CN113604532A - 一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于胶原蛋白提取技术领域，公开了一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：原料前处理，原料预处理，油水分离，酶解、灭酶，纯化，浓缩，喷雾干燥成粉。本发明利用多酶复合酶解牦牛骨富含胶原蛋白肽的酶解液，在纯化步骤中，先通过超滤纸超滤获得小于1000Da的肽组分，再在低温环境下将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，制得的牦牛骨胶原蛋白肽粉的分子量主要集中在500～1000Da，分子量为1000Da以下的胶原蛋白肽比例达到了90％以上，有效提高了牦牛骨胶原蛋白肽有效成分的提取率，有利于人体的吸收。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白提取技术领域，具体涉及一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
牦牛是高寒地区的特有牛种，是我国和世界稀有珍贵的地方类半野生特有种群，它生长在高寒缺氧、枯草期和冰封期长达半年左右的严峻自然条件下，生长在无污染的蓝天、碧水和牧草茂盛的青藏高原，牧草中还生长着众多有益的中草药，牦牛自由地生长在海拔3500米以上绿色生态的安多大草原环境中，草场无重金属残留，纯正、自然。在这样的自然环境下生存的牦牛，不仅拥有发达的骨骼与肌腱运动***，而且是真正无污染的绿色产品，是特别优质的胶原提取宝库。
与一般牛骨相比，因牦牛鲜骨骨骼密度大，骨质优良，骨骼中蕴藏的胶原蛋白小肽量大，氨基酸含量高，是非常适合的小分子骨胶原肽的提取来源。牦牛骨胶原蛋白肽牦牛骨胶原蛋白肽，是从海拔3000米以上、天然牧养的牦牛骨中提取的优质活性骨胶原蛋白肽，是极易被人体吸收的小分子胶原蛋白肽。
胶原蛋白多肽是胶原蛋白或明胶经蛋白酶水解的小分子蛋白质，分子量一般约为10Da-10kDa。从结构上讲，胶原多肽是胶原蛋白的三螺旋结构彻底打开，肽链被降解为短链肽的多肽混合物。胶原蛋白肽一般由数量很少的氨基酸组成，市场上出现的常为寡肽或小肽产品，因其分子量小，具有易吸收的功效。此外，胶原蛋白肽具有一些特殊的活性功能，例如：免疫调节、抗氧化、抑菌、抗高血压、抗衰老、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松等作用。
施用胶原蛋白肽化合物已被证明在吸收循环后能够在软骨积累，该机制有助于饱受关节疾病折磨的关节病患者，其可作为促进骨形成添加剂和骨健康基本补充剂。另外，由于伤口愈合过程中基质金属蛋白酶(MMPs)的蛋白降解活性与肉芽组织合成和沉积胶原蛋白的细胞活性之间的平衡是必要的，因此许多新的基于胶原蛋白的伤口护理产品旨在减少过度的蛋白酶水平并使伤口环境恢复平衡。此外，这些胶原蛋白肽产品有助于促进功能性细胞外基质蛋白来刺激愈合过程，研究显示大甲鲹和红牙鱼或的骨骼中提取的I型胶原蛋白在伤口愈合中的疗效进行了研究，证实施用这些胶原蛋白的膜制剂对Wistar大鼠切除型伤口的愈合起到了促进作用。
然而，当今国内市场上牛骨胶原蛋白肽与国外进口骨胶原蛋白肽之间的品质差距主要在于：1)国内牛骨胶原蛋白肽中的小分子肽集中度不够；2)国内牛骨胶原蛋白肽产品色泽泛黄；3)国内牛骨胶原蛋白肽产品的异味未能完全有效去除。造成这些问题的主要技术原因是分离纯化工艺过于繁琐或者过于简陋，传统工艺主要包括简单过滤、膜过滤、离子交换、活性炭吸附等方法，在实际生产中，采用过于简单的分离纯化工艺会导致产品出现上述问题，采用过于繁复的分离纯化工艺会导致生产成本过高且得率严重下降。因此，为解决上述问题，开发一种高效的牦牛骨胶原蛋白肽精制纯化工艺是十分必要的。
发明内容
为解决上述问题，集中牛骨胶原蛋白肽中，去除牦牛骨中的异味，充分利用牦牛骨资源，本发明公开了一种以牦牛骨为原料，多酶复合酶解牦牛骨富含胶原蛋白肽的酶解液。该法利用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化技术对牦牛骨胶原蛋白肽进行纯化，兼具了富集小分子肽、脱色、脱盐和除异味的作用，是一种可显著提高牦牛骨胶原蛋白肽品质的生产方法。
本发明通过下述技术方案实现，一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：用高压冷水冲洗新鲜或冷冻的牦牛骨，以清除异物，再将清洗的牦牛骨投入绞碎机，压碎至20-30mm大小，放置于清洁的容器中；
（2）原料预处理：加入牦牛骨质量10～20倍的氢氧化钠溶液浸泡3～6h，然后放入蒸煮罐中加入牛骨质量8～12倍的水，在120～135℃下蒸煮1.5～3h，得到蒸煮液；
（3）油水分离：将所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到牦牛骨粗胶原蛋白溶液；
（4）酶解：向牦牛骨胶原蛋白肽粗提液中加入复合蛋白酶进行一次酶解，然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6～6.5后，加入木瓜蛋白酶进行二次酶解，并辅助超声处理；酶解结束后，将酶解液煮沸20分钟，使酶灭活，静置冷却至0～4℃；
（5）纯化：超滤获得小于1000Da的肽组分，将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，洗脱液梯度：A液为0-1M NaCl溶液，用B液配制；B液为1M醋酸或醋酸钠缓冲液，控制流速0.4Bv/h，上样浓度4mg/mL，收集峰脊，即得牦牛骨胶原蛋白肽纯化液；
（6）浓缩：牦牛骨胶原蛋白肽纯化液温度控制在80～82℃，在0.06～0.08Mpa真空度下，浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20～22Bé，得牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液；
(7)喷雾干燥：牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液温度45～50℃，波美度20～22Bé，喷雾塔进风温度调节在150～160℃范围，出风温度在80～90℃范围，干燥成粉。
进一步的，所述步骤（2）中添加的氢氧化钠溶液的浓度为0.05～0.15mol/L。
进一步的，所述步骤（4）中复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物。
进一步的，步骤（4）中一次酶解的温度为55℃～60℃，一次酶解时间为1h～2h，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的0.8～1.6％；二次酶解时间为2h-4h，温度为55℃～60℃，所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.1％～0.3％。
本发明提供的牦牛骨胶原蛋白肽的生产工艺，工序合理、可操作性强，易于工业化生产，先将牦牛骨原料进行清洗和蒸煮处理能够去除牦牛骨中的杂蛋白，使其中的胶原蛋白充分溶于水，然后进行酶解、灭酶、纯化、浓缩和干燥制粉等步骤，得到的牦牛骨胶原蛋白粉质量稳定，水溶性好，溶解时不易出现沉淀现象，长期服用能有效果提高人体的免疫力，减缓疲劳的产生。
本发明的生产工艺中，由于不同类型的胶原在生物体组织中的分布存在较大差异，而且胶原常与多糖等成分结合在一起，而且酶解过后的牦牛骨胶原蛋白肽中含有分子量大小不一的杂蛋白，如果不进行去除，会影响最终制得的牦牛骨胶原蛋白肽粉的品质，在本发明的纯化步骤中，先通过超滤纸超滤获得小于1000Da的肽组分，再在低温环境下将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，制得的牦牛骨胶原蛋白肽粉的分子量主要集中在500～1000Da，分子量为1000Da以下的胶原蛋白肽比例达到了90％以上，有效提高了牦牛骨胶原蛋白肽有效成分的提取率，有利于人体的吸收。
与现有技术相比，本发明提供的牦牛骨胶原蛋白肽的生产工艺具有以下优势：
(1)采用本发明提供的牦牛骨胶原蛋白肽的生产工艺制得的牦牛骨胶原蛋白肽粉具有分子量小且分布集中，吸收快、脂肪含量低等优点，能广泛应用于保健食品、配方食品和化妆品等领域。
(2)采用本发明提供的耗牦牛骨胶原蛋白肽的生产工艺制得的耗牦牛骨胶原蛋白肽粉，水溶性好，溶于水不易产生沉淀，人体生物利用度高，长期服用能有效提高人体免疫力，减缓身体疲劳。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：用高压冷水冲洗新鲜或冷冻的牦牛骨，以清除异物，再将清洗的牦牛骨投入绞碎机，压碎至20mm大小，放置于清洁的容器中；
（2）原料预处理：加入牦牛骨质量20倍的氢氧化钠溶液浸泡3h，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.05mol/L，然后放入蒸煮罐中加入牛骨质量12倍的水，在135℃下蒸煮3h，得到蒸煮液；
（3）油水分离：将所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到牦牛骨粗胶原蛋白溶液；
（4）酶解：向牦牛骨胶原蛋白肽粗提液中加入复合蛋白酶进行一次酶解，然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6～6.5后，加入木瓜蛋白酶进行二次酶解，并辅助超声处理；酶解结束后，将酶解液煮沸20分钟，使酶灭活，静置冷却至0～4℃；
（5）纯化：超滤获得小于1000Da的肽组分，将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，洗脱液梯度：A液为0-1M NaCl溶液，用B液配制；B液为1M醋酸或醋酸钠缓冲液，控制流速0.4Bv/h，上样浓度4mg/mL，收集峰脊，即得牦牛骨胶原蛋白肽纯化液；
（6）浓缩：牦牛骨胶原蛋白肽纯化液温度控制在80～82℃，在0.06～0.08Mpa真空度下，浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20～22Bé，得牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液；
(7)喷雾干燥：牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液温度45～50℃，波美度20～22Bé，喷雾塔进风温度调节在150～160℃范围，出风温度在80～90℃范围，干燥成粉。
进一步的，步骤（4）中一次酶解的温度为60℃，一次酶解时间为2h，所述复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物，复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.6％；二次酶解时间为4h，温度为60℃，所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.3％。
实施例2
一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：用高压冷水冲洗新鲜或冷冻的牦牛骨，以清除异物，再将清洗的牦牛骨投入绞碎机，压碎至30mm大小，放置于清洁的容器中；
（2）原料预处理：加入牦牛骨质量15倍的氢氧化钠溶液浸泡4.5h，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.10mol/L，然后放入蒸煮罐中加入牛骨质量10倍的水，在130℃下2h，得到蒸煮液；
（3）油水分离：将所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到牦牛骨粗胶原蛋白溶液；
（4）酶解：向牦牛骨胶原蛋白肽粗提液中加入复合蛋白酶进行一次酶解，然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6～6.5后，加入木瓜蛋白酶进行二次酶解，并辅助超声处理；酶解结束后，将酶解液煮沸20分钟，使酶灭活，静置冷却至0～4℃；
（5）纯化：超滤获得小于1000Da的肽组分，将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，洗脱液梯度：A液为0-1M NaCl溶液，用B液配制；B液为1M醋酸或醋酸钠缓冲液，控制流速0.4Bv/h，上样浓度4mg/mL，收集峰脊，即得牦牛骨胶原蛋白肽纯化液；
（6）浓缩：牦牛骨胶原蛋白肽纯化液温度控制在80～82℃，在0.06～0.08Mpa真空度下，浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20～22Bé，得牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液；
(7)喷雾干燥：牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液温度45～50℃，波美度20～22Bé，喷雾塔进风温度调节在150～160℃范围，出风温度在80～90℃范围，干燥成粉。
进一步的，步骤（4）中一次酶解的温度为57℃，一次酶解时间为1.5h，所述复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物，复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.2％；二次酶解时间为3h，温度为57℃，所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.2％。
实施例3
一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：用高压冷水冲洗新鲜或冷冻的牦牛骨，以清除异物，再将清洗的牦牛骨投入绞碎机，压碎至20mm大小，放置于清洁的容器中；
（2）原料预处理：加入牦牛骨质量10倍的氢氧化钠溶液浸泡3～6h，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.15mol/L，然后放入蒸煮罐中加入牛骨质量8倍的水，在120℃下蒸煮3h，得到蒸煮液；
（3）油水分离：将所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到牦牛骨粗胶原蛋白溶液；
（4）酶解：向牦牛骨胶原蛋白肽粗提液中加入复合蛋白酶进行一次酶解，然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6～6.5后，加入木瓜蛋白酶进行二次酶解，并辅助超声处理；酶解结束后，将酶解液煮沸20分钟，使酶灭活，静置冷却至0～4℃；
（5）纯化：超滤获得小于1000Da的肽组分，将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，洗脱液梯度：A液为0-1M NaCl溶液，用B液配制；B液为1M醋酸或醋酸钠缓冲液，控制流速0.4Bv/h，上样浓度4mg/mL，收集峰脊，即得牦牛骨胶原蛋白肽纯化液；
（6）浓缩：牦牛骨胶原蛋白肽纯化液温度控制在80～82℃，在0.06～0.08Mpa真空度下，浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20～22Bé，得牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液；
(7)喷雾干燥：牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液温度45～50℃，波美度20～22Bé，喷雾塔进风温度调节在150～160℃范围，出风温度在80～90℃范围，干燥成粉。
进一步的，步骤（4）中一次酶解的温度为55℃，一次酶解时间为2h，所述复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物，复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的0.8％；二次酶解时间为2h，温度为60℃，所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.1％。
对比例1
一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：用高压冷水冲洗新鲜或冷冻的牦牛骨，以清除异物，再将清洗的牦牛骨投入绞碎机，压碎至20mm大小，放置于清洁的容器中；
（2）原料预处理：加入牦牛骨质量20倍的氢氧化钠溶液浸泡3h，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.05mol/L，然后放入蒸煮罐中加入牛骨质量12倍的水，在135℃下蒸煮3h，得到蒸煮液；
（3）油水分离：将所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到牦牛骨粗胶原蛋白溶液；
（4）酶解：向牦牛骨胶原蛋白肽粗提液中加入复合蛋白酶进行酶解，并辅助超声处理；酶解结束后，将酶解液煮沸20分钟，使酶灭活，静置冷却至0～4℃；
（5）纯化：超滤获得小于1000Da的肽组分，将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，洗脱液梯度：A液为0-1M NaCl溶液，用B液配制；B液为1M醋酸或醋酸钠缓冲液，控制流速0.4Bv/h，上样浓度4mg/mL，收集峰脊，即得牦牛骨胶原蛋白肽纯化液；
（6）浓缩：牦牛骨胶原蛋白肽纯化液温度控制在80～82℃，在0.06～0.08Mpa真空度下，浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20～22Bé，得牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液；
(7)喷雾干燥：牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液温度45～50℃，波美度20～22Bé，喷雾塔进风温度调节在150～160℃范围，出风温度在80～90℃范围，干燥成粉。
进一步的，步骤（4）中酶解的温度为60℃，酶解时间为2h，所述复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物，复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的1.6％。
对比例2
一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：用高压冷水冲洗新鲜或冷冻的牦牛骨，以清除异物，再将清洗的牦牛骨投入绞碎机，压碎至20mm大小，放置于清洁的容器中；
（2）原料预处理：加入牦牛骨质量20倍的氢氧化钠溶液浸泡3h，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.05mol/L，然后放入蒸煮罐中加入牛骨质量12倍的水，在135℃下蒸煮3h，得到蒸煮液；
（3）油水分离：将所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到牦牛骨粗胶原蛋白溶液；
（4）酶解：向牦牛骨胶原蛋白肽粗提液中加入木瓜蛋白酶进行酶解，并辅助超声处理；酶解结束后，将酶解液煮沸20分钟，使酶灭活，静置冷却至0～4℃；
（5）纯化：超滤获得小于1000Da的肽组分，将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，洗脱液梯度：A液为0-1M NaCl溶液，用B液配制；B液为1M醋酸或醋酸钠缓冲液，控制流速0.4Bv/h，上样浓度4mg/mL，收集峰脊，即得牦牛骨胶原蛋白肽纯化液；
（6）浓缩：牦牛骨胶原蛋白肽纯化液温度控制在80～82℃，在0.06～0.08Mpa真空度下，浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20～22Bé，得牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液；
(7)喷雾干燥：牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液温度45～50℃，波美度20～22Bé，喷雾塔进风温度调节在150～160℃范围，出风温度在80～90℃范围，干燥成粉。
进一步的，步骤（4）中酶解时间为4h，温度为60℃，所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.3％。
试验例一、分子量分布情况
1.试验材料：实施例1～3，对比例1～4制备的牦牛骨胶原蛋白肽。
2.试验方法：采用GB/T 22729-2008对本发明实施例1～3，对比例1～2制得的牦牛骨胶原蛋白肽的分子量分布进行检测。
3.试验结果
试验结果如表1所示。
表1牦牛骨胶原蛋白肽分子量分布占比
由表1可知，采用本发明实施例1～3所述的方法制得的牦牛骨胶原蛋白肽的平均分子量主要分布在500～1000Da之间，其中实施例1中500～1000Da区间的分子量占比达到86.1％，小于1000Da区间的分子量占比达到92.8％，为本发明的最佳实施例，人体对小于1000Da分子量区间的牦牛骨胶原蛋白肽的吸收利用率高，服用效果好。而对比例1～2中改变了所述牦牛骨胶原蛋白肽生产工艺中酶解的所用酶以后，得到的牦牛骨胶原蛋白肽500～1000Da区间的分子量占比仅为50％左右。说明了本发明采用的牦牛骨胶原蛋白肽的生产工艺能有效去除牦牛骨胶原蛋白肽中的杂质及杂蛋白，将牛骨胶原蛋白肽分子量集中在500～1000Da区间内，提高人体的生物利用度。
试验例二、牦牛骨胶原蛋白肽缓解疲劳的测定试验
对实施例1-3得到的牛骨胶原蛋白肽粉进行功能性评价。
试验动物：BAC小鼠，体重18-22g，购于北京大学医学部。
试验动物分组：所有的动物进入实验室后，正常饲养3天，以适应饲养环境。实验要求根据随机排列表随机将实验动物分组，每组12只。
试验动物饲养：实验组每天以灌胃的方式给予0.1g/kg的牦牛骨胶原蛋白肽粉，对照组给喂等量的蒸馏水，每次灌胃前断食2小时，基础饲料自由摄食，两天换水一次。
对试验动物进行负重游泳实验、常压耐缺氧实验。
(1)负重游泳实验
各组小白鼠按上述方法正常饲养4周，末次给予受试物30min后，按体重于尾根部负荷5％体重的铅皮，在游泳箱(70cm×70cm×60cm)中游泳。水深50cm，水温25±0.5℃，按组进行，以准确记录运动时间并避免各小鼠之间的相互影响。力竭标准为小鼠头部浸入水中8s不能游回水面。逐只记录运动开始至力竭的时间，作为小鼠游泳时间(min)。小鼠力竭后，迅速将其捞出水池，置于保温箱内用吹风筒吹干放入笼中正常饲养。
(2)常压耐缺氧实验
负重游泳实验后，所有动物休息5d，按上述方法继续饲养。末次灌喂60min后，进行常压耐缺氧实验。方法为将小鼠放入250mL密封性好的磨口玻璃瓶内，每瓶一只小鼠，瓶内用纱布包有15g钠石灰，以吸收水分和二氧化碳，造成缺氧环境。将小鼠放入瓶中后，立即用凡士林密封盖紧，记录从密封至小鼠发生全身痉孪的时间，当小鼠发生全身痉孪后，立即开启瓶盖将其取出救活。
结果如表2所示，对小鼠分别灌胃实施例1-3的牦牛骨胶原蛋白肽粉后，小鼠的体力明显优于对照组，说明本发明的牦牛骨肽粉具有很好的缓解疲劳的功效。
表2小鼠负重游泳实验、常压耐缺氧实验测试结果
负重游泳时间(min) 耐缺氧时间(min)
| 负重游泳时间(min) | 耐缺氧时间(min) | |
| 对照组 | 9.45 | 17.37 |
| 实施例1 | 15.11 | 20.69 |
| 实施例2 | 14.46 | 19.49 |
| 实施例3 | 14.87 | 19.85 |
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (4)
1.一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）原料前处理：用高压冷水冲洗新鲜或冷冻的牦牛骨，以清除异物，再将清洗的牦牛骨投入绞碎机，压碎至20-30mm大小，放置于清洁的容器中；
（2）原料预处理：加入牦牛骨质量10～20倍的氢氧化钠溶液浸泡3～6h，然后放入蒸煮罐中加入牛骨质量8～12倍的水，在120～135℃下蒸煮1.5～3h，得到蒸煮液；
（3）油水分离：将所述蒸煮液进行油水分离，去除油脂，得到牦牛骨粗胶原蛋白溶液；
（4）酶解：向牦牛骨胶原蛋白肽粗提液中加入复合蛋白酶进行一次酶解，然后用柠檬酸调节一次酶解液的pH值至6～6.5后，加入木瓜蛋白酶进行二次酶解，并辅助超声处理；酶解结束后，将酶解液煮沸20分钟，使酶灭活，静置冷却至0～4℃；
（5）纯化：超滤获得小于1000Da的肽组分，将超滤液采用SP Sephadex C25阳离子交换柱纯化，洗脱液梯度：A液为0-1M NaCl溶液，用B液配制；B液为1M醋酸或醋酸钠缓冲液，控制流速0.4Bv/h，上样浓度4mg/mL，收集峰脊，即得牦牛骨胶原蛋白肽纯化液；
（6）浓缩：牦牛骨胶原蛋白肽纯化液温度控制在80～82℃，在0.06～0.08Mpa真空度下，浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20～22Bé，得牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液；
(7)喷雾干燥：牦牛骨胶原蛋白肽浓缩液温度45～50℃，波美度20～22Bé，喷雾塔进风温度调节在150～160℃范围，出风温度在80～90℃范围，干燥成粉。
2.根据权利要求1所述的一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中添加的氢氧化钠溶液的浓度为0.05～0.15mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中一种或几种混合物。
4.根据权利要求1所述的一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）中一次酶解的温度为55℃～60℃，一次酶解时间为1h～2h，所述复合蛋白酶的添加量为粗胶原蛋白溶液质量的0.8～1.6％；二次酶解时间为2h-4h，温度为55℃～60℃，所述木瓜蛋白酶的加入量为粗胶原蛋白溶液质量的0.1％～0.3％。
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| CN114106151A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-01 | 中基惠诚科技有限公司 | 一种抗氧化活性胶原蛋白肽的制备方法 |
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- 2021-09-27 CN CN202111133674.5A patent/CN113604532A/zh not_active Withdrawn
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