CN113563465B

CN113563465B - 沙门菌PhoN蛋白抗体及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN113563465B
Application number: CN202110656656.9A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 高杨; 孟闯; 潘志明; 丁睿清; 徐双媛; 曹李妍; 康喜龙; 顾丹
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113563465A

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种沙门菌PhoN蛋白抗体及其检测方法和应用，所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区。本发明还提供了所述单抗的制备方法及应用。本发明所提供的单克隆抗体具有效价高、特异性强、反应谱广的优势。本发明采用基于针对沙门菌外膜蛋白PhoN抗原单抗的免疫磁珠富集方法，可有效富集鼠伤寒沙门菌和婴儿沙门菌，与现有技术相比，免疫磁珠富集方法拥有更好的特异性及广谱性，可同时富集至少两种沙门菌，简化了检测步骤，缩短了检测时间，为快速、高效检测多种不同血清型沙门菌提供了可靠的样品预处理技术。

Description

沙门菌PhoN蛋白抗体及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及杂交瘤淋巴细胞技术和免疫磁珠技术，并进一步涉及通过这两种技术制备获得的抗沙门菌PhoN蛋白检测抗体以及检测方法和应用。

背景技术

沙门菌(Salmonella)是一类重要的食源性***共患病原菌，感染动物和人类导致沙门菌病，严重危害畜禽产业发展和人类健康，具有重要的公共卫生意义。迄今为止，已发现的沙门菌血清型高达2600多种。据相关统计，沙门菌引起的食物中毒在世界范围内的细菌性食物中毒中位列首位。欧洲每年有16万多人感染沙门菌，美国每年也有约140万人感染沙门菌，占总食源性疾病的30％。因此，高通量检测沙门菌引起各国的高度关注。寻找沙门菌的快速检测技术尤为重要。

单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)具有特异性强、灵敏度高和纯度高等优势，该技术的应用提高了沙门菌血清学方法的特异性、敏感性和稳定性。基于McAb的检测及诊断应用，如免疫富集磁珠和血清学诊断试剂盒等，可对沙门菌进行快速检测及诊断。但目前的沙门菌检测方法存在检测耗时长，特异性低，步骤复杂等问题。

目前法定的沙门菌检测方法为微生物培养法，主要包括预增菌、增菌、分离培养物、属和种的鉴定等过程，其可重复性强、稳定性高、准确性高，是目前最可靠的检测方法。但是整个检测流程周期长、操作复杂、灵敏度较低，前期选择性富集培养的处理就需要耗费3天的时间，大大增加了时间成本，不能实现及时有效的监测。基于磁性纳米材料的免疫磁分离法(immunemagnetic separation，IMS)已经广泛地应用于食源性致病菌的分离。经过生物学修饰和功能化的磁性纳米材料，可特异性地识别食源性致病菌，再利用外加磁场分离菌体，即可实现食品中少量致病菌的特异性的快速富集分离。因此，研制诸如免疫磁珠等用来可特异、快速富集沙门菌的样品预处理技术等对提高沙门菌检测效率具有重要意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种沙门菌的PhoN蛋白检测抗体以及检测方法，用于解决现有技术中沙门菌检测耗时长，特异性低的问题，本发明所述的沙门菌PhoN蛋白抗体及免疫磁珠检测方法特异性强，并拥有广谱性，有助于缩短沙门菌的检测时间、简化检测操作。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种沙门菌PhoN蛋白抗体，所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，所述重链包括三个互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。

进一步地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的另一方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上所述抗体。

进一步地，所述多核苷酸中编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述多核苷酸中编码所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的另一方面提供了一种重组表达载体，所述表达载体中含有上述多核苷酸。

本发明的另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有或者整合有上述重组表达载体。

本发明的另一方面提供了上述抗体、多核苷酸、重组表达载体以及宿主细胞用于检测至少两种血清型沙门菌(鼠伤寒沙门菌和婴儿沙门菌)的应用。

本发明的另一方面提供了一种沙门菌免疫磁珠检测组合物，所述组合物包括上所述的抗体。

进一步地，所述组合物还包括磁珠、洗涤液、活化液、封闭液。

进一步地，所述抗体为纯化的针对沙门菌PhoN蛋白的IgG抗体。

所述磁珠用于制备免疫磁珠，所述免疫磁珠的制备方法为：用洗涤液洗涤磁珠后，使用活化液活化磁珠；然后用纯化地沙门菌PhoN蛋白的IgG抗体与磁珠进行偶联，再用封闭液封闭；然后使用洗涤液洗涤得到偶联沙门菌PhoN蛋白抗体的免疫磁珠。

进一步的，所述洗涤液为0.01mol/L的一水吗啉乙磺酸吐温溶液(MEST，PH6.0；0.05％TWeen-20)；所述活化液为0.01mol/L的一水吗啉乙磺酸溶液(MES，PH6.0)分别配制的5mg/mL的碳二亚胺(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液；所述的封闭液为PBST(pH7.4，含1％BSA)。

本发明的另外一个方面提供了一种沙门菌抗体免疫磁珠检测方法，所述方法包括采用包括上述抗体检测不同血清型沙门菌。

进一步地，所述纯化的针对沙门菌PhoN蛋白的IgG抗体。

进一步地，所述方法具体包括以下步骤：

(1)将磁珠洗涤和活化后，偶联沙门菌PhoN蛋白的抗体，封闭；

(2)向定量的菌液中加入封闭后的免疫磁珠，孵育；

(3)磁分离为上清和磁珠，磁珠用洗涤液洗涤；

(4)分别涂板计数，分析结果。

进一步地，所述方法具体可以为将磁珠使用洗涤液洗涤3次，使用活化液活化后，偶联沙门菌PhoN蛋白的抗体；磁分离后加入封闭液，再洗涤3次；将封闭好的免疫磁珠混合定量的细菌，孵育；孵育后的混合液体磁分离为上清和免疫磁珠，免疫磁珠用洗涤液洗涤2次；分别将上清和免疫磁珠稀释后涂板，计算富集效率。

进一步的，所述洗涤液为pH 0.01mol/L的一水吗啉乙磺酸吐温溶液(MEST，PH6.0；0.05％TWeen-20)；所述活化液液为0.01mol/L的一水吗啉乙磺酸溶液(MES，PH6.0)分别配制的5mg/mL的碳二亚胺(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液；封闭液为PBST(pH7.4，含1％BSA)。

进一步的，所述磁珠和抗体用量分别为为2mg和200μg；活化时间为0.5h，偶联时间为3h，封闭时间为1h。

进一步的，免疫磁珠富集细菌于37℃，80rpm孵育，孵育时间为1h。

进一步的，分析结果是指计算富集效率＝(磁分离后的菌落总数/磁分离前菌落总数)×100％。

本发明的沙门菌的检测抗体以及检测方法，具有以下有益效果：

沙门菌外膜蛋白(Out membrance protein,OMP)是沙门菌属抗原的重要组成之一，同鞭毛和菌毛一样具有多种重要功能。沙门菌外膜蛋白是一类能刺激机体产生较强体液免疫应答和较高抗体水平的抗原，并作为毒力因子在细菌的致病过程中发挥重要作用。PhoN蛋白是沙门菌的一种外膜蛋白，是一种非特异性酸性磷酸酶，可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，具有良好的免疫原性。更重要的是，PhoN存在于绝大多数血清型的沙门菌中，而在大肠杆菌等非沙门肠杆菌科细菌中则不存在，显示出作为沙门菌属检测靶标的应用潜能。

本发明为基于针对沙门菌PhoN单抗的免疫磁珠检测方法。与现有技术相比，本发明所述的沙门菌PhoN蛋白抗体及其免疫磁珠检测方法拥有更好的广谱性和特异性，并缩短了检测时间，可同时富集至少两种沙门菌，简化了检测步骤，缩短了检测时间，为快速、高效检测多种不同血清型沙门菌提供了可靠的样品预处理技术。因此，本发明为沙门菌抗体的检测提供了一种灵敏快捷的检测方法，为沙门菌的防控和净化提供了一种重要的检测手段。

附图说明

图1为单抗4B2与抗原蛋白反应性鉴定；

图2为单抗4B2与不同蛋白反应性鉴定；

图3为单抗4B2与沙门菌特异性鉴定；

图4为单抗偶联磁珠对沙门菌富集的结果；

图5为免疫磁珠对沙门菌和其他细菌富集的结果。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1：杂交瘤细胞株的获得

1.1动物免疫

具体免疫程序如下：将沙门菌PhoN蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化后进行对小鼠进行首次免疫，50μg/只，采用腹部皮下多点注射；14天后，进行第二次免疫，50μg/只，将PhoN蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行腹部皮下多点注射。二免7天后，对小鼠采血检测血清抗体效价。二免14天后，取不加佐剂的PhoN蛋白腹腔注射小鼠，进行加强免疫。

1.3细胞融合

加强免疫3天后，对小鼠采血，收集血清于-20℃保存，用于后续筛选的阳性对照。按照生物安全方法处死小鼠，酒精浸泡消毒，取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0以1:5的细胞比例在聚乙二醇PEG 50％作用下融合。用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，将融合好的细胞与饲养细胞用HAT培养基悬浮混匀铺于96孔板中，置于37℃细胞培养箱中培养。5天后补加HAT培养基，9天后换用HT培养基进行培养。

1.4间接ELISA检测方法的建立和阳性克隆的筛选

采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。具体方法如下：按照方阵试验确定的抗原最适包被浓度包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，加入含1％BSA的PBS封闭液，每孔200μL，于37℃孵育2h；封闭结束后，PBST洗涤3遍，加入杂交瘤细胞上清，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，100μL/孔，37℃水浴2h；PBST洗涤5次，加入工作浓度的辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃水浴1h；洗涤7次后，加TMB显色5min，显色终止后，酶标仪检测OD₄₅₀值，根据以下公式判定实验结果：OD₄₅₀细胞孔/OD₄₅₀阴性孔≥2.1判定为阳性孔。将筛选的阳性克隆命名为4B2。

1.6阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆4B2进行3次亚克隆并进行保存。

实施例2：沙门菌PhoN蛋白单克隆抗体的制备

2.1单抗腹水制备及纯化

采用体内诱生腹水法。9-12周龄健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7-10天后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数期生长的杂交瘤细胞4B2，2×10⁵个细胞/只；7-10天后，收集腹水，离心收集上清，-70℃保存。

将制备的腹水使用Protein A亲和层析方法进行纯化，于-70℃保存。

实施例3：单克隆抗体特性检测

3.1单抗亚类的鉴定

使用单克隆抗体亚类试剂盒进行单抗亚类的鉴定。在预先包被好抗原的ELISA酶标板中分别加入杂交瘤细胞培养上清，100μL/孔，37℃孵育2h；PBST洗涤3遍；分别加入用PBS按1:1000稀释的羊抗鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM，100μL/孔，室温放置30min，PBST洗涤3遍；加入用PBS 1:5000稀释的HRP-兔抗羊IgG酶标抗体，100μL/孔，室温孵育15min；PBST洗涤5遍；加入TMB显色液，100μL/孔，室温放置5min；加入2M H₂S0₄终止反应，50μL/孔，酶标仪检测OD₄₅₀，根据OD₄₅₀判定单抗的亚类。

结果显示，单抗4B2亚类为IgG2a。

经鉴定，结果表明，单克隆抗体轻链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQID NO.1所示，具体为：KASDHIHNWLA。

轻链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：GATSLET。

轻链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：QQYWTTYT。

重链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：SYWIH。

重链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：SIYPGNSETSYNQKFKG。

重链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：GGYGNYLSPFDY。

轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：

MKFPSQLLLFLLFRITGIICDIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHIHNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWTTYTFGGGTKLEIK。

编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：

ATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTCTTCCTGCTGTTCAGAATCACAGGCATAATATGTGACATCCAGATGACACAATCTTCATCCTACTTGTCTGTATCTCTAGGAGGCAGAGTCACCATTACTTGCAAGGCAAGTGACCACATTCATAATTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGACTACGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。

重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：

MECNWILPFILSVISGVYSDVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYSFTSYWIHWVKQRPGQGLEWVGSIYPGNSETSYNQKFKGKAKLTAVTSASTAYMELSSLTNEDSAVYYCTRGGYGNYLSPFDYWGQGTTLTVSS。

编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：

ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCGGTAATTTCAGGGGTCTACTCAGATGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACCAGCTACTGGATACACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAGTGGGTTGGTTCTATTTATCCTGGAAATAGTGAGACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGGGGGGTATGGTAACTACCTCTCCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA。

3.2单抗腹水效价的测定

使用包被缓冲液将PhoN蛋白以最佳包被浓度包被96孔ELISA板，4℃过夜；洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h；使用PBST洗涤3遍，加入倍比稀释的单抗腹水，以同样倍数稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；PBST洗涤5遍；加入工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤后，加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃孵育5min；加入2M H₂SO₄终止反应，酶标仪检测OD₄₅₀值，以P/N≥2.1为判定标准，测定单抗腹水效价。

结果显示，单抗4B2的效价为1:8192000。单抗4B2具有很高的效价，表示利用其建立检测方法能产生高的灵敏性。

3.3单抗免疫反应性鉴定

采用建立好的间接ELISA方法对单克隆抗体的特异性进行分析。将相同浓度的纯化His-PhoN、GST-PhoN、His-PdgL、His-OmpC、His-OmpF重组蛋白和pColdⅠ空载体裂解液包被至ELISA板，PBS对照，4℃冰箱过夜；次日，PBST洗涤3次，3-5min/次，尽量拍干残留液体；每孔加200μL含1％BSA的PBST封闭，37℃封闭2h；将腹水稀释后加入封闭完成的ELISA板中，每孔100μL，37℃水浴2h；PBST洗涤5次；加入工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG抗体，10μL/孔，37℃水浴1h；PBST洗涤7次，避光加入TMB显色液显色，每孔100μL，37℃作用10min；显色结束后，加入硫酸终止液(2M H₂SO₄)进行终止，每孔50μL，用酶标仪进行OD₄₅₀读取数值，分析单抗反应性。

结果(图2)表明单抗4B2可特异性识别His-PhoN、GST-PhoN重组蛋白，与其他蛋白均无反应。

3.4单抗特异性分析

将纯化后的His-phoN、GST-phoN重组蛋白和BL21(DE3)-pColdⅠ及BL21(DE3)-pGEX-6P-1重组菌对照分别加入适量的5×Protein Loading buffer进行沸水浴10min，120V进行SDS-PAGE凝胶电泳；将鼠伤寒沙门菌(S.Typhimurium)、肠炎沙门菌(S.Enteritidis)、德尔卑沙门菌(S.Derby)、婴儿沙门菌(S.Infantis)、伦敦沙门菌(S.London)、印第安纳沙门菌(S.Indiana)、科瓦利斯沙门菌(S.Corvallis)、里森沙门菌(S.Rissen)、法叶德沙门菌(S.Fairfield)大肠杆菌(E.coli)、宋内志贺菌(Sh.sonnei)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、空肠弯曲菌(C.jejuni)等细菌培养后经过超声波破裂进行处理，分别加入适量的5×Protein Loading buffer进行沸水浴10min，120V进行SDS-PAGE凝胶电泳。

使用Pyxis^TM Gel Processor快速转印仪及其配套的Pyxis^TM Protein TransferStack试剂盒，转印8min，用含有5％BSA的PBST室温封闭1h；PBST洗涤5次，加入含有5％BSA的PBST溶液1:5000稀释的小鼠腹水，室温摇床孵育2h或者4℃过夜孵育；PBST洗涤5次，加入含有5％BSA的PBST溶液1:5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG抗体，室温摇床孵育1h；PBST洗涤5次，将TMB双组份显色液的A液和B液1:1混匀，避光显色1min，终止显色反应，使用超灵敏多功能成像仪进行扫描拍照。

结果(图2)表明，在Western Blot试验中，单抗4B2与His-PhoN、GST-PhoN重组蛋白反应性良好。

结果(图3)表明，在Western Blot试验中，单抗4B2与9株沙门菌均有反应，与其他种属的细菌均不反应，说明此杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体特异性良好。

实施例4：沙门菌免疫富集磁珠的制备和应用

4.1活化PM3-050羧基磁珠

小瓶摇匀后移取200uL PM3-050羧基磁珠(2mg)至1.5mL离心管中。分别用500μL0.01mol/L的一水吗啉乙磺酸吐温溶液(MEST，PH6.0；0.05％TWeen-20)洗涤3次，用磁力架分离后吸出上清。用4℃保存的MES分别配制5mg/mL的碳二亚胺(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，向磁珠中分别加入200μL新配制的EDC和NHS溶液，涡旋混匀，使磁珠充分悬浮，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化30min，将此离心管置于磁力架上进行磁分离，弃上清，加入500μL MEST，洗一次，弃上清；将磁珠转移到新的1.5mL离心管中，加入500μLMEST,再洗3次，尽量除干净上清。经过上述步骤后，PM3-050磁珠表面的羧基已经活化，可以与带有伯氨基的生物配体进行共价偶联。

4.2活化磁珠与抗体偶联

分别加入100μg、200μg、300μg的抗体到5.1活化的磁珠中，用MES溶液调节总体积至500μL，轻柔混匀磁珠与生物配体。将上步混合的磁珠至于旋转混合仪上进行颠倒混匀，37℃偶联3h，把活化磁珠和抗体悬液进行充分混匀，在此期间，确保该活化磁珠处于悬浮状态。将离心管置于磁分离架上磁分离，移除上清，加入1mL PBST(pH7.4，含1％BSA)重悬磁珠，37℃封闭1h，期间利用旋转混合仪上进行颠倒混匀保证该期间磁珠处于悬浮状态。将离心管置于磁分离架上磁分离，移除上清，磁珠用500μL PBST洗涤3次。磁分离，移除上清，磁珠用PBST重悬，保存于4℃。

4.3免疫磁珠富集沙门菌

将封闭后的磁珠加入到1mL鼠伤寒沙门菌、和婴儿沙门菌、大肠杆菌和志贺杆菌的菌液中，充分混匀后于37℃，80rpm作用60min。将离心管置于磁力架上翻转2min，然后静止1min，待磁珠充分被吸附在管壁上，将各组的上清液分别转移到新的指形管中，梯度稀释后取100μL涂布于LB平板；免疫磁珠作用前和作用后的菌液分别经适当梯度稀释后，取100μL涂布于LB平板；所有平板37℃培养24h。通过平板计数法计算菌液浓度，计算捕获率，免疫磁珠捕获率(％)＝(磁分离后的菌落总数/磁分离前菌落总数)×100％。

结果(图4)显示，在200μg的抗体偶联磁珠试验中，对鼠伤寒沙门菌和婴儿沙门菌的捕获效率最高，分别为79％和77％，故采用200μg偶联磁珠对沙门菌和其他属细菌进行富集。

结果显示(图5)在对沙门菌和其他属细菌进行免疫磁珠富集试验中，制备的沙门菌免疫磁珠对鼠伤寒沙门菌和婴儿沙门菌的捕获效率分别为77％和77％，对大肠杆菌和志贺杆菌的捕获效率为6.1％和3.5％，表明其能特异性结合沙门菌。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 沙门菌PhoN蛋白抗体及其检测方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Ala Ser Asp His Ile His Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Gln Tyr Trp Thr Thr Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Tyr Trp Ile His

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Leu Ser Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Lys Phe Pro Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Leu Phe Arg Ile Thr

1 5 10 15

Gly Ile Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His

35 40 45

Ile His Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp

100 105 110

Thr Thr Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 8

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaagtttc cttctcaact tctgctcttc ctgctgttca gaatcacagg cataatatgt 60

gacatccaga tgacacaatc ttcatcctac ttgtctgtat ctctaggagg cagagtcacc 120

attacttgca aggcaagtga ccacattcat aattggttag cctggtatca gcagaaacca 180

ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 240

agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 300

gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggacta cgtacacgtt cggagggggg 360

accaagctgg aaataaaa 378

<210> 9

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Ile Ser Gly

1 5 10 15

Val Tyr Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Glu Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Leu Ser Pro Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 10

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggaatgta actggatact tccttttatt ctgtcggtaa tttcaggggt ctactcagat 60

gttcagctcc agcagtctgg gactgtgctg gcaaggcctg gggcttccgt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacag ctttaccagc tactggatac actgggtaaa acagaggcct 180

ggacagggtc tagagtgggt tggttctatt tatcctggaa atagtgagac tagctacaac 240

cagaagttca agggcaaggc caaactgact gcagtcacat ccgccagcac tgcctacatg 300

gagctcagca gcctgacaaa tgaggactct gcggtctatt actgtacaag aggggggtat 360

ggtaactacc tctccccctt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 420

Claims

1.一种沙门菌PhoN蛋白抗体，其特征在于，所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区，包括轻链可变区互补决定区1、轻链可变区互补决定区2和轻链可变区互补决定区3，所述轻链可变区互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区互补决定区2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述轻链可变区互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链包括三个互补决定区，包括重链可变区互补决定区1、重链可变区互补决定区2和重链可变区互补决定区3，所述重链可变区互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述重链可变区互补决定区2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-2任一项所述抗体。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述多核苷酸中编码所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求3或4所述多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有或者整合有权利要求5所述重组表达载体。

7.一种基于沙门菌PhoN蛋白制备的免疫磁珠检测组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1或2所述抗体。

8.根据权利要求7所述组合物，其特征在于，所试组合物还包括磁珠，洗涤液，活化液，封闭液；所述抗体为纯化的针对沙门菌PhoN蛋白的IgG抗体。

9.一种沙门菌抗体的免疫磁珠检测方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1或2所述抗体检测沙门菌，所述方法为非疾病诊断和治疗目的。