CN1136314C - 能够改变植物特性的转录因子的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
具有选自于a)或b)的DNA的基因：a)具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第90位到第728位的核苷酸序列的DNA；或b)在严格条件下与a)的DNA杂交，并且编码能够改变植物的特性的转录因子的DNA。
Description
本发明涉及编码能够改变植物特性的转录因子的基因及其应用。更具体地说，本发明涉及来源于碧冬茄(Petunia hybrida)的新基因PetSPL3基因，与该基因相关的基因及其应用。
为了弄清控制植物特性例如，花的形态的调节机理，已经利用拟南芥，金鱼草和碧冬茄进行分子生物学和分子遗传学研究。具体地说，由于下面理由优选地将碧冬茄用作为研究科目：作为园艺植物具有高价值；存在各种品种；易于转化；由于它的花大易于观察；和遗传学发现的积累(H.Takatsuji，“用于测定植物形状的分子原理”，细胞技术，植物细胞技术系列(SHUJUNSHA)，第96-106页)。
已经从突变体中分离了引起突变的基因，在所述突变体中上面提到的植物的花器官被改变了。因此，显然转录因子在花的分化和形态的形成中起着重要的作用。例如，拟南芥的SUPEMAN是具有锌指基元作为DNA结合区域的转录因子。已知在SUPERAN突变体中，雄蕊的数目显著地增加，雌蕊有缺陷(THE IDEN，1997年4月(Vol.51，No.4)，第34-38页)。
为了弄懂控制植物特性的机理，鉴别参与控制的新的转录因子是重要的。可通过利用基因工程程序将编码控制花形态形成的转录因子的基因导入到植物。利用基因导入方法获得具有新的特征的花的植物是可能的，所述特征是采用常规育种方法没有获得的或不可能获得的。据认为具有所述新特征的植物在园艺学上具有价值。
本发明的基因具有选自于a)或b)的DNA：a)具有由序列表中SEQ IDNO.1表示的核苷酸序列的第90位到第728位的核苷酸序列的DNA；b)在严格条件下与a)的DNA杂交，并且编码能够改变植物的特性的转录因子的DNA。
本发明的基因编码选自于i)或ii)的转录因子：i)具有由SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列的第1位到第213位的氨基酸序列的转录因子；或ii)具有其中i)的一个或多个氨基酸被缺失，取代，或添加的氨基酸序列，并且能够改变植物的特性的转录因子。
在本发明的一个实施方案中，植物的特性包括选自于下列组：花的形态，花的颜色，花的大小和分枝的数目的特性之一。
用于生产本发明的转基因植物的方法包括如下步骤：将上面提到的基因导入植物细胞；和从具有导入的基因的植物细胞再生植物体。
在本发明的一个实施方案中，该植物属于双子叶植物。
在本发明的另一个实施方案中，该植物属于茄科。
在本发明的另一个实施方案中，该植物属于碧冬茄属(Petunia)。
在本发明的另一个实施方案中，将该基因掺入到植物表达载体。
采用上面提到的方法产生了本发明的转基因植物。
因此，本文描述的发明可以具有下面优点(1)提供了编码能够改变植物特性的转录因子的基因；(2)提供了用于生产具有由导入基因改变的特性的植物的方法和(3)提供了转基因植物。
通过阅读和理解下面的详细描述以及参考附图，本发明的这些和其它的优点对本领域内技术人员来说是显而易见的。
图1显示了PetSPL3基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。
图2A图解显示了含有PetSPL3基因的高表达载体(pBIN-35S-PetSPL3)，图2B图解显示了用于分析PetSPL3基因的启动子的载体(pBIN-PetSPL3-GUS)。
图3显示出检测在用PetSPL3基因转化的碧冬茄中PetSPL3基因的mRNA的变性的琼脂糖凝胶电泳图的放射自显影。
图4显示出野生型碧冬茄(左边)和用PetSPL3基因转化的碧冬茄(右边)植物体的形态图。
图5显示出野生型碧冬茄(上面部分)和用PetSPL3基因转化的碧冬茄(下面部分)叶的形态图。
图6A显示出野生型碧冬茄的花的形态图，图6B和图6C显示出用PetSPL3基因转化的碧冬茄的花的形态图。
图7是用pB-PetSPL3-GUS转化的碧冬茄的茎的GUS染色的图案。
下文中，将对本发明进行详细描述。
本文中使用的术语“转录因子”是指与控制mRNA合成的基因的DNA调节区结合的蛋白质。已知一些转录因子在其DNA结合区域具有称作为锌指基元的高度保守的氨基酸序列。
本发明的基因编码能够改变植物的特性的转录因子。该基因可以具有下面DNA之一：
a)具有由序列表的SEQ ID NO.1表示的核苷酸序列的第90位到第728位的核苷酸序列的DNA；或
b)在严格条件下与a)的DNA杂交，并且编码能够改变植物的特性的转录因子的DNA。
本发明的基因也可以含有编码能够改变植物特性的转录因子的DNA，并且与a)的DNA具有约60％或更多，优选的是约70％或更多，更优选的是约80％或更多，并且仍然更优选的是约90％或更多的同源性。
优选的是本发明的基因可以含有a)的DNA。
本发明的基因也可以编码下面转录因子之一：
i)具有由SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列的第1位到第213位的氨基酸序列的转录因子；或
ii)具有其中i)的一个或多个氨基酸被缺失，取代，或添加的氨基酸序列，并且能够改变植物的特性的转录因子。
缺失，取代，或添加的氨基酸的数目可以是约130个或更少，优选的是约60个或更少，更优选的是约30个或更少和仍然更优选的是约20个或更少，进一步更优选的是10个或更少。
优选的是，本发明的基因可以编码i)的转录因子。
本发明特别优选的基因编码i)的转录因子。
本发明特别优选的基因是PetSPL3基因。图1显示出该基因的cDNA序列(SEQ ID NO.1)和其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。
“植物的特性”的变化是指至少植物的形态和植物的颜色之一发生任何变化，更具体地说，至少花的形态，花的颜色，植物的大小，和分枝的数目之一发生变化。通过将导入本发明的基因获得的植物的特性与导入该基因之前的植物(野生型或园艺型)特性进行比较对这些变化进行评估。
花的形态和/或花的颜色的变化是优选的植物形态变化的例子。(下文中，术语‘花’是指花瓣，除非另有说明。)
花形态的改变包括但不限于通过单个花瓣的形状(大花瓣，小花瓣，锯齿型花瓣，圆形花瓣，波纹状花瓣等等)的改变产生的形态，通过花瓣数目(重瓣，单瓣等等)的改变产生的形态，和由花瓣的异常发育(星型花瓣等等)产生的形态。
花的颜色的改变的例子包括但不限于单色例如白色，猩红色，橙红色，玫瑰红，粉红色，蓝紫色，紫色，淡紫色，天蓝色，***和带黄色的白色和两种或多种颜色的多色图案(例如杂色，斑点，边缘杂色，花瓣外边缘着色)。
改变的植物的大小的例子包括但不限于矮化和半矮化。优选的是矮化为导入基因之前植物标准大小的约1/2或更低，更优选的是约1/3或更低。改变的分枝数目的例子包括但不限于分枝增加。
植物的改变的特征优选的是包括由花瓣异常发育，重色图案，矮化或分枝增加；和更优选的是这些特性的结合(例如花瓣异常发育，重色图案的结合和/或矮化和分枝增加的结合)产生的形态学。更优选的是，改变的植物特性包括星型形状的形态，花瓣外边缘的着色，矮化或分枝增加，和更优选的是这些特征的结合(星型形状的形态，花瓣外部边缘的着色的结合，和/或矮化和分枝增加的结合)。
例如通过用植物的基因组DNA作为模板，利用对应于由已知的转录因子的基因编码的氨基酸序列的保守区的简并的引物对进行聚合酶链反应(PCR)，并利用由此获得的扩增的DNA片段作为探针筛选相同植物的基因组文库可以分离本发明的基因。引物对的例子包括5’-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3’(SEQ ID NO.3)或5’-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3’(SEQ ID NO.4)与5’-ARNCKNARYTCNARRTC-3’(SEQ ID NO.5)的结合，其中N是肌苷，R是G或A，Y是C或T，和K是T或G。
根据商品试剂盒和仪器制造商的指导或采用本领域内技术人员已知的程序进行PCR。用于生产基因文库的方法，用于与探针杂交的严格条件，和用于克隆基因的方法是本领域内技术人员已知的。例如，参见Maniatis等人，分子克隆实验手册，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoPress，Cold Spring Harbor，纽约(1989)。
通过本领域内技术人员已知的核苷酸序列分析方法或采用商购自动测序仪可以确定由此获得的基因的核苷酸序列。
本发明的基因不限于从天然基因组分离的那些，也可以包括合成的多核苷酸。通过利用本领域内技术人员已知的程序对上面描述的经过测序的基因进行修饰例如可以获得合成的多核苷酸。
采用本领域内技术人员已知的方法可以将本发明的基因连接到合适的植物载体表达，并且采用已知的基因重组技术可以将其导入到植物细胞。将导入的基因掺入到植物细胞的DNA。植物细胞的DNA包括包含于植物细胞的各种细胞器(例如线粒体，叶绿体等等)的DNA以及染色体。
“植物”包括单子叶和双子叶。优选的植物是双子叶植物。双子叶植物包括原始花被纲(Archichlamiidae)和合瓣花纲(Sympetalidae)。合瓣花纲植物是优选的。合瓣花纲植物的例子包括龙胆目(Gentianales)，茄目(Solanales)，野芝麻目(Lamiales)，水马齿目(Callitrichales)，车前草目(Plantaginales)，橘梗目(Campanulales)，玄参目(Scrophulariales)，茜草目(Rubiales)，川续断目(Dipsacales)，菊目(Asterales)等等。茄目植物是优选的。茄目植物的例子包括茄科(Solanaceae)，水叶科(Hydrophyllaceae)，花葱科(Polemoniaceae)，菟丝子科(Cusctaceae)，旋花科(Convolvulaceae)，等等。茄科是优选的。茄科包括碧冬茄属(Petunia)，曼陀罗属(Datura)，烟草属(Nicotiana)，茄属(Solanum)，蕃茄属(Lycopersicon)，辣椒属(Capsicum)，酸浆属(Physalis)，和枸杞属(Lycium)等等。碧冬茄属，曼陀罗属和烟草属是优选的。碧冬茄属是更优选的。碧冬茄属的植物的例子包括碧冬茄，腋生碧冬茄(P.axillaris)，P.inflata，P.violacea等等。碧冬茄植物是特别优选的。除非另有说明，“植物”是指具有花和从其获得种子的植物体。“植物细胞”的例子包括来自于植物器官例如叶和根，愈伤组织的细胞，和培养的悬浮细胞。
本文使用的术语“植物表达载体”是指核酸序列，其中将用于调节本发明的基因的表达的各种调节元件，例如启动子相互连接以便在宿主植物细胞中可操作。优选的是，植物表达载体可以包括植物启动子，终止子，药物抗性基因和增强子。本领域内技术人员熟知植物表达载体和调节元件的类型可以随宿主细胞的类型而变化。根据本发明使用的植物表达载体可以进一步含有T-DNA区域。该T-DNA区域允许将基因有效地导入到植物基因组，尤其是当将农杆菌用于转化植物时。
本文使用的术语“植物启动子”是指在植物中有功能的启动子。选择性地在植物体的一部分包括花有功能的组成型启动子以及组织特异性启动子是优选的。植物启动子的例子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂氨酸合酶的启动子。
本文使用的术语“终止子”是指定位于编码参与mRNA的转录的终止，和加上聚A的序列的蛋白质的基因区域的下游的序列。已知终止子对mRNA的稳定起作用，从而影响基因的表达水平。所述终止子的例子包括但不限于CaMV 35S终止子和胭脂氨酸合酶基因的终止子(Tnos)。
药物抗性基因对于转基因植物的选择是需要的。用于本发明的所述药物抗性基因的例子包括但不限于赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因，和赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因。
可以将增强子用于增强有用的基因的表达水平。作为增强子，含有上面提到的CaMV 35S启动子的上游的序列的增强子区域是优选的。可以将一个以上的增强子用于一种植物表达载体。
通过利用本领域内技术人员熟知的重组DNA技术可以生产本发明的植物表达载体。用于构建植物表达载体的优选的载体的例子包括但不限于pBI-型载体或pUC-型载体。
通过利用本领域内技术人员熟知的方法，例如用农杆菌感染植物细胞的方法，或将载体直接导入到细胞的方法可以将植物表达载体导入到植物细胞。例如按照Nagel等人，微生物学通讯，67，325，1990的描述可以进行利用农杆菌的方法。根据该方法，首先通过例如电穿孔用植物表达载体转化农杆菌，然后通过熟知的方法例如叶盘方法将转化的农杆菌感染植物细胞。用于直接将植物表达载体导入到细胞的方法的例子包括但不限于电穿孔方法，粒子枪方法，磷酸钙方法，和聚乙二醇方法。这些方法是本领域内技术人员熟知的，本领域内技术人员可以适当地选择适用于特定的待转化植物的方法。
例如基于其对药物的抗性例如抗卡那霉素抗性选择其中已经导入了植物表达载体的细胞。此后采用常规方法可以将细胞再生为植物体。
采用本领域内技术人员已知的程序能够证实再生的植物体中导入的本发明的基因的表达。例如通过northern印迹分析可以进行所述验证。更具体地说，从获得的植物的叶提取总RNAs，将其进行变性的琼脂糖凝胶电泳，然后将RNAs吸印到合适的膜上。将印迹与标记的RNA探针杂交以检测来自于本发明的基因的mRNA，所述探针与导入的基因的一部分互补。
本发明的植物是由上面提到的程序产生的转基因植物。优选的是转基因植物的改变的特性(即花的形态，花的颜色，植物的大小，和/或分枝的数目)包括在已知的野生型或园艺型中不存在的那些特性。还优选的是植物的改变的特性是具有园艺学价值。此外，优选的是花的改变的形态在随后的后代中稳定地保存。
实施例
下文中，将借助于下面的举例性实施例描述本发明。用于下面实施例的限制性酶，质粒等等是通过商业途径获得的。
实施例1：PetSPL3基因的分离
将由拟南芥的SUPERMAN基因编码的蛋白质与由特异性地在大豆根瘤中表达的GmN479基因(Kouchi等人，个人通讯)编码的蛋白质进行比较。基于在两种蛋白质中共同存在的氨基酸序列合成用于PCR的三个不同的简并引物。定位于基因的5’到3’的两种引物的核苷酸序列分别是5’-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3’(引物1，对应于氨基酸序列QALGGH；SEQ ID NO：3)和5’-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3’(引物2，对应于LGGHMN的氨基酸序列；SEQ ID NO：4)，并且定位于基因的3’到5’的引物的核苷酸序列是5’-ARNCKNARYTCNARRTC-3’(引物3，对应于DLELRL的氨基酸序列；SEQ ID NO：5)，其中N是肌苷，Y是C或T，R是G或A，和K是T或G。
在下面条件下利用根据描述于Boutry，M.和Chua N.H.(1985)EMBO J.4，2159-2165的方法提取的碧冬茄(碧冬茄Mitchell品种)的基因组DNA作为模板，用引物1和引物3进行第一组PCR：94℃进行10分钟，随后将在94℃进行30秒，50℃进行30秒，和在72℃进行60秒循环30次，随后在72℃进行7分钟。另外，利用从第一个PCR的产物的一部分作为模板，用引物2和引物3进行第二个PCR。反应条件与第一个PCR使用的条件相同。将扩增的DNA片段***到TA克隆载体(由Invitrogen生产)，然后根据常规方法将它导入到大肠杆菌。从转化的大肠杆菌提取质粒，测定该DNA片段的核苷酸序列。结果显示在获得的DNA片段内编码在SUPERMAN和GmN479中共同存在的锌指基元的一部分。将衍生该DNA片段的基因命名为PetSPL3基因。在相同的一系列试验中，证明了含有类似于PetSPL3的核苷酸序列的3个其它DNAs(PetSPL1，2和4基因)的存在。
从含有上面描述的PCR扩增的DNA片段的质粒切下EcoRI-EcoRI片段。利用常规的随机引物方法用(α-32P)dCTP标记该DNA片段(Sambrook等人，(1989)分子克隆实验手册，(Cold Spring HarborLaboratory))以产生放射性标记的探针。利用该标记的探针，筛选碧冬茄(碧冬茄Mitchell品种)的基因组文库，所述文库是在EMBL3载体中产生的(来自Stratagene)。该筛选获得的克隆含有约3.2千碱基对的基因组DNA片段。将该片段亚克隆到pBluescript载体(pBS/PetSPL3)的XbaI位点，因此，分离了来源于碧冬茄的PetSPL3基因。
实施例2：PetSPL3基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
从实施例1获得的pBS/PetSPL3载体，获得含有PetSPL3基因的蛋白质编码区的区域(HindIII位点和XbaI位点之间的区域)，并且进一步亚克隆到pBluescript载体(pBS/PetSPL3-HX)，然后测定蛋白质编码区的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。从包含于获得的DNA核苷酸序列的开放阅读框架，推导出该蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
核苷酸序列比较表明PetSPL3基因与SUPERMAN，PetSPL1，PetSPL2和PetSPL4基因的核苷酸序列同源性分别是29％，37％，52％和23％。这种核苷酸序列的比较仅在各个基因的编码区中进行。
推导的PetSPL3的氨基酸序列含有类似于SUPERMAN的单个的TFIIIA-型的锌指基元。基于此，推测PetSPL3是转录因子。也由本发明克隆的PetSPL1和PetSPL2显示其全长氨基酸序列与SUPERMAN具有35％的同源性。而，PetSPL3显示其全长氨基酸序列与SUPERMAN具有20％的同源性。
此外，证明PetSPL3与SUPERMAN在锌指基元区域的氨基酸同源性是约20％，低于PetSPL1和PetSPL2与SUPERMAN的同源性(分别是约38％和35％)。表1比较了SUPERMAN与各个PetSPL在锌指基元区域的氨基酸序列。表1也显示了SUPERMA的C末端疏水区域与各个PetSPL的比较结果。
表1锌指
C-末端的疏水区域
根据上面描述的结果，推导PetSPL3是属于不同于SUPERMAN，PetSPL1和PetSPL2的种类的新的转录因子。根据PetSPL3和SUPERMAN的表达方式的不同也支持了该结果。参见下面的实施例8。
实施例3：构建含有编码PetSPL3基因的多核苷酸的植物表达载体
将含有质粒pBI221(从Clontech购买)的CaMV 35S启动子的DNA片段(HindIII-XbaI片段)和含有NOS终止子的DNA片段(SacI-EcoRI片段)依次***到质粒pUCAP(van Engelen，F.A.等人，转基因研究，4：288-290(1995))的多克隆位点以产生pUCAP35S。另一方面，在HindIII(0位点)和AccI(第258位)位点切割含有PetSPL3的质粒pBS/PetSPL3-HX。用Klenow酶使两个被切割的末端平齐化并且再连接两个末端，去除了转录起始位点上游的258碱基对的DNA片段。从获得的质粒切除编码PetSPL3的DNA片段(KpnI-SacI片段)，并且***到上面描述的质粒pUCAP35的KpnI和SacI位点之间。进一步用AscI和PacI切割所获得的重组质粒，和将获得的编码PetSPL3的DNA片段导入到二元载体pBINPLUS(van Engelen，F.A.等人，(1995)，见上文)的AscI和PacI位点。
所构建的用于PetSPL3基因的高表达载体(pBIN-35S-PetSPL3)包括，如图2a显示的，CaMV35S启动子区域(P35S；0.9Kb)，编码PetSPL3的本发明的多核苷酸(PetSPL3；0.8Kb)和胭脂氨酸合酶的终止子区域(Tnos；0.3Kb)。在图2中，Tnos和NPTII分别表示胭脂氨酸合酶的启动子区域和新霉素磷酸转移酶II基因。LB和RB分别表示T-DNA左边界和T-DNA的右边界。
实施例4：PetSPL3基因导入到碧冬茄细胞
(1)根癌农杆菌的转化
将根癌农杆菌LBA4404系(从Clontech购买)在含有250微克/毫升链霉素和50微克/毫升利福平的L培养基上，28℃培养。根据Nagel等人(1990)(见上文)的方法，制备该菌株的细胞悬浮液。通过电穿孔将在实施例3中构建的PetSPL3基因高表达载体导入到上面描述的菌株。
(2)将编码PetSPL3的多核苷酸导入到碧冬茄细胞
将(1)中获得的根癌农杆菌LBA4404系在YEB培养基中搅拌培养(28℃，200rpm)(D.M.Glover ed.DNA克隆，IPL PRESS，第二版，p.78)，随后用无菌水稀释20倍。将碧冬茄(碧冬茄Mitchell品种)的叶切片在该稀释的溶液中培养。2-3天之后，利用含有羧苄青霉素的培养基去除农杆菌，之后通过每隔2星期转移到新鲜培养基将这些叶切片在选择性培养基中继代培养。将由来源于pBINPLUS的，与上面提到的PetSPL3基因一起导入的NPTII基因的表达赋予的卡那霉素抗性特性用作为指示剂以选择转化的碧冬茄细胞。利用常规方法从转化的细胞诱导愈伤组织，然后再分化为植物体。
实施例5：PetSPL3基因在PetSPL3转化体植物中的表达
从在实施例4中获得的14株PetSPL3转化的碧冬茄的叶提取总RNAs。将每种提取物各取10微克进行变性的琼脂糖凝胶电泳，并且采用常规分化吸印到Genescreen plus滤膜(由DuPont生产)。利用DIG RNA标记盒(由Boeringer Mannheim生产)对PetSPL3反义RNA进行标记。根据试剂盒的说明用标记的RNA进行杂交和滤膜的洗涤。在洗涤之后，将该滤膜在XAR胶片(由柯达生产)上在室温下曝光1小时。图3显示变性的琼脂糖凝胶电泳的放射性自显影图，其中在14个碧冬茄植株中有9株检测到PetSPL3基因mRNAs。这些结果表明在高表达启动子的控制下14个单个转化植株中有3个以高水平表达PetSPL3 mRNA。
实施例6：以高水平表达PetSPL3基因的转化体碧冬茄的表现型
在以高水平表达PetSPL3基因的3个单个的转化体碧冬茄中共同观察到下面的表现型。首先，如在植物体中观察到的变化，矮化植株由于顶端优势的降低出现了明显的分枝。(图4：左边泳道显示野生型碧冬茄，右边泳道显示PetSPL3转化体碧冬茄)。叶变得更小并且推测在整个表面观察到由于花色苷色素沉积导致的紫色污染(图5；上部泳道显示野生型碧冬茄的叶和底下的泳道显示PetSPL3转化体碧冬茄的叶)。就花而言，从上往下看野生型花，显示约呈圆形，而PetSPL3转化体碧冬茄的花呈星型(图6：(a)：野生型碧冬茄的花，(b)和(c)PetSPL3转化体碧冬茄花)。推测这是花瓣异常扩展的结果。在本实施例中使用的碧冬茄Mitchell品种具有白色的花瓣。这被解释为是控制花瓣着色的调节基因例如an2变异的结果(Quattrocchio，F.，Ph.D.thesis in Amsterdam FreeUniversity(1994))。相反，对于PetSPL3转化体碧冬茄，仅在花瓣的外边缘显示淡紫色的颜色(图6(c))。
上面描述的结果显示在野生型和园艺品种碧冬茄中完全没有或极少存在的PetSPL3转化体碧冬茄的花的形态和/或着色图形。就这方面而言，本发明人知道没有人报道过借助于遗传工程手段赋予植物花所述特征的例子。另外，PetSPL3转化体碧冬茄是矮化型并且分枝增加。这些特征在园艺学上具有高价值。
实施例7：含有位于GUS报道基因上游的来自PetSPL3基因的5’上游区域的多核苷酸的启动子分析载体的构建
在实施例7和8中，对赋予其表达模式的PetSPL3基因的启动子活性进行分析，并且与SUPERMAN基因和其它PetSPL基因进行比较。
利用上面描述的质粒pBS/PetSPL3作为模板，将含有PetSPL3基因的转译起始位点的上游的约70碱基对的序列和BamHI识别序列的引物(ACTGGATCCCATTAGAGAGAGAGAG；SEQ ID NO：6)和对应于载体内的一个序列的M13反向引物(GGAAACAGCTATGACCATG：SEQ IDNO：7)用于进行PCR，而扩增据认为含有PetSPL3基因的启动子区域的约2.4kb的DNA片段。在接近于该片段的两个末端的XbaI和BamHI位点裂解该DNA片段。将含有β-葡萄糖苷酸酶(GUS)编码区和从pBI221(从Clontech购买)切下的胭脂氨酸合酶基因的终止子的XbaI-EcoRI片段***到pUCAP(Van Engelen，F.A.等人，(1995)，见上文)的XbaI和EcoRI位点以获得pUCAPGUS质粒。将上面获得的XbaI-BamHI片段***到pUCAPGUS质粒的GUS编码区的上游(即XbaI和BamHI位点)。用AscI和PacI从该获得的质粒切下含有PetSPL3基因的5’上游区域，和GUS编码区和胭脂氨酸合酶的终止子区域的DNA片段，并且***到实施例3中使用的pBINPLUS的AscI和PacI位点。图2b显示了由此构建的用于启动子分析的质粒(pBIN-PetSPL3-GUS)。
实施例8：PetSPL3基因在茎秆中的表达方式
以相同于实施例3的方式，将上面提到的含有位于GUS报道基因上游的来自PetSPL3基因的5’上游区域的多核苷酸的重组质粒导入到碧冬茄(碧冬茄Mitchell品种)。根据常规方法(Murakami和Ohashi，植物细胞工程，14，281-286，(1992))利用X-GUS作为底物，在获得的转化体的幼小的茎秆中调查GUS活性的分布。结果，在叶轴上特异性检测到GUS活性(参见图7)，表明含有PetSPL3基因的5’上游部分的DNA区域具有特异于叶轴细胞的启动子活性。因此，推测PetSPL3基因特异性地在叶轴细胞中表达。总的来说这种表达特异性不同于SUPERMAN基因，它特异于雄蕊和胚珠的原基。考虑氨基酸序列的不同和低相似性(实施例2)，结论是PetSPL3是属于不同于SUPERMAN种类的新的转录因子。
根据本发明，提供了编码能够改变植物的形态，颜色等等的转录因子的基因。利用本发明的基因，能够生产具有改变的特性的植物。生产的植物具有园艺学价值，因为它提供的特性在野生型和园艺型中不存在或极少存在。
不脱离本发明的范围和精神的其它各种修饰对本领域内技术人员是显而易见的和易于制备的。因此，本发明所附的权利要求书不限于本文提出的说明书，而应广泛地理解权利要求书。
序列表<110>农林水产省农业生物资源研究所长<120>能够改变植物特性的转录因子的基因及其应用<130>J198020604<150>JP10-65921<151>1998-03-16<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>887<212>DNA<213>Petunia hybrida var.Mitchell<220><221>CDS<222>(90)..(728)<400>1TCTACAAGGC AATAACAAGT TATAGTATCA TCTTTCTTTT ATTACCTTTA TAGAACTATC 60ATTTTTCCAC CGTTGACTCT CTCTCTCTA ATG GAA ACT AGT AAA AAT CAG CCG 113
Met Glu Thr Ser Lys Asn Gln Pro
5TCT GTC TCA GAA AAT GTT GAT CAG CAG AAA GTA GAT AAC TCT TCT TCA 161Ser Val Ser Glu Asn Val Asp Gln Gln Lys Val Asp Asn Ser Ser Ser
10 15 20GAT GAA CAA CAA ATT TCA ATT ATC CAA AGC AGC CAT ACT ACT AAA TCC 209Asp Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ile Gln Ser Ser His Thr Thr Lys Ser25 30 35 40TAT GAG TGC AAC TTT TGT AAA AGA GGT TTT TCT AAC GCA CAA GCA CTT 257Tyr Glu Cys Asn Phe Cys Lys Arg Gly Phe Ser Asn Ala Gln Ala Leu
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60 65 70CAA AAG CAG CAT CAA CGA CAA CAA AAA CCT ACC TCG GTT TCC AAA GAA 353Gln Lys Gln His Gln Arg Gln Gln Lys Pro Thr Ser Val Ser Lys Glu
75 80 85ACC AAC ATG GCT CAC AAT ATC TTG CTA GCG GAT GAT TCT AAC ATC CCT 401Thr Asn Met Ala His Asn Ile Leu Leu Ala Asp Asp Ser Asn Ile Pro
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125 130 135AGA CAG ATT CAA GAT CTA AAC TTA GTC ATG GGT TCA ACT CTT AAC GTT 545Arg Gln Ile Gln Asp Leu Asn Leu Val Met Gly Ser Thr Leu Asn Val
140 145 150CTC AGA ATG AAT AGT GTT GAA GCG GGT TCT GTT GAT TCA CGT GAA AAT 593Leu Arg Met Asn Ser Val Glu Ala Gly Ser Val Asp Ser Arg Glu Asn
155 160 165AGA TTG CCG GCT AGA AAT CAA GAA ACT ACA CCA TTT TAC GCG GAA TTG 641Arg Leu Pro Ala Arg Asn Gln Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Ala Glu Leu
170 175 180GAC CTT GAG CTG CGA TTA GGT CAT GAG CCT GCA CCT TCC ACG GAT ATA 689Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly His Glu Pro Ala Pro Ser Thr Asp Ile185 190 195 200TCA TCA GCT AAT TCG GGT TTA GGC ACA AGA AAG TTC TTA TGATTTATTG 738Ser Ser Ala Asn Ser Gly Leu Gly Thr Arg Lys Phe Leu
205 210GTACTATTGC TGCTAAATGC TTTTTCTTTT TACTACTGTT TAGGGTTTTT TTGTGACTAT 798GATACTACTT TTGCTACATC TGAATTGTCT TGAACTCTTT TATTCAGAGT TCTTGGATTT 858TGCTTTGCTT GTTTTAATCT GGCTCTAGA 887<210>2<211>213<212>PRT<213>Petunia hvbrida var.Mitchell<400>2Met Glu Thr Ser Lys Asn Gln Pro Ser Val Ser Glu Asn Val Asp Gln
5 10 15Gln Lys Val Asp Asn Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ile
20 25 30Gln Ser Ser His Thr Thr Lys Ser Tyr Glu Cys Asn Phe Cys Lys Arg
35 40 45Gly Phe Ser Asn Ala Gln Ala Leu Gly Gly His Met Asn Ile His Arg
50 55 60Lys Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys Gln Lys Gln His Gln Arg Gln Gln65 70 75 80Lys Pro Thr Ser Val Ser Lys Glu Thr Asn Met Ala His Asn Ile Leu
85 90 95Leu Ala Asp Asp Ser Asn Ile Pro Thr Thr Ile Pro Phe Phe Pro Ser
100 105 110Leu Thr Ser Pro Asn Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Val Ser Ser Cys
115 120 125Thr Thr Ala Asp Thr Val Gly Gln Arg Gln Ile Gln Asp Leu Asn Leu
130 135 140Val Met Gly Ser Thr Leu Asn Val Leu Arg Met Asn Ser Val Glu Ala145 150 155 160Gly Ser Val Asp Ser Arg Glu Asn Arg Leu Pro Ala Arg Asn Gln Glu
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180 185 190Glu Pro Ala Pro Ser Thr Asp Ile Ser Ser Ala Asn Ser Gly Leu Gly
195 200 205Thr Arg Lys Phe Leu
210<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(15)<223>i<400>3CARGCNYTNGGNGGNCAY 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>人工序列描述：引物<220><221>修饰的碱基<222>(3)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>i<400>4YTNGGNGGNCAYATGAAY 18<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<220><221>修饰的碱基<222>(3)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>i<400>5ARNCKNARYTCNARRTC 17<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>6ACTGGATCCCATTAGAGAGAGAGAG 25<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>7GGAAACAGCTATGACCATG 19
Claims (8)
1.一种具有选自于a)或b)的DNA的基因：
a)具有由序列表SEQ ID NO.1表示的核苷酸序列的第90位到第728位的核苷酸序列的DNA；或
b)具有其中a)的DNA的少量核苷酸被取代的序列，并且编码能够改变植物的特性的转录因子的DNA。
2.一种编码选自于i)或ii)的转录因子的基因：
i)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第1位到第213位的氨基酸序列的转录因子；或
ii)具有其中i)的一个或少量氨基酸被缺失，取代，或添加的氨基酸序列，并且能够改变植物的特性的转录因子。
3.根据权利要求1所述的基因，其中植物的特性包括选自于下列一组的特性：花的形态，花的颜色，植物的大小和分枝的数目。
4.一种用于生产转基因植物的方法，包括如下步骤：
将权利要求1所述的基因导入到植物细胞；从具有导入的基因的植物细胞再生植物体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中植物属于双子叶植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中植物属于茄科。
7.根据权利要求6所述的方法，其中植物属于碧冬茄属。
8.根据权利要求4所述的方法，其中将基因掺入到植物表达载体。
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