CN113583981A - 一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法、四价流感病毒亚单位疫苗及其应用 - Google Patents

一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法、四价流感病毒亚单位疫苗及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法、四价流感病毒亚单位疫苗及其应用，方法对原始工艺进一步改良，首先扩增病毒后增加一步去卵清蛋白处理改良步骤，大大降低成品中卵清蛋白残留量；然后改良分离纯化四种亚型流感病毒血凝素HA的步骤，进一步降低裂解剂与灭活剂甲醛残留量，增强疫苗的安全性；最后将四种亚型流感病毒疫苗原液按一定比例混合，从而制备成四价流感病毒亚单位疫苗成品。从而获得一种裂解剂与灭活剂残留量更少、抗原纯度更高好且免疫原性良好的四价流感病毒亚单位疫苗。

Description

一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法、四价流感病毒亚 单位疫苗及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体的说，涉及一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法、四价流感病毒亚单位疫苗及其应用。
背景技术
流感是流行性感冒的简称，是由于流感病毒感染导致的呼吸道和其他脏器损伤的疾病，每年均会在冬春季有不同程度的流行。流感病毒主要分为A（甲）、B（乙）、C（丙）、D（丁）四种亚型，其中A型（甲）和B型（乙）较易造成大范围爆发感染。流感病毒感染发病后的住院和死亡主要发生在婴幼儿、老年人、慢性基础疾病患者和孕妇等免疫力低下人群。针对上述人群的流感防护，每年接种流感疫苗是预防流感的最有效方法。
流感病毒灭活疫苗包括流感病毒裂解疫苗和流感病毒亚单位疫苗。四价流感病毒裂解疫苗的制备过程是将病毒在鸡胚内培养来制备病毒液,收获尿囊液后，经澄清、浓缩、纯化、灭活、裂解后制备出四价流感病毒裂解疫苗半成品，后经包装制成四价流感病毒裂解疫苗成品。四价流感病毒亚单位疫苗的制备过程是在四价流感病毒裂解疫苗的基础上对抗原蛋白血凝素进一步纯化制得。
目前我国流感疫苗市场还存在如下几个问题亟待解决：1）流感疫苗市场供给严重不足；流感疫苗的市场需求预测难度较高，加之流感一年一季的特殊性、疫苗近5个月的生产周期、仅有1年的保质期，加大了流感病毒疫苗企业对流感病毒疫苗需求量的准确判断。2）流感病毒裂解疫苗中存在的裂解剂、卵清蛋白和灭活剂等，导致流感病毒疫苗纯度不高；当前流感病毒裂解疫苗的纯度大都在75%-80%左右；3）流感病毒裂解疫苗中存在的裂解剂、卵清蛋白和灭活剂严重影响了疫苗的安全性；由于纯度和安全性原因，当前疫苗不能适用于儿童与老年人等免疫力低下人群。
为了解决以上所述问题，急需研发一款裂解剂残留量更少、抗原纯度高且免疫原性良好的流感病毒亚单位疫苗。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法、四价流感病毒亚单位疫苗及其应用。
本发明目的是这样实现的：
一、一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法，包括扩增、澄清、浓缩、裂解，其关键在于：在澄清之后经去除卵清蛋白再进行浓缩，以及裂解后进行纯化处理；纯化处理后的流感病毒抗原液的纯度大于85%；
所述去除卵清蛋白具体为：将澄清得到的单价流感病毒合并液置于30℃温水浴，连续搅拌条件下，缓慢加入0.1M NaOH溶液至pH9.5，溶液中出现卵清蛋白聚集形成的大量白色絮状物，经滤网过滤去除该絮状物，收集过滤液再经0.3M HCl 溶液缓慢中和至pH7.2，即得去卵清蛋白处理单价流感病毒合并液；
由于流感病毒灭活疫苗制备过程采用鸡胚扩增四种亚型流感病毒，最终在成品中混入少量卵清蛋白，而卵清蛋白影响疫苗的纯度，还影响疫苗的保存，因此采用上述方法去除卵清蛋白。
所述纯化处理主要是为了去除裂解剂、灭活剂以及病毒结构蛋白；这三者的来源主要是：由于流感病毒裂解疫苗制备过程采用裂解剂破坏病毒完整结构，因此最终在成品中残留一部***解剂；同时由于流感病毒灭活疫苗制备过程采用灭活剂灭活病毒，因此最终在成品中残留一部分灭活剂；另外，流感病毒灭活疫苗制备过程未除去病毒结构蛋白，最终在成品中残留一部分流感病毒结构蛋白。因此纯化处理可采用以下两种方式进行：
其一为：先洗脱后灭活，收集样品通过裂解剂清除介质进清除95%裂解剂，首先，于1500×g、室温，离心1min，从而去除裂解剂清除介质中的储存缓冲液，再加入适量平衡液，于1500×g、室温下离心1min，从而平衡裂解剂清除介质，然后室温孵育2min，保证裂解剂与裂解剂清除介质充分结合，于1500×g、室温下离心2min，收集流穿蛋白样品，即得裂解剂清除单价流感病毒抗原液；
其二为：先洗脱后灭活，将收集样品经透析处理去除溶液中残留的裂解剂与甲醛。
优选地，上述扩增具体为：制备2.0~5.0 logEID50/mL各型流感病毒工作种子批毒种，以0 .2 mL/胚的剂量接种于清洁级鸡胚尿囊腔，33~35℃恒温静置培养48~72h；照蛋器仔细筛选活鸡胚，4~10 ℃静置冷胚10~20h后，收获鸡胚尿囊液，即流感病毒尿囊收获液。
优选地，上述澄清具体为：流感病毒尿囊收获液，离心，5000rpm，10min，收取上清合并为单价流感病毒合并液。
优选地，上述浓缩具体为：100kD超滤膜对去卵清蛋白处理单价流感病毒合并液进行超滤浓缩，流感病毒液浓缩倍数30-60倍，即得单价流感病毒浓缩液。
优选地，上述裂解具体为：配制终浓度≤1.5％Triton N-101裂解剂的蔗糖溶液，加入单价流感病毒浓缩液，15~25℃，25000rpm离心，3 .5~4 .5h，根据紫外吸收曲线OD280数值收集蔗糖浓度为10％~18％之间的目的蛋白峰。
优选地，上述纯化处理之后还需再纯化，具体为将纯化处理后的流感病毒抗原液进行反复洗滤再经除菌过滤，取样检测血凝素含量与纯度，最终制成流感病毒单价原液，其纯度能够达到≥85%。
二、一种四价流感病毒亚单位疫苗，其关键在于：
由四种经权利要求1~6任一项所述方法制备得到的亚型流感病毒血凝素蛋白与Tris缓冲液体系组成，每种所述亚型流感病毒血凝素蛋白的抗原含量均为30~39μg/mL。
优选地，四种所述亚型流感病毒血凝素蛋白的重量份数比为1:1:1:1。
优选地，四种所述亚型流感病毒血凝素蛋白分别为H1N1、H3N2、B/Victoria与B/Yamagata；四种所述亚型流感病毒HA蛋白的氨基酸序列分别如SEQID NO:1~4所示。
三、一种所述的四价流感病毒亚单位疫苗在制备同时预防四种亚型流感病毒的药物中的应用。
有益效果：
本发明制备的流感病毒亚单位疫苗与当前市场已有的流感病毒疫苗相比，其裂解剂与灭活剂残留量更少，游离甲醛残留量低至4-5ug/ml，裂解剂残留量低至84-101ug/ml，抗原纯度更高，疫苗半成品中血凝素纯度大于等于85%，卵清蛋白残留量低至21-35ng/ml，且免疫原性更好，高安全性使得其可以通过增加剂量或加入佐剂帮助各年龄人群，尤其是儿童与老年人，有效预防每年季节性流感病毒感染。
附图说明
图1为实验组与对照组成品血凝素成品SDS-PAGE胶图。
图2为实验组与对照组三批成品免疫原性检测结果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1 一种四价流感病毒亚单位疫苗的制备方法：
四价流感亚单位疫苗含有H1N1、H3N2、B/Victoria、B/Yamagata抗原蛋白，每价抗原含量均为30~39μg/mL。
1 .各亚型流感病毒扩增
制备2.0~5.0 lgEID50/mL各型流感毒工作种子批毒种，以0.2mL/胚的剂量接种于清洁级鸡胚尿囊腔，33~35℃恒温静置培养48~72h。
2.各亚型流感病毒液收获
照蛋器仔细筛选活鸡胚，4~10℃静置冷胚10~20h后，收获鸡胚尿囊液并取样检定。
3.流感病毒液离心澄清合并
各亚型流感病毒尿囊收获液，离心，5000rpm，10min，收取上清合并为单价流感病毒合并液。
4.去除卵清蛋白
将单价流感病毒合并液置于30℃温水浴，连续搅拌条件下，缓慢加入0.1M NaOH溶液至pH9.5，溶液中出现卵清蛋白聚集形成的大量白色絮状物，经滤网过滤去除该絮状物，收集过滤液再经0.3M HCl 溶液缓慢中和至pH 7.2，即得去卵清蛋白处理单价流感病毒合并液。
5.浓缩、流感病毒裂解和抗原纯化
1)流感病毒浓缩
100kD超滤膜对去卵清蛋白处理单价流感病毒合并液进行超滤浓缩，流感病毒液浓缩倍数30-60倍，即得单价流感病毒浓缩液。
2)流感病毒裂解
配制终浓度≤1.5％Triton N-101裂解剂的蔗糖溶液，加入单价流感病毒浓缩液，15~25℃，25000rpm离心，3 .5~4 .5h，根据紫外吸收曲线OD280数值收集蔗糖浓度为10％~18％之间的目的蛋白峰。
3)流感病毒抗原纯化
凝胶色谱层析采用Sephadex-G25为介质，0 .01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据紫外吸收曲线OD280数值收集目的蛋白，进一步稀释并除菌过滤收集样品，所得蛋白质含量≤2500μg/mL，加入终浓度为200μg/mL的甲醛，4~10℃静置灭活36-48h。再将收集样品装入透析膜（Spectra/Pro7，分子量截流范围是＞50kDa），经透析处理去除溶液中残留的裂解剂与甲醛。
4)流感病毒抗原再纯化
最后对各亚型流感病毒灭活液进行反复洗滤，降低游离甲醛残留量至4-5ug/ml、裂解剂残留量至84-101ug/ml、卵清蛋白残留量至21-35ng/ml，再经除菌过滤，取样检测细菌内毒素含量、微生物限度与血凝素含量与纯度（纯度需≥85%），最终制成各亚型流感病毒单价原液。
6.半成品配制
根据各亚型流感病毒单价原液的血凝素含量，将各亚型流感病毒按1:1:1:1 血凝素抗原含量比例进行半成品配制，血凝素配制量，在30~39μg/mL范围内，，即制成四价流感亚单位疫苗半成品。
实施例2 一种四价流感病毒亚单位疫苗的制备方法：
四价流感亚单位疫苗含有H1N1、H3N2、B/Victoria、B/Yamagata抗原蛋白，每价抗原含量均为30~39μg/mL。
1 .各亚型流感病毒扩增
制备2.0~5.0 logEID50/mL各型流感病毒工作种子批毒种，以0 .2 mL/胚的剂量接种于清洁级鸡胚尿囊腔，33~35℃恒温静置培养48~72h。
2.各亚型流感病毒液收获
照蛋器仔细筛选活鸡胚，4~10 ℃静置冷胚10~20h后，收获鸡胚尿囊液并取样检定。
3.流感病毒液离心澄清合并
各亚型流感病毒尿囊收获液，离心，5000rpm，10min，收取上清合并为单价流感病毒合并液。
4.去除卵清蛋白
将单价流感病毒合并液置于30℃温水浴，连续搅拌条件下，缓慢加入0.1M NaOH溶液至pH9.5，溶液中出现卵清蛋白聚集形成的大量白色絮状物，经滤网过滤去除该絮状物，收集过滤液再经0.3M HCl 溶液缓慢中和至pH 7.2，即得去卵清蛋白处理单价流感病毒合并液。
5.浓缩、流感病毒裂解和抗原纯化
1)流感病毒浓缩
100kD超滤膜对去卵清蛋白处理单价流感病毒合并液进行超滤浓缩，流感病毒液浓缩倍数30-60倍，即得单价流感病毒浓缩液。
2)流感病毒裂解
配制终浓度≤1.5％Triton N-101裂解剂的蔗糖溶液，加入单价流感病毒浓缩液，15~25℃，25000rpm离心，3 .5~4 .5h，根据紫外吸收曲线OD280数值收集蔗糖浓度为10％~18％之间的目的蛋白峰。
3)流感病毒抗原纯化
首先，凝胶色谱层析采用Sephadex-G25为介质，0 .01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据紫外吸收曲线OD280数值收集目的蛋白，进一步稀释并除菌过滤收集样品，所得蛋白质含量≤2500μg/mL，加入终浓度为200μg/mL的甲醛，4~10℃静置灭活36-48h。
其次，再将收集样品经过裂解剂清除介质处理一次，可去除溶液中95%残留的Triton N-101裂解剂，其具体操作步骤如下：
1500 × g，室温，离心1min，从而去除裂解剂清除介质中的储存缓冲液。
加入适量平衡液，1500 × g，室温，离心1min，从而平衡裂解剂清除介质。
加入含裂解剂的收集样品，室温孵育2min，保证裂解剂与裂解剂清除介质充分结合。
1500 × g，室温，离心2min， 收集流穿蛋白样品。即得裂解剂清除单价流感病毒抗原液。所采用的裂解剂清除介质为Thermo Scientific,Pierce Detergent RemovalResin,cat:87780。
4)流感病毒抗原再纯化
最后对各亚型裂解剂清除单价流感病毒抗原液进行反复洗滤再经除菌过滤，取样检测血凝素含量与纯度（纯度需≥89%），最终制成各亚型流感病毒单价原液。
6.半成品配制
根据各亚型流感病毒单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按1:1:1:1 血凝素抗原含量比例进行半成品配制(血凝素配制量可在30~39μg/mL范围内)，即制成四价流感亚单位疫苗半成品。
实施例3 以实施例2制备的四价疫苗作为实验组。对照组疫苗制备方法较实验组缺少如下几个步骤：1）碱性溶液沉淀法去除收集尿囊液中卵清蛋白；2）采用去除裂解剂介质减少95%裂解剂残留；3）透析法减少裂解剂与灭活剂残留量。
1、成品血凝素含量检测
单向免疫扩散法：在含有指定亚型流感病毒标准抗体的1％琼脂糖凝胶板上分别加入不同浓度的标准抗原和成品样品，每孔6μL，静置培养＞18h。PBS浸泡1h后，在经过干燥、染色与脱色。准确测量不同浓度的标准抗原和成品样品扩散后形成的沉淀环直径，以不同浓度的标准抗原形成的沉淀环的直径进行直线回归，得到直线回归方程，代入成品样品的沉淀环直径，即可得到实验组与对照组三批成品样品的相应亚型流感病毒血凝素含量，结果如表1所示。
表1 实验组与对照组三批成品四种亚型血凝素含量(μg/mL)数据统计表
Figure 735297DEST_PATH_IMAGE001
2、卵清蛋白残留量检测
双抗夹心ELISA法： 抗卵清白蛋白多抗包被好的微孔酶标板中分别加入卵清白蛋白标准品和供试样品，再加入HRP偶联二抗，37℃，静置孵育1h。洗板三次后加入TMB底物，静置避光显色10min，加入1M H2SO4终止液。设置检测波长450nm，参比波长620nm。根据标准品的OD值得出线性回归方程，将供试样品OD值代入方程计算出供试实验组与对照组三批成品的卵清蛋白浓度。结果如表2所示。
表2 实验组与对照组三批成品卵清蛋白残留量(ng/mL)数据统计表
Figure 587715DEST_PATH_IMAGE002
3、成品裂解剂残留量检测
比色法：首先制作标准曲线，得出线性回归方程。然后计算出供试样品的裂解剂残留量。取2mL二氯甲烷溶液分别加入Triton N-101标准品溶液管(浓度分别为40/100/200/300/400μg/mL)和供试样品管中，混匀，再加入3mL硫氰钴胺溶液，混匀，室温，静置1 .5h，间隔15min涡旋震荡一次。静置30min，取下层样品检测OD620nm处吸光度，根据标准品的OD值得出线性回归方程，将供试样品OD值代入方程计算出供试实验组与对照组三批成品的裂解剂残留量，结果如表3所示。
表3 实验组与对照组三批成品裂解剂残留量(μg/mL)数据统计表
Figure 810886DEST_PATH_IMAGE003
4、成品血凝素HA抗原纯度检测
分别取16μL实验组与对照组成品蛋白样品，加入4μL 5× loading buffer缓冲液，沸水煮5min；再加入1μL糖苷酶F，37℃温育18小时。将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入500ml 1×电泳缓冲液，每孔加入20μL样品或10μL Marker；100V电压，40min,当溴酚蓝染料前沿跑出玻璃板后取出凝胶，做标记。将蛋白胶放入适量蛋白胶染色液中。置于水平摇床缓慢摇动，室温染色5~10min。随后将染色蛋白胶置于纯净水中，水平摇床缓慢摇动，室温脱色10min。期间至少更换纯净水1～2次，直至蛋白胶中蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带清晰可见（图1）。采用全功能成像仪拍照，最后对图片中条带灰度值进行计算，测算出流感病毒血凝素HA纯度（表4）。
表4 实验组与对照组成品血凝素成品纯度检测
Figure 141373DEST_PATH_IMAGE004
5、免疫原性检测
本次研究方法是将试验疫苗肌肉接种免疫Balb/c小鼠后取血检测诱导产生的特异性抗流感病毒的抗体滴度。实验组、对照疫苗组（未经去卵清蛋白、过去裂解剂介质与反复洗虑处理样品）与PBS对照组样品分别免疫Balb/c小鼠，免疫前（d0）、免后第28天（d28）、免后第42天（d42）分组采血，分离制备小鼠血清，采用血凝抑制试验方法分别测定实验组、对照疫苗组与PBS对照组样品免疫后小鼠血清抗体效价，结果如图2所示。
综上所述：本发明所述四价流感病毒亚单位疫苗与当前市场已有的流感病毒疫苗相比，其裂解剂残留量更少，裂解剂残留量低至8-15ug/ml，抗原纯度更高，疫苗半成品中血凝素纯度大于等于85%，卵清蛋白残留量低至21-35ng/ml，且免疫原性更好。
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 易慧生物技术（上海）有限公司
<120> 一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法、四价流感病毒亚单位疫苗及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
35 40 45
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
50 55 60
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Gly Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
85 90 95
Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Arg Ala Asn Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Lys Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
130 135 140
Gly Val Lys Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Gly Ser Ser
145 150 155 160
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr
165 170 175
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys
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Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Lys Asp Gln Ile
195 200 205
Ser Leu Phe Ala Gln Pro Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
225 230 235 240
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
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Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
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Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
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Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
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Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
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Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
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Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
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Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
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500 505 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
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Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Met Ser Cys Phe Leu Leu Cys
530 535 540
Ile Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
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Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210> 2
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Met Leu Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Arg Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Ser Asn Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asn Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asp Asn Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Lys Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Ile Asn Gln Thr Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Pro Thr Ile Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Thr Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Thr Met Glu Arg Asp Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Glu Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Lys Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Asn Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Asp Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 3
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser
1 5 10 15
Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn
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Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe
35 40 45
Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys
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Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val
65 70 75 80
Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro
85 90 95
Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg
100 105 110
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115 120 125
Gln Asn Val Ile Asp Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu
130 135 140
Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ala Thr Ser Lys Ile Gly Phe Phe
145 150 155 160
Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Lys Asp Asn Tyr Lys Asn Ala Thr
165 170 175
Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Glu Gly Glu Asp
180 185 190
Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Lys Thr Gln Met Lys
195 200 205
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Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gln Ile Gly Asp Phe Pro Asp Gln
225 230 235 240
Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr
245 250 255
Met Met Gln Lys Pro Gly Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly
260 265 270
Val Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val
275 280 285
Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu
290 295 300
Glu Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Lys His
305 310 315 320
Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys
325 330 335
Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu
340 345 350
Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu
355 360 365
Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly
370 375 380
Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys
385 390 395 400
Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu
405 410 415
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420 425 430
Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln
435 440 445
Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu
450 455 460
Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly
465 470 475 480
Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys
485 490 495
Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala
500 505 510
Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala
515 520 525
Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr
530 535 540
Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Leu Ala Ile Phe
545 550 555 560
Ile Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
565 570 575
<210> 4
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp
1 5 10 15
Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys
20 25 30
Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr
35 40 45
Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr
50 55 60
Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val
65 70 75 80
Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys Thr Gly Lys Ile Pro Ser Ala Arg Val
85 90 95
Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile
100 105 110
Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly
115 120 125
Tyr Glu His Val Arg Leu Ser Thr His Asn Val Ile Asn Ala Glu Asp
130 135 140
Ala Pro Gly Arg Pro Tyr Glu Ile Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn
145 150 155 160
Ile Thr Asn Gly Asn Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro
165 170 175
Lys Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Ile Glu Val Pro Tyr Ile
180 185 190
Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp
195 200 205
Asn Glu Thr Gln Met Ala Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Lys Pro Gln Lys
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Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gln Ile
225 230 235 240
Gly Gly Phe Pro Asn Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln Ser Gly
245 250 255
Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gln Lys Ser Gly Lys Thr Gly Thr
260 265 270
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Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu
290 295 300
Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro
305 310 315 320
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Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
355 360 365
Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr
370 375 380
Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr
385 390 395 400
Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu
405 410 415
Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu
420 425 430
His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala
435 440 445
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Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys
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Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly Asn Gly Cys
485 490 495
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500 505 510
Ala Gly Thr Phe Asp Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser
515 520 525
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530 535 540
Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr
545 550 555 560
Leu Met Ile Ala Ile Phe Val Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn Val
565 570 575
Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580

Claims (10)

1.一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法，包括扩增、澄清、浓缩、裂解，其特征在于：在澄清之后经去除卵清蛋白再进行浓缩，以及裂解后进行纯化处理；
所述去除卵清蛋白具体为：将澄清得到的单价流感病毒合并液置于30℃温水浴，连续搅拌条件下，缓慢加入0.1M NaOH溶液至pH9.5，溶液中出现卵清蛋白聚集形成的大量白色絮状物，经滤网过滤去除该絮状物，收集过滤液再经0.3M HCl 溶液缓慢中和至pH 7.2，即得去卵清蛋白处理单价流感病毒合并液；
所述纯化处理具体步骤或为：先洗脱后灭活，收集样品通过裂解剂清除介质清除95%的裂解剂，首先，于1500×g、室温，离心1min，从而去除裂解剂清除介质中的储存缓冲液，再加入适量平衡液，于1500×g、室温下离心1min，从而平衡裂解剂清除介质，然后室温孵育2min，保证裂解剂与裂解剂清除介质充分结合，于1500×g、室温下离心2min，收集流穿蛋白样品，即得裂解剂清除单价流感病毒抗原液；
所述纯化处理具体步骤或为：先洗脱后灭活，将收集样品经透析处理去除溶液中残留的裂解剂与甲醛。
2.根据权利要求1所述的一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法，其特征在于所述扩增具体为：制备2.0~5.0 logEID50/mL各型流感病毒工作种子批毒种，以0 .2 mL/胚的剂量接种于清洁级鸡胚尿囊腔，33~35℃恒温静置培养48~72h；照蛋器仔细筛选活鸡胚，4~10℃静置冷胚10~20h后，收获鸡胚尿囊液，即流感病毒尿囊收获液。
3.根据权利要求1所述的一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法，其特征在于所述澄清具体为：流感病毒尿囊收获液，离心，5000rpm，10min，收取上清合并为单价流感病毒合并液。
4.根据权利要求1所述的一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法，其特征在于所述浓缩具体为：100kD超滤膜对去卵清蛋白处理单价流感病毒合并液进行超滤浓缩，流感病毒液浓缩倍数30-60倍，即得单价流感病毒浓缩液。
5.根据权利要求1所述的一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法，其特征在于所述裂解具体为：配制终浓度≤1.5％Triton N-101裂解剂的蔗糖溶液，加入单价流感病毒浓缩液，15~25℃，25000rpm离心，3 .5~4 .5h，根据紫外吸收曲线OD280数值收集蔗糖浓度为10％~18％之间的目的蛋白峰。
6.根据权利要求1所述的一种鸡胚培养法来源的流感病毒纯化方法，其特征在于：所述纯化处理之后还需再纯化，具体为将纯化处理后的流感病毒抗原液进行反复洗滤再经除菌过滤，取样检测血凝素含量与纯度，最终制成流感病毒单价原液。
7.一种四价流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：由四种经权利要求1~6任一项所述方法制备得到的亚型流感病毒血凝素蛋白与Tris缓冲液体系组成，每种所述亚型流感病毒血凝素蛋白的抗原含量均为30~39μg/mL。
8.根据权利要求7所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：四种所述亚型流感病毒血凝素蛋白的重量份数比为1:1:1:1。
9.根据权利要求7所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：四种所述亚型流感病毒血凝素蛋白分别为H1N1、H3N2、B/Victoria与B/Yamagata；四种所述亚型流感病毒HA蛋白的氨基酸序列分别如SEQID NO:1~4所示。
10.一种权利要求7~9任一项所述的四价流感病毒亚单位疫苗在制备同时预防四种亚型流感病毒的药物中的应用。
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