CN113583926B - 一种akp异源表达工程菌及其构建方法和高酶活性碱性磷酸酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种AKP异源表达工程菌，以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)为宿主，在该宿主细胞内转入携带有大肠杆菌(E.coli)phoA基因的重组质粒后而获得；所述大肠杆菌phoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3中任一项所示。还公开了该AKP异源表达工程菌的构建方法以及利用该AKP异源表达工程菌制备高酶活性碱性磷酸酶的方法。该AKP异源表达工程菌发酵的浓缩酶蛋白作为酶制剂，热稳定性好，酶活性高，对炎症有抑制作用，可增强仔猪免疫力和抗病力，促进动物的生长发育，为生猪产业提供可持续发展动力。

Description

一种AKP异源表达工程菌及其构建方法和高酶活性碱性磷酸酶的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种AKP异源表达工程菌及其构建方法和高酶活性碱性磷酸酶的制备方法。

背景技术

在猪的养殖过程中，仔猪断奶可能会增加感染革兰氏阴性病原体的风险，革兰氏阴性病原体可以产生许多毒力因子，包括内毒素脂多糖(LPS)，但是在畜牧业中禁止使用抗生素。因为不规范使用抗生素已导致严重的问题，如抗生素耐药性，严重的不良药物反应以及动物产品中的药物残留等。因此，有必要找到有效的措施来替代抗生素来促进畜牧业高质量发展。在现有的商业条件下，抗生素替代品可用于提高动物生产力并帮助家禽和猪发挥其遗传潜力，包括益生菌，有机酸，生长素，益生元，合生元，酶，抗菌肽，超免疫蛋抗体，粘土和金属。

碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AKP)是一种非特异性的磷酸单酯酶，它可以催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应的醇类、酚类或糖，还能催化磷酸基团的转移反应。它可促进哺乳动物肠道健康，包括预防和减少肠道炎症和细菌易位、调节肠道细菌生长和局部肠道pH值、局部和全身的肠道内毒素脂多糖的解毒起到抗炎作用等功能，可将AKP制成添加酶制剂作为绿色饲料添加剂。然而，目前生产AKP的方法难以获得高酶活性的AKP，限制了AKP在动物饲料添加剂的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种AKP异源表达工程菌及其构建方法和高酶活性碱性磷酸酶的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种AKP异源表达工程菌，以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)为宿主，在该宿主细胞内转入携带有大肠杆菌(E.coli)phoA基因的重组质粒后而获得；所述大肠杆菌phoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3中任一项所示。其中，未经过处理的phoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过Red/ET重组技术删除信号肽得到的DelSigphoA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过D₁₅₃G-D₃₃₀N定向诱变得到的DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N基因核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

上述的AKP异源表达工程菌，优选的，所述携带有大肠杆菌phoA基因的重组质粒由大肠杆菌(E.coli)phoA基因***穿梭载体后获得，所述穿梭载体为pP43NMK载体。更优选的，所述重组质粒中引入了mazE-mazF***，所述mazE-mazF质粒稳定***的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

该AKP异源表达工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将大肠杆菌(E.coli)phoA基因***穿梭载体，通过碱性裂解法制成携带有大肠杆菌phoA基因的重组质粒；所述大肠杆菌phoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3中任一项所示；

(2)利用感受态转化的方法将所述步骤(1)得到的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，得到AKP异源表达工程菌。

上述的制备方法，优选的，所述穿梭载体为pP43NMK载体，或由以下方法制备得到：将大肠杆菌DH5α用Km抗体筛选孵育，并通过碱裂解提取法和乙醇沉淀法制备pP43NMK质粒的基因组DNA，使用Pst I消化暴露出同源性，通过电泳跑胶回收线性载体，即得到所述的穿梭载体。

优选的，所述重组质粒的制备方法有如下几种：

1)方法一具体包括如下步骤：采用引物对P43-phoA-5/P43-phoA-3对质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA进行扩增，将得到的PCR产物和穿梭载体共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，并直接克隆在BAD启动子控制下表达的ETgA操纵子，用卡那霉素选择转化体，采用碱性裂解法提取质粒，并通过Ava I/EcoR I和BamH I/Ava I对转化体进一步筛选正确的限制性质粒，得到重组质粒pP43NMK-PhoA-km；所述引物对P43-phoA-5/P43-phoA-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，所述质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2)方法二具体包括如下步骤：采用引物对P43-DelSig-5/P43-phoA-3对质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA进行扩增，将得到的PCR产物和穿梭载体共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，在含有卡那霉素的LB琼脂平板上培养后选择转化子，采用碱性裂解法提取质粒，并通过BsrG I/Apal I、BamH I/Ava I和EcoR I/Pst I对转化子进一步筛选正确的限制性质粒，得到重组质粒pP43NMK-DelSigphoA-km；所述引物对P43-DelSig-5/P43-phoA-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.5所示，所述质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3)方法三具体包括如下步骤：所述重组质粒的制备方法具体包括如下步骤：以质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA为模板，分别采用引物对A DelSigphoA-3/A DelSigphoA-5，BDelSigphoA-3/B DelSigphoA-5和C DelSigphoA-3/C DelSigphoA-5进行扩增，得到的PCR产物混合再与和穿梭载体混合，共转化进入Ara诱导后的pSC101-BAD-ETgA-tet in DH5G，重组后得到重组质粒pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km；所述引物对A DelSigphoA-3/ADelSigphoA-5，B DelSigphoA-3/B DelSigphoA-5和C DelSigphoA-3/C DelSigphoA-5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12～17所示。

4)方法四具体包括如下步骤：采用引物对mazEF-5/mazEF-3对mazE-mazF质粒稳定***进行扩增，将得到的PCR产物与phoA基因组合并和穿梭载体共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，即得；所述mazE-mazF质粒稳定***的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述引物对mazEF-5/mazEF-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。基因组表达质粒pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km对AKP活性的提升效果最明显，所述基因组表达质粒pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

基于一个总的技术构思，本发明还提供一种高酶活性碱性磷酸酶的制备方法，包括如下步骤：将上述AKP异源表达工程菌进行培养，得到的发酵液经提取分离后，用丙酮沉淀法纯化，得到所述的高酶活性碱性磷酸酶。优选的，所述丙酮沉淀法采用的丙酮浓度为37.5％-50％(v/v)，丙酮处理时间为5-30min；更优选的，丙酮沉淀法采用的丙酮浓度为50％(v/v)，丙酮处理时间为30min。

本发明利用Red/ET同源重组技术、结合基因修饰和定点突变技术，在B.subtilis中构建高表达、高活性和具高稳定性质粒的AKP异源表达工程菌株，对发酵液直接分离后丙醇沉淀纯化AKP酶蛋白。在以往实验中，还未有大肠杆菌源AKP在细胞中进行炎症反应的研究，通过处理IPEC-J2细胞，检测细胞炎症相关因子基因表达量。AKP可促进哺乳动物肠道健康，包括预防和减少肠道炎症和细菌易位、调节肠道细菌生长和局部肠道pH值，可降低炎症反应，保护畜禽肠道健康。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明得到的AKP异源表达工程菌，其发酵的浓缩酶蛋白作为酶制剂，AKP热稳定性好，酶活性高，对炎症有抑制作用，可增强仔猪免疫力和抗病力，促进动物的生长发育，为生猪产业提供可持续发展动力，带来良好的经济效益，提升人民生活质量。

2、AKP异源表达工程菌构建方法，操作简单，操作周期短。

3、高酶活性碱性磷酸酶的制备方法，制备得到的AKP酶活性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为AKP的四环素抗性启动子在E.coli中的筛选；

图2为通过去除信号肽提高AKP的酶活性；

图3为通过点突变提高AKP的酶活性；

图4是B.subtilis中的DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N的质粒稳定性；

图5是AKP在大肠杆菌中的表达；

图6是AKP在发酵液中的分布；

图7是用酸、丙酮、乙醇和盐沉淀AKP；

图8是丙酮量对AKP活性的影响；

图9是在丙酮浓度(v/v)为50％的情况下孵育时间对AKP活性的影响；

图10是AKP的热稳定性；

图11是在120℃下孵育时间对AKP活性的影响；

图12是模拟灌胃过程下AKP对酸碱环境的影响；

图13是AKP对营养转运蛋白ASCT2基因表达的影响；

图14是AKP对紧密连接蛋白CLDN3基因表达的影响；

图15是AKP对白介素6基因表达的影响；

图16是AKP对白介素8基因表达的影响；

图17是AKP对TNF-α基因表达的影响。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种AKP异源表达工程菌，以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)为宿主，在该宿主细胞内转入携带有大肠杆菌(E.coli)phoA基因的重组质粒后而获得；大肠杆菌phoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3中任一项所示；重组质粒由大肠杆菌phoA基因***pP43NMK载体后获得；重组质粒中引入了mazE-mazF***，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

上述AKP异源表达工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1.AKP基因的筛选：

使用在线工具NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索来自不同物种(例如猪和微生物来源)的AKP基因的开放阅读框(起始密码子-终止密码子)；猪源和其他真核AKP基因具有内含子，可通过人工基因合成获得(生物工程(上海)有限公司，https：//mail.sangon.com/)它的开放阅读框，微生物源(E.coli、B.subtilis等微生物)AKP基因可通过PCR获得它的开放阅读框；共收集了phoA、phoE、ncdF等三种AKP基因的开放阅读框。利用Red/ET重组工程技术，构建包含不同物种来源AKP基因的表达质粒(载体为pGB)，并将AKP基因置于诱导型启动子(Ptet)之后，质粒中加入卡那与氯霉素抗性基因以及ccdA-ccdB稳定***基因。建立AKP基因文库后，通过在线分析软件(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析所获AKP的信号肽切割位点，为后续构建高表达、高活性AKP工程菌株奠定基础。

将不同物种来源的AKP分泌基因DNA构建PGB载体质粒，将构建体转移到异源宿主DH5α中。将构建好的质粒即：pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA(phoA from E.coli，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoE(phoE from B.subtilis)、pGB-Cm-ccdA-Ptet-NudF(nudF from B.subtilis)、pGB-Cm-ccdA-Ptet-APN(apn frompig)转化至DH5α中后，接种于37℃培养箱培养过夜，由卡那霉素抗性筛选正确构建体，转接至1mL LB液体培养基中，在恒温混匀仪中900rpm培养12h后，将每个质粒克隆在OD 600下均一化，以0.2μg/μL四环素诱导实验组，不加入四环素为对照组，将发酵液在37℃下孵育4小时。在四环素诱导和非诱导条件下，比较AKP的活性，并筛选高活性AKP基因以优化酶活性。从图1可看出，通过AKP试剂盒进行测试，在四环素诱导条件下，源自大肠杆菌的phoA基因酶活性得到显著增加，活性增加近2.5倍；而来自猪和枯草芽孢杆菌的AKP活性并未出现增加现象，因此选择大肠杆菌来源的phoA基因进行后续酶活性优化。

2.大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体(pP43NMK)及重组质粒的构建

可以直接采用市面上购买的pP43NMK载体。也可以利用酶切割技术处理质粒pP43NMK-APN-Cm-Km(其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，切割去除APN基因，制备大肠杆菌-枯草芽孢杆菌的穿梭载体(pP43NMK)，具体是将大肠杆菌DH5α用Km抗体筛选孵育，并通过碱裂解提取和乙醇沉淀制备pP43NMK基因组DNA，并使用Pst I消化暴露出同源性，在37℃下消化3小时后，电泳跑胶以回收6845bp片段作为线性载体，即得到pP43NMK载体。

分别用引物P43-phoA-5/P43-phoA-3(其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示)、P43-phoE-5/P43-phoE-3、P43-nudF-5/P43-nudF-3(见表1)从质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA、pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoE、pGB-Cm-ccdA-Ptet-NudF中分别制备碱性磷酸酶phoA、phoE、nudF基因。phoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将2ng PCR产物和2ngpP43NMK载体共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，并直接克隆在BAD启动子控制下表达的ETgA操纵子，用卡那霉素选择转化体，采用碱性裂解法提取质粒，并通过Ava I/EcoR I和BamH I/Ava I对正确的限制性质粒进行测序，并使用SeqMan软件进行序列比较以鉴定正确的重组体，检测其AKP活性。此处得到重组质粒pP43NMK-PhoA-km。本发明所采用的靶DNA序列寡核苷酸列于表1中。

表1：本发明中使用的寡核苷酸序列

3.质粒pP43NMK-DelSigphoA-km的构建

为了进一步提高AKP分泌基因phoA的酶活性，达到高水平生产的目的，在构建AKP表达质粒时根据预测的信号肽切割位点，通过Red/ET重组技术删除信号肽，设计上游引物P43-DelSig-5(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)与下游引物P43-phoA-3(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)从质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA中制备DelSigphoA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

将2ng PCR产物和2ng pP43NMK载体共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，在含有卡那霉素的LB琼脂平板上于37℃过夜生长后，选择转化子。采用碱性裂解法提取质粒，并通过BsrG I/Apal I、BamH I/Ava I和EcoR I/Pst I对转化子进一步筛选正确的限制性质粒进行测序，使用SeqMan软件进行序列比较以鉴定正确的重组体。得到DelSigphoA重组体及其质粒pP43NMK-DelSigphoA-km。

图2中，使用Red/ET重组技术删除信号肽以检测DelSigphoA重组菌酶活性，发现删除信号肽后酶活性明显增加，从数据上看，相较于PhoA提高5倍。

4.质粒pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km的构建

本发明还可以通过利用生物信息学AKP的特性，在去除信号肽的基础上对大肠杆菌AKP的活性位点进行D₁₅₃G-D₃₃₀N定向诱变，目的是更大化提高AKP的特异性活性。根据生物信息学定点突变DelSigphoA重组体基因，突变后得到的DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体操作步骤如下：(1)pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA，从-20度取该质粒0.5μL加入10μL水稀释备用；(2)分别以A DelSigphoA-3/A DelSigphoA-5，B DelSigphoA-3/B DelSigphoA-5和C DelSigphoA-3/C DelSigphoA-5为引物(核苷酸序列分别如SEQ IDNO.11～17所示，见表1)，以步骤1得到的产物为模板，进行50μL体系PCR，分别得到产物ADelSigphoA PCR，B DelSigphoA PCR和C DelSigphoA PCR，分别进行切胶回收；(3)将步骤(2)得到B DelSigphoA PCR和C DelSigphoA PCR各取1μL混合，混合后稀释10倍作为PCR模板，同时以B DelSigphoA-5/C DelSigphoA-3为引物，得到PCR产物B+C；将产物B+C切胶回收；(4)将步骤(2)得到的产物A DelSigphoA PCR和步骤(3)得到的产物B+C各取1μL混合，混合后稀释10倍作为PCR模板，同时以A DelSigphoA-5/C DelSigphoA-3为引物，得到PCR产物DelSigphoA PCR(A+B+C)，PCR产物过柱回收备用；(5)将步骤(4)得到的产物和pP43NMK载体各取2μL混合，共转化进入Ara诱导后的pSC101-BAD-ETgA-tet in DH5G，重组后，得到产物质粒pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km；(6)将酶切正确的克隆用P43-seq2，phoA-seq和P43-seq4引物(见表1)进行测序验证，验证正确的克隆转化至枯草芽孢杆菌，得到DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N突变体，检测其碱性磷酸酶活性。

从图3中发现DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N构建质粒(即pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km)的AKP活性最高，相较于DelSigPhoA质粒酶活性高30倍。

5.质粒稳定性优化

在发酵培养基中添加抗生素可以防止表达质粒的丢失，但是抗生素的引入将破坏动物的肠道平衡，这将限制AKP工程菌株的应用。为了不破坏动物的肠道平衡并且能有效的防止质粒丢失，提升质粒稳定性，本发明还可以在重组质粒pP43NMK-DelSigphoA-km、pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km的基础上引入将毒素-抗毒素***(mazE-mazF质粒稳定***)，具体操作如下：

通过NCBI网站查询mazE-mazF质粒稳定***(其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，设计合成mazEF-5与mazEF-3引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示)通过PCR获得mazEF，通过将PCR产物和2ng pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，将其引入pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-km表达质粒中，得到pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-Km-Cm-mazEF。通过测试质粒稳定性发现pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N-Km-Cm-mazEF的稳定性得到明显提升(图4)。

6.AKP在枯草芽孢杆菌中的高效表达

由于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)具有超强蛋白质和代谢产物的胞外分泌能力、不产生内毒素等特点，因此使用B.subtilis作为宿主进行AKP的异源表达。利用感受态转化的方法将重组质粒转化至B.subtilis，得到AKP异源表达工程菌株DelSigphoA重组体、DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N突变体。

枯草芽孢杆菌转化过程：首先在37℃恒温培养箱中使用LB平板激活枯草芽孢杆菌；将菌体转接至30℃，800rpm恒温混匀仪下使用1.8mL GM I培养基孵育过夜；随后将1mL发酵液转移到9mL GM I培养基中，并在37℃快速摇床(250rpm/min)上孵育210min；随后将5mL培养液转移到45mL GM II中，利用37℃缓慢摇床(125rpm/min)孵育90min后，收集菌体即感受态细胞以5000g离心10min；均分每管200μL，并加入30μLDNA后以700rpm/min的速度在30℃下孵育1h后，9000rpm然后将100μL细菌涂布到相应的抗体板上，并在37℃下培养过夜。

培养基GM I的配置材料如下：K₂HPO₄13.4 g/L，KH₂PO₄ 5.7g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.9g/L，Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，glucose0.5 g/L，Casein 0.2g/L，Yeastextract1 g/L。

GM II的配置材料如下：K₂HPO₄13.4 g/L，KH₂PO₄5.7 g/L，(NH₄)₂SO₄1.9g/L，Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 1g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，glucose0.5 g/L，Casein 0.04g/L，Yeastextract 0.04g/L，MgCl₂0.51 g/L，CaCl₂0.37 g/L。

从图5中观察到，测试其AKP活性，发现在B.subtilis中，源自大肠杆菌PhoA酶活仍然是最高，并且相较于在大肠杆菌中PhoA高达10倍。

实施例2：

一种高酶活性碱性磷酸酶的制备方法，具体操作及实验步骤如下：

1.发酵液浸提

为了明确AKP分泌于菌株胞内或胞外，将实施例1得到的AKP异源表达工程菌株(DelSigphoA重组体、DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N突变体)的上清液与菌体分装，采用超声波破碎仪处理菌体重悬液，使用AKP试剂盒检测上清液与菌体破碎液的AKP活性，

操作方法：将AKP异源表达工程菌株涂布于固体培养基上37℃培养箱培养过夜，由Km抗性筛选重组子，使用1mL Km抗性液体培养基在900rpm恒温混匀仪中培养12h扩增细菌，并将发酵液于4℃、9000rpm/min条件下离心10min，分别分装上清液与菌体，将菌体重悬于1mL LB液体培养基中，随后采用超声波破碎仪处理重悬液，检测上清液与菌体破碎液的AKP活性。从图6可看出，AKP主要分布在上清液中。

2.AKP的提纯参数优化

收集步骤1得到的AKP异源表达工程菌株发酵液上清液，采取酸、丙酮、乙醇、盐沉淀的方法沉淀析出AKP，使用AKP试剂盒检测重悬液的AKP活性。

操作方法：收集发酵液1mL上清液，采取(1)酸，向上清液中缓慢加入2％的HCl，使上清液最终pH依次为：4、4.5、5、5.5、6反应30min；(2)丙酮，向上清液中加入等量的4℃丙酮溶液反应30min；(3)乙醇，向上清液中加入等量的4℃乙醇溶液反应30min；(4)盐沉淀，向上清液中加入等量的饱和NaCl溶液反应30min等的方法沉淀AKP，将混合液置于4℃、9000rpm/min条件下离心30min，收集沉淀，将沉淀重悬于100μL LB液体培养基中。使用AKP试剂盒检测重悬液的AKP活性。

从图7发现，相比较于对照组，在酸性pH为4、4.5、5、5.5、6均没有酶活性表现，并且盐沉淀的条件下，AKP也无活性表现，在丙酮与乙醇处理下，检测到AKP有一定活性，但在丙酮处理情况下沉淀酶蛋白效果最佳，检测活性接近于原液，因此可推测出相较于其他条件，丙酮为AKP最佳析出试剂。

收集高浓度AKP需大量培养发酵液，为了优化丙酮的使用量，将发酵液︰丙酮比值为1:0、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6的比值处理30min，将混合液置于4℃、9000rpm/min条件下离心30min，收集沉淀，将沉淀重悬于100μL LB液体培养基中，使用AKP试剂盒检测重悬液的AKP活性。从图8中发现在一定范围内，丙酮使用量越大，AKP酶活越高，因此选择最佳使用量50％(v/v)丙酮浓度。

为了优化丙酮的处理时间，使用丙酮最佳处理量处理AKP菌株上清液5min、10min、15min、20min、25min、30min，利用AKP试剂盒检测沉淀蛋白重悬液的AKP活性。

从图9中发现，在一定范围内，处理时间越长AKP的活性越高，选择最佳处理时间30min。

3.AKP的热稳定性

为了确定AKP能否在高温下进行浓缩纯化，检测AKP的热稳定性。将实施例1得到的AKP异源表达工程菌株(DelSigphoA重组体、DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N突变体)在Km抗性固体培养基上激活，并且在37℃培养箱中培养过夜，使用1mLKm抗性液体培养基扩增筛选细菌，检测不同温度对AKP异源表达工程菌株酶活性的影响，置于20℃、37℃、60℃、80℃、100℃、120℃等温度处理下5min，将处理液置于1500rpm/min条件下离心10min。由于有技术可在短时间进行高温浓缩碱性磷酸酶，检测AKP异源表达工程菌株在120℃下不同处理时间对AKP活性的影响，将其置于120℃下分别处理0、5s、20s、1min、5min，将处理液置于1500rpm/min条件下离心10min。结果表明，当温度为60℃时，DelSigphoA重组体的相对活性显着降低，仅保留40％。DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N突变体的酶活性没有明显变化。当温度升至120℃时，两种AKP异源表达工程菌株的酶活性仅保留20％(图10)。

正常的喷雾干燥实际上在高温下保持5秒钟，通过缩短120℃的处理时间来检测AKP异源表达工程菌株的活性。处理1分钟后，DelsigphoA重组体的酶活性降低了60％，而DelsigD₁₅₃G-D₃₃₀N突变体仅降低了20％。结果表明，DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N突变体的热稳定性比DelSigphoA更稳定，并且在120℃处理1分钟后仍保持较高的酶活性(图11)。并且可以看出两种AKP异源表达工程菌株都可以在高温下干燥并保持高的酶活性。

4.动态测量体外AKP活性的模拟

为了检测AKP通过灌胃方式经过仔猪消化***时酸碱影响的活性变化，外界模拟仔猪胃、小肠、大肠等部位的pH。

将实施例1得到的AKP异源表达工程菌株(DelSigphoA重组体、DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N突变体)用20mL Km抗性液体培养基中培养12h扩增筛选，并将发酵液于4℃、9000rpm/min条件下离心10min，取上清液。向上清液中缓慢加入2％HCl混匀后将其pH调至2.3-2.5之间取出1mL后，随后向上清液中缓慢加入2％NaOH混匀后将其pH调至7.0-8.0之间取出1mL后，再次缓慢加入2％HCl混匀后将其pH调至6.0-7.0之间取出1mL，在各条件下处理2h后再将反应液取出，使用AKP试剂盒分别检测在不同部位的pH下AKP活性。

通过对DelSigphoA、DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N两种AKP异源表达工程菌株进行实验，使用AKP试剂盒分别检测在不同部位的pH下AKP活性。结果见图12，发现在酸性条件下(胃：pH＝2.3-2.5)检测其AKP活性，DelSigphoA、DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N菌株的AKP相对酶活力趋向零；而从酸性条件调至小肠(pH＝7-8)条件后，DelSigphoA菌株的AKP活性得到恢复达到20％，而DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N的AKP活性恢复到30％；调至大肠(pH＝6-7)条件下，DelSigPhoA菌株的AKP活性恢复到55％，而质粒DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N的AKP活性恢复到65％。实验结果表明，AKP在酸性条件下不表现活性，但并未完全变性，从酸性条件下恢复到碱性条件后，AKP活性得到一定恢复，因此可看出AKP在弱碱性条件下稳定性较强，在酸性条件下酶活力较低甚至没有。

5.实时定量PCR

以下是进行反转录反应，选择TB Green Premix ExTaq^TMII(RR820A,Takara)进行Real Time PCR反应。在Applied Biosystems Real Time PCR System(Thermo FisherScientific)中通过实时qPCR对促炎症因子的转录水平进行分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等，以确保反应的特异性。使用β-Actin抗体和亲环蛋白-A(CycA)作为内部参考基因。如前所述，使用ΔΔCT方法计算PCR产物的量。为了确定参考基因的稳定性，通过在2％琼脂糖凝胶中电泳分离PCR扩增子，通过在琼脂糖凝胶中可视化来验证所得的条带，并通过Take3^TM多体积板进行定量。

将DelSigphoA、DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N两种AKP异源表达工程菌株的酶蛋白过滤液添加到IPEC-J2细胞培养中。为了检测菌株的上清液对对IPEC-J2细胞转运蛋白基因表达的影响，测定了氨基酸转运蛋白2(ASCT2)的相对基因表达量，图13显示，与对照组相比，DelSigphoA和DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N均对ASCT2无明显影响，p值分别为0.276和0.109。

为了检测AKP对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白相对基因表达的影响，检测处理组中CLDN3的基因表达，图14显示，与对照相比，DelSigphoA(P＝0.002)和DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N(p<0)极显着上调了claudin3(CLDN3)的表达。为了检测菌株的上清液对IPEC-J2细胞的抗炎特性，测定了促炎细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的相对基因表达水平变化。从图15中看出，与对照相比，DelSigphoA对IL-6基因表达没有显着影响(P＝0.863)，而DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N显着下调了其表达(p＝0.002)。从图16中可看出DelSigphoA(p＝0.457)、DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N(p＝0.054)对IL-8表达无影响。从图17中可看出DelSigphoA(p＝0.336)无明显影响，DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N(p＝0.005)极显着下调了TNF-α基因表达的表达。由此可明显看出DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N对炎症抑制的有益作用。

综上所述，AKP对哺乳动物肠道健康具有促进作用，具体包括预防和减少肠道炎症和细菌易位、调节肠道细菌生长和局部肠道pH值。但鲜少有研究外源大肠杆菌源AKP处理细胞降低炎症反应。本发明通过利用Red/ET同源重组技术，结合基因修饰技术和定点突变技术，构建高表达、高活性和具高稳定性质粒的AKP异源表达工程菌株；利用具有强大的分泌异源酶和蛋白质的能力的B.subtilis作为过量生产异源蛋白的宿主，在双重效应下，更大程度提高AKP蛋白基因表达量。以添加外源AKP的方式增加活性，达到调节胃肠道菌群生长、减少胃肠道炎症的目的。本发明进一步试验，在猪的小肠上皮细胞中进行效应实验，结果表明大肠杆菌外源AKP能有效的减少猪的小肠上皮细胞促炎性细胞因子基因的表达，在炎症状态下有效增强肠屏障结构和功能。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一种AKP异源表达工程菌及其构建方法和高酶活性碱性磷酸酶的制备方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 1

atgcgcaact cgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60

gtttttgtaa cacatgcctc agctgcaaaa caaagcacta ttgcactggc actcttaccg 120

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ttttttaaag gtatagatgc cttaccgctt accgggcaat acactcacta tgcgctgaat 420

aaaaaaaccg gcaaaccgga ctacgtcacc gactcggctg catcagcaac cgcctggtca 480

accggtgtca aaacctataa cggcgcgctg ggcgtcgata ttcacgaaaa agatcaccca 540

acgattctgg aaatggcaaa agccgcaggt ctggcgaccg gtaacgtttc taccgcagag 600

ttgcaggatg ccacgcccgc tgcgctggtg gcacatgtga cctcgcgcaa atgctacggt 660

ccgagcgcga ccagtgaaaa atgtccgggt aacgctctgg aaaaaggcgg aaaaggatcg 720

attaccgaac agctgcttaa cgctcgtgcc gacgttacgc ttggcggcgg cgcaaaaacc 780

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gcgcgtggtt atcagttggt gagcgatgct gcctcactga attcggtgac ggaagcgaat 900

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ccgaaagcaa cgtaccatgg caatatcgat aagcccgcag tcacctgtac gccaaatccg 1020

caacgtaatg acagtgtacc aaccctggcg cagatgaccg acaaagccat tgaattgttg 1080

agtaaaaatg agaaaggctt tttcctgcaa gttgaaggtg cgtcaatcga taaacaggat 1140

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ctgcagctgg acttgatatc gctcacaatt ccacacaac                        1539

<210> 2

<211> 1430

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 2

cggcccaaat ggtttttgta acacatgcct cagctgcacg gacaccagaa atgcctgttc 60

tggaaaaccg ggctgctcag ggcgatatta ctgcacccgg cggtgctcgc cgtttaacgg 120

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ggctgaaata actgcagctg gacttgatat cgctcacaat tccacacaac            1430

<210> 3

<211> 1430

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 3

cggcccaaat ggtttttgta acacatgcct cagctgcacg gacaccagaa atgcctgttc 60

tggaaaaccg ggctgctcag ggcgatatta ctgcacccgg cggtgctcgc cgtttaacgg 120

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aacaggcaca ggcgcgtggt tatcagttgg tgagcgatgc tgcctcactg aattcggtga 780

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ggctgaaata actgcagctg gacttgatat cgctcacaat tccacacaac            1430

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 4

cggcccaaat ggtttttgta acacatgcct cagctgcaaa acaaagcact attgcactg 59

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 5

gttgtgtgga attgtgagcg atatcaagtc cagctgcagt tatttcagcc ccagagcgg 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 6

cggcccaaat ggtttttgta acacatgcct cagctgcacg gacaccagaa atgcctgtt 59

<210> 7

<211> 4209

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 7

gaattaatga tgtctcgttt agataaaagt aaagtgatta acagcgcatt agagctgctt 60

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accagaccga tctcttctac accatgaaag ccgctctggg gctgaaataa gtcgacgtca 3000

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cactaccggg cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg 3180

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cggccttttt aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca 3360

ttcttgcccg cctgatgaat gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc 3420

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aagatgtggc gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata 3600

tgtttttcgt ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca 3660

atatggacaa cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca 3720

aggtgctgat gccgctggcg attcaggttc atcatgccgt cccagcccgc ctaatgagcg 3780

ggcttttttt tgaacaaaag gctgcagctg gacttctaga gctagcctcg agtgtcaaac 3840

atgagaattc tagagtcaac ataacgaaag gtaaaataca taaggcttac taaaagccag 3900

ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt ttgcggtata agaatatata ctgatatgta 3960

tacccgaagt atgtcaaaaa gaggtgtgct atgaagcagc gtattacagt gacagttgac 4020

agcgacagct atcagttgct caaggcatat gatgtcaata tctccggtct ggtaagcaca 4080

accatgcaga atgaagcccg tcgtctgcgt gccgaacgct ggaaagcgga aaatcaggaa 4140

gggatggctg aggtcgcccg gtttattgaa atgaacggct cttttgctga cgagaacagg 4200

gactggtga                                                         4209

<210> 8

<211> 9221

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 8

tagagggaat tgatgaatta tatcaacata ttaagccttt gggcattttg caccccaata 60

catcattaaa agatcagtgg tgggatgaac gagactttgc agtaattgat cccgacaaca 120

atttgattag cttttttcaa caaataaaaa gctaaaatct attattaatc tgttcagcaa 180

tcgggcgcga ttgctgaata aaagatacga gagacctctc ttgtatcttt tttattttga 240

gtggttttgt ccgttacact agaaaaccga aagacaataa aaattttatt cttgctgagt 300

ctggctttcg gtaagctaga caaaacggac aaaataaaaa ttggcaaggg tttaaaggtg 360

gagatttttt gagtgatctt ctcaaaaaat actacctgtc ccttgctgat ttttaaacga 420

gcacgagagc aaaacccccc tttgctgagg tggcagaggg caggtttttt tgtttctttt 480

ttctcgtaaa aaaaagaaag gtcttaaagg ttttatggtt ttggtcggca ctgccgcgcc 540

tcgcagagca cacactttat gaatataaag tatagtgtgt tatactttac ttggaagtgg 600

ttgccggaaa gagcgaaaat gcctcacatt tgtgccacct aaaaaggagc gatttacata 660

tgagttatgc agtttgtaga atgcaaaaag tgaaatcagc tggactaaaa ggcatgcaat 720

ttcataatca aagagagcga aaaagtagaa cgaatgatga tattgaccat gagcgaacac 780

gtgaaaatta tgatttgaaa aatgataaaa atattgatta caacgaacgt gtcaaagaaa 840

ttattgaatc acaaaaaaca ggtacaagaa aaacgaggaa agatgctgtt cttgtaaatg 900

agttgctagt aacatctgac cgagattttt ttgagcaact ggatcctgat aggtggtatg 960

ttttcgcttg aacttttaaa tacagccatt gaacatacgg ttgatttaat aactgacaaa 1020

catcaccctc ttgctaaagc ggccaaggac gccgccgccg gggctgtttg cgttcttgcc 1080

gtgatttcgt gtaccattgg tttacttatt tttttgccaa ggctgtaatg gctgaaaatt 1140

cttacattta ttttacattt ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa 1200

tataaagtga tagcggtacc attatgggta agagaggaat gtacgcatgc gcaactcgac 1260

caagacatct ctattactgg ccggcttatg cacagcggcc caaatggttt ttgtaacaca 1320

tgcctcagct gcacaaggtg gctgggttct gcttcttctt ggtttaagac tgccgctttc 1380

actgggcttt atcccggttg aagaggagga tccggcattc tggaatagac aagctgcaca 1440

agcgcttgac gtggcgaaaa agctgcagcc gattcaaacg gcggcgaaga atctgatttt 1500

atttcttggc gacggcatgg gcgtgagcac agttacggcg acacgcattt taaaaggaca 1560

gatgaacgga aagcccggtc cggaaacacc gcttgcaatg gatcgcttcc cgtatttagc 1620

gctgagcaag acgtataacg tggatcgcca agtgccggat tcagcgggaa caacaacagc 1680

gtatttatgc ggcgtgaaga cgaatatgaa agtgatcggc gtgagcgcag cagcacgcta 1740

tgatcagtgc aacacaacgc aaggtaacga ggtgatcagc gtgatgaatc gcgcgaagaa 1800

ggcgggaaaa tcagttggcg tggttacgac gacgcgcgtg caacatgcgt caccggctgg 1860

tgcgtacgca cacacagtga accgcaactg gtatagcgat gcggaccttc cggcggaagc 1920

gaaaaaaaac ggatgtcaag atattagcac acagcttgtg tataatatgg atattgatgt 1980

gattttaggc ggcggccgca aatatatgtt cccggaagga acgccggacc cggaatatcc 2040

cgataacccg cgccaaaatg gcgtgcgcaa agataagcgc aatttagtgc aagaatggca 2100

agcgaaacat caaggcgcac gctacgtgtg gaatcgcaca gcactgattc aagctagcca 2160

agatccgtct ttaacgcatt taatgggttt atttgaaccg ggagacatga agtatgaaaa 2220

agagcgcgat ctgtctcgcg atccgtctct ggtggaaatg acggaagttg cactgcgcct 2280

tctgagccgc aatccgcgcg gctttttttt attcgtggaa ggaggccgca tcgatcatgg 2340

acatcatgag ggcattgcgt accgcgcgct gatcgaaacg gtggtgtttg acacggcgat 2400

cgataaagct ggtcagctga caagcgaaga ggatacactg acgcttgtga cagcggatca 2460

cagccatgtg tttacgtacg gaggctaccc gcttagagga agcagcgttt ttggtttagc 2520

ggacggcaag gcgagcgatg gcaaagcgta tacaagcatt ttatatggaa acggcccggg 2580

ctataaactg agcgaaggcg cacgcccgga tgtggatgaa acgaaatcac gcgacccggc 2640

gtacgtgcaa caagcagcgg tgccgcttgg cgcagaaaca catggaggcg aggatgtggc 2700

agtgtttgca cgcggcccga gagcgcatct ggttcatggc gtgcaagaac aaagctttgt 2760

ggcgcatgtg atggcattcg cggcgtgttt agaaccgtat acatcagact gcgatctgcc 2820

gccgccttct ggtccgacag cagctggtca tccgggcccc gctgcgtgta catctttact 2880

tgcacttctg gctggtgcgc tgcttcttct gcttgcaccg gcgctgcatt gatttaaata 2940

agcttggcga agatcacttc gcagaataaa taaatcctgg tgtccctgtt gataccggga 3000

agccctgggc caacttttgg cgaaaatgag acgttgatcg gcacgtaaga ggttccaact 3060

ttcaccataa tgaaataaga tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag 3120

gagctaagga agctaaaatg gagaaaaaaa tcactggata taccaccgtt gatatatccc 3180

aatggcatcg taaagaacat tttgaggcat ttcagtcagt tgctcaatgt acctataacc 3240

agaccgttca gctggatatt acggcctttt taaagaccgt aaagaaaaat aagcacaagt 3300

tttatccggc ctttattcac attcttgccc gcctgatgaa tgctcatccg gaattccgta 3360

tggcaatgaa agacggtgag ctggtgatat gggatagtgt tcacccttgt tacaccgttt 3420

tccatgagca aactgaaacg ttttcatcgc tctggagtga ataccacgac gatttccggc 3480

agtttctaca catatattcg caagatgtgg cgtgttacgg tgaaaacctg gcctatttcc 3540

ctaaagggtt tattgagaat atgtttttcg tctcagccaa tccctgggtg agtttcacca 3600

gttttgattt aaacgtggcc aatatggaca acttcttcgc ccccgttttc accatgggca 3660

aatattatac gcaaggcgac aaggtgctga tgccgctggc gattcaggtt catcatgccg 3720

tctgtgatgg cttccatgtc ggcagaatgc ttaatgaatt acaacagtac tgcgatgagt 3780

ggcagggcgg ggcgtaaccc agcccgccta atgagcgggc ttttttttga acaaaaggct 3840

gcagctggac ttgatatcgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 3900

taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 3960

cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 4020

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 4080

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 4140

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 4200

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 4260

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 4320

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 4380

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 4440

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 4500

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 4560

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 4620

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 4680

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 4740

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 4800

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 4860

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 4920

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 4980

tgacagctcg agttagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc 5040

aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc 5100

gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac 5160

atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc 5220

atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagttta tgcatttctt tccagacttg 5280

ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt 5340

cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca 5400

aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc 5460

tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccagggatcg cagtggtgag 5520

taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc 5580

cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc 5640

atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc 5700

tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat ccatgttgga 5760

atttaatcgc ggcctagagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcatac tcttcctttt 5820

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 5880

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 5940

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 6000

ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga 6060

gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc 6120

agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact 6180

gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat 6240

caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc 6300

ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac 6360

gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattcc ttaaggaacg 6420

tacagacggc ttaaaagcct ttaaaaacgt ttttaagggg tttgtagaca aggtaaagga 6480

taaaacagca caattccaag aaaaacacga tttagaacct aaaaagaacg aatttgaact 6540

aactcataac cgagaggtaa aaaaagaacg aagtcgagat cagggaatga gtttataaaa 6600

taaaaaaagc acctgaaaag gtgtcttttt ttgatggttt tgaacttgtt ctttcttatc 6660

ttgatacata tagaaataac gtcattttta ttttagttgc tgaaaggtgc gttgaagtgt 6720

tggtatgtat gtgttttaaa gtattgaaaa cccttaaaat tggttgcaca gaaaaacccc 6780

atctgttaaa gttataagtg actaaacaaa taactaaata gatgggggtt tcttttaata 6840

ttatgtgtcc taatagtagc atttattcag atgaaaaatc aagggtttta gtggacaaga 6900

caaaaagtgg aaaagtgaga ccatggagag aaaagaaaat cgctaatgtt gattactttg 6960

aacttctgca tattcttgaa tttaaaaagg ctgaaagagt aaaagattgt gctgaaatat 7020

tagagtataa acaaaatcgt gaaacaggcg aaagaaagtt gtatcgagtg tggttttgta 7080

aatccaggct ttgtccaatg tgcaactgga ggagagcaat gaaacatggc attcagtcac 7140

aaaaggttgt tgctgaagtt attaaacaaa agccaacagt tcgttggttg tttctcacat 7200

taacagttaa aaatgtttat gatggcgaag aattaaataa gagtttgtca gatatggctc 7260

aaggatttcg ccgaatgatg caatataaaa aaattaataa aaatcttgtt ggttttatgc 7320

gtgcaacgga agtgacaata aataataaag ataattctta taatcagcac atgcatgtat 7380

tggtatgtgt ggaaccaact tattttaaga atacagaaaa ctacgtgaat caaaaacaat 7440

ggattcaatt ttggaaaaag gcaatgaaat tagactatga tccaaatgta aaagttcaaa 7500

tgattcgacc gaaaaataaa tataaatcgg atatacaatc ggcaattgac gaaactgcaa 7560

aatatcctgt aaaggatacg gattttatga ccgatgatga agaaaagaat ttgaaacgtt 7620

tgtctgattt ggaggaaggt ttacaccgta aaaggttaat ctcctatggt ggtttgttaa 7680

aagaaataca taaaaaatta aaccttgatg acacagaaga aggcgatttg attcatacag 7740

atgatgacga aaaagccgat gaagatggat tttctattat tgcaatgtgg aattgggaac 7800

ggaaaaatta ttttattaaa gagtagttca acaaacgggc cagtttgttg aagattagat 7860

gctataattg ttattaaaag gattgaagga tgcttaggaa gacgagttat taatagctga 7920

ataagaacgg tgctctccaa atattcttat ttagaaaagc aaatctaaaa ttatctgaaa 7980

agggaatgag aatagtgaat ggaccaataa taatgactag agaagaaaga atgaagattg 8040

ttcatgaaat taaggaacga atattggata aatatgggga tgatgttaag gctattggtg 8100

tttatggctc tcttggtcgt cagactgatg ggccctattc ggatattgag atgatgtgtg 8160

tcatgtcaac agaggaagca gagttcagcc atgaatggac aaccggtgag tggaaggtgg 8220

aagtgaattt tgatagcgaa gagattctac tagattatgc atctcaggtg gaatcagatt 8280

ggccgcttac acatggtcaa tttttctcta ttttgccgat ttatgattca ggtggatact 8340

tagagaaagt gtatcaaact gctaaatcgg tagaagccca aacgttccac gatgcgattt 8400

gtgcccttat cgtagaagag ctgtttgaat atgcaggcaa atggcgtaat attcgtgtgc 8460

aaggaccgac aacatttcta ccatccttga ctgtacaggt agcaatggca ggtgccatgt 8520

tgattggtct gcatcatcgc atctgttata cgacgagcgc ttcggtctta actgaagcag 8580

ttaagcaatc agatcttcct tcaggttatg accatctgtg ccagttcgta atgtctggtc 8640

aactttccga ctctgagaaa cttctggaat cgctagagaa tttctggaat gggattcagg 8700

agtggacaga acgacacgga tatatagtgg atgtgtcaaa acgcatacca ttttgaacga 8760

tgacctctaa taattgttaa tcatgttggt tacgtattta ttaacttctc ctagtattag 8820

taattatcat ggctgtcatg gcgcattaac ggaataaagg gtgtgcttaa atcgggccat 8880

tttgcgtaat aagaaaaagg attaattatg agcgaattga attaataata aggtaataga 8940

tttacattag aaaatgaaag gggattttat gcgtgagaat gttacagtct atcccggcat 9000

tgccagtcgg ggatattaaa aagagtatag gtttttattg ggataaagta ggtttcactt 9060

tggttcacca tgaagatgga ttcgcagttc taatgtgtaa tgaggttcgg attcatctat 9120

gggaggcaag tgatgaaggc tggcgcctcg tagtaatgat tcaccggttt gtacaggtgc 9180

ggagtcgttt attgctggta ctgctagttg ccgcattgaa g                     9221

<210> 9

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 9

atgatccaca gtagcgtaaa gcgttgggga aattcaccgg cggtgcggat cccggctacg 60

ttaatgcagg cgctcaatct gaatattgat gatgaagtga agattgacct ggtggatggc 120

aaattaatta ttgagccagt gcgtaaagag cccgtattta cgcttgctga actggtcaac 180

gacatcacgc cggaaaacct ccacgagaat atcgactggg gagagccgaa agataaggaa 240

gtctggtaat ggtaagccga tacgtacccg atatgggcga tctgatttgg gttgattttg 300

acccgacaaa aggtagcgag caagctggac atcgtccagc tgttgtcctg agtcctttca 360

tgtacaacaa caaaacaggt atgtgtctgt gtgttccttg tacaacgcaa tcaaaaggat 420

atccgttcga agttgtttta tccggtcagg aacgtgatgg cgtagcgtta gctgatcagg 480

taaaaagtat cgcctggcgg gcaagaggag caacgaagaa aggaacagtt gccccagagg 540

aattacaact cattaaagcc aaaattaacg tattgattgg gtagtgttac taactcactt 600

ctattctggt cacaggtttc cacctgacag acccgcaatt ttcaggacaa ttcaatgaat 660

caaatcgacc gtttgctcac tattatgcag cgcctgcgcg                       700

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 10

cctaatgact ggcttttata aaggaggaag cttcatgatc cacagtagcg taaagcgt 58

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 11

gcgttttgac acatccacta tatatccgtg tcgactaccc aatcagtacg ttaattttg 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 12

cggcccaaat ggtttttgta acacatgcct cagctgcacg gacaccagaa atgcctgtt 59

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 13

ctgcaactct gcggtagaaa c 21

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 14

gtttctaccg cagagttgca gggcgccacg cccgctgcgc tggtg 45

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 15

cccacaagga ttcgcagcat gattctgttt atcgattgac gcac 44

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 16

catgctgcga atccttgtgg g 21

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(ArtificialSequence)

<400> 17

gttgtgtgga attgtgagcg atatcaagtc cagctgcagt tatttcagcc ccagagcgg 59

Claims (7)

1.一种AKP异源表达工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌（B.subtilis）为宿主，在该宿主细胞内转入携带有大肠杆菌（E.coli）phoA基因的重组质粒后而获得；所述大肠杆菌phoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3中任一项所示；

所述携带有大肠杆菌phoA基因的重组质粒由大肠杆菌（E.coli）phoA基因***穿梭载体后获得，所述穿梭载体为pP43NMK载体；

所述重组质粒中引入了mazE-mazF***，所述mazE-mazF质粒稳定***的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.一种AKP异源表达工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将大肠杆菌（E.coli）phoA基因***穿梭载体，通过碱性裂解法制成携带有大肠杆菌phoA基因的重组质粒；所述大肠杆菌phoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3中任一项所示；

（2）利用感受态转化的方法将所述步骤（1）得到的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌（B.subtilis）中，得到AKP异源表达工程菌；

所述穿梭载体为pP43NMK载体，或由以下方法制备得到：将大肠杆菌DH5α用Km抗体筛选孵育，并通过碱裂解提取法和乙醇沉淀法制备pP43NMK质粒的基因组DNA，使用Pst I消化暴露出同源性，通过电泳跑胶回收线性载体，即得到所述的穿梭载体。

3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒的制备方法具体包括如下步骤：采用引物对P43-PhoA-5/P43-PhoA-3对质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA进行扩增，将得到的PCR产物和穿梭载体共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，并直接克隆在BAD启动子控制下表达的ETgA操纵子，用卡那霉素选择转化体，采用碱性裂解法提取质粒，并通过Ava I/EcoR I和BamH I/Ava I对转化体进一步筛选正确的限制性质粒，得到重组质粒pP43NMK-PhoA-km；

所述引物对P43-PhoA-5/P43-PhoA-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，所述质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒的制备方法具体包括如下步骤：采用引物对P43-DelSig-5/P43-PhoA-3对质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA进行扩增，将得到的PCR产物和穿梭载体共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，在含有卡那霉素的LB琼脂平板上培养后选择转化子，采用碱性裂解法提取质粒，并通过BsrG I/Apal I、BamH I/Ava I和EcoR I/Pst I对转化子进一步筛选正确的限制性质粒，得到重组质粒pP43NMK-DelSigphoA-km；

所述引物对P43-DelSig-5/P43-PhoA-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.5所示，所述质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

5. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒的制备方法具体包括如下步骤：以质粒pGB-Cm-ccdA-Ptet-PhoA为模板，分别采用引物对A DelSigphoA-3/ ADelSigphoA-5，B DelSigphoA-3/ B DelSigphoA-5和C DelSigphoA-3/ C DelSigphoA-5进行扩增，得到的PCR产物混合再与和穿梭载体混合，共转化进入Ara诱导后的pSC101-BAD-ETgA-tet in DH5G，重组后得到重组质粒pP43NMK-DelSigD₁₅₃G-D₃₃₀N；

所述引物对A DelSigphoA-3/ A DelSigphoA-5，B DelSigphoA-3/ B DelSigphoA-5和C DelSigphoA-3/ C DelSigphoA-5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12~17所示。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒的制备方法具体包括如下步骤：采用引物对mazEF-5/mazEF-3对mazE-mazF质粒稳定***进行扩增，将得到的PCR产物和重组质粒共电穿孔到L-***糖诱导的DH5α细胞过表达中，即得；

所述mazE-mazF质粒稳定***的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述引物对mazEF-5/mazEF-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。

7.一种高酶活性碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将如权利要求1或由2-6中任一项所述构建方法得到的AKP异源表达工程菌进行培养，得到的发酵液经提取分离后，用丙酮沉淀法纯化，得到所述的高酶活性碱性磷酸酶。

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