CN113567583B - 应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法 - Google Patents

应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用固相萃取‑超临界流体色谱‑质谱法检测乳中极性脂的方法，属于食品检测领域，本方法包括：含有极性脂的总脂质物的提取步骤，极性脂的富集和净化得到极性脂富集物的步骤以及对极性脂富集物复溶后进行超临界流体色谱‑质谱检测分析的步骤，实现了极性脂极低含量(小于5％)样品的富集，操作简便、样品消耗量少、成本较低、检测迅速、定性定量能力较强、实用性强，结果稳定可靠，适合统一检测乳中极性范围分布较广的极性脂。可在10分钟内检测14大类极性脂，适用于各种乳液、乳制品、乳粉及其他生物样本中的极性脂的快速分析。

Description

应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的 方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，涉及乳中极性脂的检测方法，尤其涉及一种应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法。
背景技术
乳脂以脂肪球形式存在于乳中，其核心甘油三酯被外部由磷脂、胆固醇等极性脂组成的膜包围，从而保持整个乳液体系稳定。胆固醇是细胞膜的重要成分，乳中磷脂与婴儿大脑和肠道免疫***发育、胃肠道感染保护以及老年人记忆力改善相关，磷脂酰胆碱(PC)和神经鞘磷脂(SM)是重要的极性脂，是器官和细胞膜快速生长所需的结构成分。乳脂中有约98％为甘油三酯，极性脂含量极少。因此，在一些检测过程中，高含量的甘油三酯对极性脂的检测造成干扰。因此，往往需要对极性脂进行富集和净化。乳中极性脂组成复杂、性质差异大，较难分析。
固相萃取(SPE)是样品制备的有效方法之一，其基本原理类似于液-液萃取，该方法能够从样品溶液中吸附并富集和纯化固体吸附剂填料上的分析物。针对极性脂的富集和净化，目前已有的专利和文献针对磷脂进行富集，然而现有方法大多存在神经鞘磷脂和胆固醇损失的问题。胆固醇相比于磷脂，与甘油三酯的极性更接近，使得分离纯化难度提高。另外，已有专利CN106153763A 通过液相对极性脂进行分离纯化，但该方法存在操作繁复，易造成胆固醇和神经鞘磷脂的损失，且单次样本乳脂消耗量大等问题。
相关技术中，鲜有报道能够同时定性定量检测乳中胆固醇、磷脂和鞘脂的组成，这往往需要多种不同的检测方法，进而导致了数据无法统一并且增加了乳脂消耗量，使得一些珍稀乳品的检测受到了限制。另外，相关技术中的极性脂的色谱检测方法时间普遍较长，使得极性脂分子种类难以实现准确定性。
发明内容
因此，为了克服上述目前相关技术中的缺陷，本发明的第一个目的是提供一种乳中极性脂的固相萃取-超临界流体色谱-质谱的检测方法，包括以下步骤：
含有极性脂的总脂质物的提取步骤，极性脂的富集和净化得到极性脂富集物的步骤以及对极性脂富集物复溶后进行超临界流体色谱-质谱检测分析的步骤。本检测方法可以实现胆固醇、磷脂和鞘脂的统一测定，优化固相萃取条件使得胆固醇和神经鞘磷脂能够保留在极性脂洗脱液中，并且实现快速定性定量检测。
本发明的第二个目的是提供一种应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法的应用，用于乳液体原料、乳制品的成分检测。
进一步地，所述含有极性脂的总脂质物的提取步骤包括：
向乳液体原料中加入有机溶剂A后震荡混匀，再加入有机溶剂B后震荡混匀，然后超声，冰水浴超声5～20分钟，再加入溶液C震荡混匀促进分层，得到混合物Ⅰ；
将所得的混合物Ⅰ经离心机离心，移取下层有机溶液，并向上层溶液中加入有机溶剂D进行二次提取净化，再经离心机离心后，移取下层有机溶液，将两次提取的有机溶液合并后用溶液C洗涤，震荡混匀再经离心机离心后，弃去上层溶液，下层溶液用氮气吹干，得到含有极性脂的总脂质提取物；
其中，有机溶剂A为甲醇，乳液体原料与有机溶剂A的体积比为 1:10～6:10；
有机溶剂B为氯仿，乳液体原料与有机溶剂B的体积比为1:20～6:20；
溶液C为氯化钠溶液，质量百分浓度为0.5％～20％，乳液体原料与所述促进分层的溶液C的体积比为1:1～1:2，乳液体原料与所述用于洗涤的溶液C的体积比为9:1～18:1；
有机溶剂D为氯仿和甲醇的混合液，按氯仿：甲醇的体积比为： 12:1～1:1；乳液体原料与有机溶剂D的体积比为1:10～6:10。
通过对有机溶剂A、有机溶剂B、溶液C、有机溶剂D的选用，和其各配比范围的选取调整，实现了在上述各配比的条件下，含有极性脂的总脂质物的提取效果最佳。
进一步地，所述极性脂的富集和净化得到极性脂富集物的步骤包括：
先对固相萃取柱进行活化处理，固相萃取柱填料为硅胶1g/6mL，使用正己烷进行活化；
将30～200mg所述含有极性脂的总脂质提取物溶解于有机溶剂E后得到上样液，加载到活化的固相萃取柱上；
先后用有机溶剂F和有机溶剂G洗脱柱体，得到含有甘油三酯的中性脂洗脱液；
先后用有机溶剂H、有机溶剂I和有机溶剂J洗脱柱体，得到富含极性脂的洗脱液，并用氮气吹干得到极性脂富集物；
其中，有机溶剂E为氯仿：甲醇按体积比为1:1～8:1的混合液；含有极性脂的总脂质提取物与有机溶剂E的质量体积比为30mg:1mL～100mg:1mL；
有机溶剂F为正己烷：***按体积比为100:1～5:1的混合液；含有极性脂的总脂质提取物与有机溶剂F的质量体积比为5mg:1mL～25mg:1mL；
有机溶剂G为正己烷：***按体积比为10:1～2:1的混合液；含有极性脂的总脂质提取物与有机溶剂G的质量体积比为10mg:1mL～50mg:1mL；
有机溶剂H为正己烷：***按体积比为3:1～0.5:1的混合液；含有极性脂的总脂质提取物与有机溶剂H的质量体积比为30mg:1mL～90mg:1mL；
有机溶剂I为甲醇，含有极性脂的总脂质提取物与有机溶剂I的质量体积比为5mg:1mL～25mg:1mL；
有机溶剂J为氯仿：甲醇：水按体积比为3:5:2的混合液；含有极性脂的总脂质提取物与有机溶剂J的质量体积比为10mg:1mL～50mg:1mL。
通过对有机溶剂E、有机溶剂F、溶液G、有机溶剂H和有机溶剂I的选用，和其各配比范围的选取调整，实现了在上述各配比条件下，含有极性脂的极性脂的富集和净化所用样品消耗少，能够实现14个大类极性脂的富集。
进一步地，对极性脂富集物进行超临界流体色谱-质谱检测分析的条件如下：
超临界流体色谱采用Waters Acquity超高效合相色谱仪UPC2，色谱柱为 AcquityUPC2BEH，150mm×3.0mm，1.7μm，Waters，USA；柱温为55℃，背压1500psi，进样体积2μL；洗脱液A为超临界CO2，纯度≥99.99％，洗脱液B为含有甲酸铵的甲醇/水溶液，甲醇体积百分比为90％～100％，甲酸铵的含量为5mM～35mM，洗脱梯度为0min,5％B；5.5min,48％B；10min,48％B；
质谱采用Waters Synapt Q-TOF-MS质谱仪，碰撞气体(氩气)流速为50 L/h，去溶剂化气体(氮气)流速为700L/h，离子源温度100℃，脱溶剂温度400℃，锥孔电压30eV，低能量碰撞设为6eV，高能量碰撞设为20-45eV，质荷比扫描范围为100-1600m/z。
在一种实施例中，所述超声条件为40kHz；离心条件为25℃，8000rpm，离心10min。
在一种实施例中，所述固相萃取洗脱时的流速为0.03～0.1mL/min，优选为0.05mL/min。
在一种实施例中，所述对极性脂富集物复溶所用的复溶溶剂为氯仿：甲醇按体积比为2:1的混合液，极性脂富集物与复溶溶剂的质量体积比为1.5mg:1 mL～10mg:1mL，优选为5mg:1mL。
进一步地，所述极性脂包含：胆固醇、神经酰胺Cer、磷脂酰甘油PG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰肌醇PI、溶血磷脂酰乙醇胺LPE、磷脂酸PA、单唾液酸神经节苷酯GM3、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰胆碱PC、双唾液酸神经节苷酯 GD3、神经鞘磷脂SM、溶血磷脂酰胆碱LPC和心磷脂CL。
本发明的有益效果：
本发明的检测方法包括：含有极性脂的总脂质物的提取步骤，极性脂的富集和净化得到极性脂富集物的步骤以及对极性脂富集物复溶后进行超临界流体色谱-质谱检测分析的步骤，实现了极性脂极低含量(小于5％)样品的富集，操作简便、样品消耗量少、成本较低、检测迅速、定性定量能力较强、实用性强，结果稳定可靠，适合统一检测乳中极性范围分布较广的极性脂。可在10分钟内检测14大类极性脂，适用于各种乳液、乳制品、乳粉及其他生物样本中的极性脂的快速分析。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例1的极性脂富集与净化各洗脱液薄层色谱结果图，薄层色谱条件为：20*20cm硅胶玻璃板，点样后在展开剂正己烷：***：乙酸 (80:20:1，v/v/v)内展开，溶剂前沿展开至距板前沿1cm处时将板取出，干燥后用碘显色，下同。
图2为实施例3的极性脂富集与净化各洗脱液薄层色谱结果图；
图3为实施例5的极性脂富集与净化各洗脱液薄层色谱结果图；
图4为实施例1的超临界流体色谱总离子流色谱图；
图5为实施例2的超临界流体色谱总离子流色谱图；
图6为实施例3的超临界流体色谱总离子流色谱图；
图7为实施例4的超临界流体色谱总离子流色谱图；
图8为实施例5的超临界流体色谱总离子流色谱图。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：以下将详细说明本发明的具体实施方式，使本领域的技术人员更清楚地理解如何实践本发明。应当理解，尽管结合其优选的具体实施方案描述了本发明，但这些实施方案只是阐述，而不是限制本发明的范围。
本发明中极性脂包含以下14个大类：胆固醇、神经酰胺(Cer)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE)、磷脂酸(PA)、单唾液酸神经节苷酯(GM3)、磷脂酰丝氨酸 (PS)、磷脂酰胆碱(PC)、双唾液酸神经节苷酯(GD3)、神经鞘磷脂 (SM)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和心磷脂(CL)。
本发明中的“乳液体原料”是指人、牛、羊、驴或骆驼等哺乳动物从乳腺分泌的白色或者微黄色不透明液体；“乳制品”是指使用牛乳、羊乳、驴乳或骆驼乳及其加工制品为主要原料，加入或不加入适量的维生素、矿物质和其他辅料，经加工制成的液体剂、粉剂、凝胶剂、糊剂、固体剂、浓缩剂、混悬剂、或即用形式的各种食品。
本发明中所用材料与试剂：
磷脂酰甘油PG(16:0/18:1)，磷脂酰乙醇PE(14:0/14:0)，磷脂酰肌醇 PI(16:1/16:0)，溶血磷脂酰乙醇胺LPE(18:1/0:0)，磷脂酸PA
(16:0/18:1)，单唾液酸神经节苷酯GM3，神经鞘磷脂SM(d18:1/23:0)，溶血磷脂酰胆碱LPC(18:1/0:0)和双唾液酸神经节苷酯GD3标准品均购自瑞典 Larodan FineChemicals AB公司。
神经酰胺Cer(d18:1/16:0)，心磷脂CL(14:0/14:0/14:0/14:0)标准品：美国Avanti Polar Lipids公司；磷脂酰丝氨酸PS(14:0/14:0)标准品：美国Sigma 公司；胆固醇标准品：中国Aladdin公司；硅胶固相萃取柱1g/6mL：上海安谱实验科技公司；色谱级正己烷：中国泰坦科技公司；色谱级甲醇：美国Tedia High Purity Solvents公司；色谱级氯仿：中国国药试剂公司；高纯二氧化碳(纯度≥99.999％)：无锡鑫锡仪气体公司。
实施例中超临界流体色谱分析条件：色谱柱为Acquity UPC2BEH(150mm ×3.0mm，1.7μm，Waters，USA)；柱温55℃，背压1500psi，进样体积2 μL；洗脱液a为超临界CO2(纯度≥99.99％)，洗脱液b为甲醇/水溶液(甲醇体积百分比97％)，洗脱液b中含有20mM的甲酸铵，流动相流速为1.1 mL/min洗脱梯度为0min,5％洗脱液b；5.5min,48％洗脱液b；10min,48％洗脱液b。
实施例中质谱分析条件：碰撞气体(氩气)流速50L/h，去溶剂化气体 (氮气)流速700L/h，离子源温度100℃，脱溶剂温度400℃，锥孔电压30 eV，低能量碰撞设为6eV，高能量碰撞设为20～45eV，质荷比扫描范围为 100～1600m/z。
以下通过实施例对本发明做进一步介绍。
实施例1：母乳样品中极性脂的检测
1)含有极性脂的总脂质物的提取：
向4mL母乳中，即乳液体原料中加入10mL甲醇后震荡30秒混匀，再加入20mL氯仿后震荡15分钟至混匀，然后超声冰水浴10分钟，再加入质量百分浓度为0.9％的氯化钠溶液7.5mL，促进分层并震荡60秒混匀，得到混合物Ⅰ。
将所得的混合物Ⅰ经离心机离心，离心条件为：25℃，8000rpm离心 10min，移取下层有机溶液，并向上层溶液中加入15mL按氯仿：甲醇的体积比为6:1的的混合液，进行二次提取净化，震荡混匀再经离心机离心后，移取下层有机溶液，将两次提取的有机溶液合并后用0.75mL质量百分浓度为0.9％的氯化钠溶液洗涤，震荡混匀再经离心机离心后弃去上层溶液，下层溶液用氮气吹干，得到含有极性脂的总脂质提取物。
2)极性脂的富集和净化得到极性脂富集物：
先对固相萃取柱进行活化处理，固相萃取柱填料为硅胶1g/6mL，通过使用正己烷实现活化；将50mg含有极性脂的总脂质提取物溶解于1mL氯仿：甲醇按体积比为4:1的混合液，得到上样液，加载到活化的固相萃取柱上；
先后用5mL正己烷：***按体积比为50:1的混合液和3mL正己烷：***按体积比为6:1的混合液洗脱柱体，得到含有大部分甘油三酯的中性脂洗脱液；
先后用1mL正己烷：***按体积比为1:1的混合液、6mL甲醇和3mL氯仿：甲醇：水按体积比为3:5:2的混合液洗脱柱体，得到富含极性脂的洗脱液，并用氮气吹干得到极性脂富集物。
3)对极性脂富集物进行超临界流体色谱-质谱检测分析：
将胆固醇、神经酰胺(Cer)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(SM)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)标准品用氯仿甲醇(2:1，v/v)配成极性脂混合标准溶液储备液。采用外标法通过浓度-峰面积标准曲线实现定量分析，运用Progenesis QI软件中的 Lipidblast和Progenesis MetScope自建本地数据库进行定量分析。
结果如下：
1、薄层色谱结果，参见图1，显示大部分的甘油三酯被有效去除，胆固醇被保留在极性脂富集物的组分中。
2、取3份10mg母乳极性脂富集物作为空白样品，用氯仿：甲醇按体积比为2:1的混合液复溶至5mg/mL，分别添加含量约为母乳极性脂富集物中各极性脂含量1.2倍、1倍、0.8倍的高、中、低3个浓度水平的混合标准溶液，进行方法学验证，每个加标水平下做3次平行，并结合极性脂标准曲线，计算本方法的日内精密度、日间精密度和回收率，参见表1、表2。
表1 胆固醇、神经酰胺和磷脂标准品的线性回归方程
Figure BDA0003174526050000071
Figure BDA0003174526050000081
表2 胆固醇、神经酰胺和磷脂标准品的精密度和加标回收率
Figure BDA0003174526050000082
3、超临界流体色谱结果如图4。质谱检测结果：母乳中共检测出187种极性脂，其中胆固醇1种、神经酰胺(Cer)19种、磷脂酰甘油(PG)9种、磷脂酰乙醇胺(PE)31种、磷脂酰肌醇(PI)12种、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE) 9种、磷脂酸(PA)20种、磷脂酰丝氨酸(PS)17种、磷脂酰胆碱(PC)28 种、神经鞘磷脂(SM)22种、心磷脂(CL)8种、溶血磷脂酰胆碱(LPC)11 种。其中神经鞘磷脂(SM)是含量最多的磷脂。
实施例2：母乳样品中神经节苷脂的检测
1)神经节苷脂富集物提取：
向4mL母乳中加入4mL去离子水后震荡30秒混匀，再加入21.6mL甲醇和10.8mL氯仿。在25℃下以150rpm缓和震荡30分钟后，所得的混合物用离心机在25℃下，以8000rpm离心10分钟。收集富含极性脂的上清液，并向下层沉淀中加入4mL去离子水和2mL氯仿：甲醇按体积比为1:2的混合液进行二次提取。在25℃下，以150rpm缓和震荡30分钟后，混合物用离心机25℃以8000rpm离心10分钟。收集富含极性脂的上清液，将两次提取的富含极性脂的上清液合并后加入10.4mL去离子水，然后轻轻倒置4次，用离心机25℃以8000rpm离心10分钟。收集富含神经节苷脂的上清液。向剩余混合物加入4 mL浓度为0.01mol/L的氯化钾溶液，并用离心机25℃以8000rpm离心10分钟，收集富含神经节苷脂的上清液。合并两次提取的富含神经节苷脂的上清液，用氮气吹干，得到神经节苷脂富集物。
2)将所得的神经节苷脂富集物进行超临界流体色谱-质谱检测分析：
将单唾液酸神经节苷酯(GM3)和双唾液酸神经节苷酯(GD3)标准品用氯仿：甲醇按体积比为2:1的混合液，配成神经节苷脂混合标准溶液储备液。采用外标法通过浓度-峰面积标准曲线实现定量分析，运用Progenesis QI软件中的Lipidblast和ProgenesisMetScope自建本地数据库进行定量分析。
结果如下：
1、取3份从4mL母乳富集的神经节苷脂富集物作为空白样品，用0.5mL 氯仿：甲醇按体积比为2:1的混合液复溶，分别添加含量约为母乳神经节苷脂富集物中各神经节苷脂含量1.2倍、1倍、0.8倍的高、中、低3个浓度水平的混合标准溶液，进行方法学验证，每个加标水平下做3次平行，计算方法的日内精密度、日间精密度和回收率，参见表3、表4。
表3 神经节苷脂的线性回归方程
Figure BDA0003174526050000091
表4 神经节苷脂标准品的精密度和加标回收率
Figure BDA0003174526050000092
2、超临界流体色谱结果如图5。质谱检测结果：母乳中共检测出27种神经节苷脂，其中单唾液酸神经节苷酯(GM3)16种、双唾液酸神经节苷酯 (GD3)11种。母乳中双唾液酸神经节苷酯(GD3)浓度单唾液酸神经节苷酯 (GM3)的3.5倍。
实施例3：骆驼乳样品中极性脂的检测
1)含有极性脂的总脂质物的提取：
向4mL骆驼乳中加入10mL甲醇后震荡30秒混匀，再加入20mL氯仿后震荡15分钟混匀，然后冰水浴超声10分钟，再加入7.5mL质量百分浓度为0.9％的氯化钠溶液，促进分层并震荡60秒混匀，得到混合物Ⅰ。
将所得的混合物Ⅰ用离心机离心，离心条件为：25℃，8000rpm离心10分钟，移取下层有机溶液，并向上层溶液中加入15mL按氯仿：甲醇的体积比为 6:1的混合液，进行二次提取净化，震荡混匀再经离心机离心后，移取下层有机溶液，将两次提取的有机溶液合并后用0.75mL质量百分浓度为0.9％的氯化钠溶液洗涤，震荡混匀再经离心机离心后弃去上层溶液，下层溶液用氮气吹干，得到含有极性脂的总脂质提取物。
2)极性脂的富集和净化得到极性脂富集物：
先对固相萃取柱进行活化处理，固相萃取柱填料为硅胶1g/6mL，通过使用正己烷实现活化；将55mg含有极性脂的总脂质提取物溶解于1mL氯仿：甲醇按体积比为4:1的混合液，得到上样液，加载到活化的固相萃取柱上；
先后用5mL正己烷：***按体积比为50:1的混合液和3mL正己烷：***按体积比为4:1的混合液洗脱柱体，得到含有大部分甘油三酯的中性脂洗脱液；
先后用2mL正己烷：***按体积比为1:1的混合液、4mL甲醇和3mL氯仿：甲醇：水按体积比为3:5:2的混合液洗脱柱体，得到富含极性脂的洗脱液，并用氮气吹干得到极性脂富集物。
3)对极性脂富集物进行超临界流体色谱-质谱检测分析：
将胆固醇、神经酰胺(Cer)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(SM)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)标准品用氯仿甲醇(2:1，v/v)配成极性脂混合标准溶液储备液。采用外标法通过浓度-峰面积标准曲线实现定量分析，运用Progenesis QI软件中的 Lipidblast和Progenesis MetScope自建本地数据库进行定量分析。
结果如下：
1、薄层色谱结果，参见图2，显示大部分的甘油三酯被有效去除，但同时胆固醇因部分随中性脂洗脱液流出而损失。
2、同实施例1。
3、超临界流体色谱结果如图6。质谱检测结果：骆驼乳中共检测出170种极性脂，其中胆固醇1种、神经酰胺(Cer)19种、磷脂酰甘油(PG)7种、磷脂酰乙醇胺(PE)33种、磷脂酰肌醇(PI)10种、溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE)1种、磷脂酸(PA)16种、磷脂酰丝氨酸(PS)16种、磷脂酰胆碱 (PC)27种、神经鞘磷脂(SM)22种、心磷脂(CL)7种、溶血磷脂酰胆碱(LPC)11种。其中磷脂酰乙醇胺(PE)是含量最多的磷脂。
实施例4：乳脂肪球膜样品中极性脂的检测
1)脂质提取：
将1g乳脂肪球膜粉末溶解于4.5mL去离子水并加入10mL甲醇后震荡30 秒混匀，再加入20mL氯仿后震荡2分钟混匀，超声冰水浴提取10分钟，提取完毕后加入6mL质量百分浓度为0.9％的氯化钠溶液，促进分层并震荡60秒混匀，得到混合物Ⅰ。所得的混合物Ⅰ用离心机25℃以8000rpm离心10分钟，移取下层有机溶液，并向上层溶液加入15mL按氯仿：甲醇的体积比为6:1的混合液，进行二次提取净化，震荡混匀再经离心机离心后，移取下层有机溶液，将两次提取的有机溶液合并后用0.75mL质量百分浓度为0.9％的氯化钠溶液洗涤，震荡混匀再经离心机离心后弃去上层溶液，下层溶液用氮气吹干，得到含有极性脂的总脂质提取物，因乳脂肪球膜中甘油三酯含量较少，因此可作为极性脂富集物。
2)所得的极性脂富集物进行超临界流体色谱-质谱检测分析：
将胆固醇、神经酰胺(Cer)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(SM)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)标准品用氯仿甲醇(2:1，v/v)配成极性脂混合标准溶液储备液。采用外标法通过浓度-峰面积标准曲线实现定量分析，运用Progenesis QI软件中的 Lipidblast和Progenesis MetScope自建本地数据库进行定量分析。
结果如下：
1、同实施例1。
2、同实施例1。
3、超临界流体色谱结果如图7。质谱检测结果：乳脂肪球膜中共检测出 146种极性脂，其中胆固醇1种、神经酰胺(Cer)19种、磷脂酰甘油(PG)5 种、磷脂酰乙醇胺(PE)20种、磷脂酰肌醇(PI)11种、溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE)1种、磷脂酸(PA)14种、磷脂酰丝氨酸(PS)12种、磷脂酰胆碱 (PC)28种、神经鞘磷脂(SM)22种、心磷脂(CL)4种、溶血磷脂酰胆碱(LPC)9种。其中磷脂酰乙醇胺(PE)是含量最多的磷脂。
实施例5：配方奶样品中极性脂的检测
1)脂质提取：
将1g配方奶粉末溶解于4mL去离子水并中加入10mL甲醇后震荡30秒混匀，再加入20mL氯仿后震荡5分钟混匀，超声冰水浴提取10分钟，提取完毕后加入8mL质量百分浓度为1.0％氯化钠溶液，促进分层并震荡60秒混匀，得到混合物Ⅰ。
将所得的混合物Ⅰ用离心机25℃下以8000rpm离心10分钟，移取下层有机溶液，并向上层溶液加入15mL按氯仿：甲醇的体积比为6:1的混合液，进行二次提取净化，震荡混匀再经离心机离心后，移取下层有机溶液，将两次提取的有机溶液合并后用0.75mL质量百分浓度为0.9％氯化钠溶液洗涤，震荡混匀再经离心机离心后弃去上层溶液，下层溶液用氮气吹干，得到含有极性脂的总脂质提取物。
2)富集和净化：
先对固相萃取柱进行活化处理，固相萃取柱填料为硅胶1g/6mL，通过使用正己烷实现活化；将50mg含有极性脂的总脂质提取物溶解于1mL氯仿：甲醇按体积比为4:1的混合液，得到上样液，加载到活化的固相萃取柱上；
先后用5mL正己烷：***按体积比为50:1的混合液和3mL正己烷：***按体积比为8:1的混合液洗脱柱体，得到含有大部分甘油三酯的中性脂洗脱液；
先后用1mL正己烷：***按体积比为1:1的混合液、4mL甲醇和3mL氯仿：甲醇：水按体积比为3:5:2的混合液洗脱柱体，得到富含极性脂的洗脱液，并用氮气吹干得到极性脂富集物。
3)对极性脂富集物进行超临界流体色谱-质谱检测分析：
将胆固醇、神经酰胺(Cer)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(SM)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)标准品用氯仿甲醇(2:1，v/v)配成极性脂混合标准溶液储备液。采用外标法通过浓度-峰面积标准曲线实现定量分析，运用Progenesis QI软件中的 Lipidblast和Progenesis MetScope自建本地数据库进行定量分析。
结果如下：
1、薄层色谱结果，参见图3，显示胆固醇被保留在极性脂的组分，但甘油三酯在极性脂洗脱液中保留较多。
2、同实施例1
3、超临界流体色谱结果如图8。质谱检测结果：配方奶中共检测出207种极性脂，其中胆固醇1种、神经酰胺(Cer)19种、磷脂酰甘油(PG)9种、磷脂酰乙醇胺(PE)35种、磷脂酰肌醇(PI)15种、溶血磷脂酰乙醇胺
(LPE)8种、磷脂酸(PA)28种、磷脂酰丝氨酸(PS)19种、磷脂酰胆碱 (PC)28种、神经鞘磷脂(SM)22种、心磷脂(CL)7种、溶血磷脂酰胆碱(LPC)16种。其中磷脂酰胆碱(PC)是含量最多的磷脂。
通过以上优选实施例可以看出，本发明的检测方法在所有优选实施例中实现了10分钟内统一检测乳中极性范围分布较广的14大类极性脂，且检测迅速、定性定量能力较强、实用性强，结果稳定可靠，适合。对比实施例2，实施例3富集和净化时中性脂去除效果与实施例2类似，但造成了少量胆固醇的损失；对比实施例2，实施例5富集和净化时胆固醇保留能力与实施例2类似，但甘油三酯残留较多。但总体而言，本发明中富集和净化所用的固相萃取方法能够适用于极性脂极低含量(小于5％)样品的富集，操作简便、样品消耗量少且成本较低。
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (7)

1.一种应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：含有极性脂的总脂质物的提取步骤，极性脂的富集和净化得到极性脂富集物的步骤以及对极性脂富集物复溶后进行超临界流体色谱-质谱检测分析的步骤；
所述含有极性脂的总脂质物的提取步骤包括：
向乳液体原料中加入有机溶剂A后震荡混匀，再加入有机溶剂B后震荡混匀，然后冰水浴超声5~20分钟，再加入溶液C震荡混匀促进分层，得到混合物Ⅰ；
将所得的混合物Ⅰ经离心机离心，移取下层有机溶液，并向上层溶液中加入有机溶剂D进行二次提取净化，再经离心机离心后，移取下层有机溶液，将两次提取的有机溶液合并后用溶液C洗涤，震荡混匀再经离心机离心后，弃去上层溶液，下层溶液用氮气吹干，得到含有极性脂的总脂质提取物；
其中，所述有机溶剂A为甲醇，所述乳液体原料与所述有机溶剂A的体积比为1:10~6:10；
所述有机溶剂B为氯仿，所述乳液体原料与所述有机溶剂B的体积比为1:20~6:20；
所述溶液C为氯化钠溶液，质量百分浓度为0.5%~20%，所述乳液体原料与促进分层的溶液C的体积比为1:1~1:2，所述乳液体原料与用于洗涤的溶液C的体积比为9:1~18:1；
所述有机溶剂D为氯仿和甲醇的混合液，按氯仿：甲醇的体积比为：12:1~1:1；所述乳液体原料与所述有机溶剂D的体积比为1:10~6:10；
所述极性脂的富集和净化得到极性脂富集物的步骤包括：
先对固相萃取柱进行活化处理，固相萃取柱填料为硅胶1 g/6 mL，使用正己烷进行活化；
将所述含有极性脂的总脂质提取物溶解于有机溶剂E后得到上样液，加载到活化的固相萃取柱上；
先后用有机溶剂F和有机溶剂G洗脱柱体，得到含有甘油三酯的中性脂洗脱液；
先后用有机溶剂H、有机溶剂I和有机溶剂J洗脱柱体，得到富含极性脂的洗脱液，并用氮气吹干得到极性脂富集物；
其中，所述有机溶剂E为氯仿：甲醇按体积比为1:1~8:1的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂E的质量体积比为30 mg:1 mL~100 mg:1 mL；
所述有机溶剂F为正己烷：***按体积比为100:1~5:1的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂F的质量体积比为5 mg:1 mL~25 mg:1 mL；
所述有机溶剂G为正己烷：***按体积比为10:1~2:1的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂G的质量体积比为10 mg:1 mL~50 mg:1 mL；
所述有机溶剂H为正己烷：***按体积比为3:1~0.5:1的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂H的质量体积比为30 mg:1 mL~90 mg:1 mL；
所述有机溶剂I为甲醇，所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂I的质量体积比为5 mg:1 mL~25 mg:1 mL；
所述有机溶剂J为氯仿：甲醇：水按体积比为3:5:2的混合液；所述含有极性脂的总脂质提取物与所述有机溶剂J的质量体积比为10 mg:1 mL~50 mg:1 mL；
对极性脂富集物进行超临界流体色谱-质谱检测分析的条件如下：
超临界流体色谱采用Waters Acquity超高效合相色谱仪UPC2，色谱柱为Acquity UPC2BEH，150 mm × 3.0 mm，1.7 μm，Waters，USA；柱温为55 ºC，背压1500 psi，进样体积2 μL；洗脱液a为超临界CO2，洗脱液b为含有甲酸铵的甲醇/水溶液，甲醇体积百分比为90%~100%，甲酸铵的含量为5 mM~35 mM，洗脱梯度为0 min, 5% b; 5.5 min, 48% b; 10 min, 48%b；
质谱采用Waters Synapt Q-TOF-MS 质谱仪，碰撞气体流速为50 L/h，去溶剂化气体流速为700 L/h，离子源温度100 ºC，脱溶剂温度400 ºC，锥孔电压 30 eV，低能量碰撞设为 6eV，高能量碰撞设为20~45 eV，质荷比扫描范围为100~1600 m/z；
其中，所述极性脂包含：胆固醇、神经酰胺Cer、磷脂酰甘油PG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰肌醇PI、溶血磷脂酰乙醇胺LPE、磷脂酸PA、单唾液酸神经节苷酯GM3、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰胆碱PC、双唾液酸神经节苷酯GD3、神经鞘磷脂SM、溶血磷脂酰胆碱LPC和心磷脂CL。
2.根据权利要求1所述的应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法，其特征在于，固相萃取洗脱时的流速为0.03~0.1 mL/min。
3.根据权利要求2所述的应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法，其特征在于，固相萃取洗脱时的流速为0.05 mL/min。
4.根据权利要求1所述的应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法，其特征在于，所述超声条件为40 kHz；离心条件为25℃，8000 rpm，离心10 min。
5.根据权利要求1所述的应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法，其特征在于，所述对极性脂富集物复溶所用的复溶溶剂为氯仿：甲醇按体积比为2:1的混合液，极性脂富集物与复溶溶剂的质量体积比为1.5 mg:1 mL~10 mg:1 mL。
6.根据权利要求5所述的应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法，其特征在于，所述极性脂富集物与复溶溶剂的质量体积比为5 mg:1 mL。
7.一种如权利要求1~6任一项所述的应用固相萃取-超临界流体色谱-质谱法检测乳中极性脂的方法在乳液体原料、乳制品的成分检测中的应用。
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