CN113588769A - 一种多孔合金纳米材料的制备方法及其在检测血浆代谢物中的应用 - Google Patents

一种多孔合金纳米材料的制备方法及其在检测血浆代谢物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多孔合金纳米材料的制备方法及其在检测血浆代谢物中的应用，涉及多孔合金纳米材料合成领域，制备方法包括以下步骤：将Na2PdCl4、H2PtCl6·6H2O、盐酸和F127充分混合，超声溶解；完全溶解后，加入抗坏血酸溶液，并立刻置于水浴超声反应；随后加入HAuCl4·4H2O溶液反应；最后分别用无水乙醇和水离心洗涤后干燥。多孔合金纳米材料作为基质辅助激光解吸电离质谱的基质应用于小分子检测。本发明通过一步法即可合成，步骤简单、成本低；作为激光解吸电离质谱的基质，可以解决传统有机基质的热点效应以及在低分子量区有干扰的问题；血浆样本只需经过简单的预处理，准确率高、成本低、检测通量高。

Description

一种多孔合金纳米材料的制备方法及其在检测血浆代谢物中 的应用
技术领域
本发明涉及多孔合金纳米材料合成领域，尤其涉及一种多孔合金的制备方法及其在检测血浆代谢物中的应用。
背景技术
生物标志物(蛋白质、核酸、代谢物等)检测因其无创等特点，在体外诊断中发挥越来越重要的作用。与功能受表观遗传调控的基因和翻译后修饰的蛋白质不同，代谢物是生化活性的直接标志，更易与表型相关联。因此，代谢物分析，或代谢组学，已经成为一种强有力的工具，被逐渐用于体外诊断。目前生化分析和基于气相/液相色谱-质谱联用技术(gaschromatography/liquid chromatography mass spectrometry,GC/LC MS)是代谢物检测的主要手段，这些方法在对样品进行除盐、除蛋白、衍生化、浓缩等预处理后，即可实现代谢物的检测。但是生化方法通常一次只能检测一种物质，且容易受背景信号的干扰，灵敏度和特异性低。GC/LC MS可以做到多种代谢物的同时检测，灵敏度高，特异性强。但GC/LC MS存在色谱柱，需要复杂的样品预处理，存在检测时间长、价格昂贵等问题。难以实现对血浆样本的低成本、高通量检测，用于临床比较困难。
除此之外，基质辅助激光解吸电离质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization MS,MALDI MS)也在代谢物检测中发挥越来越重要的作用，不同于传统的生化分析和GC/LC MS，MALDI MS不需或只需简单的样品预处理，在极少量的样本前提下，即可实现代谢物的快速、灵敏和高通量检测。而传统有机基质因在低分子量区有碎裂峰，并不适用于小分子代谢物检测。
基质是MALDI MS的核心组成部分。传统的有机基质易在小分子量端(m/z<500)产生强的背景信号，影响小分子的检测。且在实际的生物样本体系中，血浆样品中存在着各种不同的生物大分子，且不同的酸碱度以及高盐度都会对小分子的检测带来阻碍，因此传统的有机基质难以满足小分子的检测需求。无机纳米材料(如碳基、硅基、贵金属材料等)虽然可以用于小分子代谢物的检测，但在对复杂生物样本检测时，仍然存在局限性。因此需要开发一种新的纳米材料用于复杂生物样本(血浆)代谢物的检测。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种具有更好的LDI效率的MALDI MS基质，用于复杂生物样本(血浆)代谢物的检测。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何具有更好的LDI效率的MALDI MS基质，用于复杂生物样本(血浆)代谢物的检测。
为实现上述目的，本发明提供了一种多孔合金纳米材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1、将Na2PdCl4、H2PtCl6·6H2O、盐酸和F127充分混合，超声溶解；
步骤2、待完全溶解后，加入抗坏血酸溶液，并立刻置于水浴超声反应；
步骤3、随后加入HAuCl4·4H2O溶液反应；
步骤4、最后分别用无水乙醇和水离心洗涤后干燥得到所述多孔合金纳米材料PdPtAu。
进一步地，步骤1所述Na2PdCl4、H2PtCl6·6H2O、盐酸和F127用量分别为20Mm的Na2PdCl4加入0.6mL，20Mm的H2PtCl6·6H2O加入3mL，6.0M的盐酸加入60μL，F127加入60mg。
进一步地，步骤2所述抗坏血酸溶液加入量为0.1M的抗坏血酸溶液加入3mL。
进一步地，步骤2所述水浴超声反应为在45℃反应3h。
进一步地，步骤3所述HAuCl4·4H2O溶液的浓度为10Mm-40 Mm，加入量为1.2mL。
进一步地，步骤3所述离心洗涤次数为3次，转速为10000rpm，干燥温度为50。℃上述多孔合金纳米材料在检测血浆代谢物中的应用，所述多孔合金纳米材料作为基质辅助激光解吸电离质谱的基质。
进一步地，包括以下步骤：
步骤1、将所述多孔合金纳米材料PdPtAu分散在去离子水中；
步骤2、将血浆与等体积甲醇/乙腈混合液混合，所述甲醇/乙腈体积比为1:1，摇床震荡10min，离心10min，取上清液用于质谱检测；
步骤3、所述基质辅助激光解吸电离质谱采用正离子反射模式，在所述基质辅助激光解吸电离质谱的质谱靶板上进行样品制备，所述样品为1μL血浆提取液，对血浆样品中的小分子进行检测。
进一步地，所述小分子的分子量范围为小于1000Da。
进一步地，所述小分子为糖类或氨基酸。
本发明的技术效果如下：
(1)多孔PdPtAu合金，通过一步法即可合成，合成步骤简单，制备成本低。
(2)该纳米材料作为激光解吸电离质谱的基质，可以解决传统有机基质的热点效应以及在低分子量区有干扰的问题。
(3)本发明中，血浆样本只需经过简单的预处理，并且每份样本只需要1μL血浆提取液，就可快速、灵敏的检测血浆中的小分子代谢物。这种方法准确率高、成本低、检测通量高，满足了临床血浆检测的需求。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的多孔PdPtAu纳米材料的SEM图片；
图2是本发明的一个较佳实施例的多孔PdPtAu纳米材料的TEM表征图片；
图3是本发明的一个较佳实施例的多孔PdPtAu纳米材料作为基质辅助激光解吸电离质谱检测标准小分子的质谱图；
图4是本发明的一个较佳实施例的多孔PdPtAu纳米材料作为基质辅助激光解吸电离质谱检测含有NaCl和牛血清白蛋白的小分子的质谱图；
图5是本发明的一个较佳实施例的多孔PdPtAu纳米材料作为基质辅助激光解吸电离质谱检测血浆样本中小分子代谢物的质谱图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1多孔合金纳米材料的制备
步骤1：仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离质谱，采用正离子反射模式；
步骤2：多孔PdPtAu合金的制备，包括以下步骤；
步骤2.1：将0.6mL Na2PdCl4(20mM)，3mL H2PtCl6·6H2O(20mM)，60μL盐酸(6.0M)和60mg F127充分混合，超声溶解，待F127完全溶解后，加入3mL抗坏血酸溶液(0.1M)，立刻置于45℃水浴超声反应3h，分别加入1.2mL HAuCl4·4H2O溶液(浓度分别为10mM、20mM、30mM、40mM)，反应1h。反应结束后，分别用无水乙醇和水离心(10000rpm)洗涤3次，50干℃燥备用。
步骤2.2：将上述多孔PdPtAu合金分散在去离子水中，作为基质使用；
步骤3：配比(葡萄糖、苯丙氨酸、赖氨酸)溶解在去离子水中，检测不同孔径和金含量的PdPtAu质谱性能；
步骤4：将血浆与等体积甲醇/乙腈混合液(甲醇/乙腈，v/v＝1:1)混合，摇床震荡10min，离心10min，取上清液用于质谱检测；
步骤5：在质谱靶板上进行样品制备，基质采用优化的PdPtAu材料，室温下干燥；
步骤6：对血浆样品中的小分子进行检测；
步骤7：对质谱检测结果进行分析，得出结论。
采用Hitachi S-4800获取扫描电子显微镜与能量色散X射线光谱结果，如图1所示，合成的多孔PdPtAu合金，粒径约为170nm，粒径均匀，存在多孔结构。
采用JEOL JEM-2100F获得透射电子显微镜结果。如图2所示，纳米材料存在多孔结构，与扫描电镜结果一致。
实施例2标准小分子物质检测
(1)仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离质谱，采用阳离子反射模式检测；将多孔合金配制成悬浮液，并配制标准品小分子(葡萄糖、苯丙氨酸、赖氨酸)溶液；
(2)在质谱靶板上进行样本制备，室温下干燥；
(3)在质谱仪下进行检测，并对质谱图像进行分析，结果如图3所示，图3a、3b、3c分别是葡萄糖、苯丙氨酸、赖氨酸标准小分子溶液。
实施例3含有NaCl和牛血清白蛋白的小分子物质检测
(1)仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离质谱，采用阳离子反射模式检测；将多孔合金配制成悬浮液，并配制高浓度盐或蛋白的混合小分子(葡萄糖、苯丙氨酸、赖氨酸)溶液；
(2)在质谱靶板上进行样本制备，室温下干燥；
(3)在质谱仪下进行检测，并对质谱图像进行分析，结果如图4所示，图4a是含有NaCl的溶液中检测葡萄糖、苯丙氨酸和赖氨酸的质谱图，图4b牛血清白蛋白的溶液中检测葡萄糖、苯丙氨酸和赖氨酸的质谱图。
实施例4血浆代谢物的检测
(1)仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离质谱，采用阳离子反射模式检测；将多孔合金配制成悬浮液；对血浆用有机溶剂进行简单的预处理；
(2)在质谱靶板上进行样本制备，室温下干燥；
(3)在质谱仪下进行检测，并对质谱图像进行分析，如图5所示，图5a，5b分别为健康血浆样本和癌症血浆样本的质谱图。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种多孔合金纳米材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、将Na2PdCl4、H2PtCl6·6H2O、盐酸和F127充分混合，超声溶解；
步骤2、待完全溶解后，加入抗坏血酸溶液，并立刻置于水浴超声反应；
步骤3、随后加入HAuCl4·4H2O溶液反应；
步骤4、最后分别用无水乙醇和水离心洗涤后干燥得到所述多孔合金纳米材料PdPtAu。
2.如权利要求1所述的多孔合金纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤1所述Na2PdCl4、H2PtCl6·6H2O、盐酸和F127用量分别为20Mm的Na2PdCl4加入0.6mL，20Mm的H2PtCl6·6H2O加入3mL，6.0M的盐酸加入60μL，F127加入60mg。
3.如权利要求1所述的多孔合金纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤2所述抗坏血酸溶液加入量为0.1M的抗坏血酸溶液加入3mL。
4.如权利要求1所述的多孔合金纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤2所述水浴超声反应为在45℃反应3h。
5.如权利要求1所述的多孔合金纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤3所述HAuCl4·4H2O溶液的浓度为10Mm-40Mm，加入量为1.2mL。
6.如权利要求1所述的多孔合金纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤3所述离心洗涤次数为3次，转速为10000rpm，干燥温度为50℃。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的多孔合金纳米材料在检测血浆代谢物中的应用，其特征在于，所述多孔合金纳米材料作为基质辅助激光解吸电离质谱的基质。
8.如权利要求7所述的多孔合金纳米材料在检测血浆代谢物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将所述多孔合金纳米材料PdPtAu分散在去离子水中；
步骤2、将血浆与等体积甲醇/乙腈混合液混合，所述甲醇/乙腈体积比为1:1，摇床震荡10min，离心10min，取上清液用于质谱检测；
步骤3、所述基质辅助激光解吸电离质谱采用正离子反射模式，在所述基质辅助激光解吸电离质谱的质谱靶板上进行样品制备，所述样品为1μL血浆提取液，对血浆样品中的小分子进行检测。
9.如权利要求8所述的多孔合金纳米材料在检测血浆代谢物中的应用，其特征在于，所述小分子的分子量范围为小于1000Da。
10.如权利要求8所述的多孔合金纳米材料在检测血浆代谢物中的应用，其特征在于，所述小分子为糖类或氨基酸。
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