacca gcttattacg cacctgaatc cccatttgca 300

tagaaactga ggctttttgc atatcggtca tcacatcgtt taacgccacg ccgggttcac 360

cgagagtgaa tttttctgcc tgcgtgcggg cagctgtttg tgtatcacta atgcgatcga 420

gcgcggcgtg cagctgcccg gcaaaactaa tggtcggttg cggcagtgat tcctgcgcac 480

gcgcactcat cgccgtagcc ttacttctta atgcccatct cttcttcaag ccaggcttta 540

aattccgtgc caagggtgtt atgacgaata ccgtattcaa cgaaggcctg catgtaacct 600

aatttattac cgcagtcatg gctcttccct ttcatatgat aggcttccac cgtttctttt 660

tcgatcagca tatcaattgc gtcggtgagc tgaatttcat caccagctcc cggaggggtt 720

tttgccagca acggccaaat atccgcgcta agtacgtaac gacccacaat agcgagatta 780

gacggcgcaa catccgcttt cggtttttct accacaccaa ccatcggtac gctttcaccc 840

ggcgctaatt caacgccttt gcaatccaca acgccatatg cggtcacatc agcaaccggt 900

tcaaccatga tctggctatg acccgtttca tcaaagcggc ggatcatctc tgccaggtta 960

tcctgtgaca aatcggattc atattcatcc agaataacat caggcaaaat aacagctacc 1020

ggttcatcac ccactaccgg gtgagcacac aataccgcgt gtcccaggcc tttcgccaga 1080

ccctgacgaa cttgcataat agtcacgtgc ggtggacaaa tagactgcac ttcatcaagc 1140

agttgacgtt ttacacgttt ttccagcatt gcttccagtt caaaactggt atcaaagtgg 1200

ttttcaatag agtttttaga tgagtgtgta accagcacaa tttcagtaat gccagccgca 1260

atacattcat tcacgacgta ttgaattaat ggcttatcga caagtggcag catctctttc 1320

gggatggctt tcgtcgccgg caacatcctg gttcctaatc ccgcaacggg gataacggct 1380

tttttgactt tcgtattaat ggcagccatg gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaagg 1440

tctgatcaca ttatacgagc cgatgattaa ttgtcaatct cgtctcccgg ataatttctg 1500

gtagcaaagc ctaccagtaa gtcaataaga caaaggcgct aaatagcaac aaaaaaacgg 1560

gtttattggc ggatagaaaa aaacgaaagc acaaataatg ggagcgtcaa tttttcgagt 1620

ttgctgaccc gggagtgagt cttgttccac tttgccaata acgccgtcca taatcagcca 1680

cgaggtgcgc gatgaatgcg actgcagccc agacaaaatc tcttgagtgg cttaatcgcc 1740

tgcgtgcgaa tccgaaaatt ccattgattg ttgccggttc cgcggcagtg gcggtcatgg 1800

tcgcactgat cctgtgggcg aaagcccccg actaccgcac attattcagc aatctttccg 1860

atcaggatgg tggcgcaatt gtcagccaac tgacgcaaat gaatattcct taccgcttca 1920

gcgaagccag cggcgctatt gaagttccgg cagataaagt tcacgaactg cgtctgc 1977

<210> 68

<211> 2085

<212> DNA

<213> 人工序列(人工基因)

<400> 68

aaatcactat tgctgccgat ggcacaatct cggcgctcaa tccgggcgat ccggcaaata 60

cggttgcgcc agtagggcgt cttaaactgg tgaaagccac gggcagcgaa gtgcagcgcg 120

gtgacgacgg catttttcgt ttaagcgcag aaacccaggc cacgcgtggg ccggtactgc 180

aggcagatcc aaccttgcgt gtgatgtcgg gggttctgga aggcagtaac gtcaatgccg 240

ttgcggcaat gagcgacatg attgccagcg cgcggcgttt tgaaatgcag atgaaggtga 300

tcagcagcgt cgatgataac gcaggccgtg ccaaccaact gctgtcgatg agttaattga 360

aaggatacat gacaagtata agttgcccga tgcgcaagtt tatcgggtct atgggggcaa 420

tcgcaattta tcgattttgc gagcacttgt aggccggata aggcgtttac gccgcatccg 480

gcaagaagac atatgcactt ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gatcagacct 540

ttgtttaact ttaagaagga gatataccat gagagttctg gttaccggtg gtagcggtta 600

cattggaagt catacctgtg tgcaattact gcaaaacggt catgatgtca tcattcttga 660

taacctctgt aacagtaagc gcagcgtact gcctgttatc gagcgtttag gcggcaaaca 720

tccaacgttt gttgaaggcg atattcgtaa cgaagcgttg atgaccgaga tcctgcacga 780

tcacgctatc gacaccgtga tccacttcgc cgggctgaaa gccgtgggcg aatcggtaca 840

aaaaccgctg gaatattacg acaacaatgt caacggcact ctgcgcctga ttagcgccat 900

gcgcgccgct aacgtcaaaa actttatttt tagctcctcc gccaccgttt atggcgatca 960

gcccaaaatt ccatacgttg aaagcttccc gaccggcaca ccgcaaagcc cttacggcaa 1020

aagcaagctg atggtggaac agatcctcac cgatctgcaa aaagcccagc cggactggag 1080

cattgccctg ctgcgctact tcaacccggt tggcgcgcat ccgtcgggcg atatgggcga 1140

agatccgcaa ggcattccga ataacctgat gccatacatc gcccaggttg ctgtaggccg 1200

tcgcgactcg ctggcgattt ttggtaacga ttatccgacc gaagatggta ctggcgtacg 1260

cgattacatc cacgtaatgg atctggcgga cggtcacgtc gtggcgatgg aaaaactggc 1320

gaacaagcca ggcgtacaca tctacaacct cggcgctggc gtaggcaaca gcgtgctgga 1380

cgtggttaat gccttcagca aagcctgcgg caaaccggtt aattatcatt ttgcaccgcg 1440

tcgcgagggc gaccttccgg cctactgggc ggacgccagc aaagccgacc gtgaactgaa 1500

ctggcgcgta acgcgcacac tcgatgaaat ggcgcaggac acctggcact ggcagtcacg 1560

ccatccacag ggatatcccg attaatcaac gtggcggaag aactggtcaa tatgattcag 1620

gtgcaacgcg cttacgaaat caacagtaaa gcggtgtcca ccaccgatca gatgctgcaa 1680

aaactgacgc aactctaagg cttaaccggt ggcaggttca ccggtttact gatttttgaa 1740

gatgatagcc atgcaaaaaa acgctgcgca tacttatgcc atttccagct tgttggtgct 1800

ttcactaacc ggctgcgcct ggataccctc cacgccgctg gtgcaggggg cgaccagtgc 1860

acaaccggtt cccggtccga cgcccgtcgc caacggttct attttccagt ctgctcagcc 1920

gattaactat ggctatcaac cgctgtttga agatcgtcga ccacgcaata ttggcgatac 1980

gctgaccatc gtgttgcagg agaacgtcag cgccagcaaa agctcctctg cgaatgccag 2040

ccgtgacggt aaaactaatt ttggctttga tactgtgccg cgcta 2085

<210> 69

<211> 2207

<212> DNA

<213> 人工序列(人工基因)

<400> 69

gacgtgtcat acgatcagtt actctgcaag tcttgctgcg cttcgttgat cagcgcatcg 60

gcaattttgc cggtgtccat ttttagttca ccgttacgaa tcgccagttt taacgcttcg 120

acacgttcaa gattgatatc actgctgccg ggttgcatca gttttgcttg cgcgtcgctt 180

aacgtcacac tggtgctggt ggaggcggtt gtttttgccg cccggctgtt cgttaccggc 240

gcgtcagtgg tttcgcgcgg ttgaacggtg cttacaggct tcagaggcga agtgcgatca 300

atactcatgg tttattcctc attgagggcg cttttatcat gtgttgctta tttatcggca 360

agggacgggt aatctttaac agcttacagg tttataagaa tattcccatc tgcatcaaca 420

acgccgctga ctacctgtcc cgataccatg cgcacccgcg cattctgtgc gacggctgca 480

ttgttcagcg cctgaccttc ttatgactcc agcgcgatcg ccacgtcgta gccgtgagat 540

ttcagcagag agtgtttttt cgccgcttcg aggtcattag ccaccatttc agacaccatc 600

tctctgaggg tgatttccgg tttccagccc agtttttcgt gcgctttggt cgggtcgccg 660

agcagcgttt caacttcagc cggacggaag taacgcgggt caacagcgat aatcacatca 720

cccggtttaa cgcccggcgc gtcatgcccg gtgacggaaa ccacaatgcc cttctcttca 780

acgcccgtgc cttcaaagcg cagtttgatg cccagctgtg ctgccgccat ttccacgaac 840

tgacgcacgg agtactgaac gccggtcgcg ataacgaaat cttccggctg ttcctgctgc 900

agcatcatcc actgcatttt tacgtagtct ttggcgtggc cccagtcacg cagggaatcc 960

atattgccga ggtacaggca cgactccagc ccctgggcga tgttggcgat tgcgcgggtg 1020

attttgcggg taacgaaggt ttcgccgcgg cgcggggatt catggttgaa gagaattccg 1080

ttacaggcgt acatgccgta ggattcacgg tagttaacgg tgatccagta ggcgtacagt 1140

ttggcgaccg catacggaga tcgcgggtag aacggcgtgg tctctttctg cggaatttcc 1200

tgcaccagac catacagttc agaggtggaa gcctgataga aacgagtttt cttttccaga 1260

ccgaggaagc ggatcgcctc cagcaggcgc agcgtaccca tcgcgtcgac gtcagcggta 1320

tattctggtg actcaaaaga gaccgcaacg tggctcattg cgcccaggtt gtacacttca 1380

tccggctgta cttcacgcaa aatgcgcgtc aggttagagg tatcactcag gtcgccataa 1440

tgcagatgga atttcgggtt gcaggtgtgc ggatcctgat aaatgtgatc cacgcgctcg 1500

gtgttgaatg acgatgcgcg acgcttaata ccatgcacct cgtaaccttt ttccagcaga 1560

aactctgcca ggtaagaacc gtcttgtccg gttacaccgg tgatgagagc gacttttgac 1620

atggtatatc tccttcttaa agttaaacaa aggtctgatc acattatacg agccgatgat 1680

taattgtcaa aaaaaagttg tgcaattgcg atgtgagatt gctcgccgta cttaacggac 1740

tgaacagtat cgcgatgatc gccacgctac gttttattat cagcattttc gcccccagcc 1800

atttctacaa cgtgaattgt acctgtccgc aatgaccatc aacggcataa atagcgaccc 1860

attttgcgtt tattccgccg ataacgcgcg cgtaaaggca tttaagctga tggcagaatt 1920

ttgatacctg cggaggagat atgctcgata agctcgacgc cgccttacgt tttcaacaag 1980

aggcgctcaa tctgcgcgcc cagcgtcagg aagtgctggc agcaaacatc gccaatgccg 2040

atacccctgg ttatcaggcg cgcgatatcg attttgccag tgaacttaaa aaagtcatgc 2100

aacgtggacg ggatgcaacc agtgtggttg cactgacgat gacctcaacg caacacattc 2160

cggcgcaggc gctgacgcct cctaccgcag aactgcaata ccgtatt 2207

<210> 70

<211> 2505

<212> DNA

<213> 人工序列(人工基因)

<400> 70

agcagttcga aaacaacagt aattccaagt aagcaatatt catcgggaga caggtcatgt 60

acgcggcaaa aggcacccag gcctatgcac aaattggcgt cgaaagcgcc gtaatgagcg 120

ccagccagca gcagctggtc accatgctat ttgatggagt gctgagcgca ctggttagag 180

cgagcctgtt tatgcaggac aacaatcagc aaggcaaagg cgtctctttg tcaaaagcga 240

tcaacatcat tgagaacgga ctgcgggtga gtcttgatga agagagcaaa gacgaactaa 300

cccaaaactt gattgctctt tatagctata tggtcaggcg cttgctgcaa gccaatttac 360

gcaacgatgt ctccgcagtc gaagaagtgg aagcattaat gcgcaatatt gccgatgcct 420

ggaaagagtc gttactctcc ccttctttga ttcaggaccc agtctgatga accatgcacc 480

gcatttatat ttcgcctggc ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gatcagacct 540

ttgtttaact ttaagaagga gatataccat ggcgcagtcg aaactctatc cagttgtgat 600

ggcaggtggc tccggtagcc gcttatggcc gctttcccgc gtactttatc ccaagcagtt 660

tttatgcctg aaaggcgatc tcaccatgct gcaaaccacc atctgccgcc tgaacggcgt 720

ggagtgcgaa agcccggtgg tgatttgcaa tgagcagcac cgctttattg tcgcggaaca 780

gctgcgtcaa ctgaacaaac ttaccgagaa cattattctc gaaccggcag ggcgaaacac 840

ggcacctgcc attgcgctgg cggcgctggc ggcaaaacgt catagcccgg agagcgaccc 900

gttaatgctg gtattggcgg cggatcatgt gattgccgat gaagacgcgt tccgtgccgc 960

cgtgcgtaat gccatgccat atgccgaagc gggcaagctg gtgaccttcg gcattgtgcc 1020

ggatctacca gaaaccggtt atggctatat tcgtcgcggt gaagtgtctg cgggtgagca 1080

ggatatggtg gcctttgaag tggcgcagtt tgtcgaaaaa ccgaatctgg aaaccgctca 1140

ggcctatgtg gcaagcggcg aatattactg gaacagcggt atgttcctgt tccgcgccgg 1200

acgctatctc gaagaactga aaaaatatcg cccggatatc ctcgatgcct gtgaaaaagc 1260

gatgagcgcc gtcgatccgg atctcaattt tattcgcgtg gatgaagaag cgtttctcgc 1320

ctgcccggaa gagtcggtgg attacgcggt catggaacgt acggcagatg ctgttgtggt 1380

gccgatggat gcgggctgga gcgatgttgg ctcctggtct tcattatggg agatcagcgc 1440

ccacaccgcc gagggcaacg tttgccacgg cgatgtgatt aatcacaaaa ctgaaaacag 1500

ctatgtgtat gctgaatctg gcctggtcac caccgtcggg gtgaaagatc tggtagtggt 1560

gcagaccaaa gatgcggtgc tgattgccga ccgtaacgcg gtacaggatg tgaaaaaagt 1620

ggtcgagcag atcaaagccg atggtcgcca tgagcatcgg gtgcatcgcg aagtgtatcg 1680

tccgtggggc aaatatgact ctatcgacgc gggcgaccgc taccaggtga aacgcatcac 1740

cgtgaaaccg ggcgagggct tgtcggtaca gatgcaccat caccgcgcgg aacactgggt 1800

ggttgtcgcg ggaacggcaa aagtcaccat tgatggtgat atcaaactgc ttggtgaaaa 1860

cgagtccatt tatattccgc tgggggcgac gcattgcctg gaaaacccgg ggaaaattcc 1920

gctcgattta attgaagtgc gctccggctc ttatctcgaa gaggatgatg tggtgcgttt 1980

cgcggatcgc tacggacggg tgtaattaag tgcctatggc gatcagggcg gctttgtgct 2040

ggctccgcag gataacctct tttgaatctg aatgagtcga tggctcgcga ataatccgat 2100

tacggctacg cttctaatgt tccccttgaa tggagtcgaa gaatgcgtaa tcccacgctg 2160

ttacaatgtt ttcactggta ttacccggaa ggcggtaagc tctggcctga actggccgag 2220

cgcgccgacg gttttaatga tattggtatc aatatggtct ggttgccgcc cgcctataaa 2280

ggcgcatcgg gcgggtattc ggtcggctac gactcctatg atttatttga tttaggcgag 2340

tttgatcaga aaggcagcat ccctactaaa tatggcgata aagcacaact gctggccgcc 2400

attgatgctc tgaaacgtaa tgacattgcg gtgctgttgg atgtggtagt caaccacaaa 2460

atgggcgcgg atgaaaaaga agctattcgc gtgcagcgtg taaat 2505

<210> 71

<211> 2439

<212> DNA

<213> 人工序列(人工基因)

<400> 71

gattatcgac ctggtgatag ccagcgtgtt gatggcattg gggatgatga tggttccccc 60

agccaccatt gctctgccct ttaaactgat gctgtttgta ctggtggatg gctggcaatt 120

gctggtcggt tcgctggcgc agagctttta cagctagaga ggcaaaatga cacctgaatc 180

ggtcatgatg atggggactg aagcgatgaa agtcgcgctg gcactggctg ccccgctatt 240

gttggtagcg ttggtcacgg gccttatcat cagtattttg caggccgcca cgcagattaa 300

cgaaatgacg ctgtcgttta ttccgaaaat catcgccgta tttatcgcca ttattattgc 360

cggaccgtgg atgctcaatc tgttgctgga ttacgtccgc accttgttca ctaacctgcc 420

gtatatcatc gggtagccgt actatgttgc aggtgacaag cgaacaatgg ctatcctggt 480

taaacctgta cttctggccg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gatcagacct 540

ttgtttaact ttaagaagga gatataccat gaaaaaatta acctgcttta aagcctatga 600

tattcgcggg aaattaggcg aagaactgaa tgaagatatc gcctggcgca ttggtcgcgc 660

ctatggcgaa tttctcaaac cgaaaaccat tgtgttaggc ggtgatgtcc gcctcaccag 720

cgaaacctta aaactggcgc tggcgaaagg tttacaggat gcgggcgttg acgtgctgga 780

tattggtatg tccggcaccg aagagatcta tttcgccacg ttccatctcg gcgtggatgg 840

cggcattgaa gttaccgcca gccataatcc gatggattat aacggcatga agctggttcg 900

cgagggggct cgcccgatca gcggagatac cggactgcgc gacgtccagc gtctggctga 960

agccaacgac tttcctcccg tcgatgaaac caaacgcggt cgctatcagc aaatcaacct 1020

gcgtgacgct tacgttgatc acctgttcgg ttatatcaat gtcaaaaacc tcacgccgct 1080

caagctggtg atcaactccg ggaacggcgc agcgggtccg gtggtggacg ccattgaagc 1140

ccgctttaaa gccctcggcg cgcccgtgga attaatcaaa gtgcacaaca cgccggacgg 1200

caatttcccc aacggtattc ctaacccact actgccggaa tgccgcgacg acacccgcaa 1260

tgcggtcatc aaacacggcg cggatatggg cattgctttt gatggcgatt ttgaccgctg 1320

tttcctgttt gacgaaaaag ggcagtttat tgagggctac tacattgtcg gcctgttggc 1380

agaagcattc ctcgaaaaaa atcccggcgc gaagatcatc cacgatccac gtctctcctg 1440

gaacaccgtt gatgtggtga ctgccgcagg tggcacgccg gtaatgtcga aaaccggaca 1500

cgcctttatt aaagaacgta tgcgcaagga agacgccatc tatggtggcg aaatgagcgc 1560

ccaccattac ttccgtgatt tcgcttactg cgacagcggc atgatcccgt ggctgctggt 1620

cgccgaactg gtgtgcctga aagataaaac gctgggcgaa ctggtacgcg accggatggc 1680

ggcgtttccg gcaagcggtg agatcaacag caaactggcg caacccgttg aggcgattaa 1740

ccgcgtggaa cagcatttta gccgtgaggc gctggcggtg gatcgcaccg atggcatcag 1800

catgaccttt gccgactggc gctttaacct gcgcacctcc aataccgaac cggtggtgcg 1860

cctgaatgtg gaatcgcgcg gtgatgtgcc gctgatggaa gcgcgaacgc gaactctgct 1920

gacgttgctg aacgagtaat ggcattaggt ttacttaatc gtatggcccc gcaattatcc 1980

atttttgtta ttggatttcc attaactctg actgtcggca tctctttaat ggcggcatta 2040

atgccgttaa ttgcaccttt ttgcgaacat ttattcagtg aaatttttaa tttgctggct 2100

gatattatta gtgaattgcc attaatataa ttccgtaacg tttatcatgt tatcctaagg 2160

attatccgaa aaataatacc tacgaacatc ttccaggata ctcctgcagc gaaatatttg 2220

ttttaagctc actcacatat cgcaacattt actttacttt aagacaattc caggcaaatt 2280

atacaacact ttacgggata gtaagtccgc ctgaaaaatc gcgagagtgg cgcattaggt 2340

gacccatgtt gttccgttta gtcatgatga aatattcagg taaggggaat tatcgttacg 2400

cattgagtga gggtatgcca tgtcaacgat tattatgga 2439

<210> 72

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列(人工基因)

<400> 72

cgatgttcgg ctgcttattc acttccccct ggctttgggt gtaatcatca ccaccgccgg 60

gaattgggct ttcactatta gaaatgcgat cgccgcccgt aaccgcagtc gccagtggag 120

tccggaagta ctccgcaatc tgaatcagct cttttgggct ggagatggag atcagccaca 180

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catgtgctgc cccgtggctt ttggctttgc gtcgtttgac gacaataatc ggatgcgctt 300

gattcttcat gcttcctcgg ttgtcgtctg ttgttgcgga tttttcaccg cacgcacatg 360

ctcttccagt tcaataaacg acggacgttc gctggaatag agcgttttgc gaccaaactc 420

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catcattttg ctggtttcgg cgcttttctg acgtaaaaca gtcgctaatg gggaaataaa 540

tccgtaagcc aataaaatgc cgaggaaagt ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt 600

gatcagaccc ttaagattaa ctcacacaag gagatatacc atgtcaacga ttattatgga 660

tttatgtagt tacacccgac taggtttaac cgggtatctg ttgagtagag gggttaaaaa 720

aagagaaatc aacgacattg aaaccgttga tgaccttgcc atagcttgtg attcacagcg 780

cccttcagtg gtgtttatta atgaggactg tttcatccac gatgcttcta acagtcagcg 840

tatcaagctc atcattaatc aacatcccaa tacgttattt atcgttttta tggcaattgc 900

caatgttcat tttgatgaat atctattggt cagaaaaaat ttattgatca gttctaaatc 960

gattaaaccg gaatctctcg acgatatcct tggcgatatt ctgaaaaaag agacaacgat 1020

aacctcgttt ttaaatatgc cgacgttatc attgagccga accgaatcga gtatgttgcg 1080

aatgtggatg gcaggtcagg gaaccattca aatctctgac caaatgaata tcaaagccaa 1140

gaccgtttca tcgcataaag gtaatattaa acgtaagatc aaaacgcata ataaacaggt 1200

tatctaccat gtcgtccgac tgacggataa tgtgactaat ggtatttttg tcaacatgcg 1260

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ttgatagagt gctccaaggc ttccaccggt catcaaataa ccgccgaaaa ctgtaccgag 1500

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<210> 73

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(人工基因)

<400> 73

cgcaggttga accggaagat ctgatcaagt ttggtcttat ccctgagttt attggtcgtc 60

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tggaattccg tgacgaggcg ctggatgcta tcgctaagaa agcgatggcg cgtaaaaccg 240

gtgcccgtgg cctgcgttcc atcgtagaag ccgcactgct cgataccatg tacgatctgc 300

cgtccatgga agacgtcgaa aaagtggtta tcgacgagtc ggtaattgat ggtcaaagca 360

aaccgttgct gatttatggc aagccggaag cgcaacaggc atctggtgaa taattaacca 420

ttcccataca attagttaac caaaaagggg ggattttatc tcccctttaa tttttcctct 480

attctcggcg ttgaatgtgg gggaaacatc cccatatact gacgtacatg ttaatagatg 540

gcgtgaagca cagtcgtgtc atctgattac ctggcggaaa ttaaactaag agagagctct 600

tgacctcgcg caaaatgcac taataaaaac agggctggca ggctaattcg ggcttgccag 660

cctttttttg tctcgctaag ttagatggcg gatcgggctt gcccttatta aggggtgttg 720

taaggggatg gctggcctga tataactgct gcgcgttcgt accttgaagg attcaagtgc 780

gatataaatt ataaagagga agagaagagt gaataaatct caattgatcg acaagattgc 840

tgcaggggct gatatctcta aagctgcggc tggccgtgcg ttagatgcta ttattgcttc 900

cgtaactgaa tctctgaaag aaggggatga tgtagcactg gtaggttttg gtacttttgc 960

cgttaaagag cgtgctgccc gtactggccg caacccgcag accggtaaag agatcaccat 1020

cgctgctgct aaagtaccga gcttccgtgc aggtaaagca ctgaaagacg cggtaaacta 1080

agcgttgtcc ccagtgggga tgtgacgaag ttcaagggcg catctactga tgtgcctttt 1140

ttatttgtat tcggtgactt tctgcgtctt gtgggctgac aattgccccc gtttcttgtc 1200

<210> 74

<211> 1208

<212> DNA

<213> 人工序列(人工基因)

<400> 74

ataacctggc agagatgatc cgccgctttg atgaaacggg tcatagccag atcatggttg 60

aaccggttgc tgatgtgacc gcatatggcg ttgtggattg caaaggcgtt gaattagcgc 120

cgggtgaaag cgtaccgatg gttggtgtgg tagaaaaacc gaaagcggat gttgcgccgt 180

ctaatctcgc tattgtgggt cgttacgtac ttagcgcgga tatttggccg ttgctggcaa 240

aaacccctcc gggagctggt gatgaaattc agctcaccga cgcaattgat atgctgatcg 300

aaaaagaaac ggtggaagcc tatcatatga aagggaagag ccatgactgc ggtaataaat 360

taggttacat gcaggccttc gttgaatacg gtattcgtca taacaccctt ggcacggaat 420

ttaaagcctg gcttgaagaa gagatgggca ttaagaagta acatccgtat cggtgttatc 480

cacgaaacgg cgttgagcaa tcgacgccgt ttttttatag cttattctta ttaaattgtc 540

ttaaaccgga caataaaaaa tcccgccgct ggcgggattt taagcaagtg caatctacaa 600

aagattattg cttgatcagg aaatcgtcga gggatttacc ttgctcatcc attgcttttt 660

tgattacagc tggagtacgg ccttggccag tccaggtttt agtttcgccg ttttcgtcaa 720

cgtagctata ttttgccgga cgctgagcac gtttagcttt ggtgccagat ttaacggcag 780

caaggctatt cagcagttcg ttcgggtcaa taccgtcagc gatcagcatt tcgcgatatt 840

gctgcagttt acgagtgcgc tcttcaactt cagcagcagc cgcgctttct tcttcgcgac 900

gttcgttaac aacaacttct aatttttcca gcatttcttc cagcgtttca agtgtacatt 960

ctcttgcctg cgcacgaaga gtacggatgt tgttcagaat tttaagtgct tcgctcattg 1020

tagtaatctc aaacttatat tggggtggtt tgttgaggta ataatagagc cttaaattca 1080

gttgtgcaat agccaggaat gtaaggaatt caaaattgtt ctttattttg tgccgccaat 1140

aaatatcttt tcataaaatt agccagaaaa gacgcggcat atagccctat ttacaccgat 1200

gatttcgc 1208

Claims

1.一种克拉酸高产菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以保藏编号ATCC25404的大肠杆菌K12 MG1655为初始菌株，将如SEQ ID NO .67所示对UDP-葡萄糖途径强化的galu基因片段整合进入所述初始菌株中，获得大肠杆菌菌1；

S2、在所述大肠杆菌菌1的基因组中，将如SEQ ID NO .68所示对UDP-半乳糖途径强化的gale基因片段整合入flgg位点构建成大肠杆菌菌2；

S3、在所述大肠杆菌菌2的基因组中，将如SEQ ID NO .69所示对GDP-岩藻糖途径强化的gmd基因片段、如SEQ ID NO .70所示对GDP-岩藻糖途径强化的manc基因片段和如SEQ IDNO .71所示对GDP-岩藻糖途径强化的manb基因片段分别整合入基因组中的flga位点、flit位点、flir位点，获得含有如SEQ ID NO .69所示的gmd基因片段的大肠杆菌菌3、含有如SEQID NO .69 所示的gmd基因片段和如SEQ ID NO .70所示的manc基因片段的大肠杆菌菌4、含有如SEQ ID NO .69 所示的gmd基因片段、如SEQ ID NO .70 所示的manc基因片段和如SEQ ID NO .71所示的manb基因片段的大肠杆菌菌5；

S4、在所述大肠杆菌菌5基因组中，将如SEQ ID NO .72所示的rcsa基因整合入基因组中的mota位点，获得大肠杆菌菌6；

S5、在所述大肠杆菌菌6基因组中，敲除如SEQ ID NO .73所示的lon基因片段，获得大肠杆菌菌7，并在所述大肠杆菌菌7基因组的基础上敲除如SEQ ID NO .74所示的hns基因片段，获得大肠杆菌菌8，即所述克拉酸高产菌株。

2.一种采用如权利要求1所述的克拉酸高产菌株的构建方法构建的克拉酸高产菌株制备克拉酸的方法，其特征在于，包括将所述克拉酸高产菌株的菌落挑取至TB培养基中，37℃发酵培养12小时作为种子液，向含有TB培养液的发酵罐中加入种子液，将种子液搅拌通气，添加葡萄糖，发酵温度为20℃~42℃，培养32~60小时后，收集分泌物。

3.如权利要求2所述的制备克拉酸的方法，其特征在于，在所述发酵罐中，发酵温度为42℃，培养时间为32小时。