CN113637607A - 一株拟无枝酸菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株拟无枝酸菌及其应用。本发明的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM‑141(保藏编号为CGMCC No.22871)应用于以阿魏酸为底物生产香兰素。本发明通过实验确认拟无枝酸菌HM‑141以阿魏酸为底物生产香兰素，能够实现的摩尔转化率高达87％，且产物中的杂质(或副产物)显著低于现有技术，其中，香兰醇的检出量为0，而香兰酸的检出量低至0.25g/L，具有显著优势。

Description

一株拟无枝酸菌及其应用
【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)，还涉及所述拟无枝酸菌以阿魏酸为底物生物转化产香兰素的方法。
【背景技术】
香兰素又称香草醛、香兰醛，是世界上使用最广泛的调味料之一，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用。香兰素具有“食品香料之王”的美称，有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，可在食品中起到助香、增味的作用；在医药方面，香兰素是合成多种药物的重要原料；香兰素在化妆品、香水等领域可作为调香剂；在农业生产中也可作为农作物的催熟剂和增产剂。由于其广泛的使用领域，国内外所生产出的香兰素远远不能满足目前的市场需求。
目前，市场上香兰素的生产方式主要包括植物提取、化学合成、微生物转化。植物提取主要是从香荚兰豆中提取天然香兰素，但此法原料供应有限，提取方法强度大、加工周期长、制品的价格十分昂贵，因此，植物提取的香兰素远远不能满足市场需求。化学合成法主要包括丁香酚法、木质素法、4-甲基愈创木酚法、愈创木酚二甲基苯胺法、愈创木酚-乙醛酸法、对羟基苯甲醛法等，其中木质素法和愈创木酚-乙醛酸法最为常用。化学合成法生产的香兰素价格低廉，但是，在反应过程中会导致不必要的外消旋混合物的形成，同时也缺乏底物选择性；由于不环保的工艺过程，该法生产的香兰素在全球范围内受到食品和制药行业的限制；化学合成的香兰素香型单一、容易引发环境污染，不符下游应用市场对天然原料的消费趋势。由于植物提取与化学合成法存在种种不足，致使人们越来越重视微生物转化法生产香兰素。微生物转化法所用的微生物有多种，底物主要是可再生资源阿魏酸或丁香酚，天然底物经生物转化产生的香兰素被称为“天然香兰素”，其在价格以及品质方面都比化学合成的香兰素占有优势；微生物转化法周期短，产率高，污染少，有利于工业化生产，因此，微生物转化法已经成为生产香兰素的一种趋势，将是一种非常具有发展前景的研究方向。
CN102321563A专利公开了一株拟无枝酸菌CCTCC M 2011265及利用其全细胞转化制备香草醛的方法，该微生物细胞转化阿魏酸产生香草醛的最大浓度可达到10g/L以上，对底物摩尔转化率为50％以上。US6133003专利公开了利用拟无枝酸菌DMS9992转化阿魏酸生产香兰素，香兰素的浓度达到11.5g/L，摩尔转化率为77.8％。US6235507B1专利公开了一株西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii ATCC39116)转化阿魏酸生产香兰素的产量达到13.9g/L，摩尔转化率为75％。CN101165168A公开了一株链霉菌Streptomyces sp.V-1CCTCCM 206065，转化阿魏酸生产香兰素的产量最高达到19.2g/L，摩尔转化率为54.5％。
以上公开的生产香兰素的菌株摩尔转化率均低于80％，副产物较多，包括香兰酸、香兰醇、愈创木酚等，给后续香兰素的分离纯化带来了一定的困难，并且造成底物阿魏酸的资源浪费，提高了生产成本。本发明提供一种拟无枝酸菌及其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，摩尔转化率达到85％，并且副产物较少，利用全细胞直接进行转化，发酵工艺简单。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一株新的拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.)，以期获得更高的香兰素，且发酵产物的摩尔得率更高，其杂质含量如香草醇、香草酸的含量更低。
为了实现上述目标，本发明提供一株拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141，该菌株已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.22871。
基于此，本发明还提供上述的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141在生产香兰素中的应用。
特别地，所述拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141以阿魏酸为底物生产香兰素。
本发明还提供拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)平板活化
取冻存的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141稀释涂布在固体平板上，将平板倒置于30℃培养箱中培养至长出菌落；
所述固体平板培养基的组成为：葡萄糖4g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽提取物10g/L，琼脂20g/L，其余为水，在121℃下灭菌20min，倒平板得到固体平板；
(2)种子发酵
接一环菌到种子培养基中，在30℃培养48-72h，转速为200rpm；
所述种子培养基的组成为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2，在121℃下灭菌20min得到种子培养基；
(3)发酵罐发酵
将种子液按照5％的接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，在30℃、搅拌转速800rpm、通气比为1vvm的条件下发酵培养24h后，加入底物阿魏酸22.5g/L，调节pH为8.2继续发酵48h；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节初始pH为7.2，在121℃下灭菌20min得到发酵培养基。
根据一种优选的实施方式，在进行发酵罐发酵时，所述发酵罐为装有4L发酵培养基的5L发酵罐。将本发明的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141在发酵罐中发酵，以阿魏酸为底物，发酵结束后用HPLC测定发酵液中香兰素的浓度，实即测得阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为87％。副产物香兰酸的含量低至0.25g/L，且发酵液中未检测到香兰醇，产物中的杂质(或副产物)含量显著低于现有技术。
微生物信息：拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141，2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.22871。
【附图说明】
图1为本发明拟无枝酸菌HM-141的菌落形态；
图2为本发明拟无枝酸菌HM-141革兰氏染色的菌体形态，放大倍数100倍；
图3为本发明香兰素和阿魏酸标准品的HPLC图，14.639min出峰为香兰素标品，18.252min出峰为阿魏酸标品；
图4为本发明5L发酵罐发酵液的HPLC图，阿魏酸转化为香兰素，其中10.534min出峰为副产物香兰酸。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”均为质量百分比，用于说明用量比例的“：”均为质量比。
本发明涉及以下培养基：
富集培养基：葡萄糖4g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽提取物10g/L，琼脂20g/L，阿魏酸钠0.5g/L，其余为水；
种子培养基：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2，在121℃下灭菌20min；
发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节初始pH为7.2，发酵培养基在121℃下灭菌20min；
固体培养基：葡萄糖4g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽提取物10g/L，琼脂20g/L，其余为水。实施例1拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141的筛选
从西安、咸阳、渭南等地果树周围采集的土壤样品。将采集的10份土壤样品稀释到合适倍数，涂布到富集培养基上，放置于30℃的培养箱中培养。培养96h后，挑取能够使2，4-二硝基苯肼溶液(1.6mg 2，4-二硝基苯肼/1mL 50％H2SO4)显红色的菌落，接种到发酵培养基中于30℃，200rpm培养24h，然后加入10g/L的阿魏酸，继续振荡培养48h，通过HPLC检测发酵液，挑选出生产香兰素多的菌株，得到转化阿魏酸生产香兰素的原始菌株。
该原始菌株是革兰氏阳性菌，菌体为细丝状，好氧，菌落为白色或淡黄色、不透明，可利用葡萄糖、乳糖、麦芽糊精、麦芽糖、果糖、甘油，不能水解淀粉，其16s rDNA基因序列与拟无枝酸菌的16s rDNA序列相似性达到99％。
HPLC检测发酵液：发酵液离心，取上清液进行HPLC分析。采用安捷伦HPLC1260分析转化产物，色谱柱为依利特Hypersil ODS2，5μm，4.6mm×250mm；检测波长295nm；柱温30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；流动相为乙腈和0.5％磷酸水溶液，0-20min，10-20％乙腈，20-30min，20-10％乙腈。
以所得原始菌株为出发菌株，进行复合诱变选育，紫外-亚硝酸钠复合诱变筛出高产香兰素的菌株：
将出发菌株在平板培养基上进行活化，然后挑取菌落溶于装有玻璃珠的10mL无菌水中，震荡混匀后得到菌悬液，梯度稀释获得OD600为0.4-0.6的菌悬液。取10mL菌悬液置于无菌培养皿中，在15W紫外灯的30cm处照射30s，然后避光培养1h，再向培养皿中加入0.1M的亚硝酸钠，在30℃，200rpm培养3min。
诱变结束后，立即加入磷酸氢二钠溶液终止反应。将诱变后的菌悬液进行梯度稀释，然后涂布于平板培养基上，挑取长出的单菌落接入装有种子培养基的96孔板中培养，种子液以5％的接种量接入96孔板发酵培养基中，在30℃、200rpm摇床中培养，加入0.5g/L的底物阿魏酸，结合2，4-二硝基苯肼显色法，用酶标仪在520nm处测吸光度，以此测定发酵液中香兰素的含量。
采用2，4-二硝基苯肼显色法测定香兰素的产量：发酵转化后期每4h从96孔板的培养液中取出10μL菌液于24深孔板内，加入100μL 2，4-二硝基苯肼溶液和5mL 0.8mol/L的NaOH溶液，混匀，以蒸馏水作为空白对照，同时以出发菌株作为对照组，然后检测吸光度。筛选出正突变株进行摇瓶复筛，将在平板培养基上活化的正突变株分别接种于种子培养基，30℃、200rpm培养48-72h，然后按照5％的接种量接种于发酵培养基中，30℃、200rpm条件下进行转化，底物阿魏酸初始浓度为10g/L。通过HPLC测定最终发酵液中香兰素的含量。最终筛选出高产香兰素的菌株。
所得菌株的菌种鉴定：
采用16s rDNA方法鉴定，确认筛选的菌株的16s rDNA与拟无枝酸菌具有99％的同源性，因此，将拟无枝酸菌HM-141定名为Amycolatopsis sp.HM-141。
本发明的拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.HM-141具有下述生物学特性：
在固体培养基上能形成明显的菌落，其菌落形态见附图1，菌落为白色或淡黄色、不透明，表面干燥。革兰氏染色为阳性，菌体为细丝状，其菌体形态见附图2。
实施例2拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.HM-141产香兰素测定
取一管-80℃保藏的甘油菌种Amycolatopsis sp.HM-141，在固体平板上稀释涂布，平板倒置于30℃培养箱中培养3-4d至长出菌落。
从活化平板上接一环菌到种子培养基中，在30℃培养48-72h，转速为200rpm。
将种子液按照5％的接种量接种到5L发酵罐中(含有4L发酵培养基)，在30℃发酵培养，搅拌转速为800rpm，通气比为1vvm。培养24h后，加入底物阿魏酸22.5g/L(共90g，按照4L发酵液体积计算的阿魏酸浓度，将阿魏酸溶于0.5M NaOH溶液中使其浓度为100g/L)，然后调节pH为8.2，继续发酵48h。
由于在4L发酵液的基础上加了0.9L的阿魏酸溶液，而在发酵期间对发酵液取样导致发酵液有所减少，在发酵结束时，测得实际的发酵液体积为4.5L，为了保持数据一致，以下数据均用4L发酵液进行计算。用HPLC测定发酵液中香兰素的浓度为15g/L，残留的阿魏酸浓度为0.5g/L，如果计入未参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为85％；如果不计入未参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为87％。副产物香兰酸的含量为0.25g/L，发酵液中未检测到香兰醇。HPLC检测阿魏酸和香兰素的图谱见附图3和4。
综上所述，本发明的拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.HM-141以阿魏酸为底物生产香兰素，实现的摩尔转化率高达87％，且产物中的杂质(或副产物)显著低于现有技术，其中，香兰醇的检出量为0，而香兰酸的检出量低至0.25g/L，具有显著优势。

Claims (5)

1.一株拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141，该菌株已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.22871。
2.权利要求1所述的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141在生产香兰素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141以阿魏酸为底物生产香兰素。
4.拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)平板活化
取冻存的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141稀释涂布在固体平板上，将平板倒置于30℃培养箱中培养至长出菌落；
所述固体平板培养基的组成为：葡萄糖4g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽提取物10g/L，琼脂20g/L，其余为水，在121℃下灭菌20min，倒平板得到固体平板。
(2)种子发酵
接一环菌到种子培养基中，在30℃培养48-72h，转速为200rpm；
所述种子培养基的组成为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2，在121℃下灭菌20min得到种子培养基；
(3)发酵罐发酵
将种子液按照5％的接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，在30℃、搅拌转速800rpm、通气比为1vvm的条件下发酵培养24h后，加入底物阿魏酸22.5g/L，调节pH为8.2继续发酵48h；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节初始pH为7.2，在121℃下灭菌20min得到发酵培养基。
5.根据权利要求3所述的方法其特征在于所述发酵罐为装有4L发酵培养基的5L发酵罐。
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