CN113616779A - 用于动员干细胞的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于动员干细胞的方法和组合物。具体地，本发明涉及用于动员造血干细胞和/或祖细胞的方法和组合物、为移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入进行调制的相关方法以及需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病的治疗方法。

Description

用于动员干细胞的方法和组合物
本申请是国际申请日2014年2月28日、国际申请号PCT/US2014/019596于2015年10月26日进入中国国家阶段、申请号201480023643.6、发明名称“用于动员干细胞的方法和组合物”的申请的分案申请。
与相关申请的交叉引用
本申请要求2013年2月28日提交的美国临时申请号61/770,533、2013年5月29日提交的美国临时申请号61/828,568和2013年11月15日提交的美国临时申请号61/904,768的利益。上述申请的全部教示通过参考并入本文。
政府支持
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的HL044851、HL97794和HL09774的政府支持下做出。美国政府在本发明中具有一定权利。
背景技术
造血干细胞(HSC)移植是一种常用的挽救生命的医疗程序，在全球每年用于治疗并治愈约60,000位患者。尽管它很常用，但对于提高移植效率和患者获得性来说仍存在关键的未满足的需求，因为只有一部分能够从HSC移植获益的患者实际上接受移植。动员的HSC被广泛用于HSC移植，并且与骨髓来源的HSC相比具有改进的结果。尽管存在有效的动员方案(例如G-CSF)，但对鉴定节省G-CSF的方案或在G-CSF难治性群体中起作用的药物，仍存在需求。
发明内容
对于在动员抗性(mobilization resistant)群体(例如糖尿病诱导的动员病(mobilopathy))中增强造血干细胞和/或祖细胞的动员的方法，以及对对象进行调制以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入(engraftment)的非细胞毒性方法(例如在不存在细胞毒性调制例如化疗和放疗的情况下)，存在着需求。本发明涉及应对这些需求的进一步解决方案，并具有其他所需特征。
因此，一方面，本发明提供了一种在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括向对象给药有效量的在所述对象中抑制外生骨疣蛋白1(exostosin 1)(EXT1)的水平或活性的药剂，由此在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞。
一方面，本发明提供了一种在表现出糖尿病诱导的造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的抑制EXT-1的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员。
一方面，本发明提供了一种在不存在细胞毒性调制的情况下对对象进行调制以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入的方法，所述方法包括向对象给药一定量的抑制EXT1的水平或活性的药剂以有效地在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞，由此在不存在细胞毒性调制的情况下对所述对象进行调制以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入。
一方面，本发明提供了一种在需要治疗的对象中治疗需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病的方法，所述方法包括：(a)向对象给药一定量的抑制EXT 1的水平或活性的药剂以有效地在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞，由此在不存在细胞毒性调制的情况下对所述对象进行调制以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入；以及(b)将造血干细胞和/或祖细胞移植到所述对象中，其中所述移植的造血干细胞植入到所述对象的骨髓中，由此在所述对象中治疗需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病。
一方面，本发明提供了一种在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括向对象给药有效量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂，由此在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞。
一方面，本发明提供了一种在表现出糖尿病诱导的造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员。
一方面，本发明提供了一种在不存在细胞毒性调制的情况下对对象进行调制以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入的方法，所述方法包括向对象给药一定量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂以有效地在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞，由此在不存在细胞毒性调制的情况下对所述对象进行调制以备移植的外周血干细胞和/或祖细胞的植入。
一方面，本发明提供了一种在需要治疗的对象中治疗需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病的方法，所述方法包括：(a)向对象给药一定量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂以有效地在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞，由此在不存在细胞毒性调制的情况下对所述对象进行调制以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入；以及(b)将造血干细胞和/或祖细胞移植到所述对象中，其中所述移植的造血干细胞植入到所述对象的骨髓中，由此在所述对象中治疗需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病。
本发明设想了在任何细胞、组织、器官或个体中抑制EXT 1或其产物(硫酸乙酰肝素)的水平或活性。在某些实施方式中，所述药剂抑制在间充质细胞中表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性。在某些实施方式中，所述药剂抑制在骨髓间充质细胞中表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性。在某些实施方式中，所述药剂抑制在Mx1+骨骼干细胞和/或祖细胞中表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性。
在某些实施方式中，所述药剂选自小的有机或无机分子，糖类，寡糖，多糖，选自肽、蛋白质、肽类似物和衍生物的生物大分子，肽模拟物，选自siRNA、shRNA、反义RNA、核酶和适体的核酸，从选自细菌、植物、真菌、动物细胞和动物组织的生物材料制造的提取物，天然存在或合成的组合物，及其任何组合。在某些实施方式中，所述药剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物、硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物、降低EXT-1的水平或活性的药剂和降低VCAM-1的水平或活性的药剂。
在某些实施方式中，在所述对象中动员的所述干细胞和/或祖细胞包含CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
在某些实施方式中，所述方法包括收获在所述对象中动员的所述干细胞和/或祖细胞。
在某些实施方式中，所述方法包括将所述收获的干细胞和/或祖细胞移植到需要这种移植的对象中。
在某些实施方式中，在所述对象中动员的所述干细胞和/或祖细胞被收获用于自体移植到所述对象中。在某些实施方式中，在所述对象中动员的所述干细胞和/或祖细胞被收获用于同种异体移植到受体对象中。在某些实施方式中，在所述对象中动员所述干细胞和/或祖细胞以调制所述对象，以备随后移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入。
在某些实施方式中，在不存在细胞毒性调制的情况下对所述对象进行调制，以备随后移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入。在某些实施方式中，在不使用化疗的情况下对所述对象进行调制以备植入。在某些实施方式中，在不用辐照的情况下对所述对象进行调制以备植入。
在某些实施方式中，所述方法包括选择对常规动员方案做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，所述对象对粒细胞集落刺激因子(G-CSF)做出响应表现出不良动员。
在某些实施方式中，所述方法包括向所述对象给药选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式的细胞因子。
在某些实施方式中，所述方法包括向所述对象给药G-CSF或其糖基化或聚乙二醇化形式与肝素的组合。
在某些实施方式中，所述方法包括选择被诊断患有、被怀疑患有恶性血液肿瘤或具有发生恶性血液肿瘤的风险的对象。在某些实施方式中，所述需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病包含恶性血液肿瘤。在某些实施方式中，所述恶性血液肿瘤选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。
在某些实施方式中，所述方法包括选择被诊断患有、被怀疑患有非恶性疾病或具有发生非恶性疾病的风险的对象。在某些实施方式中，所述需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病包含非恶性疾病。在某些实施方式中，所述非恶性疾病选自骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。
在某些实施方式中，所述方法包括选择被诊断患有、被怀疑患有糖尿病或具有发生糖尿病的风险的对象。在某些实施方式中，所述对象表现出干细胞和/或祖细胞动员病。在某些实施方式中，所述方法包括选择表现出糖尿病诱导的造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象。
一方面，本发明提供了一种在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括向对象给药包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述对象的外周血中动员造血干细胞和/或祖细胞。
在某些实施方式中，所述在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法包括收获在所述对象中动员的所述外周血干细胞。在某些实施方式中，所述在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法包括通过血液成分单采术收获所述外周血干细胞。在某些实施方式中，所述造血干细胞动员和血液成分单采术在同一天进行。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的外周血干细胞以获得约2x106/kg至10x106/kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，所述在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法包括对需要干细胞移植的对象进行调制以备移植的干细胞的植入，所述调制如下进行：向所述对象给药包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述被调制的对象的干细胞巢中耗尽造血干细胞，以备随后移植的干细胞在所述被调制的对象的干细胞巢中的植入。在某些实施方式中，所述在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法包括将所述收获的外周血干细胞移植到需要这种移植的对象中。
一方面，本发明提供了一种收获外周血干细胞以备移植到需要这种细胞的对象中的方法，所述方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
一方面，本发明提供了一种对对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入的方法，所述方法包括：(a)向对象给药包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂或CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽造血干细胞，以备随后移植的外周血干细胞在所述对象的干细胞巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入。
一方面，本发明提供了一种对需要外周血干细胞移植的对象进行治疗的方法，所述方法包括：(a)向对象给药包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂或CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合，其量有效地调制所述对象的干细胞巢以备随后移植的外周血干细胞的植入；以及(b)将外周血干细胞移植到所述对象中。
在某些实施方式中，所述两种或更多种动员剂的组合被配制成组合物。在某些实施方式中，所述组合物被配制成用于皮下给药。
在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物、硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物、降低EXT 1的水平或活性的药剂和降低VGAM-1的水平或活性的药剂。在某些实施方式中，所述至少一种CXCR2激动剂选自(i)Gro-β或其类似物或衍生物和(ii)Gro-βΔ4或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福(Plerixafor)或其类似物或衍生物。
在某些实施方式中，所述两种或更多种动员剂的组合的给药在所述对象中动员了一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约1x106/kg体重至10x106/kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，所述两种或更多种动员剂的组合的给药在所述对象中动员了一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约2x106/kg体重至8x106/kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，所述两种或更多种动员剂的组合的给药在所述对象中动员了一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约3x106/kg体重至6x106/kg体重之间的细胞剂量。
在某些实施方式中，在不使用化疗的情况下对所述对象进行调制以备植入。在某些实施方式中，在不进行辐照的情况下对所述对象进行调制以备植入。在某些实施方式中，在不衰减基质细胞的情况下对所述对象进行调制以备植入。在某些实施方式中，在不向所述对象给药G-CSF的情况下对所述对象进行调制以备植入。
在某些实施方式中，本发明的方法包括向所述对象给药选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式的细胞因子。在某些实施方式中，本发明的方法包括向所述对象给药至少一种化疗药剂。
在某些实施方式中，动员的造血干细胞包含CD34+外周血干细胞。
应该认识到，本文中描述的方法可以与自体干细胞移植或同种异体干细胞移植联合使用。在自体干细胞移植的情形中，“供体”和“对象”是指同一个体。在同种异体干细胞移植的情形中，“供体”和“对象”是指不同个体。然而，在本领域技术人员显而易见的某些情形中，“对象”可以与“供体”互换使用，用于指称接受本文中描述的造血干细胞动员剂、或造血干细胞动员剂的组合，以备随后收获并移植到需要这样的造血干细胞的对象中的个体。
在某些实施方式中，在所述对象中动员所述造血干细胞以备自体移植。在某些实施方式中，在所述对象中动员所述造血干细胞以备同种异体移植。在某些实施方式中，选择对单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，选择对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，选择对G-CSF和普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的所述对象。
在某些实施方式中，所述对象是显现出恶性血液肿瘤的患者。在某些实施方式中，所述恶性血液肿瘤选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。
在某些实施方式中，所述对象是显现出非恶性疾病的患者。在某些实施方式中，所述非恶性疾病选自骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。
一方面，本发明提供了一种在需要治疗的对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病的方法，所述方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)将来自于所述供体的动员的循环外周血干细胞移植到需要外周血干细胞移植的对象中。
在某些实施方式中，所述两种或更多种动员剂的组合被配制成组合物。在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物、硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物、降低ΕXΤ1的水平或活性的药剂和降低VCAM-1的水平或活性的药剂。在某些实施方式中，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述方法包括向所述对象给药选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式的细胞因子。
在某些实施方式中，动员的造血干细胞包含CD34+外周血干细胞。在某些实施方式中，所述方法包括在移植到所述对象中之前从所述供体收获所述CD34+外周血干细胞。在某些实施方式中，收获所述动员的造血干细胞包括血液成分单采术。在某些实施方式中，所述两种或更多种动员剂的组合向所述供体的给药与所述血液成分单采术操作在同一天进行。在某些实施方式中，所述血液成分单采术操作在所述两种或更多种动员剂的组合的给药的1小时内进行。
在某些实施方式中，所述方法包括在所述外周血干细胞移植之前对需要所述外周血干细胞移植的对象进行调制，以备移植的外周血干细胞的植入。在某些实施方式中，调制包括向所述对象给药包含i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的造血干细胞，以备随后移植的外周血干细胞在所述被调制的对象的干细胞巢中的植入。
在某些实施方式中，在所述外周血干细胞移植之前不向所述对象实施化疗或放疗治疗。在某些实施方式中，所述供体和所述对象是同一个体。在某些实施方式中，所述供体和所述对象是不同个体。在某些实施方式中，选择对单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员的供体和/或对象。在某些实施方式中，选择对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员的供体和/或对象。在某些实施方式中，选择对G-CSF和普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的供体和/或对象。
在某些实施方式中，所述对象是显现出恶性血液肿瘤的患者。在某些实施方式中，所述恶性血液肿瘤选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。在某些实施方式中，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的用于所述恶性血液肿瘤的常规治疗。
在某些实施方式中，所述对象是显现出非恶性疾病的患者。在某些实施方式中，所述非恶性疾病选自骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。在某些实施方式中，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的用于所述非恶性疾病的常规治疗。
一方面，本发明提供了一种选择会从使用包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合的造血干细胞重新动员获益的对象的方法，所述方法包括鉴定对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，其中对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，是会从使用包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合的造血干细胞重新动员获益的对象。
在某些实施方式中，所述方法包括向所述对象给药所述两种或更多种动员剂的组合，以在所述对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物、硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物、降低ΕXI1的水平或活性的药剂和降低VCAM-1的水平或活性的药剂，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。
一方面，本发明提供了一种对对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入的方法，所述方法包括向对象给药包含i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽造血干细胞，以备随后移植的干细胞在所述对象的干细胞巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的干细胞的植入。在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物、硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物、降低EXT1的水平或活性的药剂和降低VCAM-1的水平或活性的药剂，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。
一方面，本发明提供了一种包含两种或更多种动员剂的组合物，其包含i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂，以及ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者。在某些实施方式中，所述组合物包括选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式的细胞因子。在某些实施方式中，所述组合物包括至少一种化疗药剂。在某些实施方式中，所述组合物包括至少一种用于恶性血液肿瘤的常规治疗，所述恶性血液肿瘤选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。在某些实施方式中，所述组合物包括至少一种用于非恶性血液肿瘤的常规治疗，所述非恶性血液肿瘤选自骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。在某些实施方式中，所述组合物可用于动员造血干细胞到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对普乐沙福和单独的G-CSF中的一种或多种的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于对对象进行调制以备移植的干细胞的植入。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞从干细胞巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将造血干细胞从干细胞巢动员到外周血中。在某些实施方式中，所述两种或更多种动员剂的组合被配制成用于皮下给药。在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物、硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物、降低EXT 1的水平或活性的药剂和降低VCAM-1的水平或活性的药剂。在某些实施方式中，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。
一方面，本发明提供了一种鉴定造血干细胞动员剂的方法，所述方法包括：(a)提供试验药剂；以及(b)评估所述试验药剂模仿包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和(ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者的、两种或更多种动员剂的组合的造血干细胞动员效果的能力。在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物和硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。
一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)两种或更多种动员剂的组合，所述组合包含(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂，和(ii)CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂中的至少一者；以及(b)说明书，其用于指导向对象给药所述两种或更多种动员剂的组合以实现下列一种或多种效果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)对对象进行调制以备移植的干细胞的植入；和(iv)在所述对象中治疗需要干细胞移植的疾病。在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物和硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述试剂盒包括用于将动员的外周血干细胞移植到所述对象中的一种或多种医疗装置。
一方面，本公开提供了一种在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括向对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地将造血干细胞和/或祖细胞动员到所述对象的外周血中。
在某些实施方式中，动员干细胞和/或祖细胞(例如造血的)的方法还包括向所述对象给药选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(1L-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式的细胞因子。
在某些实施方式中，所述动员的造血干细胞包含CD34+外周血干细胞。
在某些实施方式中，所述方法还包括收获所述CD34+外周血干细胞。
在某些实施方式中，收获所述动员的干细胞包含血液成分单采术，例如与向所述对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合在同一天进行的血液成分单采术。
在某些实施方式中，所述选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合的给药在所述对象中动员了一定量的循环外周血干细胞，足以在单次血液成分单采术中收获约1x106/kg体重至10x106/kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，所述选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合的给药在所述对象中动员了一定量的循环外周血干细胞，足以在单次血液成分单采术中收获约2x106/kg体重至8x106/kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，所述选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合的给药在所述对象中动员了一定量的循环外周血干细胞，足以在单次血液成分单采术中收获约3x106/kg体重至6x106/kg体重之间的细胞剂量。
在某些实施方式中，所述方法还包括对需要干细胞移植的对象进行调制，以备移植的干细胞的植入。在某些实施方式中，调制所述对象包括向所述对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地耗尽被调制的对象的干细胞巢中的造血干细胞，以备随后移植的干细胞在所述被调制的对象的干细胞巢中的植入。在某些实施方式中，调制所述对象包括向所述对象给药包含选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合的组合物，其量有效地耗尽被调制的对象的干细胞巢中的干细胞，以备随后移植的干细胞在所述被调制的对象的干细胞巢中的植入。在某些实施方式中，所述方法还包括向所述对象给药至少一种化疗药剂。在某些实施方式中，在不使用化疗的情况下对所述对象进行调制以备植入。在某些实施方式中，在不使用辐照的情况下对所述对象进行调制以备植入。在某些实施方式中，在不衰减基质细胞的情况下对所述对象进行调制以备植入。在某些实施方式中，在不向所述对象给药G-CSF的情况下对所述对象进行调制以备植入。
在某些实施方式中，所述方法还包括将收获的外周血干细胞移植到需要这种移植的对象中。
在某些实施方式中，在所述对象中动员所述造血干细胞以备自体移植。在某些实施方式中，在所述对象中动员所述造血干细胞以备同种异体移植。
在某些实施方式中，选择对一种或多种药剂例如单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，选择对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，选择对G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象。
在某些实施方式中，所述对象是显现出恶性血液肿瘤的患者。在某些实施方式中，所述恶性血液肿瘤选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。
在某些实施方式中，所述对象是显现出非恶性疾病的患者。在某些实施方式中，所述非恶性疾病选自骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。
另一方面，本公开提供了一种收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的方法，所述方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备在对象中移植。
在某些实施方式中，所述循环外周血干细胞包含CD34+外周血干细胞。
在某些实施方式中，收获所述外周血干细胞包含血液成分单采术，并且所述造血干细胞动员和血液成分单采术在同一天进行。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约2x106/kg至10x106/kg受体体重之间的细胞剂量。
在某些实施方式中，收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的方法还包括对需要外周血干细胞移植的对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入，所述调制如下进行：向待调制的对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地耗尽被调制的对象的干细胞巢中的造血干细胞，以备随后移植的外周血干细胞在所述被调制的对象的干细胞巢中的植入。在某些实施方式中，在不使用化疗或放疗的情况下对所述对象进行调制以备植入。
在某些实施方式中，收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的方法还包括将所述收获的外周血干细胞移植到需要这种移植的对象中。
在某些实施方式中，在所述对象中动员所述造血干细胞以备自体移植。在某些实施方式中，在所述对象中动员所述造血干细胞以备同种异体移植。
在某些实施方式中，选择对一种或多种药剂例如单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，选择对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，选择对G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象。
在某些实施方式中，所述对象是显现出恶性血液肿瘤的患者。在某些实施方式中，所述恶性血液肿瘤选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。
在某些实施方式中，所述对象是显现出非恶性疾病的患者。在某些实施方式中，所述非恶性疾病选自骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。
在某些情况下，本公开提供了一种对对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入的方法，所述方法包括：(a)向对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽造血干细胞，以备随后移植的外周血干细胞在所述对象的干细胞巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入。
在某些实施方式中，所述方法还包括向所述对象给药选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式的细胞因子。在某些实施方式中，不向所述对象给药选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式的细胞因子。
在某些实施方式中，在不使用化疗或放疗的情况下对所述对象进行调制以备植入。
在某些实施方式中，所述方法还包括将CD34+外周血干细胞移植到需要这种移植的对象中。
在某些实施方式中，所述对象是显现出恶性血液肿瘤的患者。在某些实施方式中，所述恶性血液肿瘤选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。
在某些实施方式中，所述对象是显现出非恶性疾病的患者。在某些实施方式中，所述非恶性疾病选自骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。
在某些情况下，本公开提供了一种在需要治疗的对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病的方法，所述方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)将动员的循环外周血干细胞从所述供体移植到需要外周血干细胞移植的对象中。
在某些实施方式中，动员的造血干细胞包含CD34+外周血干细胞。
在某些实施方式中，所述方法还包括在移植到所述对象中之前从所述供体收获所述CD34+外周血干细胞。
在某些实施方式中，收获动员的造血干细胞包括血液成分单采术。在某些实施方式中，选自所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、所述至少一种CXCR2激动剂和所述至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合向所述供体的给药，与所述血液成分单采术操作在同一天进行。
在某些实施方式中，所述血液成分单采术操作在选自所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、所述至少一种CXCR2激动剂和所述至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合的给药的1小时内进行。
在某些实施方式中，所述方法还包括在所述外周血干细胞移植之前对需要所述外周血干细胞移植的对象进行调制，以备移植的外周血干细胞的植入。
在某些实施方式中，调制包括向所述对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的造血干细胞，以备随后移植的外周血干细胞在所述被调制的对象的干细胞巢中的植入。
在某些实施方式中，在所述外周血干细胞的移植之前不向所述对象实施化疗或放疗治疗。
某些实施方式中，所述供体和所述对象是同一个体。在某些实施方式中，所述供体和所述对象是不同个体。在某些实施方式中，选择对单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员的供体和/或对象。在某些实施方式中，选择对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员的述供体和/或对象。在某些实施方式中，选择对G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的供体和/或对象。
在某些实施方式中，所述对象是显现出恶性血液肿瘤的患者。在某些实施方式中，所述恶性血液肿瘤选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。
在某些实施方式中，所述方法还包括向所述对象施用治疗有效量的用于所述恶性血液肿瘤的常规治疗。
在某些实施方式中，所述对象是显现出非恶性疾病的患者。在某些实施方式中，所述非恶性疾病选自骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。
在某些实施方式中，所述方法还包括向所述对象施用治疗有效量的用于所述非恶性疾病的常规治疗。在某些情况下，本公开提供了一种选择会从使用选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合的造血干细胞重新动员获益的对象的方法，所述方法包括鉴定对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，其中对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，是会从使用选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合的造血干细胞重新动员获益的对象。
在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物、硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物、降低EXT 1的水平或活性的药剂和降低VCAM-1的水平或活性的药剂，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂选自普乐沙福或其类似物或衍生物和
Figure BDA0003138711700000231
或其类似物或衍生物。
在某些情况下，对对象进行调制以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种CXCR2激动剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽造血干细胞以备随后移植的干细胞在所述对象的干细胞巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，对对象进行调制以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽造血干细胞以备随后移植的干细胞在所述对象的干细胞巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，对对象进行调制以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药Gro-β或其类似物或衍生物，其量有效地从所述对象的骨髓巢耗尽造血干细胞以备随后移植的外周血干细胞在所述对象的骨髓巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入。
在某些情况下，对对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入的方法包括向对象给药Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽造血干细胞以备随后移植的干细胞在所述对象的干细胞巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，对对象进行调制以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药普乐沙福或其类似物或衍生物，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽造血干细胞以备随后移植的干细胞在所述对象的干细胞巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，对对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入的方法包括向对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽造血干细胞以备随后移植的干细胞在所述对象的干细胞巢中的植入，由此对所述对象进行调制以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，本公开提供了一种组合物，其包含选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合。
在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，选自所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、所述至少一种CXCR2激动剂和所述至少一种CXCR4拮抗剂的所述两种或更多种动员剂的组合选自小的有机或无机分子，糖类，寡糖，多糖，选自肽、蛋白质、肽类似物和衍生物的生物大分子，肽模拟物，选自siRNA、shRNA、反义RNA、核酶和适体的核酸，从选自细菌、植物、真菌、动物细胞和动物组织的生物材料制造的提取物，天然存在或合成的组合物，及其任何组合。
在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，选自所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、所述至少一种CXCR2激动剂和所述至少一种CXCR4拮抗剂的所述两种或更多种动员剂的组合被配制成用于皮下给药。
在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、所述至少一种CXCR2激动剂和所述至少一种CXCR4拮抗剂选自小的有机或无机分子，糖类，寡糖，多糖，选自肽、蛋白质、肽类似物和衍生物的生物大分子，肽模拟物，选自siRNA、shRNA、反义RNA、核酶和适体的核酸，从选自细菌、植物、真菌、动物细胞和动物组织的生物材料制造的提取物，天然存在或合成的组合物，及其任何组合。
在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种CXCR2激动剂是Gro-β或其类似物或衍生物。在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种CXCR2激动剂是Gro-βΔ4或其类似物或衍生物。在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物、硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物、降低EXT 1的水平或活性的药剂和降低VCAM-1的水平或活性的药剂。在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物。在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物和
Figure BDA0003138711700000261
或其类似物或衍生物。在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种CXCR2激动剂是Gro-β或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，所述至少一种CXCR2激动剂是Gro-β或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂是
Figure BDA0003138711700000262
或其类似物或衍生物。
在本发明的这种以及其他情况的某些实施方式中，本文中描述的组合物或方法还包括细胞因子或向对象给药细胞因子，所述细胞因子选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式。
在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对普乐沙福和单独的G-CSF中的一者或多者的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于调制对象以备移植的干细胞的植入。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞从所述干细胞巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将造血干细胞从所述干细胞巢动员到外周血中。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供CXCR2蛋白或其功能性片段；(b)提供试验药剂；以及(c)测定所述试验药剂激动(agonize)所述CXCR2蛋白或其功能性片段的能力，其中激动所述CXCR2蛋白或其功能性片段的试验药剂是候选的造血干细胞动员剂。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供CXCR4蛋白或其功能性片段；(b)提供CXCR4结合配偶体；(c)提供试验药剂；以及(d)测定所述试验药剂抑制所述CXCR4结合配偶体与所述CXCR4蛋白或其功能性片段结合的能力，其中抑制所述CXCR4结合配偶体与所述CXCR4蛋白或其功能性片段结合的试验药剂是候选的造血干细胞动员剂。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供试验药剂；以及(b)评估所述试验药剂模仿选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合的造血干细胞动员效果的能力。
在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物和硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂选自普乐沙福或其类似物或衍生物和
Figure BDA0003138711700000271
或其类似物或衍生物。
在某些情况下，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(a)选自(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、(i)至少一种CXCR2激动剂和(iii)至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合；以及(b)说明书，其用于指导向对象给药所述选自(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、(ii)至少一种CXCR2激动剂和(iii)至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合以实现下列一种或多种效果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)对对象进行调制以备移植的干细胞的植入；和(iv)在所述对象中治疗需要干细胞移植的疾病。
在某些实施方式中，选自所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、所述至少一种CXCR2激动剂和所述至少一种CXCR4拮抗剂的所述两种或更多种动员剂的组合选自小的有机或无机分子，糖类，寡糖，多糖，选自肽、蛋白质、肽类似物和衍生物的生物大分子，肽模拟物，选自siRNA、shRNA、反义RNA、核酶和适体的核酸，从选自细菌、植物、真菌、动物细胞和动物组织的生物材料制造的提取物，天然存在或合成的组合物，及其任何组合。
在某些实施方式中，所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂选自硫酸肝素或其类似物或衍生物和硫酸鱼精蛋白或其类似物或衍生物，所述至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，并且所述至少一种CXCR4拮抗剂选自普乐沙福或其类似物或衍生物和
Figure BDA0003138711700000281
或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含用于将所述选自所述至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、所述至少一种CXCR2激动剂和所述至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种动员剂的组合移植到所述对象中的一种或多种医疗装置。
附图简述
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图1A、1B、1C和1D示出了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对于HSPC在骨髓中的保留来说是必不可少的，并且糖基转移酶基因EXT 1的缺失导致HSPC定位的逐渐改变。图1A(顶图)示出了产生图1B、1C和1D中示出的结果的实验设计的流程。图1B示出了在血液中由集落形成能力度量的造血祖细胞显著增加。图1C和1D显示了在缺失EXT 1后6个月后，骨髓中免疫分型确定的祖细胞(图1C，中图)和干细胞(图1D，右图)明显减少。这些结果代表了3个独立的实验，每个实验组使用6-10只动物。*p<0.05；**p<0.01。
图2A、2B和2C示出了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)改变VCAM-1对造血干细胞定位的活性。图2A示出了产生图2B和2C中示出的结果的实验设计的流程。图2B和1C显示，VCAM-1诱导的动员依赖于Ext 1/硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，正如由集落形成单位测定法(图2B，左下图)和竞争性重建测定法(图2C，右下图)所示。这些结果代表了两个独立实验，每个实验组使用5只动物。**p<0.05；***p<0.01；ns＝不显著的。
图3A、3B和3C示出了硫酸肝素与内源HSPG竞争并能够动员功能上强有力的HSC。图3A(顶图)示出了产生图3B和3C中示出的结果的实验设计的流程。图3B显示，肝素显著增强G-CSF诱导的动员，正如通过连续竞争性移植所测量的(左下图)。图3C显示，由G-CSF与肝素的组合所实现的增强的动员依赖于完整的内源HSPG(右下图)。这些结果代表了三个独立实验，每个实验组使用6-10只动物。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图4示出了通过将硫酸乙酰肝素抑制剂与AMD3100组合获得的显著高效的干细胞动员。将来自于用单剂单独的AMD3100(5mg/kg)或AMD3100加上肝素(100U/小鼠)或硫酸鱼精蛋白(40mg/kg)处理的动物的血液用于被进行过致死辐射的同类系寄主的移植，并标出了植入的供体细胞的相对频率。1处的线＝单独的AMD3100。结果来自于6-10只动物/组。
图5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K和5L证实了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖控制HPSC定位。图5A是描绘了实验设计的示意性概述。图5B-5J涉及在pIpC诱导后24周收集的数据。图5B和5C是示出了骨髓分析结果的条形图，显示出对髓系定向祖细胞(共同髓系祖细胞(CMP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)和巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP))和淋巴系定向祖细胞(CLP)(图1B)以及对KLS CD48-CD150+HSC(图5C)的贡献。图5D是条形图，示出了骨髓KLSCD48-CD150+细胞群体中的凋亡。图5E是条形图，示出了骨髓KLS CD48-CD150+HSC的细胞周期分析的结果，描述了在细胞周期的G0、G1和S-G2-M期中的细胞的百分率。图5F是条形图，示出了外周血白细胞(WBC)计数。图5G是示出了外周血分析的条形图，描绘了在嵌合小鼠中在甲基纤维素中通过集落形成单位测定法(CPU)测量的循环祖细胞的数量。图5H-K是示出了脾脏分析结果的条形图，描绘了总重量(mg)(图5H)，对KLS 48-CD150+HSC的贡献(图5I)，对CMP、GMP和MEP细胞的贡献(图5J)，以及用来自于对照或突变嵌合小鼠(CD45.1)的脾细胞与同等数量的WT CD45.2脾细胞相竞争输注至受体C57BL/6J(CD45.2)小鼠，所述小鼠在移植后16周的相对PB重建(图5K)。图5L示出了对照(n＝8)和突变(n＝4-5)小鼠的股骨密质骨(顶图)和松质骨(底图)的代表性的三维微型CT图像。数据代表了至少3个独立实验，每个实验每种基因型n＝5-8只小鼠。数据被表示成平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01。
图6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I、6J、6K、6L、6M、6N、6O、6P、6Q、6R、6S、6T、6U、6V和6W证实了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖控制造血干细胞/祖细胞定位。图6A-6C描绘了对BM Mx1+间充质细胞中Ext 1缺失的评估。图6A是示意图，描绘了如何将对照和突变小鼠繁育成ROSA26-loxP-stop-loxP-EYFP(Rosa-YFP)品系，以便于将来分离CD45-Ter119-Mx1+细胞。图6B示出了Ext 1在来自于对照和突变小鼠(每种基因型n＝3)的离体扩增的BM CD45-Ter119-Mx1+(YFP+)细胞中的蛋白质印迹，示出了Gapdh作为载样对照。图6C是条形图，示出了通过测量Ext 1条带相对于Gapdh条带的光密度而进行的定量。图6D-F是条形图，描绘了在来自于对照和突变小鼠的离体扩增的(图6D)和新鲜分离的(图6E)BM CD45-Ter119-Mx1+BM细胞中HS水平的定量。图6F是描绘了骨髓分析的条形图，示出了对对照和突变小鼠中CD45-Ter119-Mx1+CD105+CD140+Sca1+间充质干细胞的贡献。图6G-6K示出了在移植后6至8周pIpC诱导之前，嵌合的Ext 1对照和突变小鼠的外周血造血参数的分析，显示了供体细胞群体(CD45.1)的频率(图6G)、白细胞(WBC)计数(图6H)、红细胞(RBC)计数(图6I)、血小板(PLT)计数(图6J)以及对B细胞(B220)、髓细胞(Mac 1和Gr1)和T细胞(CD3)的贡献(图6K)。图6L-6S描绘了在pIpC诱导后24周嵌合的Ext 1对照和突变小鼠的分析。图6L是示出了总体重(TBW)(g)的条形图。图6M和6N是示出了骨髓分析的条形图，显示了受体小鼠中的总BM细胞构成(图6M)以及对B细胞(B220)、髓细胞(Mac1和Gr 1)和T细胞(CD3)的贡献(图6N)。图6O-6Q是描绘了外周血分析的条形图，显示了对受体小鼠中的B细胞(B220)、髓细胞(Mac 1和Gr 1)和T细胞的贡献(CD3)(图60)，血小板计数(PLT)(图6P)和红细胞计数(RBC)(图6Q)。图6R和6S是描绘了脾脏驻留的KLS CD48-CD150+HSC分析的图，示出了细胞周期分析(图6R)；示出对照和突变嵌合小鼠中处于细胞周期的G0、G1和S-G2-M期的细胞和凋亡(图6S)。图6T是条形图，示出了用来自于对照或突变嵌合小鼠(CD45.1)的脾细胞与同等数量的WTCD45.2脾细胞相竞争输注至受体C57BL/6J(CD45.2)小鼠，所述小鼠在移植后16周的PB重建，显示出对B细胞(B220)、髓细胞(Mac 1和Gr 1)和T细胞(CD3)的贡献。图6U是条形图，示出了在pIpC诱导后24周，嵌合对照和突变小鼠中CD62Low循环中性粒细胞的分布。图6V是条形图，示出了在pIpC诱导后24周，对照和突变嵌合小鼠的BM中Cxcl 12蛋白的水平。图6W示出了在pIpC诱导后24周，来自于嵌合的Ext 1对照和突变小鼠的股骨的代表性的苏木精和曙红染色。放大倍数：上图4X，下图40X。除非另有指明，否则数据代表了至少2个独立实验，每个试验每种基因型n＝5-8只小鼠。数据被表示成平均值±SD或中值±IQR(四分位距)，ns：不显著的；*p<0.05；**p<0.01。
图7A、7B、7C、7D、7E、7F和7G证实了硫酸乙酰肝素调节Vcam 1依赖性HSPC粘附。图7A和7B描绘了HSC在BM腔内的相对定位。图7A显示，对照和突变小鼠被繁育成在Col2.3启动子下表达GFP来标记成骨细胞的品系。图7B示出了在移植后24小时，LKS CD48-CD150+HSC距Col2.3GFP细胞(左图)和骨内膜表面(右图)的以μm为单位的距离。图7C和7D描绘了在Mx1+细胞中巢相关分子的表达。图7C示出了Vcaml、Cxcl12、Angpt1和Scf1的实时PCR结果。图7D是来自于对照和突变小鼠的BM CD45-Ter119-Mx1+细胞中Vcam l蛋白水平的代表性柱状图。图7E、7F和7G描绘了Mx-1+细胞中Vcam 1的功能评估。图7E是实验设计的示意概述。图7F示出了在用G-CSF和Vcam l中和抗体注射的对照和突变小鼠的外周血中通过CFU-C测定法测量的循环祖细胞的数量。图7G示出了在用来自于用G-CSF和Vcam 1中和抗体或同种型对照动员的对照或突变小鼠的150μl外周血输注的受体小鼠中，移植后16周的总外周血重建。CD45.1 BM细胞以相等的量移植到对照和突变小鼠中以提供放射保护。数据代表了至少2个独立实验，每个试验每种基因型n＝5-8只小鼠。在动员实验中，PB从每个实验组至少5只小鼠收集。数据被表示成平均值±SD。ns：不显著的；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图8A、8B、8C和8D进一步证实了硫酸乙酰肝素调节Vcam 1依赖性HSC粘附。图8A示出了用同等数量的DiD标记的HSC(红色)注射的对照和突变小鼠的骨髓腔的代表性图片；蓝色，二次谐波产生信号(骨骼)；绿色，Col2.3GFP(成骨细胞)。标尺条，100μm。图8B示出了在来自于对照和突变Ext 1小鼠的CD45-Ter119-Mx1+间充质细胞中Cxcl12蛋白水平的定量。图8C示出了在来自于对照和突变Ext 1小鼠的CD45-Ter119-Mx1+间充质细胞中Vcam 1蛋白水平的定量。图8D示出了来自于接受Vcam l中和抗体或同种型对照的Ext 1对照或突变小鼠的通过集落形成单位测定法(CFU)测量的外周血循环祖细胞的定量。除非另有陈述，否则数据代表了至少2个独立实验，每个实验每种基因型n＝5-8只小鼠。数据被表示成平均值±SD。ns：不显著的；*p<0.05；**p<0.01。
图9A、9B、9C、9D、9E、9F、9G、9H、9I、9J、9K、9L和9M证实了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的药理学抑制诱导HSPC动员。图9A是实验设计的示意概述。图9B是示出了在接受G-CSF或G-CSF加上肝素的C57BL6/J(CD45.2)小鼠中外周血WBC计数的图。图9C示出了移植到被致死性辐照过的CD45.1同类系受体中的来自于C57BL/6J(CD45.2)的G-CSF或G-CSF加上肝素动员的PB的全供体(CD45.2)重建。在两个组中以相等的量移植CD45.1 BM细胞以提供放射保护。X-轴中的中断表示在被致死性辐照过的受体中的连续BM移植。图9D-9F示出了在G-CSF(n＝1)或G-CSF加上肝素(n＝2)诱导的动员后，在来自于PB的FACS分拣的HSPC(Lin-，cKit+，Sca1+)中差异表达的基因的簇集，示出了细胞粘附基因(图9D)、细胞增殖基因(图9E)和生长调节基因(图9F)的变化。蓝色和黄色分别表示更高和更低的表达。图9G-9H示出了G-CSF或G-CSF加上肝素动员的PB在被致死性辐照过的受体中的非竞争性移植，显示了嗜中性粒细胞(图9G)和血小板恢复(图9H)。图9I示出了移植到被致死性辐照过的CD45.1同类系受体中的来自于Ext 1突变小鼠的G-CSF或G-CSF加上肝素动员的PB的全供体(CD45.2)重建。在两个组中以相等的量移植CD45.1 BM细胞以提供放射保护。图9J示出了用来自于接受G-CSF和肝素或G-SCF和水蛭素的C57BL/6J小鼠(CD45.2)的PB输注的受体CD45.1小鼠在移植后16周的相对PB重建。受体小鼠被致死性辐照过并接受CD45.1细胞以提供放射保护。图9K-9L描绘了用来自于非糖尿病或糖尿病的对照和突变小鼠(总共4组)(图9K)的G-CSF动员的PB或来自于非糖尿病和糖尿病的C57BL/6J小鼠(图9L)的G-CSF加上肝素动员的PB输注的受体小鼠在移植后16周的相对PB重建。为了移植，使用被致死性辐照过的CD45.1动物作为受体。以同等的数量使用CD45.1 BM以提供放射保护。图9M显示出Vcam 1抑制废止肝素诱导的动员。通过集落形成单位测定法(CFU)来测量接受介质、AMD3100、或单独的或与肝素组合的Vcam 1中和抗体的动物的外周血循环祖细胞。数据代表了至少2个独立实验，每个实验每种基因型n＝5-8只小鼠。在动员实验中，从每个实验组的至少5只小鼠收集PB。数据被表示成平均值±SD或中值±IQR(四分位距)，ns：不显著的；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图10A、10B、10C、10D和10E进一步证实了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的药理学抑制诱导HSPC动员。图10A示出了在接受介质(PBS)或肝素的C57BL/6J小鼠中的外周血WBC计数。图10B示出了在接受介质(PBS)或肝素的C57BL/6J小鼠中通过集落形成单位测定法(CFU)测量的外周血循环祖细胞。图10C是CFU测定法的代表性图像，示出了来自于接受介质、AMD3100、或单独的或与肝素组合的Vcam 1中和抗体的C57BL/6J小鼠的PB循环祖细胞集落。图10D示出了在来自于接受介质(PBS)或肝素的C57BL/6J小鼠的CD45-Ter119-Mx1+间充质细胞中Vcam 1蛋白水平的定量。图10E示出了用来自于接受单独的或与AMD3100组合的G-CSF的Ext1对照或突变小鼠(CD45.2)的PB输注的受体CD45.1小鼠的移植后16周的相对PB重建。受体小鼠被致死性辐照过并接受CD45.1细胞以提供放射保护。
图11A、11B和11C证实了Mx1+间充质细胞控制移植的HSPC的植入。图11A是示出了用106和8x106个CD45.1同类系BM细胞输注的未调制的对照小鼠和用106、4x106和8x106个CD45.1同类系BM细胞输注的突变受体小鼠的全PB重建。图11B是示出了在将8x106个CD45.1同类系BM细胞非调制移植到EXT-1突变受体小鼠中之后16周的PB分析的条形图，示出了对B细胞(B220)、髓细胞(Mac 1和Gr 1)和T细胞(CD3)的贡献。图11C是为在巢中表达的EXT-1/HSPG的功能作用提出的模型的示意图。每种基因型n＝5只小鼠。数据被表示成平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01。
发明详述
本公开涉及干细胞和/或祖细胞(例如造血干细胞和/或祖细胞)的动员，以与干细胞移植联合使用。简单来说，干细胞移植方法可以包括下列任何或所有步骤：将动员剂注射到对象(例如供体)中，将对象的干细胞从骨髓空间动员到对象的血液中，从血液收集动员的干细胞(例如通过血液成分单采术)，制备收集的干细胞以备储存(例如在输液袋中)，将收集和储存的动员的干细胞冷冻保存，调制对象以备待移植的储存的动员的干细胞的植入，将干细胞移植到调制过的对象中，以及植入和恢复，正如由对象中嗜中性粒细胞和血小板的绝对计数增加所证实的。(参见《造血干细胞动员和血液成分单采术：护士和其他联合卫生护理专业人员实践指南》，血液与骨髓移植欧洲组-护士组(Haematopoietic StemCell Mobilization and Apheresis:A Practical Guide for Nurses and Other AlliedHealth Care Professionals,European Group for Blood and MarrowTransplantation-Nurses Group)，其内容通过参考并入本文)。
本公开设想了与干细胞移植中涉及的任何操作联合使用的方法、组合物、药剂和试剂盒，例如动员干细胞的方法、收获动员的用于移植的干细胞的方法、保存收获的动员的干细胞以备随后移植的方法、调制对象以备移植的干细胞的增强的植入的方法、治疗需要干细胞移植的疾病的方法、选择用于干细胞动员的对象的方法，以及在所述方法中使用的组合物、药剂和试剂盒。
动员HSPC
本发明的某些方面涉及动员造血干细胞和/或祖细胞的方法。当在本文中使用时，“动员”和“动员造血干细胞和/或祖细胞”可互换使用，是指诱导造血干细胞和/或祖细胞从第一位置(例如干细胞巢，例如骨髓)迁移到第二位置(例如组织(例如外周血)或器官(例如脾脏))中的作用。本文描述的工作证实了硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)参与维持造血干细胞和/或祖细胞在骨髓干细胞巢中的保留。具体来说，本发明人令人吃惊且出人意料地证实，外生骨疣蛋白-1(GeneID：2131，EXT-1，也被称为EXT、LGS、TTV、LGCR和TRPS2)这种硫酸乙酰肝素生产所必需的糖基转移酶基因的缺失，引起造血干细胞和/或祖细胞从骨髓流出。令人吃惊且出人意料地，本发明人进一步证实了硫酸乙酰肝素(例如内源的)的抑制(例如药理学的)，即使在其中的动员抗性(mobilization resistance)原本应该引起不良动员的情形中，也增强造血干细胞和/或祖细胞动员。
本文公开的某些方面依赖于本文中描述的引人注目的工作，所述工作证实了至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合，与单独使用或与普乐沙福组合使用的G-CSF的造血干细胞和/或祖细胞动员相比，在动员造血干细胞和/或祖细胞方面明显更加有效。因此，在某些方面，本公开提供了涉及使用至少一种CXCR2激动剂(例如Gro-β)和至少一种CXCR4拮抗剂(例如普乐沙福)来动员造血干细胞和/或祖细胞的方法和组合物。
本文公开的某些方面依赖于本文中描述的引人注目的工作，所述工作证实了G-CSF与至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂的组合，与单独使用G-CSF的造血干细胞和/或祖细胞动员相比，在动员造血干细胞和/或祖细胞方面明显更加有效。因此，在某些方面，本公开提供了涉及使用G-CSF与至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂(例如硫酸肝素)的组合来动员造血干细胞和/或祖细胞的方法和组合物。
本文公开的某些方面依赖于本文中描述的引人注目的工作，所述工作证实了至少一种CXCR4拮抗剂与至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂的组合，与单独使用普乐沙福的造血干细胞和/或祖细胞动员相比，在动员造血干细胞和/或祖细胞方面明显更加有效。因此，在某些方面，本公开提供了涉及使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂(例如硫酸肝素)与至少一种CXCR4拮抗剂(例如普乐沙福)的组合来动员造血干细胞和/或祖细胞的方法和组合物。
因此，本发明提供了在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的各种不同方法。
一方面，在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法包括向对象给药有效量的在所述对象中抑制外生骨疣蛋白1(EXT-1)的水平或活性的药剂，由此在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞。一方面，在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法包括向对象给药有效量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂，由此在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法的某些方面总的来说涉及使用至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF中的两者或更多者的组合。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的示例性方法包括向对象给药选自至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的任两种或更多种动员剂的组合，其量足以将造血干细胞和/或祖细胞动员到外周血中。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的另一种示例性方法包括向对象给药至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地将造血干细胞和/或祖细胞动员到对象的外周血中。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的另一种示例性方法包括向对象给药与G-CSF或至少一种CXCR4拮抗剂组合的至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂，其量有效地将造血干细胞和/或祖细胞动员到对象的外周血中。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的另一种示例性方法包括向对象给药与至少一种CXCR4拮抗剂组合的至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂，其量有效地将造血干细胞和/或祖细胞动员到对象的外周血中。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的另一种示例性方法包括向对象给药与至少一种CXCR2激动剂组合的至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂，其量有效地将造血干细胞和/或祖细胞动员到对象的外周血中。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的另一种示例性方法包括向对象给药与至少一种CXCR2激动剂组合的至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂，其量有效地将造血干细胞和/或祖细胞动员到对象的外周血中。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的另一种示例性方法包括向对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR4拮抗剂和至少一种CXCR2激动剂的组合，其量有效地将造血干细胞和/或祖细胞动员到对象的外周血中。
在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的另一种示例性方法包括向对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种CXCR2激动剂和G-CSF的组合，其量有效地将造血干细胞和/或祖细胞动员到对象的外周血中。
本发明的某些方面涉及在表现出干细胞和/或祖细胞动员病的个体中增强造血干细胞和/或祖细胞动员。令人吃惊且出人意料地，本文中描述的工作证实了本文中描述的药剂在克服糖尿病诱导的动员病方面有效。因此，不希望受到理论限制，据信本文中描述的药剂可用于在表现出造血干细胞和/或祖细胞动员病的个体中增强造血干细胞和/或祖细胞动员。正如本领域技术人员将会认识到的，在表现出造血干细胞和/或祖细胞动员病的个体中增强造血干细胞和/或祖细胞的动员具有各种不同的有用应用，例如在对象中动员细胞以备随后的收获和移植，或调制对象以备随后的植入，或其组合等。
一方面，本发明提供了一种在表现出造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员的方法，所述方法包括向对象给药有效量的抑制EXT-1的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员。一方面，本发明提供了一种在表现出糖尿病诱导的造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员的方法，所述方法包括向对象给药有效量的抑制EXT-1的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员。
一方面，本发明提供了一种在表现出造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员的方法，所述方法包括向对象给药有效量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员。一方面，本发明提供了一种在表现出糖尿病诱导的造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员的方法，所述方法包括向对象给药有效量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂，由此在所述对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员。
在某些实施方式中，在表现出造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象中增强造血干细胞和/或祖细胞动员的方法包括选择表现出造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象。选择表现出造血干细胞和/或祖细胞动员病的对象可以按照专业技术人员可以获得的任何技术来进行。例如，可以选择对常规动员剂(例如G-CSF)表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，所述对象是患有被报道诱导动员病的疾病、病症或障碍例如糖尿病的对象。用于选择表现出动员病的对象的其他适合技术对于专业技术人员来说是显而易见的。
当在本文中使用时，“造血干细胞”是指可以分化成造血谱系并产生所有血液细胞类型例如白细胞和红细胞，包括髓系(例如单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜曙红粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(例如T-细胞、B-细胞、NK-细胞)的干细胞。“干细胞”由它们的形成多种细胞类型的能力(多能性)和它们自我更新的能力来确定。造血干细胞可以例如通过细胞表面标志物例如CD34-、CD133+、CD48-、CD150+、CD244-、cKit+、Scal+和谱系标志物的缺失(对B220、CD3、CD4、CD8、Mac1、Gr1和Ter119等阴性)来鉴定。鉴定和分析造血干细胞的方法已被Challen等综述(参见例如“小鼠造血干细胞鉴定和分析”(Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification andAnalysis)，Cytometry A.2009；75(1):14-24，以其全部内容通过参考并入本文)。本文中描述的方法设想了对于移植有用的任何干细胞，包括但不限于外周血干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、遗传修饰的干细胞等)。
当在本文中使用时，术语“造血祖细胞”涵盖了已定向到造血细胞谱系，一般不自我更新，并且能够分化成造血***的数种细胞类型例如粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞、B-细胞和T-细胞的多能性细胞，包括但不限于短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞(MPP)、共同髓系祖细胞(CMP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)、巨核细胞-红细胞祖细胞(MRP)和淋巴系定向祖细胞(CLP)。造血祖细胞的存在可以在完全甲基纤维素测定法中作为集落形成单位细胞(CFU-C)在功能上确定，或通过使用本领域技术人员已知的测定法检测细胞表面标志物(例如CD45-、CD34+、Ter119-、CD16/32、CD127、cKit、Sca 1)在表型上确定。
一般来说，动员造血干细胞和/或祖细胞的方法能够动员其中由硫酸乙酰肝素蛋白聚糖负责维持造血干细胞和/或祖细胞在它们的细胞巢中的粘附的任何造血干细胞和/或祖细胞。在某些实施方式中，动员的造血干细胞包含KLS-CD150+CD48-细胞。在某些实施方式中，动员的造血干细胞包含CD34-CD133+细胞。在某些实施方式中，动员的造血干细胞和/或祖细胞包含共同髓系祖细胞。在某些实施方式中，动员的造血干细胞和/或祖细胞包含粒细胞/单核细胞祖细胞。在某些实施方式中，动员的造血干细胞和/或祖细胞包含巨核细胞/红系祖细胞。在某些实施方式中，动员的造血干细胞和/或祖细胞包含淋巴系定向祖细胞。在某些实施方式中，动员的造血干细胞和/或祖细胞包含共同髓系祖细胞、粒细胞/单核细胞祖细胞、巨核细胞/红系祖细胞的组合。在某些实施方式中，造血祖细胞包含CD150-CD48-CD244+细胞。在某些实施方式中，造血祖细胞包含CD150-CD48+CD244+细胞。在某些实施方式中，造血祖细胞包含Lin-SCA-1-c-Kit+CD34+CD 16/32mid细胞。在某些实施方式中，造血祖细胞包含lin-SCA-1-c-kit+CD34-CD 16/32low细胞。
本发明设想了出于专业技术人员希望的任何目的而动员造血干细胞和/或祖细胞。本领域技术人员将会认识到，造血干细胞和/或祖细胞的动员提供了可以收获(例如通过血液成分单采术)用于移植的造血干细胞和/或祖细胞的更加容易获得的来源，例如通过增加外周血中造血干细胞和/或祖细胞的数量。在某些实施方式中，所述方法包括收获在所述对象中动员的干细胞和/或祖细胞。在某些实施方式中，所述方法包括将收获的干细胞和/或祖细胞移植到需要这种移植的对象中。在某些实施方式中，收获在对象中动员的造血干细胞和/或祖细胞以备在所述对象中自体移植。在某些实施方式中，收获在所述对象中动员的造血干细胞和/或祖细胞以备在受体对象中同种异体移植。在某些实施方式中，本文描述的方法可用于对利用常规造血干细胞和/或祖细胞动员方案(例如G-CSF)的不良动员做出响应来动员造血干细胞和/或祖细胞。
在某些实施方式中，本文中描述的方法包括向对象给药选自重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式的细胞因子。在某些实施方式中，本文中描述的方法包括向对象给药G-CSF或其糖基化或聚乙二醇化形式与肝素的组合。
在某些实施方式中，在对象中动员造血干细胞和/或祖细胞来调制对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入，例如通过减少移植的细胞可以植入其中的干细胞巢(例如骨髓)中的造血干细胞和/或祖细胞的数量。
本文公开的本发明方法(例如动员造血干细胞和/或祖细胞的方法)的多个方面涉及收获动员的干细胞(例如CD34+和/或CD133+外周血干细胞)。因此，在某些情况下，本公开提供了收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的方法。收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的示例性方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药选自至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂和至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
在某些实施方式中，收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药选自至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
在某些实施方式中，收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药选自至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的两种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
在某些实施方式中，收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药选自至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的三种或更多种动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的另一种示例性方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的另一种示例性方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的另一种示例性方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
收获外周血干细胞以备在需要这种细胞的对象中移植的另一种示例性方法包括：(a)向外周血干细胞供体给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)从所述供体收获动员的循环外周血干细胞以备移植到对象中。
应该认识到，上面对于收获、调制和移植的描述同样适用于这里描述的收获方法的情况。
本公开设想了使用任何适合的收获和/或收集动员的干细胞的方法。在某些实施方式中，收获动员的造血干细胞和/或祖细胞包括血液成分单采术。本文中描述的工作证实了至少一种CXCR2激动剂(例如Gro-β或Gro-βΔ4)与至少一种CXCR4拮抗剂(例如普乐沙福或
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)的组合快速高效地动员干细胞，并且与G-CSF和普乐沙福(单独或组合的)相比表现出提高的效率。结果，在某些实施方式中，本文中描述的方法允许在向对象给药至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的同一天进行血液成分单采术操作。在某些实施方式中，本文中描述的方法允许在向对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的同一天进行血液成分单采术操作。在某些实施方式中，本文中描述的方法允许在向对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂的同一天进行血液成分单采术操作。换句话说，可以在向对象给药动员剂的同一天在单次访问卫生护理机构期间，通过血液成分单采术从所述对象(例如供体)收获动员的干细胞。
在某些情况下，血液成分单采术操作可以在至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂给药后少至15分钟内开始。在某些实施方式中，血液成分单采术操作可以在至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂给药后少至20分钟、22分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、47分钟、52分钟、58分钟或1小时内开始。
在某些情况下，血液成分单采术操作可以在至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂给药后少至15分钟内开始。在某些实施方式中，血液成分单采术操作可以在至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂给药后少至20分钟、22分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、47分钟、52分钟、58分钟或1小时内开始。
在某些情况下，血液成分单采术操作可以在至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂给药后少至15分钟内开始。在某些实施方式中，血液成分单采术操作可以在至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂给药后少至20分钟、22分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、47分钟、52分钟、58分钟或1小时内开始。
在某些情况下，血液成分单采术操作可以在至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF给药后少至15分钟内开始。在某些实施方式中，血液成分单采术操作可以在至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF给药后少至20分钟、22分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、47分钟、52分钟、58分钟或1小时内开始。
在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约1x106kg体重至10x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约1x106kg至10x106kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约2x106kg体重至8x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约2x106kg至8x106kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约3x106kg体重至6x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约1x106kg至10x106kg受体体重之间的细胞剂量。
在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约1x106kg体重至10x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约1x106kg至10x106kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约2x106kg体重至8x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约2x106kg至8x106kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约3x106kg体重至6x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约1x106kg至10x106kg受体体重之间的细胞剂量。
在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约1x106kg体重至10x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约1x106kg至10x106kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约2x106kg体重至8x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约2x106kg至8x106kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约3x106kg体重至6x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约1x106kg至10x106kg受体体重之间的细胞剂量。
在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约1x106kg体重至10x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约1x106kg至10x106kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约2x106kg体重至8x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约2x106kg至8x106kg受体体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的给药在所述对象中动员一定量的循环外周血干细胞，以在单次血液成分单采术中收获约3x106kg体重至6x106kg体重之间的细胞剂量。在某些实施方式中，单次血液成分单采术收集足够的CD34+外周血干细胞，以获得约1x106kg至10x106kg受体体重之间的细胞剂量。
调制以备植入
本发明的某些方面涉及调制对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞(例如外周血干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、遗传修饰的干细胞等)的植入的方法。
总的来说，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法利用本文中描述的一种或多种干细胞动员剂。在某些实施方式中，本公开涉及利用本文中描述的造血干细胞动员剂调制对象以备移植的外周血干细胞的植入的方法。在某些实施方式中，本公开涉及利用本文中描述的造血干细胞动员剂调制对象以备移植的骨髓干细胞的植入的方法。在某些实施方式中，本公开涉及利用本文中描述的造血干细胞动员剂调制对象以备移植的脐带干细胞的植入的方法。在某些实施方式中，本公开涉及利用本文中描述的造血干细胞动员剂调制对象以备移植的遗传修饰的干细胞的植入的方法。在某些实施方式中，本公开涉及利用本文中描述的造血干细胞动员剂调制对象以备移植的干细胞群体的植入的方法，所述干细胞群体包含选自外周血干细胞、骨髓干细胞、外周血干细胞和遗传修饰的干细胞的干细胞的混合物。
在某些情况下，本公开提供了调制对象以备移植的干细胞的植入的方法，所述方法包括向对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的干细胞和/或祖细胞动员剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽细胞(例如干细胞和/或祖细胞)以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
一方面，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种CXCR2激动剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞和/或祖细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
另一方面，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞和/或祖细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
一方面，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞和/或祖细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
另一方面，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药Gro-β或其类似物或衍生物，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
另一方面，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
另一方面，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药普乐沙福或其类似物或衍生物，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
另一方面，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药
Figure BDA0003138711700000491
或其类似物或衍生物，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
在某些情况下，调制对象以备移植的干细胞的植入的方法包括向对象给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种CXCR2激动剂和G-CSF的两种或更多种干细胞动员剂的组合，其量有效地从所述对象的干细胞巢耗尽干细胞以备随后将移植的干细胞植入到所述对象的干细胞巢中，由此调制对象以备移植的干细胞的植入。
在某些实施方式中，被耗尽的干细胞和/或祖细胞包括造血干细胞和/或祖细胞。在某些实施方式中，所述干细胞巢包括骨髓。在某些实施方式中，所述移植的干细胞包括外周血干细胞。在某些实施方式中，所述移植的干细胞包括收获的动员的外周血干细胞(例如CD34+和/或CD133+)。在某些实施方式中，所述移植的干细胞包括外周血干细胞和/或祖细胞。在某些实施方式中，所述移植的干细胞包括收获的动员的外周血干细胞和/或祖细胞(例如CD34+和/或CD133+)。在某些实施方式中，所述移植的干细胞包括脐带干细胞和/或祖细胞。在某些实施方式中，所述移植的干细胞包括骨髓干细胞和/或祖细胞。在某些实施方式中，所述移植的干细胞包括遗传修饰的干细胞和/或祖细胞。
本文中公开的方法(例如动员造血干细胞和/或祖细胞的方法)的许多方面包括对需要外周血干细胞移植的对象进行调制以备移植的外周血干细胞的植入。当在本文中使用时，干细胞、包括扩增的造血干细胞的“植入”，意味着通过例如注射将干细胞放置在动物中，其中干细胞存留在体内。这可以通过例如造血干细胞有助于持续进行中的血细胞形成的能力容易地测量。当在本文中使用时，“调制对象以备植入”、“腾空干细胞巢”和产生“巢空缺”可以互换使用，以指称耗尽对象的干细胞巢(例如骨髓)中的细胞(例如造血干细胞和/或祖细胞)的量以备随后在所述干细胞巢中植入健康的移植的干细胞(例如外周血干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、遗传修饰的干细胞、最低限度处理的干细胞等)的过程。“巢腾空药剂”是指产生“巢空缺”的药剂。应该认识到，在本文中描述的动员剂(例如造血干细胞和/或祖细胞动员剂)被用于调制对象以备移植的干细胞的植入的情形中，动员剂也是指巢腾空药剂。本公开设想了本文中描述的药剂(例如动员剂和/或巢腾空药剂)可用于减少来自于干细胞巢(例如骨髓)的造血干细胞、CMP、GMP、MEP和/或CLP的量。本公开设想了在特定对象的治疗过程中适合的任何调制方法，以及作为移植的理想来源的任何干细胞来源。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药选自至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂的至少两种巢腾空药剂的组合，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药选自至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂、至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的至少两种巢腾空药剂的组合，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药包含至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合物，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合物，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂的组合物，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象给药包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的组合物，其量有效地耗尽所述被调制的对象的干细胞巢中的干细胞和/或祖细胞，以备随后将移植的干细胞植入到所述被调制的对象的干细胞巢中。
在某些实施方式中，被耗尽的干细胞和/或祖细胞包括造血干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞巢包括骨髓。
在某些实施方式中，调制对象包括向所述对象施加化疗或放疗疗法，以在对象的骨髓巢中杀死任何残留的癌细胞，并为将要移植并植入到对象的骨髓巢中的健康外周血干细胞腾出空间。由于由化疗或放疗造成的全身毒性作用，这样的调制在本文中被称为“毒性调制”，某些患者、特别是经历非血液恶性肿瘤疾病治疗的患者不能或不愿耐受这样的全身毒性作用。
调制患者以备植入的常规方法通常包括全身辐照和高剂量化疗，这对于未患有需要辐照或高剂量化疗作为治疗计划的一部分的恶性疾病(例如HIV和其他免疫缺陷症)的患者来说是有毒和不想要的。
与通常通过向对象施用G-CSF与化疗或放疗的组合来进行的毒性调制相反，本文中描述的利用至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂作为动员剂的方法能够在不使用化疗或放疗的情况下调制对象以备植入，因此允许非毒性调制。在某些实施方式中，本文中描述的方法利用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂作为动员剂，其能够在不使用化疗或放疗的情况下调制对象以备植入，因此允许非毒性调制。在某些实施方式中，本文中描述的方法利用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂作为动员剂，其能够在不使用化疗或放疗的情况下调制对象以备植入，因此允许非毒性调制。
与常规的细胞毒性调制方法相反，本发明提供了非毒性调制方法。具体来说，本发明人令人吃惊且出人意料地演示了在不存在细胞毒性调制的情况下将造血干细胞和/或祖细胞植入到EXT-1缺陷动物体内。不希望受到理论限制，据信例如通过EXT-1抑制或VCAM-1抑制在对象中抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，提供了调制对象以备造血干细胞和/或祖细胞的植入的有效的可替选的非毒性方法。
一方面，在不存在细胞毒性调制的情况下调制对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入的方法包括向对象给药一定量的抑制的水平或活性的药剂，以在所述对象中有效地动员造血干细胞和/或祖细胞，由此在不存在细胞毒性调制的情况下调制所述对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入。一方面，在不存在细胞毒性调制的情况下调制对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入的方法包括向对象给药一定量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂，以在所述对象中有效地动员造血干细胞和/或祖细胞，由此在不存在细胞毒性调制的情况下调制所述对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入。
在某些实施方式中，在不存在细胞毒性调制的情况下调制对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入。在某些实施方式中，在不存在化疗的情况下调制对象以备植入。在某些实施方式中，在不存在辐照的情况下调制对象以备植入。在某些实施方式中，在不存在衰减基质细胞的情况下调制对象以备植入。在某些实施方式中，在不向对象给药G-CSF的情况下调制对象以备植入。
应该认识到，本文中描述的任何调制方法也可以包括将干细胞(例如外周血干细胞例如CD34+外周血干细胞或CD133+外周血干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、遗传修饰的干细胞)移植到对象中，以备移植的细胞的植入。
移植动员的HSPC
本发明的实施方式(例如动员干细胞和/或祖细胞的方法)涉及将干细胞移植到需要这种移植的对象中。本文中公开的方法设想了将任何种类的干细胞移植到需要这种移植的对象中(例如外周血干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、遗传修饰的干细胞等)。
在某些实施方式中，本文中公开的方法(例如动员造血干细胞的方法)包括将收获的外周血干细胞移植到需要这种移植的对象中。
治疗方法
本发明的某些方面涉及需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病的治疗方法。造血干细胞和/或祖细胞(HPSC)移植对于许多造血障碍来说仍是黄金标准治愈疗法。然而，成功的HPSC移植取决于将足够的HSPC动员到循环中以备它们的收获和在患者中移植，以及高效腾空骨髓巢以备随后进行移植的HPSC的植入的能力。然而，诱导动员和腾空骨髓巢以备随后植入的常规方法苦于几个缺点。例如，当前的动员方法例如G-CSF诱导遭受动员抗性，其对于某些个体来说可能危害到挽救生命的疗法。同样地，当前的调制患者以备植入的方法通常包括全身辐照和高剂量化疗，这对于未患有需要辐照或高剂量化疗作为治疗计划的一部分的恶性疾病(例如HIV和其他免疫缺陷症)的患者来说是有毒且不想要的。因此，本文中描述的方法通过例如即使在动员抗性原本将引起不良动员(例如动员病)的情形中也提供强烈的造血干细胞和/或祖细胞动员，并且通过提供在不使用细胞毒性调制的情况下调制对象以改进造血干细胞和/或祖细胞的植入的非细胞毒性调制方法，提高了HPSC移植的安全性和效能。
一方面，在需要治疗的对象中治疗需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病的方法包括：(a)向对象给药一定量的抑制的水平或活性的药剂以有效地在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞，由此在不存在细胞毒性调制的情况下调制所述对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入；以及(b)将造血干细胞和/或祖细胞移植到所述对象中，其中移植的造血干细胞植入到对象的骨髓中，由此在所述对象中治疗需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病。一方面，在需要治疗的对象中治疗需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病的方法包括：(a)向对象给药一定量的抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂以有效地在所述对象中动员造血干细胞和/或祖细胞，由此在不存在细胞毒性调制的情况下调制所述对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入；以及(b)将造血干细胞和/或祖细胞移植到所述对象中，其中移植的造血干细胞植入到对象的骨髓中，由此在所述对象中治疗需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病。
在需要治疗的对象中治疗需要干细胞和/或祖细胞移植的疾病的示例性方法包括：(a)向干细胞和/或祖细胞供体给药选自至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种干细胞和/或祖细胞动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环干细胞和/或祖细胞；以及(b)将动员的循环干细胞和/或祖细胞从所述供体移植到需要干细胞移植的对象中。
在某些实施方式中，在需要治疗的对象中治疗需要干细胞移植的疾病的方法包括：(a)向干细胞供体给药至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地在所述供体中动员循环干细胞；以及(b)将动员的循环干细胞从所述供体移植到需要干细胞移植的对象中。
在某些实施方式中，在需要治疗的对象中治疗需要干细胞移植的疾病的方法包括：(a)向干细胞供体给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂，其量有效地在所述供体中动员循环干细胞；以及(b)将动员的循环干细胞从所述供体移植到需要干细胞移植的对象中。
在某些实施方式中，在需要治疗的对象中治疗需要干细胞移植的疾病的方法包括：(a)向干细胞供体给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂，其量有效地在所述供体中动员循环干细胞；以及(b)将动员的循环干细胞从所述供体移植到需要干细胞移植的对象中。
在某些实施方式中，在需要治疗的对象中治疗需要干细胞移植的疾病的方法包括：(a)向干细胞供体给药至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF，其量有效地在所述供体中动员循环干细胞；以及(b)将动员的循环干细胞从所述供体移植到需要干细胞移植的对象中。
在需要治疗的对象中治疗需要外周血干细胞和/或祖细胞移植的疾病的另一种示例性方法包括：(a)向外周血干细胞和/或祖细胞供体给药选自至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种干细胞和/或祖细胞动员剂的组合，其量有效地在所述供体中动员循环外周血干细胞；以及(b)将动员的循环外周血干细胞和/或祖细胞从所述供体移植到需要外周血干细胞和/或祖细胞移植的对象中。
应该理解，上面对于收获、调制和移植的描述也同样适用于这里描述的治疗方法的情况。
在某些实施方式中，治疗需要干细胞移植的疾病的方法包括向所述对象施用治疗有效量的用于恶性血液肿瘤的常规治疗。
在某些实施方式中，治疗需要干细胞移植的疾病的方法包括向所述对象施用治疗有效量的用于非恶性疾病的常规治疗。
在某些实施方式中，治疗需要外周血干细胞移植的疾病的方法包括向所述对象施用治疗有效量的用于恶性血液肿瘤的常规治疗。
在某些实施方式中，治疗需要外周血干细胞移植的疾病的方法包括向所述对象施用治疗有效量的用于非恶性疾病的常规治疗。
在某些实施方式中，治疗需要外周血干细胞移植的疾病的方法包括向所述对象施用治疗有效量的用于心脏修复或心肌病的常规治疗。其中动员的CD34+和/或CD133+细胞可用于心脏修复的示例性指征包括但不限于治疗心绞痛(例如难治性心绞痛)，在心肌缺血(例如慢性心肌缺血)中改善心功能等。
当在本文中使用时，“治疗”或“改善”当用于指称疾病、障碍或医疗病症时，是指病症的治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的发展或严重性。术语“治疗”包括减轻或缓解病症的至少一种不利效应或症状。如果一种或多种症状或临床标志减轻，治疗通常是“有效的”。或者，如果病症的发展被减轻或停止，治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且包括停止或至少减缓在不存在治疗的情况下预期的症状的发展或恶化。有益或所需的临床结果包括但不限于例如本文中描述的病症、疾病或障碍的一种或多种症状的缓解、缺陷程度的减小、状态稳定(即不恶化)，或延迟或减缓本文中描述的病症、疾病或障碍的发作，以及与不存在治疗的情况下所预期的寿命相比增加寿命。
应该认识到，与通常需要分开施用动员剂(例如G-CSF)和细胞毒性调制方法(例如化疗或放疗)的常规方法相反，本文中描述的方法、组合物和药剂的某些实施方式通过单一药剂的给药允许造血干细胞和/或祖细胞和非细胞毒性调制的双重动员，以备随后造血干细胞和/或祖细胞的植入。例如，当本文中描述的药剂被给药到对象以备自体造血干细胞和/或祖细胞移植时，药剂有效地动员造血干细胞和/或祖细胞，同时调制所述对象以备那些细胞在被收获(例如通过血液成分单采术)后的植入。
当在本文中使用时，术语“给药”或“施用”是指通过引起向作用位点的递送的方法或途径，将例如按照专业技术人员公知的技术配制成可药用组合物的本文中描述的药剂(例如抑制EXT-1的水平或活性的药剂或抑制硫酸乙酰肝素的水平或活性的药剂)放置到对象中。抑制EXT-1的水平或活性的药剂、抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂或包含这样的药剂的药物组合物，可以通过在所述对象中引起有效治疗的任何适合的途径来给药。
本发明设想了治疗与希望进行造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病、障碍或病症相关的任何疾病、障碍、病症或并发症。在某些实施方式中，本公开提供了在需要治疗的对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病的方法。这样的疾病的实例包括例如恶性血液肿瘤和血液非恶性疾病。
在某些实施方式中，所述疾病是恶性血液肿瘤。可以使用本文中描述的方法治疗的示例性的恶性血液肿瘤包括但不限于急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。在某些实施方式中，所述疾病是非恶性障碍。可以使用本文中描述的方法治疗的示例性的非恶性疾病包括但不限于骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。本公开还设想了将按照本文中描述的方法动员的细胞用于心脏修复。例如，某些动员的CD34+和/或CD133+细胞可能有助于新血管形成并促进受损的心组织的血管生成和缺血组织的再灌注。识别需要这种治疗的对象的方法描述在本文中。识别这种对象的其他适合方法对于专业技术人员来说是显而易见的。
对象
当在本文中使用时，“对象”意味着人类或动物。通常，动物是脊椎动物例如灵长动物、啮齿动物、驯养动物或竞赛动物。灵长动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。驯养和竞赛动物包括奶牛、马、猪、鹿、美洲野牛、水牛，猫科动物例如家猫，犬科动物例如狗、狐狸和狼，禽类例如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼类例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或对象包括上述的任何子集，例如所有上述动物但排除一个或多个组或物种例如人类、灵长动物或啮齿动物。在某些实施方式中，对象是哺乳动物，例如灵长动物如人类。术语“患者”、“个体”和“对象”在本文中可互换使用。优选地，对象是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。人类之外的哺乳动物可以有利地用作例如代表例如恶性血液肿瘤的动物模型的对象。此外，本文中描述的方法可用于治疗驯养动物和/或宠物。对象可以是雄性或雌性。
对象可以是以前被诊断为或鉴定为患有或具有本文中描述的需要治疗的病症、疾病或障碍(例如本文中描述的恶性血液肿瘤或非恶性疾病)或与这样的病症相关的一种或多种并发症，并且任选地但不一定已经经历用于病症或与所述病症相关的一种或多种并发症的治疗的对象。或者，对象也可以是以前尚未被诊断为具有需要治疗的病症或与这样的病症相关的一种或多种并发症的对象。优选地，对象可以包括表现出一种或多种病症风险因子或一种或多种与病症相关的并发症的对象。“需要”特定病症的治疗“的对象”可以是具有该病症、被诊断为具有该病症或相对于给定参比人群来说具有发生该病症的高风险的对象。
在某些实施方式中，本文中描述的方法包括选择被诊断患有、被怀疑患有或有风险发生恶性血液肿瘤、例如本文中描述的恶性血液肿瘤的对象。
在某些实施方式中，本文中描述的方法包括选择被诊断患有、被怀疑患有或有风险发生非恶性疾病、例如本文中描述的非恶性疾病的对象。
在某些实施方式中，本文中描述的方法包括选择被诊断患有、被怀疑患有或有风险发生糖尿病的对象。
在某些实施方式中，本文中描述的方法包括选择对动员方案做出响应表现出不良动员的对象。例如，可以对施用第一动员方案的对象进行选择，用于向其给药本文中描述的药剂以在所述对象中增强造血干细胞和/或祖细胞的动员。本发明设想了在对任何动员剂或方案做出响应表现出不良动员的对象中增强动员。在某些实施方式中，对象对粒细胞集落刺激因子(G-CSF)做出响应表现出不良动员。在某些实施方式中，对象表现出干细胞和/或祖细胞动员病。
在某些实施方式中，本文中描述的方法进一步包括选择对以前的造血干细胞动员剂给药做出响应表现出不良动员的对象。本文中描述的工作证实了至少一种CXCR2激动剂与至少一种CXCR4拮抗剂相结合给药，明显比单独的G-CSF、单独的普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药更加有效。因此，在某些实施方式中，本文中描述的方法进一步包括选择对单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员的对象。本文中描述的工作进一步证实了至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂与至少一种CXCR4拮抗剂相结合给药明显比单独的普乐沙福给药更加有效，并且至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂与G-CSF相结合给药明显比单独的G-CSF给药更加有效。因此，在某些实施方式中，本文中描述的方法进一步包括选择对单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，选择对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员的对象。在某些实施方式中，选择对G-CSF和普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象。
在这样的实施方式中，可以按照本文中描述的教示使用至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂来选择对象以备重新动员。在示例性实施方式中，选择会从使用至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的造血干细胞重新动员获益的对象的方法，包括鉴定对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，其中对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，是会从使用至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的造血干细胞重新动员获益的对象。
在这样的实施方式中，可以按照本文中描述的教示使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂来选择对象以备重新动员。在示例性实施方式中，选择会从使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂的造血干细胞重新动员获益的对象的方法，包括鉴定对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，其中对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，是会从使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂的造血干细胞重新动员获益的对象。
在这样的实施方式中，可以按照本文中描述的教示使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂来选择对象以备重新动员。在示例性实施方式中，选择会从使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂的造血干细胞重新动员获益的对象的方法，包括鉴定对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，其中对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，是会从使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂的造血干细胞重新动员获益的对象。
在这样的实施方式中，可以按照本文中描述的教示使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF来选择对象以备重新动员。在示例性实施方式中，选择会从使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的造血干细胞重新动员获益的对象的方法，包括鉴定对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，其中对选自G-CSF和普乐沙福的动员剂或方案的施用做出响应表现出不良动员的对象，是会从使用至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的造血干细胞重新动员获益的对象。
在某些实施方式中，对象是呈现有恶性血液肿瘤的患者。示例性的恶性血液肿瘤包括但不限于急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、弥散性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型结节性霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和幼年型粒单核细胞白血病。
在某些实施方式中，本文中描述的方法还包括选择被诊断患有恶性血液肿瘤的对象。可以根据表现出的症状来选择患有与恶性血液肿瘤相关的障碍的对象。例如，患有恶性血液肿瘤的对象可能显示出疲劳、萎靡、呼吸急促、虚弱、过度或容易瘀伤、牙龈出血或频繁鼻出血、反复发作的感染或发热、盗汗、体重减轻、厌食、***肿胀、由腹部器官膨大造成的肿块或腹胀、腹痛、骨痛、背痛、迷乱、谵妄、头痛、视力障碍、体液潴留、排尿减少的症状。
在某些实施方式中，本文中描述的方法还包括选择具有发生恶性血液肿瘤的风险的对象。可以根据家族史(例如，在1998-2001年间对被诊断患有淋巴瘤的患者的研究表明，具有任何恶性血液肿瘤、尤其是任何淋巴瘤的阳性家族史的个体，具有非霍奇金氏淋巴瘤的高风险；参见Mensah等，“非霍奇金氏淋巴瘤和恶性血液肿瘤的家族史”(Non-Hodgkin'slymphoma and family history of hematological malignancy)，Am J Epidemiol.2007165(2):126-33)或根据表现出的症状来选择具有发生恶性血液肿瘤的风险的对象。
在某些实施方式中，本文中描述的方法还包括选择被怀疑患有恶性血液肿瘤的对象。可以根据家族史、诊断测试(例如与白血病或淋巴瘤相关的易位)或根据表现出的症状或其组合来选择被怀疑患有恶性血液肿瘤的对象。
在某些实施方式中，对象是呈现有非恶性血液疾病的患者。示例性的非恶性血液疾病包括但不限于骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、淀粉样变性、重度再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、免疫性血细胞减少症、***性硬化症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、***性红斑狼疮、克罗恩病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、人类免疫缺陷病毒(HIV)、范科尼贫血、镰状细胞病、重型β-地中海贫血、赫尔勒综合征(MPS-IH)、肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症和其他组织细胞障碍、重症联合免疫缺陷(SCID)和威斯科特-奥尔德里奇综合征。
在某些实施方式中，本文中描述的方法还包括选择被诊断患有非恶性血液疾病的对象。可以根据表现出的症状来选择患有与非恶性血液疾病相关的障碍的对象。例如，患有镰状细胞病(例如镰状细胞贫血)的对象可能显示出周期性发作的疼痛、手脚肿胀、频繁感染和生长延迟的症状。
在某些实施方式中，本文中描述的方法还包括选择具有发生非恶性血液疾病的风险的对象。可以根据家族史(例如父/母亲具有镰状细胞病性状的儿童可能具有发生或患有镰状细胞病的风险)、起源(例如来自于非洲、印度和地中海的后裔可能具有发生镰状细胞病的较高风险)、诊断测试(例如β-珠蛋白基因中的一个或多个点突变可用于镰状细胞病和/或珠蛋白生成障碍性贫血的筛查)或根据表现出的症状来选择具有发生非恶性血液疾病的风险的对象。
在某些实施方式中，本文中描述的方法还包括选择被怀疑患有非恶性血液疾病的对象。可以根据家族史、诊断测试或根据表现出的症状或其组合来选择被怀疑患有非恶性血液疾病的对象。
在某些实施方式中，本文中描述的方法还包括选择需要心脏修复的对象。可以根据例如由急性缺血性损伤和/或慢性心肌病造成的心组织损伤史来选择需要心脏修复的对象。
组合物
本公开设想了包含本文中描述的药剂(例如造血干细胞和/或祖细胞动员剂)的组合物。在某些情况下，本公开提供了包含至少一种CXCR2激动剂的组合物。在某些情况下，本公开提供了包含至少一种CXCR4拮抗剂的组合物。在某些情况下，本公开提供了包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂的组合物。
在某些情况下，本公开提供了包含至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合物。包含至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合物可用于涉及造血干细胞动员和移植的任何应用。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对其他动员治疗响应不良或不能对其他动员治疗做出响应进行动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对单独的G-CSF和普乐沙福中的一者或多者的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于调制对象以备移植的外周血干细胞的植入。在某些实施方式中，所述组合物可用于将干细胞从干细胞巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将干细胞从干细胞巢动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞从骨髓巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将造血干细胞从骨髓巢动员到外周血中。
在某些情况下，本公开提供了包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合物。包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合物可用于涉及造血干细胞动员和移植的任何应用。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对其他动员治疗响应不良或不能对其他动员治疗做出响应进行动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对单独的G-CSF、或单独或与G-CSF组合的普乐沙福的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于调制对象以备移植的干细胞的植入。在某些实施方式中，所述组合物可用于将干细胞从干细胞巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将干细胞从干细胞巢动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞从骨髓巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将造血干细胞从骨髓巢动员到外周血中。
在某些情况下，本公开提供了包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂的组合物。包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2激动剂的组合物可用于涉及造血干细胞动员和移植的任何应用。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对其他动员治疗响应不良或不能对其他动员治疗做出响应进行动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对单独的G-CSF、或单独或与G-CSF组合的普乐沙福的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于调制对象以备移植的干细胞的植入。在某些实施方式中，所述组合物可用于将干细胞从干细胞巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将干细胞从干细胞巢动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞从骨髓巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将造血干细胞从骨髓巢动员到外周血中。
在某些情况下，本公开提供了包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的组合物。包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF的组合物可用于涉及造血干细胞动员和移植的任何应用。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对其他动员治疗响应不良或不能对其他动员治疗做出响应进行动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对单独的G-CSF、或单独或与G-CSF组合的普乐沙福的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于调制对象以备移植的干细胞的植入。在某些实施方式中，所述组合物可用于将干细胞从干细胞巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将干细胞从干细胞巢动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞从骨髓巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将造血干细胞从骨髓巢动员到外周血中。
在某些情况下，本公开提供了包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合物。包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的组合物可用于涉及造血干细胞动员和移植的任何应用。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对其他动员治疗响应不良或不能对其他动员治疗做出响应进行动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对单独的G-CSF、或单独或与G-CSF组合的普乐沙福的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于调制对象以备移植的干细胞的植入。在某些实施方式中，所述组合物可用于将干细胞从干细胞巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将干细胞从干细胞巢动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞从骨髓巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将造血干细胞从骨髓巢动员到外周血中。
在某些情况下，本公开提供了包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂和G-CSF的组合物。包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂、至少一种CXCR4拮抗剂和G-CSF的组合物可用于涉及造血干细胞动员和移植的任何应用。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对其他动员治疗响应不良或不能对其他动员治疗做出响应进行动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对单独的G-CSF、或单独或与G-CSF组合的普乐沙福的给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于调制对象以备移植的的植入。在某些实施方式中，所述组合物可用于将干细胞从干细胞巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将干细胞从干细胞巢动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物可用于将造血干细胞从骨髓巢快速动员到外周血中。在某些实施方式中，所述组合物在少至15分钟内将造血干细胞从骨髓巢动员到外周血中。
在某些情况下，组合物包含本文中描述的至少一种抑制EXT 1的水平或活性的药剂和至少一种巢腾空药剂。在某些情况下，组合物包含本文中描述的至少一种抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂(例如硫酸乙酰肝素抑制剂)和至少一种巢腾空药剂。在某些情况下，组合物包含至少一种抑制EXT 1的水平或活性的药剂和至少一种抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂。在某些情况下，组合物包含本文中描述的至少一种抑制EXT 1的水平或活性的药剂和细胞因子。在某些实施方式中，组合物包含本文中描述的至少一种抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂和细胞因子。在某些实施方式中，组合物包含至少一种抑制EXT 1的水平或活性的药剂以及CXCR2激动剂、CXCR4拮抗剂和G-CSF中的至少一者。在某些实施方式中，组合物包含至少一种抑制EXT 1的水平或活性的药剂以及CXCR2激动剂、CXCR4拮抗剂和G-CSF中的至少两者。在某些实施方式中，组合物包含至少一种抑制EXT 1的水平或活性的药剂、CXCR2激动剂、CXCR4拮抗剂和G-CSF。
鉴定方法
本公开设想了鉴定干细胞动员剂(例如造血干细胞动员剂)和调制剂的各种不同方法。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供CXCR2蛋白或其功能性片段；(b)提供试验药剂；以及(c)测定所述试验药剂激动所述CXCR2蛋白或其功能性片段的能力，其中激动所述CXCR2蛋白或其功能性片段的试验药剂是候选的造血干细胞动员剂。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供CXCR4蛋白或其功能性片段；(b)提供CXCR4结合配偶体；(c)提供试验药剂；以及(d)测定所述试验药剂抑制所述CXCR4结合配偶体与所述CXCR4蛋白或其功能性片段结合的能力，其中抑制所述CXCR4结合配偶体与所述CXCR4蛋白或其功能性片段结合的试验药剂，是候选的造血干细胞动员剂。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；(b)提供硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合配偶体；(c)提供试验药剂；以及(d)测定所述试验药剂抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合配偶体结合的能力，其中抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合配偶体结合的试验药剂，是候选的造血干细胞动员剂。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供试验药剂；以及(b)评估所述试验药剂模仿至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的造血干细胞动员效果的能力。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供试验药剂；以及(b)评估所述试验药剂模仿至少一种硫酸乙酰肝素拮抗剂和至少一种CXCR4拮抗剂的造血干细胞动员效果的能力。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供试验药剂；以及(b)评估所述试验药剂模仿至少一种硫酸乙酰肝素拮抗剂和至少一种CXCR2激动剂的造血干细胞动员效果的能力。
在某些情况下，鉴定造血干细胞动员剂的方法包括：(a)提供试验药剂；以及(b)评估所述试验药剂模仿至少一种硫酸乙酰肝素拮抗剂和G-CSF的造血干细胞动员效果的能力。
对于按照本文中描述的方法鉴定的候选造血干细胞动员剂，可以进一步评估它们调制对象以增强移植的动员的干细胞的植入的能力。
试剂盒
可以将本文中描述的药剂提供在试剂盒中。所述试剂盒包括(a)药剂，例如包括所述药剂的组合物，以及(b)信息材料。所述信息材料可以是与本文中描述的方法相关的和/或与药剂在本文中描述的方法中的使用相关的描述性、说明性、销售或其他材料。例如，所述信息材料描述了下列方法：将药剂给药到对象以在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)调制对象以备移植的外周血干细胞的植入；和(iv)在所述对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病。
在一种实施方式中，所述信息材料可以包括将药剂以适合的方式例如以适合的剂量、剂型或给药方式(例如本文中描述的剂量、剂型或给药方式)给药的说明书。在另一种实施方式中，所述信息材料可以包括用于选择适合的对象例如人类如成年人类的说明书。试剂盒的信息材料不受其形式的限制。在许多情况下，信息材料例如说明书以印刷材料例如印刷的文本、图画和/或照片例如标签或印刷单的形式提供。然而，信息材料也可以以其他格式提供，例如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录。在另一种实施方式中，试剂盒的信息材料是链接或联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、超链接、网址或电话号码，试剂盒的用户可以在那里获得关于所述调节物和/或它在本文中描述的方法中的使用的实质性信息。当然，信息材料也可以以所述格式的任何组合的形式提供。
除了药剂之外，试剂盒的组合物可以包括其他成分，例如溶剂或缓冲剂、稳定剂或防腐剂，和/或用于治疗本文中描述的病症或障碍、例如需要动员的外周血干细胞移植的疾病的第二种药剂。或者，所述其他成分可以被包含在试剂盒中，但是在与所述药剂不同的组合物或容器中。在这样的实施方式中，试剂盒可以包括将所述药剂与其他成分混合，或将所述调节剂与其他成分一起使用的说明书。
所述药剂可以以任何形式例如液体、干燥或冷冻干燥的形式提供。药剂优选地是基本上纯的和/或无菌的。当药剂以液体溶液的形式提供时，液体溶液优选为水性溶液，其中无菌水性溶液是优选的。当药剂被提供为干燥形式时，一般通过添加适合的溶剂来重构。所述溶剂例如无菌水或缓冲液可以被任选地提供在试剂盒中。
试剂盒可以包括一个或多个容器，用于包含药剂的组合物。在某些实施方式中，试剂盒含有用于药剂(例如在组合物中)和信息材料的分开的容器、分隔物(divider)或区室(compartment)。例如，药剂(例如在组合物中)可以被包含在瓶、小瓶或注射器中，信息材料可以被包含在塑料套管或袋中。在其他实施方式中，试剂盒的分开的特征件被包含在单个未被分隔的容器内。例如，药剂(例如在组合物中)被包含在附有采取标签形式的信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在某些实施方式中，试剂盒包括多个(例如一组)单独的容器，每个容器含有药剂(例如在组合物中)的一个或多个单位剂型(例如本文中描述的剂型)。例如，试剂盒包括多个注射器、安瓿、铝箔包或泡罩包装，每个含有药剂的单一单位剂量。试剂盒的容器可以是气密的和/或防水的。
可以将药剂(例如在组合物中)给药到对象例如成年对象，例如患有需要动员的外周血干细胞移植的疾病(例如恶性血液肿瘤)的对象。方法可以包括评估对象以例如获得全血计数，并由此将对象鉴定为患有恶性血液肿瘤。获得全血计数的方法对于专业技术人员来说是已知的。
在某些情况下，试剂盒包含：(a)选自(i)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂，(ii)至少一种CXCR2激动剂和(iii)至少一种CXCR4拮抗剂的两种或更多种干细胞动员剂的组合；以及(c)说明书，其用于指导将选自(i)、(ii)和(iii)的两种或更多种干细胞动员剂的组合给药到对象，以获得下列一种或多种结果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)调制对象以备移植的外周血干细胞的植入；以及(iv)在所述对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病。
在某些情况下，试剂盒包含：(a)至少一种CXCR2激动剂；(b)至少一种CXCR4拮抗剂；以及(c)说明书，其用于指导将至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂给药到对象，以获得下列一种或多种结果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)调制对象以备移植的外周血干细胞的植入；以及(iv)在所述对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病。
在某些情况下，试剂盒包含：(a)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂；(b)至少一种CXCR4拮抗剂；以及(c)说明书，其用于指导将至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂给药到对象，以获得下列一种或多种结果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)调制对象以备移植的外周血干细胞的植入；以及(iv)在所述对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病。
在某些情况下，试剂盒包含：(a)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂；(b)至少一种CXCR2拮抗剂；以及(c)说明书，其用于指导将至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2拮抗剂给药到对象，以获得下列一种或多种结果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)调制对象以备移植的外周血干细胞的植入；以及(iv)在所述对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病。
在某些情况下，试剂盒包含：(a)至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂；(b)G-CSF；以及(c)说明书，其用于指导将至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和G-CSF给药到对象，以获得下列一种或多种结果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)调制对象以备移植的外周血干细胞的植入；以及(iv)在所述对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病。
在某些情况下，试剂盒包含：(a)至少一种抑制EXT 1的水平或活性的药剂；(b)至少一种CXCR4拮抗剂；以及(c)说明书，其用于指导将至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR4拮抗剂给药到对象，以获得下列一种或多种结果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)调制对象以备移植的外周血干细胞的植入；以及(iv)在所述对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病。
在某些情况下，试剂盒包含：(a)至少一种抑制EXT 1的水平或活性的药剂；(b)至少一种CXCR2拮抗剂；以及(c)说明书，其用于指导将至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂和至少一种CXCR2拮抗剂给药到对象，以获得下列一种或多种结果：(i)在所述对象中动员造血干细胞；(ii)在对单独的G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合给药做出响应表现出不良动员的对象中重新动员造血干细胞；(iii)调制对象以备移植的外周血干细胞的植入；以及(iv)在所述对象中治疗需要外周血干细胞移植的疾病。
药剂
本发明设想了与本文中描述的方法和组合物相关的各种不同药剂的使用。具体来说，本文中描述的工作证实了通过例如抑制EXT-1的水平或活性来抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂，可被用于动员造血干细胞和/或祖细胞的方法和组合物中，并且在动员抗性原本会引起不良动员的情形中，以及在不需细胞毒性调制的情况下调制对象以备植入的非细胞毒性方法中，在动员造血干细胞和/或祖细胞方面特别有效。正如本领域技术人员将会认识到的，上述药剂可用于需要造血干细胞和/或祖细胞移植的疾病的各种不同的治疗方法中。
本文中描述的方法和组合物设想了给药“有效量”的本文中描述的药剂。当在本文中使用是，“有效地……的量”、“有效量”或“治疗有效量”可互换使用，意味着有效地动员造血干细胞和/或祖细胞以从对象的细胞巢例如从对象的骨髓流出到对象的外周血中的药剂的量。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围之内。一般来说，有效量可以随着对象的病史、年龄、状况、性别、对象中的医学病症的严重性和类型以及在恶性血液肿瘤或非恶性障碍中抑制病理过程的其他药剂的给药而变。
在某些情况下，本文中描述的药剂的给药减少对象的细胞巢(例如骨髓)中造血干细胞和/或祖细胞的量。当在本文中使用时，术语“减少”、“降低”或“抑制”在本文中一般都用于指称以统计上显著的量减少。然而，为了避免疑问，“降低”或“减少”或“抑制”意味着与参比水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％或至少约30％或至少约40％或至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％，其中所述减少小于100％。在一种实施方式中，减少包括100％的减少(例如与参比样品相比零水平)，或与参比水平相比10-100％之间的任何减少。在某些实施方式中，抑制EXT-1的水平或活性的药剂的给药，使对象的骨髓中造血干细胞和/或祖细胞的量与参比水平相比减少至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80、90％或多达100％。在某些实施方式中，抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂的给药，使对象的骨髓中造血干细胞和/或祖细胞的量与参比水平相比减少至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80、90％或多达100％。
在某些情况下，本文中描述的药剂的给药增加对象的外周血中造血干细胞和/或祖细胞的量。术语“增加”、“提高”或“激活”在本文中一般都用于指称以统计上显著的量增加；为了避免任何疑问，术语“增加”、“提高”或“激活”意味着与参比水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％或至少约30％或至少约40％或至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％，或最多并包括100％的增加或与参比水平相比10-100％之间的任何增加，或与参比水平相比增加至少约2倍或至少约3倍或至少约4倍或至少约5倍或至少约10倍，或2倍至10倍或更多倍之间的任何增加。在某些实施方式中，抑制EXT-1的水平或活性的药剂的给药，使对象的外周血中造血干细胞和/或祖细胞的量与参比水平相比增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80、90％或多达100％。在某些实施方式中，抑制EXT-1的水平或活性的药剂的给药，使对象的外周血中造血干细胞和/或祖细胞的量与参比水平相比增加至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或至少约10倍或更多倍。在某些实施方式中，抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂的给药，使对象的外周血中造血干细胞和/或祖细胞的量与参比水平相比增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80、90％或多达100％。在某些实施方式中，抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂的给药，使对象的外周血中造血干细胞和/或祖细胞的量与参比水平相比增加至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或至少约10倍或更多倍。
术语“统计上显著的”或“显著地”是指统计显著性，并且一般意味着比标志物的正常浓度低2个标准偏差(2SD)或更低。该术语是指存在差异的统计学证据。它被定义为当零假设事实上为真时做出舍弃所述零假设的决定的概率。所述决定通常使用p-值做出。
本发明设想了抑制参与造血干细胞和/或祖细胞在细胞巢(例如骨髓干细胞巢)中的持留的任何硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性。在某些实施方式中，所述药剂抑制在间充质细胞中表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性。在某些实施方式中，所述药剂抑制在骨髓间充质细胞中表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性。在某些实施方式中，所述药剂抑制在Mx1+骨骼干细胞和/或祖细胞中表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性。
本发明还设想了以任何干扰造血干细胞和/或祖细胞在细胞巢(例如骨髓)中的持留的方式抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性。应该理解，抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平或活性的药剂也可以被称为硫酸乙酰肝素抑制剂。当在本文中使用时，“硫酸乙酰肝素抑制剂”是指能够在骨髓中保留的干细胞和/或祖细胞中与内源硫酸乙酰肝素例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的水平和/或活性竞争与VCAM-1的相互作用的药剂。
在某些实施方式中，硫酸乙酰肝素抑制剂包含降低EXT-1的水平或活性的药剂。降低EXT-1的水平或活性的示例性药剂包括但不限于shRNA、miRNA、siRNA、微RNA、小分子、反义寡核苷酸和抗EXT-1抗体。针对EXT-1的shRNA被Reijmers等描述(Blood.2010；115(3):601-604)。抗EXT-1抗体是可商购的(例如从Abcam)。
硫酸乙酰肝素的示例性小分子抑制剂被Garud等描述(J Biol Chem.2008；283(43):28881-28887)。在某些实施方式中，硫酸乙酰肝素抑制剂包含糖基转移酶抑制剂。在某些实施方式中，所述硫酸乙酰肝素抑制剂是内源硫酸乙酰肝素的竞争抑制剂。这样的抑制剂的实例包括硫酸肝素、硫酸鱼精蛋白、苏尔芬及其类似物或衍生物。表现出与肝素的相似性的分子的实例包括但不限于肝素四糖、戊聚糖多硫酸酯、磷酸甘露戊糖硫酸酯和选择性的化学O-脱硫酸化肝素。可以用作至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂的肝素衍生物描述在美国专利号4,816,446中，所述专利通过参考并入本文。可以用作至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂的多硫酸酯化肝素描述在欧洲专利号EP0322659A1中，所述专利通过参考并入本文。
在某些实施方式中，至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂是降低VCAM-1的水平或活性的药剂。降低VCAM-1的水平或活性的示例性药剂包括但不限于shRNA、miRNA、siRNA、微RNA、小分子、反义寡核苷酸和抗VCAM-1抗体。在某些实施方式中，降低VCAM-1的水平或活性的药剂是Symbiopolyol。在某些实施方式中，降低VCAM-1的水平或活性的药剂是蛋白酶体抑制剂。在某些实施方式中，降低VCAM-1的水平或活性的药剂普罗布考以及普罗布考的琥珀酸酯，正如在欧洲专利号EP146639中描述的，所述专利以其全部内容通过参考并入本文。在某些实施方式中，降低VCAM-1的水平或活性的药剂是一氧化氮。VCAM-1的示例性小分子抑制剂包括在PCT国际申请公开号WO/2001/070757A2中描述的酮缩硫醇和硫醚，所述申请的内容通过参考并入本文。用于抑制VCAM-1表达的其他化合物和方法描述在美国专利号6,147,250中，所述专利的内容通过参考并入本文。抑制VCAM-1表达的其他化合物和方法可以在美国专利号6,828,447、6,548,699、6,617,352、6,660,914和7,189,870中找到。针对人类VCAM-1 RNA的示例性反义寡核苷酸可以在美国专利号5,596,090中找到，所述专利以其全部内容通过参考并入本文。
本公开设想了将至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂单独或组合地在本文描述的方法、组合物和试剂盒中用作干细胞和/或祖细胞动员剂。本公开设想了使用能够抑制硫酸乙酰肝素、激动CXCR2或拮抗CXCR4并动员干细胞的任何药剂。可以在本文描述的方法、组合物和试剂盒中用作至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂、至少一种CXCR2激动剂和至少一种CXCR4拮抗剂的药剂的示例性类型包括小的有机或无机分子，糖类，寡糖，多糖，选自肽类、蛋白质、肽类似物和衍生物的生物大分子，肽模拟物，选自siRNA、shRNA、反义RNA、核酶和适体的核酸，从选自细菌、植物、真菌、动物细胞和动物组织的生物材料制造的提取物，天然存在的或合成的组合物，及其任何组合。
在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂是趋化因子Gro-β或其类似物或衍生物。Gro-β的示例性形式是人类Gro-β多肽(GenBank登记号：AAP13104)。示例性的Gro-β类似物或衍生物是脱氨基Gro-β蛋白(也被称为MIP-2α)，其包含成熟的gro-S蛋白在其N端处2位和8位氨基酸之间截短的氨基酸序列，正如在PCT国际申请公开号WO/1994/029341中所描述的，所述申请以其全部内容通过参考并入本文。另一种Gro-β类似物或衍生物是在美国专利号6,413,510中描述的二聚体修饰的Gro-β蛋白，所述专利以其全部内容通过参考并入本文。另一种示例性的Gro-β类似物或衍生物是SB-251353，一种参与指导干细胞和其他白细胞移动的Gro-β类似物，正如被Bensinger等所描述的(Bone Marrow Transplantation(2009),43,181-195，通过参考并入本文)。
在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂是Gro-βΔ4或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物。
在某些实施方式中，至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，至少一种CXCR4拮抗剂是
Figure BDA0003138711700000791
或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，至少一种CXCR4拮抗剂选自普乐沙福或其类似物或衍生物和
Figure BDA0003138711700000792
或其类似物或衍生物。普乐沙福的示例性类似物包括但不限于AMD11070、AMD3465、KRH-3955、T-140和4F-苯甲酰基-TN14003，正如由De Clercq,E.所描述的(Pharmacol Ther.2010 128(3):509-18，以其全部内容通过参考并入本文)。
在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂是Gro-β或其类似物或衍生物，并且至少一种CXCR4拮抗剂是普乐沙福或其类似物或衍生物。
在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂是Gro-β或其类似物或衍生物，并且至少一种CXCR4拮抗剂是
Figure BDA0003138711700000801
或其类似物或衍生物。
在某些实施方式中，至少一种CXCR2激动剂选自Gro-β或其类似物或衍生物和Gro-βΔ4或其类似物或衍生物，并且至少一种CXCR4拮抗剂选自普乐沙福或其类似物或衍生物和
Figure BDA0003138711700000802
或其类似物或衍生物。
任何适合的给药途径可被用于将本文中描述的药剂给药到对象。对于药物递送策略的详尽综述，参见Ho等，Curr.Opin.Mol.Ther.(199),1:336-3443；Groothuis等，J.NeuroVirol.(1997),3:387-400；以及Jan，《药物递送***：技术和商业机会》(Drug DeliverySystmes:Technologies and Commercial Opportunities)，Decision Resources,1998，所述文献的内容通过参考并入本文。
药剂可以被配制在可药用组合物中，所述组合物包含与一种或多种可药用载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起的治疗有效量的药剂。
制剂可以方便地以单位剂型形式出现，并且可以通过药学领域中公知的任何方法来制备。技术、赋形剂和配方一般可以在例如《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences),Mack Publishing Co.,Easton,Pa.1985，第17版，Nema等，PDAJ.Pharm.Sci.Tech.1997 51:166-171中找到。
本文中描述的药剂可以与其他药物活性剂组合给药到对象。示例性的药物活性剂包括但不限于在下述文献中发现的药物活性剂：《Harrison内科学原理》(Harrison'sPrinciples of Internal Medicine)，第13版，T.R.Harrison等主编，McGraw-Hill N.Y.,NY；《医生桌面参考》(Physician's Desk Reference)，第50版，1997,Oradell New Jersey,Medical Economics Co.；《治疗学的药理基础》(Pharmacological Basis ofTherapeutics)，第8版，Goodman和Oilman，1990；《美国药典》(United StatesPharmacopeia)，The National Formulary,USP XII NF XVII,1990，所有上述文献的完整内容通过参考并入本文。在某些实施方式中，所述药物活性剂是用于恶性血液肿瘤的常规治疗。在某些实施方式中，所述药物活性剂是用于非恶性疾病的常规治疗。专业技术人员将能够根据他们的专业技能、知识和经验，使用上面提到的参考文献来选择用于治疗任何特定恶性血液肿瘤或非恶性疾病的适合的常规药物活性剂。
在某些实施方式中，所述药物活性剂是造血干细胞动员剂。在某些实施方式中，所述造血干细胞动员剂是细胞因子。与本文中描述的药剂(例如硫酸乙酰肝素抑制剂)联合使用的示例性的细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)及其糖基化或聚乙二醇化形式。
在某些实施方式中，所述造血干细胞动员剂是化疗药剂(例如CY、紫杉醇、依托泊苷)。在某些实施方式中，所述造血干细胞动员剂是EPO。在某些实施方式中，所述造血干细胞动员剂是干细胞因子。在某些实施方式中，所述造血干细胞动员剂是TPO。在某些实施方式中，所述造血干细胞动员剂是甲状旁腺激素。
在某些实施方式中，所述药物活性剂是化疗药剂。示例性的化疗药剂包括但不限于长春碱、多柔比星、博来霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、环磷酰胺和顺铂。其他适合的化疗药剂对于专业技术人员来说是显而易见的。
一些定义
除非在本文中另有定义，否则与本申请相结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员所通常理解的意义。此外，除非上下文另有需要，否则单数术语将包括复数形式并且复数术语将包括单数形式。
当在本文中使用时，术语“包含”被用于指称对本发明来说必不可少的组合物、方法及其相应的组分，但也是开放性的，包括未指定的要素，不论其是否必需。
当在本文中使用时，术语“基本上由……构成”是指给定实施方式需要的要素。该术语允许存在不实质性影响本发明的该实施方式的基本和新颖或功能性特征的其他要素。
术语“由……构成”是指本文中描述的组合物、方法及其相应的组分，其排除了在所述实施方式的描述中没有叙述的任何要素。
除了在操作实例中之外或除非另有指明，否则表示在本文中使用的成分的量或反应条件的所有数字，应该被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。术语“约”当与百分率相结合使用时，可能意味着±1％。
单数术语包括复数指称物，除非上下文明显指明不是如此。同样地，“或”打算包括“和”，除非上下文明显指明不是如此。尽管与本文中描述的相似或等效的方法和材料可用于本公开的实践或试验，但适合的方法和材料描述在本文中。术语“包含”意味着“包括”。缩写“e.g.”源自于拉丁语exempli gratia，在本文中被用于指示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。
实施例
实施例1-降低调制的毒性以降低实现用于HIV/AIDS的HSC移植疗法的障碍
造血干细胞(HSC)移植是HIV表观治愈的一个已知的基本原理。在强烈化疗后同种异体CCR5-/-造血移植在其中提供了持久的不可检测到HIV的状态的“柏林患者”，为基于干细胞的方法提供了强烈论据1。最近，已报道用同种异体移植治疗的两位其他患者在移植后8和17个月时具有不可检测的HIV病毒载荷(摘要′I′HΑΑ0101，XIXInternational AIDSConference,Washington,DC；2012年7月22-27日)。此外，已在临床试验中试验了使用遗传修饰的HSC提高HIV抗性。2(以及未报道的Systemix赞助的多中心试验，研究人员为DTS)。利用新兴基因修饰策略例如TALEN和锌指核酸酶的多项尝试专注于产生HIV抗性的自体HSC，其为将干细胞移植用作产生能够靶向HIV储库的HIV抗性免疫***的手段提供了更大的机会3。这些方法如果成功的话，能够提供长久控制或根除HIV的手段而不需终生使用抗反转录病毒疗法。这样的结果将具有大量明显的益处，但实现这种结果需要在移植中取得相当大的进展，以降低毒性、复杂性和成本。
移植之前的调制通常通过给药高剂量的化疗和/或与辐照相结合来实现，以便耗尽受体骨髓内的造血细胞。这些传统调制方法通常阻碍了在未患有危及生命的恶性疾病的患者中使用HSC移植，显著减少了可能从HSC移植获益的患者的数量。非清髓性调制缩减方案将治愈性HSC移植极大地扩展到更广泛的疾病，尤其是HIV。以前使用非清髓性调制实现HSC植入的尝试已证实，在没有明显全身毒性的情况下选择性靶向和消除HSC允许免疫***的几乎完全的替换。然而，这些方法或者使用小鼠特异性抗体试剂4，或者合并有低剂量的辐照5。能够引起HSC从骨髓外流的CXCR4拮抗剂AMD3100的使用，或者不进行调制重复地输注干细胞已经实现了适当水平的嵌合状态，但却尚未被扩展到临床实践，这部分是由于植入的水平不良6。需要其他的策略。有鉴于到目前为止移植的成功，在基因修饰技术中正取得的进展和终生抗反转录病毒化疗的令人生畏的挑战，降低将干细胞疗法用于HIV/AIDS的障碍似乎是非常有理由的。我们在这里讨论的方法可以潜在地导致基因修饰的自体细胞或同种异体细胞更快速地进入到更广泛的临床试验。
干细胞疗法用于HIV的问题并不是新的，事实上我们和其他人在过去已进行了一系列临床前和临床研究7-10。这些研究聚焦于HSC是否感染有HIV(我们发现它们没有7)，以及带有限制HIV复制的遗传构建物的反转录病毒转导的细胞是否可以被成功地移植到HIV感染的个体中。此外，我们进行了关于在患有AIDS相关淋巴瘤的患者中使用HSC移植的多中心试验，证实了它可以被实现并且持久地影响深层的恶性肿瘤9。然而，对于没有恶性肿瘤的HIV感染的个体来说，毒性令人望而却步。发现实现遗传修饰的或CCCR5-/-HSPC的高效植入的新手段，将在目前对潜在治愈性方法的应用的限制性障碍周围引入创新方法。
我们计划用于实现植入的改进的具体手段，涉及许多新发现和构建物，这些构建物利用了本发明人关于糖基转移酶EXT 1在HSPC在骨髓中的保留中的作用的新发现，以试验腾空骨髓巢的新的、低成本、低毒性的手段。这些允许腾空巢的尝试都基于新的药剂或新的生物学，并且代表了各自有潜力用于临床应用的新方法。具体来说，这些尝试使用了许多已获FDA批准用于新用途的化合物，允许正面发现的快速转化。
作为跨越使用HSC移植作为HIV/AIDS的治愈性治疗模式的一个关键障碍，即毒性调制，的手段，我们继续试验了缩减的调制方法以实现对HSC巢具有最低毒性和损伤的HSC植入。我们的方法为输注的细胞成功地与内源干细胞竞争以实现植入提供了机会。具体来说，我们将机械地组合不同的动员剂，所述动员剂已知靶向参与HSC在骨髓中的保留的不同分子，不损害巢但引起高效动员。这种方法随后可以允许输注的细胞与内源细胞竞争。我们旨在不需目前正在使用的高毒性、非靶向调制方案，为输注的细胞提供竞争优势。本文中描述的工作为HSC移植受体的新的调制策略建立了概念证明。改进的调制方案将限制急性免疫抑制和脱靶组织损伤，并潜在地解决了限制将HSC移植用于患有非恶性血液和免疫疾病HIV/AIDS的患者的问题中的至少一个问题。
实施例2-通过操作CXCR2和CXCR4的没有巢毒性的巢腾空
临床前数据表明，CXCR2激动剂可能在作用动力学和被动员的细胞的质量两方面优于当前的医疗标准。这项计划的目的是试验现有的GSK CXCR2激动剂Gro-β与CXCR4抑制剂
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的组合，将结果与当前用于动员、植入的医疗标准进行比较，并作为非毒性调制方案。将动物用G-CSF、普乐沙福(例如
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)、Gro-β或其他动员剂的各种不同组合进行处理，并试验它们诱导HSC动员的能力。分析被动员的细胞的体外和体内功能性能力以及在被辐照小鼠中提高存活率和造血恢复的能力。通过功能测定法、免疫组织化学和转录组学对细胞进行表征，以帮助确定动员的干细胞群体中的变化。
潜在影响是鉴定某些药物，所述药物可以显著增加有资格进行HSC移植的患者数量，降低健康和自体供体两者的与G-CSF相关的发病率，提高供体尽管预期减少的寿命中的生活质量，以及能够通过减毒或无毒调制潜在地增加HSC移植作为患有非恶性疾病的患者或需要基因治疗的患者的挽救生命的药物的使用。由于正在III期临床试验中积极探索动员的CD34+细胞作为缺血性心脏病的治疗剂，这种快速动员策略还具有在非造血指征中使用的潜力。
目前，造血干细胞(HSC)移植对于许多恶性血液疾病来说是唯一的治愈性治疗模式。然而，与移植相关的发病率和死亡率仍然高，并且只有一部分能够从HSC移植获益的患者实际上接受了这种移植。降低这些固有的风险具有极大增加每年的移植患者数量的潜力。
用于移植的HSC的来源包括骨髓、脐带血或动员的外周血。在稳态条件下，HSC和HPC驻留在骨髓巢中，而由这些群体产生的成熟细胞离开骨髓进入外周。基于在化疗后的患者中发现HPC增加这一观察，HSC和HPC的自然外流是可以被提高的变成已知。造血生长因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在临床上被广泛用于动员HSC和HPC以备移植。G-CSF动员的外周血干细胞(PBSC)与相比于骨髓更快速的植入、更短的住院时间(1-4)以及某些情况下更高的总体存活率(5)相关。动员的成年人HSC和HPC现在被广泛用于自体和同种异体移植。
尽管是成功的，但对改进的HSPC动员剂仍存在显著的医疗需求，这是因为G-CSF方案涉及重复的皮下注射，这通常与骨痛(一种通常严重且令人虚弱的并发症)、恶心、头痛和疲劳的发病率相关(6-9)。它们可能破坏生活方式，在正常志愿者中具有高的自愿撤出百分率，并且对于正忍受癌症化疗的严酷的患者来说特别令人痛苦。此外，在少量正常供体人群中，G-CSF也与严重毒性相关。尽管是成功的，但在15％的正常健康供体中发生对G-CSF响应的不良动员。没有获得足够数量的CD34+细胞的患者通常需要超过一次的血液成分单采术操作(18-20)。多达60％的患者不能动员对于自体移植来说最适的CD34+细胞数量，需要高剂量化疗的串联循环(25-27)。这对于患有需要扩展的血液成分单采术(29)并包含最大的移植受体组的淋巴瘤和多发性骨髓瘤(28)的患者来说，特别成问题。这些问题提供了动员HSPC的可选替方法可以在其中具有高度影响的背景。
已显示，小分子CXCR4拮抗剂普乐沙福(AMD3100)解决了单独使用G-CSF时动员不良的问题(32-35)，并且现在已被FDA批准与G-CSF组合用于在患有非霍奇金氏淋巴瘤或多发性骨髓瘤并且使用GCSF时失败的患者中动员PBSC。然而，即使在普乐沙福给药后仍有显著部分的患者不能动员足够的数量，其中约33％的患者报告了腹泻或注射位点反应。尽管普乐沙福加上G-CSF已对在这些患者中动员HSC的能力产生明显影响，但对于可替选的药剂来说仍存在相当多的临床机会。克服了下述问题的药剂将是特别有吸引力的：1)对多次每日注射G-CSF的需求，这引起相当大的骨痛和其他不想要的效应；2)在使用现有动员剂的一部分患者和志愿者中多变和次优的动员；以及3)需要的血液成分单采术操作的总数和不能预测最适动员时间。
试验动员剂的效能得到临床效能的清晰终点的帮助。已经确立了用于充分动员的临床靶。>3x106/kg的CD34+细胞剂量与同种异体移植受体中降低的发病率和死亡率相关(21)。高达10x106/kg的更高CD34+细胞剂量据报道引起更快速的植入、更低的发病率和更好的存活率(22)，特别是对于患有具有高复发风险的疾病的患者来说(23,24)。因此，度量动员方案的成功的参数准备就绪。尽管这个提案的首要焦点是开发用于造血干细胞收获的现有疗法的药理学替代物，但对于我们打算探索的临床影响仍存在其他机会。从巢中动员内源干细胞的药剂可以引起巢腾空，能够使移植的细胞植入。由于已知的对干细胞巢的不利效果，G-CSF在这种功能中受限，但可替选的方法可能不同样地受限。如果这种功能可以被优化，在不使用细胞毒性的化疗或辐照的情况下“调制”受体以备干细胞植入的可能性将是可能的。由于对治疗非恶性疾病镰状细胞贫血、先天性免疫缺陷、存储缺陷和HIV的兴趣，这样的结果对于临床团体来说越来越有趣。确定新的动员剂是否可以在没有细胞毒性的情况下实现植入，是动员研究的延伸并具有重要的潜在影响。
实施例3-通过操作CXCR2和最近确定的HSC与骨髓巢之间的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用增强没有巢毒性的巢腾空
HSPC的巢保留部分地通过SDF-1与其在HSPC上的同源受体CXCR4的相互作用来维持。在临床上，CXCR4拮抗剂AMD3100被FDA批准与G-CSF相组合用于增强HSPC从骨髓外流到外周，以备通过血液成分单采术收获和随后的移植。尽管这种组合明显腾空骨髓巢，但G-CSF引起基质巢细胞的显著衰减18。当目的仅仅是干细胞收获时，这几乎没有后果，但是当考虑到腾空巢以便能够在低毒性调制背景中使竞争细胞植入时，它是成问题的。这可能是G-CSF在这种情形中不成功的原因；它降低巢对输注的和内源细胞的支持能力。因此，导致HSPC腾空巢并同时维持巢的完整性的策略，对于缩减的调制策略来说是优选的。本文中描述的工作设想了使用两种这样的方法的组合来确定是否可以发生足够的动员，以便在不破坏巢的情况下能够使移植的细胞植入。
CXCR-2激动剂GRO-β是能够快速动员HSPC的药剂，并引起长期再生性(repopulating)HSC的动员，与G-CSF相比具有优越的植入潜力19。由于这种药剂激活MMP-9，它具有与G-CSF或AD3100完全不同的推测的作用机制。它急性地激活MMP-9，在小鼠中到输注后15分钟为止最大地动员HSPC。与G-CSF不同，通过免疫组织化学发现动员与骨髓形态的变化无关(数据未示出)。它是起到巢腾空剂作用的出色候选物。我们最近还已经鉴定到新发现的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)参与HSC在骨髓中的保留，可以在药理学上对其进行操作以诱导在功能上与被G-CSF动员的细胞不同的细胞的干细胞动员。这一过程是涉及使用肝素和AMD3100的过程，并且使用可以快速转移到临床试验的得到批准的药剂实现稳固的动员。
假设细胞外基质蛋白起到骨髓巢的关键要素的作用，已证实骨桥蛋白发挥这样的作用20,21。此外，我们试验了HSPG是否发挥作用，因为已知它们在发育中在局部组织中产生多种其他细胞因子和形态发生素的梯度22,23。为了评估这一点，我们检查了编码硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的产生所必需的糖基转移酶的基因EXT 1的条件缺失的影响24。我们通过将带有条件等位基因的小鼠与在Mx1启动子控制下表达Cre重组酶的小鼠杂交，做到了这一点。在造血细胞中Mx1可以由聚(I)/聚(C)诱导，并且我们最近显示，在骨谱系间充质干细胞/祖细胞中也是如此25。为了排除EXT 1对造血细胞的直接影响，在通过移植制造成嵌合型的动物上进行了下述研究：这些动物的造血***是WT，而微环境是EXT1 fl/fl(KO)或+/+(对照)。
通过Cre的条件激活然后在1-6个月内评估血液、骨髓和脾脏，评估了嵌合动物的微环境中EXT 1的缺失对造血的影响(图1)。血液中集落形成单位(CFU)的数量显著增加(p<0.01)(左图)，并伴有骨髓中髓系祖细胞(中图)和HSC(右图)的逆向减少(p<0.05)。
调查这种效应的潜在基础，我们发现骨髓的骨谱系细胞中VCAM-1的表达被IHC降低(数据未示出)，并通过动员研究试验了VCAM-1的功能作用(图2)。我们使用了VCAM-1中和抗体(或同种型对照)与G-CSF的组合来动员细胞(示意图，上图)，并发现除了在EXT 1缺失的背景中之外，通过G-CSF加上抗VCAM-1抗体的动员是累加的(p<0.01)，正如通过集落形成单位测定法(p<0.001)和竞争性移植测定法(p<0.01)所测量的。这些数据不仅表明在由EXT1缺失引起的HSPC在骨髓中的保留的变化中，VCAM 1是参与其中的分子之一，而且支持了EXT 1缺失对G-CSF动员的与众不同的机制和EXT 1控制的HSPG在建立骨髓中干细胞的VCAM-1保留中的重要性。
假设内源HSPG可以与已知的药理学HSPG竞争，我们研究了硫酸肝素是否可以模拟EXT 1缺失对干细胞定位的影响。首先，这通过在标准的G-CSF动员方案后使用单剂硫酸肝素(100U/小鼠)，收获外周血并使用它来重建被致死性辐照过的同类系受体来完成(图3)。然后在4个月后收获第一受体，并将其用于移植被致死性辐照过的第二受体。
结果表明，硫酸肝素确实诱导了干细胞的累加动员(左下图)。在提供第二次植入时细胞显得明显更有能力(线图中断后，左下图)(p<0.001)。这些数据表明，廉价的临床上可用的硫酸肝素能够动员与单独的G-CSF相比功能不同的、可能在功能上更优越的干细胞群体。
为了试验硫酸肝素是否确实起到内源HSPG的竞争物的作用，我们检查了它在EXT1KO中提高G-CSF动员的能力，并观察到其效应的丧失(右下图)。因此，如果内源蛋白聚糖减少，硫酸肝素是无活性的；它的活性依赖于这些分子的存在，这表明它确实抑制HSPG，可能是通过与局部结合于内源HSPG的分子例如VCAM-1结合。
由于HSPG似乎控制干细胞的定位并具有特别强的二次重建能力，并且由于HSPG抑制剂可以容易地在诊所获得，因此我们试验了这种方法在希望避免巢损伤的情形中是否可能有用。我们试验了硫酸肝素或另一种临床上使用的HSPG拮抗剂硫酸鱼精蛋白单独地作为干细胞动员剂。两者单独地都不够有效(数据未示出)。因此，我们将它们与可以动员干细胞而没有与G-CSF相伴的骨内膜细胞损伤的AMD3100一起进行试验。数据表明，与单独的AMD3100(由图4中1处的线指示)相比任一种药剂都提供增强的动员效力，其中AMD3100加上硫酸肝素提供了特别的效力(提高2-6倍)(p<0.05)。
由于GRO-β、HS抑制剂和AMD3100能够从巢快速动员HSPC并靶向控制HSC定位的不同分子实体，因此这些药剂可用于最大地动员内源HSPC。
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实施例4–抑制间充质细胞硫酸乙酰肝素生产改进了干细胞动员并且能够在不使用细胞毒性调制的情况下植入
简介
糖基转移酶基因Ext 1是硫酸乙酰肝素(HS)生产所必需的，并且当在成年小鼠的间充质细胞(骨骼干细胞/祖细胞)群体中被抑制时，引起造血干细胞和祖细胞(HSPC)定位的显著变化。在Ext 1缺失后，HSPC从骨髓外流到脾脏。这与间充质细胞中改变的信号传导和由它们造成的Vcam 1生产减少相关。此外，与单独的G-CSF相比，HS的药理学抑制从骨髓动员在质量上更强效并且在数量上更多的HSPC，包括在G-CSF抗性的背景中。Ext 1缺失后内源HSPC存在的减少，与不存在宿主的任何毒性调制的情况下输注的HSPC的植入相关。因此，抑制HS生产可以为在用于非恶性病症的HSPC移植中避免辐照或化疗的毒性提供手段。
在发育中建立细胞模式对于多细胞生物所需的更高组织次序来说是基本的。形态发生素梯度在模式建立和随后的组织功能中发挥中心作用(Akiyama等，2008；Vied等，2012)，并通过与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的相互作用得以维持(Inatani等，2003)。在造血***中，HSPG在体外与关键的造血细胞因子相互作用，表明了它们在骨髓(BM)区室化中的潜在作用(Gordon等，1987；Roberts等，1988)。
我们实验室最近描述了以粘病毒抵抗蛋白1(Mx1)基因的干扰素可诱导的表达为特征的骨髓(BM)骨骼干细胞/祖细胞群体(Park等，2012)。这些细胞参与骨骼体内平衡，并与显示出是HSPC巢的组分的巢蛋白1+间充质群体部分重叠(Mendez-Ferrer等，2010)。我们假设通过与局部分泌的基质蛋白相互作用得以维持的细胞因子和形态发生素在维护造血干细胞/祖细胞(HSPC)巢中是必不可少的。为了试验这一点，我们在Mx1+间充质细胞中对硫酸乙酰肝素(HS)的合成所必需的糖基转移酶Ext 1基因进行了条件缺失(Inatani等，2003；McCormick等，1998)。
我们的数据证实，在Mx1+间充质细胞和它们的后代中表达的Ext 1/HSPG部分地通过调节血管细胞粘附分子-1、即Vcam 1来控制HSPC在BM中的定位和驻留。在糖尿病模型中，内源HS的竞争性药理学抑制提高了粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)的动员效能，包括在动员抗性的情形中。此外，动员的HSPC在被辐照的宿主中的初次和二次移植中具有提高的重建动力学。最后，在小鼠被赋予Ext-1缺陷后不久，移植的HSPC的植入在没有细胞毒性调制的情况下高效地发生。
这些发现证实了HS在骨髓造血干细胞巢中的关键作用，并且表明靶向HS或酶Ext1可以提供新的方法，用于在对于临床移植来说重要的动员或植入中获得结果。
结果
硫酸乙酰肝素控制HSPC定位
Mx1在通过Poly(I):Poly(C)(pIpC)进行干扰素诱导后表达在造血***和骨谱系的间充质细胞中(Kuhn等，1995；Park等，2012)。通过Mx 1启动子驱动的cre重组酶进行的侧翼带有LoxP的(floxed)等位基因的双等位基因缺失在造血***中非常高效(Gurumurthy等，2010)，但是在间充质区室中表征得不太充分。为了评估在pIpC给药后间充质区室中Ext1缺失的效率，将对照和突变的Ext 1小鼠与ROSA26-loxP-stop-loxP-EYFP(Rosa-YFP)报告小鼠杂交，以产生Ext 1flox/flox；Mx1 cre+；Rosa-YFP+(突变体-YFP)和Ext 1+/+；Mx1cre+；Rosa-YFP+(对照-YFP)动物(图6A)。在pIpC诱导后21天对突变和对照的YFP+,CD45-,Ter119-骨骼祖细胞进行流式细胞术分拣，并在离体扩增的细胞中通过蛋白质印迹确认了Ext 1的高效缺失(图6B和6C)。此外，在离体扩增的以及新鲜分离的Mx1+间充质细胞中检测到Ext 1缺失后HS生产的显著废止(图6D和6E)。重要的是，Ext 1的缺失不影响免疫表型确定的间充质干细胞在BM中的丰度(图6F)。
为了将Ext 1缺失限制到Mx1+骨骼祖细胞，我们将来自于表达CD45.1的同类系动物(B6.SJL)的全部BM细胞移植到被致死性辐照过的突变(Ext 1flox/flox；Mx 1cre+)或对照(Ext 1flox/flox；Mx 1cre-)小鼠(两者都在C57BL/6J背景中)中(图5A)，以产生对照和突变嵌合体。移植后6至8周，造血***被CD45.1细胞完全替换(图6G)，并且嵌合动物在外周血(PB)中表现出等同的造血参数例如白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板计数和WBC谱系分布(图6H、6I、6J和6K)。然后通过pIpC诱导在非造血细胞中缺失Ext 1，并对造血进行24周的监测。在pIpC后24周时，对照和突变嵌合小鼠两者表现出相当的总体重(TBW)和BM细胞组成(图6L和6M)。骨髓免疫表型分析揭示出突变的嵌合体中Mac1+Gr1+和CD3+细胞的比例显著降低以及B220+种群数减少的趋势(图6N)。同样地，我们在突变的嵌合小鼠的BM中发现了成熟的髓系祖细胞(共同髓系祖细胞或CMP、巨核细胞红细胞类祖细胞或MEP以及粒细胞巨噬细胞祖细胞或GMP)的比例显著降低(图5B)、共同淋巴系祖细胞(CLP)减少的趋势以及LKSCD48-CD150+造血干细胞(HSC)的比例两倍的降低(图5C)。然而，这些变化不能归因于HSC死亡的增加，也不能归因于增殖缺陷(图5D和5E)。由于在突变的嵌合小鼠中HSC的凋亡和细胞周期缺少变化，因为我们通过检查PB和脾脏评估了HSPC的错误定位。在24周的时间过程中，突变的嵌合体发生显著的白细胞增多(图5F)(其中PB中淋巴系和髓系细胞的数量显著增加(图6O))和中度血小板减少并具有正常的红细胞(RBC)计数(图6P和6Q)。此外，PB集落形成测定法(CFU-C)显示突变的嵌合小鼠中循环祖细胞的显著增加(图5G)。
在pIpC注射后24周，突变嵌合体具有明显更大的脾脏(图5H)。脾脏的免疫表型表征揭示出在这些小鼠中HSC(图5I)、CMP和GMP而不是MEP的比例实质性提高(图5J)。这种HSC在脾脏中的积累不能归因于它们的增殖提高或对细胞死亡的抗性(图6R和6S)。此外，来自于突变的嵌合小鼠的脾细胞与同等数量的来自于C57BL/6J小鼠的脾细胞的竞争性移植，揭示出与来自于对照嵌合体的脾细胞相比显著且长期的竞争性优势(图5K)。在这个移植研究中，来自于对照和突变嵌合体的HSC对血液细胞谱系的贡献是等同的(图6T)。
已将HSPC的错误定位与嗜中性粒细胞周转和嗜中性粒细胞诱导的BM微环境变化相关联(Casanova-Acebes等，2013)。在对照和突变的嵌合Ext 1小鼠中循环的“衰老”嗜中性粒细胞(图6U)的分布和BM Cxcl12水平(图6V)是等同的，表明在我们的模型中观察到的嗜中性粒细胞不造成HSPC错误定位。由于已在许多鼠类模型中显示骨谱系细胞影响造血(Mercier等，2012)，因此我们评估了在Ext 1突变小鼠中观察到的HSPC错误定位是否是骨谱系细胞功能受损的结果。骨的组织形态、微型CT和组织学分析没有显示出显著差异，表明在Mx1+骨骼祖细胞中Ext 1缺失对于骨骼体内平衡来说不是必需的(图5L、图6W、表1和表2)。合在一起，这些结果表明由Mx1+骨骼祖细胞群体产生的HS调节HSPC在BM腔内的持留。
表1：雄性EXT-1对照和突变体股骨的微型CT分析
Figure BDA0003138711700000961
表2：雄性EXT-1对照和突变体的胫骨近端的组织形态分析
Figure BDA0003138711700000971
硫酸乙酰肝素调节Vcam 1依赖性HSPC粘附
HSPC在BM中的显微解剖定位影响它们的异型相互作用，改变活性和对刺激物的响应。我们评估了在Mx1+骨骼祖细胞中Ext 1缺失后HSPC在BM中的定位是否受到影响。将对照和突变小鼠繁育成在Col2.3启动子控制下表达GFP(Col2.3-GFP)、具体来说标记成骨细胞的报告品系(图7A)。对Ext 1对照和突变Col2.3-GFP+小鼠进行致死性辐照，并用104个WTLKS CD48-,CD150+DiD(1,1’-双十八烷基-3,3,3’-四甲基吲哚二碳花菁高氯酸盐)标记的HSC进行移植。在注射后24小时，利用活体高分辨率双光子和共聚焦显微术观察颅骨BM中标记的HSC，并对它们与成骨细胞(Col2.3-GFP+)和骨内膜表面的相对距离进行定量。在突变动物中，DiD+细胞的解剖学定位显著变化，所述细胞位于距GFP+骨谱系细胞更远的距离(图7B和图8A)。为了调查HS是否影响已知调节HSPC定位的分子的调控，在pIpC诱导后21天，对对照和突变的YFP+(图6A)、CD45-、Ter119-骨骼祖细胞进行流式细胞术分拣。mRNA水平的评估揭示出在突变小鼠中，Cxcl12、Vcam 1、Scf和血管生成素-1(Mercier等，2012)的表达被显著下调，与观察到的HSC定位更远离成骨细胞相一致(图7C)。
在骨谱系细胞中Cxcl12和Scf的条件缺失不影响HSPC生物学(Ding和Morrison，2013；Ding等，2012；Greenbaum等，2013)，并且血管生成素1控制HSC沉默(Arai等，2004)，这种状态在HSC中在Ext 1缺失后不改变(图5E)。此外，在对照和突变小鼠中，BM中的Cxcl12水平以及由Mx1+间充质细胞产生的Cxcl12蛋白相当(图6V和图8B)。因此，我们随后评估了在Mx1+间充质细胞中在Ext 1缺失后观察到的HSPC缺陷是否是Vcam 1表达改变的结果。Vcam1是α4-β1整合蛋白Vla4的配体。Vla4-Vcam 1轴在HSPC与它们的巢的粘附中发挥作用，并且这种相互作用的药理学抑制引起HSPC动员(Craddock等，1997；Papayannopoulou等，1995)。在突变小鼠中，Mx1+间充质细胞中的Vcam 1蛋白水平显著降低(图7D和图8C)。为了确定观察到的Vcam 1表达的降低在功能上是否对在Ext 1-突变嵌合小鼠中看到的HSPC的错误定位有贡献，我们评估了在对照和突变动物中Vcam 1中和抗体的添加如何影响G-CSF诱导的HSPC动员(图7E)。来自于一起接受G-CSF和Vcam 1中和抗体的对照动物的动员的PB，与仅接受G-CSF的动物相比，显示出循环CFU-C的显著增加(图7F左图)(Craddock等，1997)以及在移植后被致死性辐照过的同类系受体中供体嵌合性的提高(图7G左图)。然而，来自于用G-CSF和Vcam 1中和抗体的组合动员的突变Ext 1小鼠的PB显示出与单独的G-CSF相当的CFU-C数量(图7F右图)和相当的在被致死性辐照过的同类系受体中重建造血的能力(图7G右图)。在没有给药G-CSF的情况下对Vcam 1中和做出的响应中获得可比的结果(图8D)。概括来说，在Mx1+骨骼祖细胞中Ext 1及其HSPG产物的缺失，减少了Vcam 1和其他粘附介导物的生产，使所述区域作为干细胞驻留位点的功能降低。
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在体内的药理学竞争性抑制诱导HSPC动员
已显示，HS模拟物在小鼠中诱导快速HSPC动员，假设是通过内源HSPG的竞争性抑制实现的(Di Giacomo等，2012；Frenette和Weiss，2000；Sweeney等，2002)。肝素这种高度硫酸化的糖胺聚糖，已被显示缺少自身诱导动员的能力(Frenette和Weiss，2000)。令人吃惊的是，我们观察到肝素给药(在PB收获前1小时100U/小鼠)诱导了轻度但仍显著的循环HSPC数量的增加，正如通过CFU测定法所测量的，而没有WBC计数的显著变化(图10A和10B)。由于我们观察到HS生产的遗传性缺失改变了HSPC定位，并且肝素是一种廉价的、FDA批准的竞争性抑制HSPG信号传导的药物，因此我们调查了它是否可以与当前的G-CSF动员方案协作(图9A)。
用肝素(在PB收获前1小时100U/小鼠)与G-CSF的组合处理的小鼠与单独用G-CSF处理的小鼠相比，显示出PB中WBC计数的轻度(p>0.05)增加(图9B)。然而，肝素与G-CSF的组合显著提高了长期重建性(reconstituting)细胞的动员，正如通过致死性辐照过的同类系小鼠中的PB竞争性移植所测量的(图9C线图中断前的部分)。此外，这些细胞高效地自我更新，正如由它们植入第二受体的能力所示(图9C线图中断后的部分)。重要的是，与单独的G-CSF相比，肝素和G-CSF的给药动员了具有不同转录特征的HSC群体(图9D、9E、9F和表3)，表明HS竞争性抑制动员了不同的HSPC群体，或者动员过程足够不同以快速改变基因表达特征。嗜中性粒细胞和血小板计数的恢复确定了在临床背景中BM移植后的成功植入，并且恢复需要的时间预测了存活率(Davies等，2000)。重要的是，与单独的G-CSF相比，利用G-CSF和肝素的共同给药动员的PB的非竞争性移植导致嗜中性粒细胞(图9G)和血小板(图9H)的恢复快出4到6天。在Ext 1突变小鼠中，相比于单独的G-CSF，肝素与G-CSF的组合不增加HSPC动员，表明在野生型小鼠中肝素通过调节内源HSPG来提高G-CSF诱导的动员(图9I)。此外，一种不基于肝素的抗凝剂水蛭素不影响G-CSF诱导的HSPC动员(图9J)，表明观察到的效应不是肝素抗凝性质的结果。
表3：G-CSF加上肝素动员的相比于单独的G-CSF动员的HSPC中差异表达的基因
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造血干细胞移植仍然是许多造血障碍的黄金标准治愈疗法。然而，对于某些个体来说，G-CSF动员抗性可能危害挽救生命的疗法。因此，我们评估了在1型糖尿病诱导的动员病的鼠类模型中，HSPG的遗传或药理学竞争性抑制是否可能促进G-CSF诱导的HSPC从BM的外流(Ferraro等，2011)。在1型糖尿病小鼠中，G-CSF不能高效动员HSPC。然而，在Mx1+间充质细胞中缺乏Ext 1表达的1型糖尿病小鼠中，对G-CSF的受损的响应被完全校正(图9K)。此外，在糖尿病动物中，肝素与G-CSF的组合引起长期重建性细胞的正常动员，正如通过在被致死性辐照过的同类系小鼠中的PB竞争性移植所测量的(图9L)。这些数据证实，内源HSPC的功能性竞争抑制挽救了在患有药理学诱导的糖尿病的动物中注意到的动员异常。
接下来，我们评估了在不存在G-CSF刺激的情况下，在Vcam 1抑制后肝素诱导的动员是否被废止，这是由于Vcam 1至少部分造成了在Ext 1突变小鼠中观察到的缺陷。与介质相比，肝素的给药提高了HSPC动员，正如通过CFU测定法所测量的(图9M和图10C)。相反，肝素与Vcam l中和抗体的共同给药相比于单独的Vcam l中和未能提高HSPC动员，表明肝素通过调节Vcam 1依赖性粘附来诱导动员(图9M和图10C)。然而，在PB收获前1小时给药肝素不调节Mx1+间充质细胞中的Vcam 1水平(图10D)，表明在肝素对Vcam 1依赖性粘附的影响中蕴含可选替的机制，例如影响以前所显示的Vcam 1-Vla4相互作用的变构相互作用(Schlesinger等，2009)。重要的是，我们的结果还显示，肝素的共同给药提高了AMD3100诱导的动员(图9M，中间的阴影图，以及图10C)。而且，AMD3100这种Cxcr4拮抗剂(Broxmeyer等，2005)也增加Ext 1缺陷小鼠中G-CSF诱导的动员(图10E)，表明HS在HSPC驻留中的作用独立于Cxcl12-Cxcr4轴。
Mx1+间充质细胞控制移植的造血干细胞和祖细胞的植入
HSPC在BM中的植入依赖于BM巢的高效腾空，这通常利用全身辐照和高剂量化疗来实现(Armitage，1994)。这些调制方法对于未患有需要辐照或高剂量化疗作为治疗计划的一部分的恶性疾病的患者来说是有毒且不想要的。
我们评估了在Mx1+间充质细胞中Ext 1的废止是否能够在不使用细胞毒性调制的情况下实现植入。在pIpC诱导后3周，将对照和突变小鼠用同类系CD45.1 BM细胞移植，并跟踪16周。值得注意的是，尽管无论移植的细胞剂量如何对照动物都不能植入，但突变小鼠在整个移植过程中以剂量依赖性方式显示出植入的显著增加(图11A)。植入的细胞证实了长期的多谱系重建(图11B)。因此，HSPG的Mx1+间充质细胞生产调节HSPC在BM中的植入过程，表明靶向HS可以提供在不进行细胞毒性预调制的情况下实现植入的手段。
讨论
分泌型和膜结合型HSPG与从果蝇到哺乳动物的生物体中的大量生物过程相关，产生异源细胞相互作用所需的微环境，以产生并维持组织(Kraushaar等，2012；Vied等，2012)。几份现有技术报告指出了HSPG在造血中的重要性。例如，已显示HS模拟物诱导造血干细胞/祖细胞(HSPC)动员(Di Giacomo等，2012；Frenette和Weiss，2000；Sweeney等，2002)，而切割HS的酶乙酰肝素酶的过表达，引起HSPC在BM中积累(Spiegel等，2008)。而且，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3这种细胞表面HSPG抑制细胞外二肽基肽酶CD26(Khurana等，2013)，其影响HSPC归巢和从BM的外流(Christopherson等，2004)。在这里，我们提出的证据表明HS的骨骼干细胞/祖细胞生产控制HSPC的骨髓驻留，可以被抑制以便即使在动员抗性的情形中也动员更强力的HSPC，并且可以被靶向以实现非毒性调制以备HSPC植入。通过这些数据，我们显示了表达Mx1的间充质细胞和/或它们的后代包含加入到巢中用于造血干细胞的BM细胞群体(图11C)。
由骨骼干细胞/祖细胞产生的内源HSPG的操作可以充分改变与临床重要问题相关的定位。首先，G-CSF和肝素的共同给药动员了在质上不同的HSPC，其具有更快速的造血重建和提高的二次移植能力。这些数据表明，这些药剂的组合使用可能有利于收集高效力的HSPC以备移植。其次，肝素或Ext 1缺失增加了G-CSF诱导的HSPC动员，即使是在由糖尿病表型诱导的G-CSF抗性的情形中。顺带来说，糖尿病表型的病理生理学基础包括神经病。由于Ext 1的缺失阻止动员缺陷的发生，因此考虑HS是否参与糖尿病的神经病理并发症，将是有趣的。最后，Ext 1缺失提供了一种背景，输注的HSPC可以植入在其中并获得对某些非恶性临床病症来说有意义的嵌合性水平。应该指出，与其他人使用多出5倍的骨髓细胞并使用AMD3100作为调制方案时观察到的嵌合性水平(Chen等，2006)相比，所述嵌合性水平高于两倍。由于在动物中诱导Ext 1缺失在细胞输注前的3周时间间隔中不损害动物的表观健康，因此抑制Ext 1的功能可能是在没有细胞毒性调制的情况下实现HSPC植入的一种策略。随着遗传修饰的HSPC不断成功地用于非恶性疾病，这个问题越来越重要(Aiuti等，2013；Biffi等，2013)。
实施例4的实验程序
小鼠
Ext 1flox/flox小鼠在以前描述过(Inatani等，2003)。C57BL/6J、B6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ(B6.SJL)、Mx1-Cre(B6.Cg-Tg(Mx1-cre)1Cgn/J)、Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP(Rosa-YFP，B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm 1(EYFP)Cos/J)和Col2.3-GFP(B6.Cg-Tg(Col1a1*2.3-GFP)1Rowe/J)小鼠购自Jackson laboratory。使用6至12周龄的雄性小鼠。聚次黄嘌呤核苷酸-聚胞嘧啶核苷酸(pIpC)从Amersham(GE-Healthcare Life Sciences)获得，并每隔一天以在PBS中25mg/kg总体重(TBW)的剂量通过腹膜内(i.p.)注射给药，共四天。哈佛大学学术动物护理和使用委员会(Harvard University Institutional AnimalCare and Use Committee)(IACUC)和马萨诸塞总医院研究动物护理分委员会(Subcommittee on Research Animal Care of the Massachusetts General Hospital)批准了所有动物工作。
流式细胞术分析
造血和间充质区室的免疫表型表征按照以前的描述进行(Gurumurthy等，2010)。详情参见补充信息。Vcam1和Cxcl12蛋白的水平分别使用抗Vcam1-APC和抗Cxcl12-APC抗体以及相应的同种型对照(R&D Systems)来评估。所有数据收集在LSRII或FACS Aria II(Beckon Dickinson)上进行，数据分析使用FlowJo(Treestar)来进行。
移植测定法
对于非竞争性BM移植来说，为了产生图1a中描述的嵌合体，在pIpC给药前6至8周，将来自于B6.SJL(CD45.1)小鼠的一百万个全BM细胞移植到被致死性辐照过的(在移植前4-24小时来自于铯源的9.5Gy辐照)Ext1-loxP/loxP-Mx1 cre(CD45.1)受体中。嗜中性粒细胞和血小板恢复测定法按照以前的描述进行(Hoggatt等，2013)。简单来说，将来自于C57BL/6J(CD45.2)小鼠的3百万个动员的PB单核细胞(MNC)移植到被致死性辐照过的B6.SJL(CD45.1)小鼠中，并跟踪至少36天。对于不使用细胞毒性调制的移植来说，在pIpC给药后3周，将来自于B6.SJL小鼠的1、4或8百万个全BM细胞移植到Ext1-loxP/loxP-Mx1 cre受体中。对于动员的外周血(PB)的竞争性移植来说，将150μl PB(CD45.2)与2x105个同类系BM支持细胞混合，并注射到被致死性辐照过的CD45.1受体中。细胞通过侧尾静脉注射进行输注。以4周的间隔通过FACS分析监测植入。
活体显微术
HSPC在颅盖BM腔中的体内成像和数据分析按照以前的描述进行(Lo Celso等，2009)。简单来说，将FACS分拣的HSC在PBS中，在37℃下用1:200稀释的DiD(Invitrogen)染色15分钟，并注射到被致死性辐照过的Ext1对照和突变的Col2.3-GFP+受体中。24小时后对小鼠成像。使用Image J软件测量HSC、GFP+成骨细胞与骨骼之间的距离。
HSC动员和血液收集
将重组人类G-CSF(Ncupogen，Filgrastrim)每12小时以125μg/kg TBW的量给药，连续注射8次。以100U的量i.p.注射单剂肝素钠(APP Pharmaceuticals)。水蛭素以40mg/kgTBW的量单剂使用，Vcam1中和抗体和相应的同种型对照(大鼠IgG2a，k)以2mg/kg TBW的量每天静脉内注射共3剂，并在最后一次注射之后的一天通过眶后取血获得PB样品。AMD3100以5mg/kg TBW的量单剂皮下给药。在最后一次G-CSF注射后3小时和肝素、AMD3100或水蛭素注射后1小时通过眶后取血获得PB样品。。
糖尿病小鼠模型
如以前所描述的在4至6周龄的C57BL/6J或Ext1-loxP/loxP-Mx1 cre雄性小鼠中诱导糖尿病(Ferraro等，2011)。只有葡萄糖值高于300mg/dl的动物被用于实验。
统计分析
使用不配对的双尾T检验或单因素方差分析并紧接适合的事后检验。对于符合正态(高斯)分布的样品来说，将数据作图为平均值±SD。或者，使用曼-惠特尼U检验，并将数据作图为中位数±IQR(四分位距)。统计学显著性如下标出：ns：不显著的；*P<0.05；**P<0.01；***P<0,001。
流式细胞术分析
通过谱系标志物以及下列偶联到荧光染料的标志物来鉴定造血干细胞和祖细胞：c-Kit-APC，CD34-FITC，CD16/32-PE-Cy7，CD127-APC-Cy7，CD48-PacificBlue，CD150-PE和Sca-1-PE-Cy7。谱系染色使用生物素标记的针对Mac-1a(CD11b)、Gr-1(Ly-6G/C)、Ter119(Ly-76)、CD3、CD4、CD8a(Ly-2)和B220的抗小鼠抗体的混合物来进行，然后使用偶联到Pacific Orange(Invitrogen)的链亲和素检测。对于同类品系的辨别来说，使用抗CD45.1-PE-Cy7和抗CD45.2-FITC抗体。成熟的淋巴系和髓系细胞通过下列标志物来鉴定：B220-PacificBlue(B细胞)，Mac-1a-PE和Gr1-APC或FITC(髓系细胞)和CD3-PE-Cy5或Alexa700(T细胞)。
循环嗜中性粒细胞的评估按照以前的描述来进行(Casanova-Acebes等，2013)。嗜中性粒细胞通过它们的Mac1(PE-Cy7)、Gr1(FITC)、CD62(APC)和Cxcr4(PE)的表达以及缺少B220(PacificBlue)、CD3、CD4、CD8、Ter119、CD115、CD117、CD49b和F4/80(都是生物素标记的，然后使用偶联到Pacific Orange的链亲和素来检测)的表达来鉴定。对于细胞周期分析来说，首先将骨髓细胞进行HSC细胞表面标志物(谱系-APC-Cy7，c-Kit-APC，Sca-1-PE-Cy7，CD48-PE和CD150-PE-Cy5)染色，使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)进行固定和通透化处理，并用Ki-67-FITC(BD Biosciences)在4℃染色45min，随后用DAPI(2pg/mL)(Invitrogen)进行DNA染色。对于凋亡来说，按照制造商的说明书使用7-AAD和膜联蛋白V-FITC(BD Biosciences)染色剂。
通过CD45-Ter119-(二者都是PE-Cy7)BM细胞中CD105(PE)、CD140(APC)、Sca1(PacificBlue)和Mx1(Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP)的表达来鉴定间充质干细胞(Chan等，2009；Morikawa等，2009；Park等，2012)。
在Mx1+间充质细胞中Ext1缺失后硫酸乙酰肝素生产的评估使用抗HS抗体10E4(Seikagaku Corporation)来进行，然后按照制造商的说明书与PE偶联的抗小鼠IgM抗体温浴。
除非另有陈述，否则所有抗体购自BD Biosciences、BioLegend或eBiosciences。
全血计数(CBC)
血液计数使用自动化的Vetscan HM2(Abaxis)来进行。
集落形成单位(CFU)测定法
CFU测定法按照以前的描述来进行(Ferraro等，2011)。将相等体积的PB(取决于实验，50至200jμL)使用氯化铵-钾缓冲液进行红细胞裂解，重悬浮在4ml methocult M3434(Stem Cell Technologies)中，在35mm培养皿中铺板(1mL/皿)，并在37℃培养8天，然后对集落形成进行评分。
微型CT
通过高分辨率微型计算机断层扫描术(分辨率7μm，微型CT35，Scanco MedicalAG，Bassersdorf，瑞士)分析了股骨中松质骨和皮质骨的微观体系结构。以55kVp的能量水平和145jA的强度对骨骼进行扫描。使用由Scanco提供的人体模型每周对微型CT35进行校准。在始于远端股骨生长板的近端0.15mm处，并向近端延伸3.2mm的二级松质中评估松质骨体积分数和微观体系结构。在生长板的远端处并向近端方向延伸，以7jm的间隔制造460个连续切片，并选择300个连续切片进行分析。在所有样品中，使用最大灰度值为29％的固定阈值将骨骼与软组织分开。皮质区域的扫描在每根股骨的中点处测量，各向同性体素大小为7jm。对于中段分析来说，通过最大灰度值为35％的用户定义的阈值对皮质骨壳进行轮廓绘制并在所有86个切片中进行了重复。所有扫描使用制造商的软件(Scanco，4.05版)进行分析。微型CT数据的获取和分析按照最近发表的指南来进行(Bouxsein等，2010)。
骨骼组织形态测量
在6周龄时对对照和突变小鼠进行致死性辐照，并用106个BM细胞进行移植。在移植后3周通过pIpC注射诱导Ext1缺失。在12周龄(BM移植后6周)时，分析突变和对照小鼠之间的静态和动态组织形态测量值。将小鼠用20mg/kg钙黄绿素和地美环素分别i.p.注射7天和2天，然后收集样品。按照以前的描述分析胫骨(Liu等，2012)，并将标准的命名用于参数的描述(Dempster等，2013)。
骨骼组织学
组织学制备和分析按照以前的描述进行(Guo等，2010)。
RNA分离、定量实时PCR和微阵列基因表达情况分析
将来自于Ext1-loxP/loxP-Mx1cre+-Rosa-YFP+和Ext1-loxP/loxP-Mx1cre+-Rosa-YFP+小鼠的YFP+CD45-Ter119-PI-(碘化丙啶)细胞直接FACS分拣到Trizol试剂(Invitrogen)中，并按照制造商的说明书提取mRNA。使用RETROscript反转录试剂盒(Ambion)来进行cDNA合成。使用SYBR Green(Applied Biosystems)技术，按照制造商的说明书来进行实时PCR。在本研究中用于SYBR-Green实时PCR的引物以前已经发表过(Ding和Morrison，2013；Mendez-Ferrer等，2010；Pomyje等，2001；Zerfaoui等，2008)(都是5’到3’方向)：
VCAM 1：TGCCGAGCTAAATTACACATTG(SEQ ID NO:1)和CCTTGTGGAGGGATGTACAGA(SEQID NO:2)。
CXCL12：TGCATCAGTGACGGTAAACCA(SEQ ID NO:3)和CACAGTTTGGAGTGTTGAGGAT(SEQID NO:4)。
Angpt 1：GCGCTGGCAGTACAATGACAGT(SEQ ID NO:5)和ATTTTCCATCACATGCTCCAGAT(SEQ ID NO:6)。
SCF 1：CCCTGAAGACTCGGGCCTA(SEQ ID NO:7)和CAATTACAAGCGAAATGAGAGCC(SEQID NO:8)。
EXT-1：GCCCTTTTGTTTTATTTTGG(SEQ ID NO:9)和TCTTGCCTTTGTAGATGCTC(SEQ IDNO:10)。
Frizzled-1：CAGCAGTACAACGGCGAAC(SEQ ID NO:11)和GTCCTCCTGATTCGTGTGGC(SEQ ID NO:12)。
对于微阵列分析来说，按照文本的主体中所描述的从被单独或与肝素组合的G-CSF动员的小鼠收集PB。利用梯度离心分离单核细胞，对HSPC标志物(谱系-，c-kit+，Sca-1+)进行染色并直接分拣到Trizol(Invitrogen)中。按照制造商的说明书提取RNA。使用NuGEN Ovation V2扩增***，按照制造商的说明书从总RNA制备扩增的cDNA。使用ZymoResearch DNA清洁&浓缩器(Clean&Concentrator)***纯化扩增的cDNA。按照制造商的说明书将纯化的cDNA杂交到小鼠430A微阵列芯片。使用Nexus Expression v2.0(Biodiscovery)分析数据。对数据分析使用低方差、低强度和假发现(FDR)率校正。
蛋白质印迹
对来自于Ext1-loxP/loxP-Mx1cre+-Rosa-YFP+和Ext1-loxP/loxP-Mx1 cre+-Rosa-YFP+小鼠的YFP+CD45-Ter119-PI-(碘化丙啶)细胞进行FACS分拣，并在没有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸并增补有20％FBS、2.2g/L碳酸氢钠和2.5mL 2-巯基乙醇的alpha-MEM培养基(100x，Millipore ES-007-E)中离体扩增10天。将细胞在增补有蛋白酶和磷酸盐抑制剂(10mM NaF，1mM Na3VO4和1X蛋白酶混合物(Roche))的RIPA缓冲液(BostonBioproducts)中裂解。将蛋白提取物(20jμg)在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE进行分离，免疫转印在硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，并使用标准流程通过化学发光进行可视化。使用了下述抗体：抗Ext1抗体(Sigma，wh0002131m1)和抗兔Gapdh抗体(abcam，ab9485)。将薄膜扫描并使用ImageJ软件(NIH)进行光密度测量。将Ext 1条带的光密度针对Gapdh的光密度进行归一化。Ext1蛋白的水平被表示成它的光密度相对于Gapdh的光密度之比。
实施例4的参考文献
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41.Ferraro,F.,Lymperi,S.,Mendez-Ferrer,S.,Saez,B.,Spencer,J.A.,Yeap,B.Y.,Masselli,E.,Graiani,G.,Prezioso,L.,Rizzini,E.L.等，(2011)，“糖尿病通过改变巢功能而损害造血干细胞动员”(Diabetes impairs hematopoietic stem cellmobilization by altering niche function)，Sci Transl Med 3,104ra101。
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所注明的所有专利和其他出版物，出于描述和公开例如在这些出版物中描述的可以与本公开相结合使用的方法的目的，明确地通过参考并入本文。提供这些出版物仅仅是因为它们的公开在本申请的提交日期之前。就此而言，绝不应该被解释为承认本发明人无权利用先有发明或出于任何其他原因在日期上早于这些公开内容。所有关于这些文献的日期的陈述或关于其内容的表述是基于本申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
根据上面的描述，本发明的大量修改和可替选的实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，本说明书应该被解释为仅仅是说明性的，是用于教授本领域技术人员执行本发明的最佳方式的目的。结构的详细情况可以实质性改变而不背离本发明的精神，并且进入权利要求书的范围之内的所有修改的独家使用权被保留。在本说明书中，实施方式以能够清楚简明地书写本说明书的方式进行描述，但打算并且应该认识到，实施方式可以进行各种不同的组合和分离而不背离本发明。本发明打算只受限到权利要求书和适用的法律规则所要求的程度。
还应该理解，权利要求书将覆盖本文中描述的本发明的所有通用和具体特征，以及在语言上可能被说成是落于本发明的范围之中的所有陈述。

Claims (30)

1.一种在患有多发性骨髓瘤的人类对象中动员造血干细胞和/或祖细胞的方法，所述方法包括在同一天向所述人类对象给药普乐沙福和Gro-βΔ4，普乐沙福和Gro-βΔ4的给药量能够有效地将一定量的CD34+造血干细胞和/或祖细胞动员到所述人类对象的外周血中，被动员到所述人类对象的外周血中的CD34+造血干细胞和/或祖细胞的量足以在向所述人类对象给药普乐沙福和Gro-βΔ4的同一天在单次血液成分单采术中收集约2x106/kg体重至约10x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中被动员到所述人类对象的外周血中的CD34+造血干细胞和/或祖细胞的量足以收集约2x106/kg体重至约8x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中被动员到所述人类对象的外周血中的CD34+造血干细胞和/或祖细胞的量足以收集约3x106/kg体重至约6x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法克服了所述人类对象的造血干细胞和/或祖细胞动员病。
5.根据权利要求1所述的方法，其中选择的所述人类对象对单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
6.根据权利要求1所述的方法，其中选择的所述人类对象对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
7.根据权利要求1所述的方法，其中选择的所述人类对象对G-CSF和普乐沙福给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述人类对象不是在向所述人类对象给药普乐沙福和Gro-βΔ4的同一天给药G-CSF。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在普乐沙福和Gro-βΔ4给药后1小时内开始所述单次血液成分单采术。
10.一种用于在患有多发性骨髓瘤的人类对象中自体干细胞移植的方法，所述方法包括向所述人类对象输注有效量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞，其中所述外周血干细胞和/或祖细胞是在向所述人类对象给药普乐沙福和Gro-βΔ4的同一天在单次血液成分单采术中从同一人类对象收集的，普乐沙福和Gro-βΔ4的给药量能够有效地将一定量的CD34+造血干细胞和/或祖细胞动员到所述人类对象的外周血中，被动员到所述人类对象的外周血中的CD34+造血干细胞和/或祖细胞的量足以收集约2x106/kg体重至约10x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中向所述人类对象给药的普乐沙福和Gro-βΔ4的量能够有效地将一定量的CD34+造血干细胞和/或祖细胞动员到所述人类对象的外周血中，被动员到所述人类对象的外周血中的CD34+造血干细胞和/或祖细胞的量足以收集约2x106/kg体重至约8x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其中向所述人类对象给药的普乐沙福和Gro-βΔ4的量能够有效地将一定量的CD34+造血干细胞和/或祖细胞动员到所述人类对象的外周血中，被动员到所述人类对象的外周血中的CD34+造血干细胞和/或祖细胞的量足以收集约3x106/kg体重至约6x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类对象先前对单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类对象先前对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类对象先前对G-CSF和普乐沙福给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类对象不是在向所述人类对象给药普乐沙福和Gro-βΔ4的同一天给药G-CSF。
17.根据权利要求10所述的方法，其中在普乐沙福和Gro-βΔ4给药后1小时内开始所述单次血液成分单采术。
18.根据权利要求10所述的方法，其中向所述人类对象输注约3x106/kg体重至约6x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
19.根据权利要求10所述的方法，其中在不用辐照的情况下对所述人类对象进行调制以备植入。
20.一种用于在患有多发性骨髓瘤的人类对象中自体干细胞移植的方法，所述方法包括：
(a)向所述人类对象给药普乐沙福和Gro-βΔ4，普乐沙福和Gro-βΔ4的给药量能够有效地将CD34+造血干细胞和/或祖细胞动员到所述人类对象的外周血中；
(b)在向所述人类对象给药普乐沙福和Gro-βΔ4的同一天在单次血液成分单采术中收集约2x106/kg体重至约10x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞；
(c)在步骤(b)之后，对所述人类对象进行调制，以备移植的造血干细胞和/或祖细胞的植入；以及
(d)在步骤(c)之后，将收集的外周血干细胞和/或祖细胞移植到所述人类对象中，其中移植的外周血干细胞和/或祖细胞植入到所述人类对象中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中被动员到所述人类对象的外周血中的CD34+造血干细胞和/或祖细胞的量足以收集约2x106/kg体重至约8x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
22.根据权利要求20所述的方法，其中被动员到所述人类对象的外周血中的CD34+造血干细胞和/或祖细胞的量足以收集约3x106/kg体重至约6x106/kg体重之间的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞。
23.根据权利要求20所述的方法，其中普乐沙福和Gro-βΔ4的给药克服了所述人类对象的造血干细胞和/或祖细胞动员病。
24.根据权利要求20所述的方法，其中选择的所述人类对象对单独的G-CSF给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
25.根据权利要求20所述的方法，其中选择的所述人类对象对单独的普乐沙福给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
26.根据权利要求20所述的方法，其中选择的所述人类对象对G-CSF和普乐沙福给药做出响应表现出不良动员，其中所述不良动员的特征在于需要超过一次的血液成分单采术来收集足够量的CD34+外周血干细胞和/或祖细胞用于自体干细胞移植。
27.根据权利要求20所述的方法，其中所述人类对象不是在向所述人类对象给药普乐沙福和Gro-βΔ4的同一天给药G-CSF。
28.根据权利要求20所述的方法，其中在普乐沙福和Gro-βΔ4给药后1小时内开始所述单次血液成分单采术。
29.根据权利要求20所述的方法，其中约3x106/kg体重至约6x106/kg体重之间的所收集的外周血干细胞和/或祖细胞被移植到所述人类对象中。
30.根据权利要求20所述的方法，其中在不用辐照的情况下对所述人类对象进行调制。
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