CN113559084B - 一种基于微流控芯片的载药超小四氧化三铁纳米团簇及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于微流控芯片的载药超小四氧化三铁纳米团簇及其制备方法和应用。该方法包括:超小四氧化三铁纳米颗粒制备,超小四氧化三铁纳米团簇制备,4T1细胞膜囊泡悬液制备,微流控芯片制备,细胞膜包覆的载药超小四氧化三铁纳米团簇制备。该方法以微流控芯片为反应器制备的细胞膜包覆的载药超小四氧化三铁纳米团簇,生物安全性好,特异性靶向肿瘤区域,选择性递送药物,实现T2/T1双模态转换的磁共振成像,同时实现肿瘤的光热治疗/化学动力治疗/化疗三模态联合治疗,在癌症诊疗方面具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米医学诊疗材料及其制备和应用领域,特别涉及一种基于微流控芯片的载药超小四氧化三铁纳米团簇及其制备方法和应用。
背景技术
世界卫生组织公布的最新数据显示,癌症仍是全人类面临的主要致命疾病,其发病率和死亡率都呈上升趋势。但是,癌症的早期诊断和治疗,可以极大地提高治愈率。手术切除,放疗和化疗作为目前癌症的主要治疗手段,都存在一定的问题。如手术切除不完全,患者要面临复发的风险,并且需要术后长期的临床观察;放疗和化疗由于缺乏靶向性,治疗过程伴随着极大的副作用。得益于纳米技术的快速发展,各种类型的纳米材料已经开发用于肿瘤诊疗一体化的研究。集多种成像和治疗手段于一体的多功能纳米材料,有望用于癌症精确的检测和治疗,为实现肿瘤的早期诊疗带来了契机。
超小四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒作为一种FDA批准的纳米材料,具有良好的生物相容性和T1磁共振成像(MRI)特性。有趣的是,当超小四氧化三铁纳米颗粒发生团聚,进一步形成较大尺寸的纳米团簇时,又转变为具备T2磁共振成像性能的造影剂,因此由超小四氧化三铁纳米团簇到超小四氧化三铁纳米颗粒的变换,就能够实现动态的T2/T1双模态MRI(Liang Jia,et al.Nano Today,2021,36,101022)。由于肿瘤微环境的谷胱甘肽(GSH)含量偏高,可以利用GSH响应的二硫键将超小四氧化三铁纳米颗粒连接为团簇。二硫键在高浓度GSH肿瘤微环境中发生断裂,团簇重新分散为单一超小四氧化三铁纳米颗粒,从而既消耗了肿瘤细胞内的GSH,使其对活性氧(ROS)敏感,又实现肿瘤部位的特异性T2/T1双模态磁共振成像和药物递送。同时,在微酸的肿瘤微环境中,超小四氧化三铁纳米颗粒能够释放出铁离子,与肿瘤微环境中H2O2作用,通过芬顿反应(Fenton)产生活性氧(ROS),实现化学动力学治疗(CDT)(Keyi Luo,et al.ACS Appl.Mater.Interfaces,2020,12,22650-22660)。
纳米颗粒在肿瘤组织的增强渗透和滞留效应(EPR)可以实现纳米材料在肿瘤位置的富集。但是,当前用于体内的纳米递送***依然面临着免疫清除、蛋白粘附和缺乏靶向性等问题。研究表明,癌细胞膜表面存在免疫逃避蛋白和同源靶向蛋白,可促进免疫逃逸(Mingjun Xuan,et al.Natl.Sci.Rev.,2019,6,551-561)。为了进一步提高药物的靶向性和递送效率,降低对正常组织和细胞的毒性,将特定的癌细胞膜包覆在纳米载体表面,从而实现肿瘤部位的精准成像和同源靶向治疗,在癌症的个性化治疗领域具有广阔的前景。
近年来,用于癌症诊疗的纳米材料已经成为研究的热点,但是,纳米材料在临床上的转化受到了阻碍。主要原因之一,就是具有相同性质和足够数量的纳米材料的可重复合成仍然存在困难。微流体技术作为一种高度交叉的科学和技术,在材料制备方面,能够对反应程序进行精确控制,并生成具有确定尺寸和形态的纳米材料(Xin Zhao,et al.Small,2019,16,1901943)。由于微流控芯片中反应环境均一,因此微流体制备的纳米材料的生产效率和单分散性远高于传统方法。此外,通过设计定制微通道,引入特定的理化过程并结合功能剂,制备的纳米材料的结构和功能可灵活控制。因此,微流体技术为合成高质量的多功能纳米材料提供了一个极好的平台,有望促进纳米医学的发展和临床转化。
检索国内外文献和专利结果表明:基于微流控芯片制备的细胞膜包覆的负载顺铂的GSH响应型超小四氧化三铁纳米团簇用于肿瘤的动态T2/T1双模态MRI引导的光热治疗/化学动力治疗/化疗三模态联合治疗的方法,尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于微流控芯片的载药超小四氧化三铁纳米团簇及其制备方法和应用,以克服现有技术中传统湿化学方法的制备不易控制、产品形貌不规整和重复性差以及肿瘤单模态成像容易出现假阳性的缺陷,本发明提高药物的靶向富集和治疗效果,并降低其副作用。
本发明提供一种基于微流控芯片的载药超小四氧化三铁纳米团簇,将活化的超小四氧化三铁纳米颗粒与胱胺二盐酸盐反应,得到超小四氧化三铁纳米团簇,与盐酸多巴胺溶液混合,超声,然后注入微流控芯片的第一进样口,将4T1细胞膜囊泡悬液注入微流控芯片的第二进样口,将Tris缓冲液注入微流控芯片的第三进样口,将顺铂水溶液注入微流控芯片的第四进样口,所生成的细胞膜包覆的载药超小四氧化三铁纳米团簇通过出样口收集。
本发明还提供一种基于微流控芯片的载药超小四氧化三铁纳米团簇的制备方法,包括:
(1)将铁盐溶于溶剂中,超声,加入柠檬酸钠,搅拌,再加入无水乙酸钠,继续搅拌,然后溶剂热反应,冷却,离心,干燥,得到超小四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4 NPs;
(2)将步骤(1)中超小四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4 NPs分散在超纯水中,经EDC和NHS活化,然后滴入胱胺二盐酸盐溶液反应,透析,得到超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4 NCs溶液;
(3)将4T1细胞离心,向得到的4T1细胞沉淀中加入低渗细胞裂解液,反复冻融破碎,采用梯度离心提取4T1细胞膜,重悬于PBS溶液中,得到4T1细胞膜悬液,挤压,得到4T1细胞膜囊泡悬液;
(4)设计出包含五个进样口、一个出样口、逐渐扩大的S形微流控通道结构,然后打印出掩膜版,再在硅片上光刻制备出模具,然后倒模,将得到的微流控通道盖片以载玻片作为基底,通过等离子键合,得到微流控芯片;
(5)将步骤(2)中超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4 NCs溶液与盐酸多巴胺溶液混合,超声,注入到步骤(4)中微流控芯片的第一进样口中,将步骤(3)中4T1细胞膜囊泡悬液注入到步骤(4)中微流控芯片的第二进样口中,将Tris缓冲液注入到步骤(4)中微流控芯片的第三进样口,将顺铂水溶液注入到步骤(4)中微流控芯片的第四进样口,所生成的细胞膜包覆的载药超小四氧化三铁纳米团簇FDPC通过出样口收集。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中铁盐为三氯化铁;溶剂为二乙二醇。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中铁盐、溶剂、柠檬酸钠和无水乙酸钠的比例为0.60~0.66g:36~42mL:0.46~0.48g:1.3~1.4g。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中超声时间为20~40min,超声至铁盐完全溶解。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中搅拌为:空气氛围下75~85℃搅拌1~3h。
优选地,上述方法中,所述步骤(1)中溶剂热反应温度为180~220℃,溶剂热反应时间为3~5h。
优选地,上述方法中,所述步骤(2)中超小四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4 NPs、EDC、NHS和胱胺二盐酸盐的质量比为40~60:196~216:114~134:88.5~108.5。
优选地,上述方法中,所述步骤(2)中反应温度为室温,反应时间为2~4天
优选地,上述方法中,所述步骤(2)中EDC和NHS活化为:先加入EDC,搅拌反应0.5~1.5h,再加入NHS,搅拌反应2~4h。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中4T1细胞与低渗细胞裂解液的比例为107个:2~4mL。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中低渗细胞裂解液中苯甲基磺酰氟PMSF体积分数为10%。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中反复冻融破碎的工艺参数为:-10~-30℃快速冷冻,30~50℃快速融化,重复2~4次。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中梯度离心为:离心温度为4℃,先以600~800g的离心力,离心5~15min,去沉淀,留上清,再以12000~14000rpm的转速,离心20~40min,去上清,留沉淀。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中挤压为:使用Avanti微型挤出机将4T1细胞膜悬液挤出8~14次。
优选地,上述方法中,所述步骤(3)中4T1细胞膜囊泡悬液的蛋白浓度为1.8~2.2mg/mL。
优选地,上述方法中,所述步骤(4)中PDMS倒模的温度为75~85℃。
优选地,上述方法中,所述步骤(4)中等离子键合的工艺参数为:真空度为18~22Pa,空气中键合处理时间为70~90s。
优选地,上述方法中,所述步骤(4)中所有微流控通道的高度都为50μm,第一进样口、第二进样口和第三进样口的微流控通道宽度为100μm,其余的微流控通道宽度都为300μm,通道入口到出口的总长度为37.8mm。
优选地,上述方法中,所述步骤(5)中超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4 NCs、盐酸多巴胺、4T1细胞膜囊泡和顺铂的质量比为6~8:2~3:0.5~1.5:9~11。
优选地,上述方法中,所述步骤(5)中超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4 NCs溶液浓度为1~2mg/mL。
优选地,上述方法中,所述步骤(5)中盐酸多巴胺溶液浓度为10~20mg/mL。
优选地,上述方法中,所述步骤(5)中顺铂水溶液浓度为0.6~2.4mg/mL。
优选地,上述方法中,所述步骤(5)中Tris缓冲液浓度为10mM,pH为8.5。
优选地,上述方法中,所述步骤(5)中第一进样口、第二进样口、第三进样口和第四进样口的流速分别为4~6mL/h、0.2~1mL/h、20~35mL/h、8~9.5mL/h。
优选地,上述方法中,所述步骤(5)中注入是采用微量注射泵。
本发明还提供一种载药超小四氧化三铁纳米团簇在制备GSH响应的T2/T1双模态核磁共振成像造影和多模态抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
本发明通过溶剂热法合成表面柠檬酸稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4NPs),活化其羧基后以胱胺(Cys)为连接剂得到GSH响应的超小四氧化三铁纳米团簇,然后分别以超小四氧化三铁纳米团簇、盐酸多巴胺、4T1细胞膜囊泡、Tris缓冲液、顺铂为原料,通过控制流速比,经微流控芯片技术一步反应得到细胞膜包裹的载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)。细胞膜能够增强纳米材料的生物相容性和靶向性。包裹在Fe3O4 NCs表面的聚多巴胺(PDA),具有良好的光热性能,而且PDA表面的酚羟基可与化疗药顺铂配位。Fe3O4 NCs中的二硫键被肿瘤微环境中的GSH破坏,重新分散为Fe3O4 NPs,用于体内肿瘤模型的T2/T1双模态MRI。同时,Fe3O4 NPs在酸性肿瘤微环境中能够释放出铁离子,用于肿瘤的化学动力治疗(CDT),从而实现T2/T1双模态MRI引导的光热治疗/化学动力治疗/化疗三模态肿瘤靶向治疗。
本发明使用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、红外光谱(FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)、透射电子显微镜(TEM)、电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)等手段表征制备的细胞膜包裹的载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)的物理及化学性质。通过核磁共振成像分析仪测定细胞膜包裹的载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)的T2/T1双模态成像性能。然后利用CCK-8法评价细胞膜包裹的载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)的细胞毒性,利用激光共聚焦显微镜(Confocal)验证细胞膜包裹的载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)的化学动力学治疗效果,利用流式细胞仪检测细胞膜包裹的载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)对癌细胞的凋亡影响,通过体内热成像观测荷瘤裸鼠肿瘤位置的光热升温情况。最后构建4T1的裸鼠皮下瘤模型,考察FDPC的T2/T1双模态磁共振成像和光热治疗/化学动力学治疗/化疗三模态联合治疗效果。具体测试结果如下:
1.Zeta电势及水动力学直径测试结果
参见说明书附表1,分别为超小四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4 NPs)、超小四氧化三铁纳米团簇(Fe3O4 NCs)、载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDP)、细胞膜包覆的载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)的水动力学直径和电势变化情况。如附表1所示,Fe3O4 NPs的电势为-32.1mV,水合粒径为154.4nm。利用胱胺偶联Fe3O4 NPs后,电势变为-21.3mV,水合粒径增加至235.0nm,证明了Fe3O4 NCs的成功合成。当Fe3O4 NCs包裹聚多巴胺和上载化疗药物顺铂后,电势进一步升至-2.8mV,水合粒径变为222.3nm,这是由于聚多巴胺的包裹作用使得Fe3O4 NCs水合粒径缩小,说明多巴胺的成功包裹和顺铂的成功负载。包覆细胞膜之后,电势又变为-16.3mV,水合粒径变为233.6nm,表明FDPC表面细胞膜的成功包覆。如附图2所示,FDPC在水、PBS溶液和DMEM培养基中的水动力学直径能够较长时间不变,证明了FDPC具有良好的胶体稳定性。
2.紫外(UV-Vis)测试结果
参见说明书附图3中A,分别为Fe3O4 NPs、Fe3O4 NCs、FDP、FDPC的紫外-可见吸收光谱图,在600-800nm的近红外光区观察到了聚多巴胺的特征吸收峰,证明了聚多巴胺的成功包裹。从图中可以看到,包裹细胞膜后,280nm蛋白的紫外吸收增强,表明了细胞膜的成功包覆。
3.红外(FTIR)测试结果
参见说明书附图3中B,分别为Fe3O4 NPs、Fe3O4 NCs、FDP、FDPC的红外图谱,如附图3中B所示,591cm-1附近的特征吸收峰归属于超小四氧化三铁纳米颗粒的Fe-O,557cm-1附近的特征吸收峰归属于胱胺的S-S,证明Fe3O4 NCs的成功合成。2923和2850cm-1附近增强的特征吸收峰为胱胺、聚多巴胺和膜蛋白的C-H的伸缩和弯曲振动特征峰,1465cm-1附近的特征峰则归属于聚多巴胺和膜蛋白的–C=C–伸缩振动,进一步证明了聚多巴胺和细胞膜的成功包裹。
4.X射线光电子能谱(XPS)测试结果
参见说明书附图3中C和D,在附图3中C分别为Fe3O4 NPs、Fe3O4 NCs、FDP、FDPC的X射线光电子能谱。其中,在Fe3O4 NPs、Fe3O4 NCs、FDP、FDPC的XPS图谱中都观察到了Fe元素,并且Fe结合能的强度呈递减趋势,这是由于Fe3O4 NPs表面依次被胱胺修饰、聚多巴胺包裹和细胞膜包覆。在Fe3O4 NPs的XPS图谱中未观察到N元素,而在Fe3O4 NCs、FDP、FDPC的XPS图谱中都观察到了N元素,并且N结合能的强度呈上升趋势,进一步表明Fe3O4 NPs表面依次被胱胺修饰、聚多巴胺包裹和细胞膜包覆。在FDP和FDPC的XPS图谱中观察到Pt元素,证明了Pt的成功负载。附图3中D为FDPC的Fe 2p高分辨XPS图谱,710.52、712.84、724.08、726.65、715.17、719.14、729.49和733.21eV分别对应于Fe2+2p3/2、Fe3+2p3/2、Fe2+2p1/2、Fe3+2p1/2、Fe2+2p3/2satellite、Fe3+2p3/2satellite、Fe2+2p1/2satellite和Fe3+2p1/2satellite,证明了FDPC中Fe3O4的存在。
5.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试结果
参见说明书附图4为4T1细胞膜(CM)、FDPC和FDP的SDS-PAGE结果。用BCA蛋白定量试剂盒对细胞膜悬液和FDPC中的蛋白含量进行测定,再用PBS调节蛋白含量为1mg/mL。取5μL的蛋白Marker加入到第一条蛋白泳道,再分别取20μL的细胞膜悬液(CM)、FDPC和FDP(200μg溶于1mL PBS)依次加入泳道,设置跑胶电流为100A,时间30min。如附图4所示,FDP组没有跑出具有蛋白条纹的泳道,而CM和FDPC组跑出了类似的蛋白条纹泳道,证明细胞膜在FDP表面的成功包覆。
6.TEM测试结果
参见说明书附图5中A、B、C分别为不同放大倍数下FDPC的TEM图。从附图5中A中可以看出,FDPC的大小分布非常均一,平均粒径为205.5nm,具有良好分散性。从附图5中B和C中可以明显观察到在FDPC的***存在厚度为9.8nm的细胞膜,居于核心的聚多巴胺包裹的超小四氧化三铁纳米团簇粒径大小为17.6nm,而且内部包裹的超小四氧化三铁纳米颗粒大小为3.0nm。综上所述,证明了FDPC的成功合成。
7.材料T1和T2弛豫性能测试结果
参见说明书附图6中A和B分别为FDPC在有无GSH(10mM)存在条件下T1和T2弛豫性能变化图。如附图6中A和B所示,在无GSH的条件下,FDPC的r2为20.06mM-1s-1,r1为1.05mM-1s-1,此时,r2/r1大于5,则说明在无GSH存在的条件下,FDPC具有良好的T2成像性能;而在GSH存在的条件下,FDPC的r2降低至3.73mM-1s-1,r1上升至2.22mM-1s-1,此时,r2/r1小于5,则表明在GSH存在的条件下FDPC具有良好的T1成像性能。综上所述可以证明,以GSH为响应机制,FDPC具有良好的T2/T1双模态MRI性能,可作为MRI分子影像学诊断中良好的T2/T1双模态造影剂。
8.体外光热性能测试结果
参见说明书附图7中A,考察了不同浓度(25,50,100μg/mL)的FDPC在808nm激光照射下的升温情况。在一定功率密度(1W/cm2)下,FDPC的升温效应随着浓度的增大逐渐增加,在浓度为100μg/mL时,FDPC的温度升高了20.6℃,而水仅增加了0.9℃。参见说明书附图7中B,FDPC(100μg/mL)的光热稳定性通过五次循环升降温进行测试,用808nm激光照射5min完成一个升温过程,然后关闭激光冷却至起始温度,完成一个降温过程。从图中看出五个循环之间温度变化没有出现明显的差异,表明制备的FDPC具有良好的光热稳定性。根据说明书附图7中C中的升温冷却曲线,得到附图7中D冷却时间与驱动温度的自然对数的相反数之间的关系,经线性拟合可知FDPC的热传递系数为171s,根据公式计算出其光热转换效率为46.2%。
9.药物释放测试结果
参见说明书附图8中A和B分别为FDPC在不同条件(pH=7.4、pH=6.5、pH=7.4+GSH、pH=6.5+GSH)下的药物释放曲线,通过ICP-OES检测不同时间点的Fe和Pt的释放量,并根据初始的Fe和Pt含量计算得到累积释放率。从附图8中A中可以看出,在pH=7.4时,Fe的累积释放量只有5.8%,而当GSH(10mM)存在时,Fe的累积释放量可以增加到6.3%,这是由于GSH加速了超小四氧化三铁团簇解离为单独的四氧化三铁颗粒。在pH=6.5时,Fe的累积释放量增加到11.9%,这是由于弱酸性条件下能够加速Fe3O4中Fe的释放,并且基于GSH对超小四氧化三铁团簇的解离作用,在GSH存在的条件下,Fe的累积释放量上升至13.0%。从附图8中B中可以看出,在pH=7.4时,Pt的累积释放量只有11.5%,而在pH=6.5时,Pt的累积释放量增加到27.6%,这是由于在酸性条件下,氢离子(H+)会与聚多巴胺表面的邻苯二酚羟基中氧原子的孤电子对相互作用,导致[Pt(H2O)2(NH2)2]2+脱离,实现Pt的酸响应释放。并且在GSH存在的条件下,Pt的累积释放量略微增加到29.3%,这得益于GSH改变甚至破坏了聚多巴胺的聚合状态。
10.细胞毒性测试结果
参见说明书附图9为不同处理方式下4T1细胞的CCK-8细胞活力实验。从CCK-8结果可以看到,在相同的Pt浓度下,相比于自由Pt和FDP,FDPC表现出更强的细胞毒性,这是由于细胞膜具有靶向作用,能够增强细胞对纳米材料的摄取。同时,在相同Pt浓度下,相比于无808nm激光照射组,FDP+NIR和FDPC+NIR实验组都表现出更强的细胞毒性,这得益于聚多巴胺良好的光热性能。综上所述,集光热治疗/化学动力治疗/化疗于一体的FDPC+NIR组对4T1细胞具有最强的杀伤作用。
11.细胞内GSH含量测试结果
参见说明书附图10中A为细胞内GSH含量的测试结果。以PBS为空白对照组,以PBS+NIR和相同铁浓度的FDP、FDP+NIR、FDPC和FDPC+NIR作为实验组,在培养箱中与4T1细胞共孵育4h后,更换新鲜培养基,其中PBS+NIR、FDP+NIR和FDPC+NIR组在激光下照射5min(808nm,1.0W/cm2),继续培养至24h,培养结束后用PBS清洗三次,用胰蛋白酶消化细胞,1000rpm,5min离心后,用500μL PBS溶液重悬,再次离心收集细胞沉淀,使用GSH和GSSG检测试剂盒检测细胞内GSH水平。实验结果如附图10中A所示,相比于PBS组,相同Fe浓度的FDP和FDPC处理的细胞GSH水平均发生了不同程度的降低,由于FDPC***细胞膜的靶向作用,FDPC处理的细胞内GSH水平更低。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组细胞内的GSH水平都略微下降,这是由于热疗能够促进ROS的产生,从而进一步消耗GSH。
12.细胞内ROS含量测试结果
参见说明书附图10中B和C分别为通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜对细胞内ROS含量的检测。以PBS为空白对照组,以PBS+NIR和相同铁浓度的FDP、FDP+NIR、FDPC和FDPC+NIR作为实验组,在培养箱中与4T1细胞共孵育4h后,更换新鲜培养基,其中PBS+NIR、FDP+NIR和FDPC+NIR组在激光下照射5min(808nm,1.0W/cm2),继续培养至24h,培养结束后用PBS清洗三次,在避光条件下,每孔加2μL ROS探针和2000μL DMEM培养基,在培养箱中孵育20分钟,孵育结束后用PBS清洗三次,然后用胰酶将细胞消化下来,1000转5min收集细胞,用PBS重悬细胞,通过流式细胞仪检测细胞内ROS含量。如附图10B所示,相比于PBS组,相同Fe浓度的FDP和FDPC处理的细胞内ROS含量都有不同程度的提高,由于FDPC***细胞膜的同源靶向作用,FDPC处理的细胞内ROS含量更高,是PBS组的1.9倍。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组细胞内的ROS含量更高,这也得益于热疗对ROS的产生具有促进作用。
以PBS为空白对照组,以PBS+NIR和相同铁浓度的FDP、FDP+NIR、FDPC和FDPC+NIR作为实验组,在培养箱中与4T1细胞共孵育4h后,更换新鲜培养基,其中PBS+NIR、FDP+NIR和FDPC+NIR组在激光下照射5min(808nm,1.0W/cm2),继续培养至24h,培养结束后用PBS清洗三次。在避光条件下,每孔加1μL ROS探针和1000μL DMEM培养基,在培养箱中孵育20min,孵育结束后用PBS清洗三次,然后用2.5%的戊二醛固定15min,固定后用DAPI染色5min,然后在油镜下观察细胞的绿色荧光信号。如附图10中C所示,相比于PBS组,相同Fe浓度的FDP和FDPC处理的细胞都观察到不同强度的绿色荧光信号,由于FDPC包覆的细胞膜具有靶向特性,FDPC处理的细胞内绿色荧光信号更强。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组细胞内的绿色荧光信号更强,这同样得益于热疗促进了ROS的生成。
13.细胞内LPO含量测试结果
参见说明书附图11为细胞内LPO含量测试结果。以PBS为空白对照组,以PBS+NIR和相同铁浓度的FDP、FDP+NIR、FDPC和FDPC+NIR作为实验组,在培养箱中与4T1细胞共孵育4h后,更换新鲜培养基,其中PBS+NIR、FDP+NIR和FDPC+NIR组激光照射5min(808nm,1.0W/cm2),继续培养至24h,培养结束后用PBS清洗三次。在避光条件下,每孔加1μL LPO探针和500μL DMEM培养基,在培养箱中孵育20min,孵育结束后用PBS清洗三次,然后用2.5%的戊二醛固定15min,固定后用DAPI染色5min,然后在油镜下观察细胞的红色和绿色荧光信号。如附图11所示,探针显示红色荧光时,代表探针未被LPO氧化;探针显示绿色荧光时,代表探针被细胞内的LPO氧化。相比于PBS组,FDP和FDPC处理的细胞的绿色荧光信号显著增强,而红色荧光信号显著降低,此外由于FDPC***细胞膜的靶向作用,其绿色荧光信号更强。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组细胞内的绿色荧光信号更强,红色荧光信号更弱,这是由于光热治疗促进了ROS的产生,从而进一步提高了细胞内LPO水平。
14.细胞凋亡测试结果
参见说明书附图12为细胞凋亡测试结果。以PBS为空白对照组,以PBS+NIR和相同铁浓度的FDP、FDP+NIR、FDPC和FDPC+NIR作为实验组,在培养箱中与4T1细胞共孵育4h后,更换新鲜培养基,其中PBS+NIR、FDP+NIR和FDPC+NIR组在激光下照射5min(808nm,1.0W/cm2),继续培养2h,培养结束后用PBS清洗三次,然后用胰酶将细胞消化下来,1000转5min收集细胞,用PBS重悬细胞,在避光条件下经Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂染色15min,通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。如附图11所示,相比于PBS组,FDP和FDPC组的细胞凋亡率明显提高,此外由于FDPC***细胞膜的靶向作用,FDPC组显示出更高的凋亡率,是FDP组凋亡率的4倍。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组显示出更高的细胞凋亡率和细胞坏死率,这是由于光热治疗进一步促进了细胞的凋亡和坏死,表明光热治疗/化学动力治疗/化疗三模态联合治疗的抗肿瘤效果最好。
15.体内肿瘤热成像测试结果
参见说明书附图13为荷瘤小鼠的体内热成像结果。PBS作为空白对照组,在808nm激光照射5min后(1W/cm2),小鼠肿瘤部位的温度仅上升了1.9℃,这主要是由于生物体本身吸收激光辐射产生的少量热量造成的。相比于PBS组,由于聚多巴胺具有优异的光热转换效率,FDC和FDPC组小鼠肿瘤部位的温度分别上升了14.2和14.7℃,而FDC和FDPC组之间未展现出显著差异。
16.体内磁共振双模态成像测试结果
参见说明书附图14为荷瘤小鼠的体内磁共振双模态成像结果。如附图14中A所示,由于Fe3O4 NPs缺乏靶向性和响应性,Fe3O4组的整个小鼠体内都观察到明显的T2和T1 MR信号,并且在不同的时间点(0、15、30、45、75min)未表现出动态T2/T1双模态MRI的特性。通过胱胺修饰得到的Fe3O4 NCs在尾静脉注射15min后,荷瘤小鼠肿瘤内部T2 MR信号强度达到最低值,并随着时间的推移,T2 MR信号强度逐渐上升(如图14中B);在注射30min后,肿瘤部位明显变亮,T1 MR信号达到峰值(如图14中C),说明肿瘤部位的高浓度GSH环境会使团簇结构的Fe3O4 NCs发生解离,从而实现肿瘤部位的动态T2/T1双模态MRI,但是由于缺乏靶向性,仍然可以在整个小鼠体内观察到明显的磁共振信号。由于FDPC包覆细胞膜的同源靶向特性,在尾静脉注射15min后,荷瘤小鼠肿瘤内部T2 MR信号达到最低值,并且明显比同一时间点Fe3O4 NCs组小鼠肿瘤内部的T2 MRI效果好,随着时间的推移,T2 MR信号逐渐升高(如图14B);在注射30min后,可以观察到肿瘤部位明显变亮,T1 MR信号达到峰值,且显著高于同一时间点Fe3O4 NCs组小鼠肿瘤的T1 MR信号(如图14中C),进一步证明肿瘤部位的高浓度GSH会使二硫键断裂,促使团簇结构的FDPC发生降解,从而实现肿瘤部位的动态T2/T1双模态精准MRI。
17.体内治疗效果评价
参见说明书附图15中A为联合治疗过程示意图,主要分为6组:PBS组、Pt组、FDC组、FDPC组、FDC+NIR组和FDPC+NIR组。在裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型,待模型长到200mm3左右开始进行治疗,其中4组分别尾静脉注射100μL的PBS、Pt、FDC和FDPC(Fe浓度为1mg/mL,对应的Pt浓度为208μg/mL);剩余2组分别尾静脉注射100μL的FDC和FDPC(Fe浓度为1mg/mL),并在15min后,用808nm近红外激光照射5min(1.0W/cm2),每4天治疗一次,一个疗程共治疗3次。治疗结束后至第14天,所有小鼠进行安乐死,然后取肿瘤组织分别进行H&E和TUNEL染色。如附图15中B和15中D所示,PBS对照组小鼠的肿瘤体积增大最多,细胞膜包裹的载药超小四氧化三铁纳米团簇联合光热治疗FDPC+NIR组肿瘤体积减小最大,表现出了最佳的治疗效果。如附图15中C所示,在整个治疗过程Pt组小鼠的体重显著下降,说明Pt存在严重的副作用,而其它组小鼠的体重基本保持稳定,无明显变化,证明FDPC具有良好的生物相容性。参照说明书附图15中E,通过H&E和TUNEL染色考察各治疗组小鼠肿瘤的坏死和凋亡情况,从图中看出FDPC+NIR组的坏死和凋亡最明显,证明化疗/化学动力治疗/光热治疗三模态联合治疗效果最好。
有益效果
(1)本发明反应条件易于实现,可控性强,易操作,原料环保,且成本较低,具有良好的发展前景。
(2)本发明制备的细胞膜包覆的负载顺铂的超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)具有良好的GSH和pH双响应性能。在肿瘤微环境(高浓度GSH),团簇结构的四氧化三铁(Fe3O4NCs)会分散成单个的四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒,对应的T2 MRI成像转变为T1 MRI成像,实现材料的T2/T1双模态MRI。在肿瘤微环境(弱酸性,pH约为6.5),氢离子(H+)会与聚多巴胺表面的邻苯二酚羟基中氧原子的孤电子对相互作用,导致[Pt(H2O)2(NH2)2]2+脱离,实现Pt的酸响应释放,降低对正常细胞的毒副作用。
(3)本发明制备的细胞膜包覆的负载顺铂的超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)具有良好的生物相容性和较高的光热转换效率。借助细胞膜的同源靶向作用,增加抗肿瘤药物在肿瘤的特异性聚积,在增强肿瘤诊疗效果的同时减少了Pt的毒副作用,为构建安全高效的药物载体和成像引导的肿瘤联合治疗提供了应用前景。
(4)本发明制备的细胞膜包覆的负载顺铂的超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)通过尾静脉注射进入小鼠体内后,不仅可以实现肿瘤内部GSH响应的T2/T1的双模态MRI转化,还可以实现肿瘤的化疗/化学动力治疗/光热治疗三模态联合治疗,进一步增强抗肿瘤效果,具有潜在临床应用价值。
附图说明
图1为本发明制备的FDPC的合成和应用示意图,其中1为第一进样口,2为第二进样口,3为第三进样口,4为第四进样口,5为出样口;
图2为本发明制备的FDPC分别在超纯水、PBS溶液(pH=7.4)和DMEM培养基中的水动力学直径随时间变化的曲线图;
图3为本发明制备的Fe3O4 NPs、Fe3O4 NCs、FDP、FDPC的紫外光谱图(A),红外光谱图(B)、XPS谱图(C)和FDPC的Fe 2p高分辨XPS谱图(D);
图4为本发明制备的细胞膜悬液(CM)、FDPC和FDP的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图;
图5为本发明制备的FDPC的TEM图,标尺(Scale bar)分别为200nm(A),50nm(B),20nm(C);
图6为本发明制备的FDPC在有无GSH存在的条件下的T2弛豫率(r2)(A)和T1弛豫率(r1)(B);
图7为本发明制备的FDPC体外光热性能分析:一定功率(1W/cm2)、不同浓度下的FDPC在808nm激光下照射5min时的升温曲线(A),连续升温/降温五个循环的光热稳定性(B),在激光照射阶段和移除激光冷却阶段的温度与时间关系图(C)和线性拟合冷却时间与驱动温度的自然对数的相反数关系(D);
图8为本发明制备的FDPC在不同条件下的Fe释放曲线(A),FDPC在不同条件下的Pt释放曲线(B);
图9为自由Pt、FDP、FDPC以及FDP和FDPC在有激光照射的条件下(5min)与4T1细胞共孵育24h后的细胞活力图;
图10为PBS、FDP和FDPC在有无激光照射的条件下对4T1细胞内GSH和ROS含量的影响:4T1细胞内GSH含量的影响(A),4T1细胞内ROS含量的定量分析(B),4T1细胞内ROS含量的定性分析(C),标尺(Scale bar)为50μm;
图11为PBS、FDP和FDPC在有无激光照射的条件下对4T1细胞内LPO含量的影响,标尺(Scale bar)为50μm;
图12为PBS、FDP和FDPC在有无激光照射的条件下对4T1细胞凋亡的影响;
图13为PBS、FDC和FDPC在荷瘤小鼠体内肿瘤热成像图及对应的升温曲线;
图14为本发明制备的Fe3O4 NPs、Fe3O4 NCs和FDPC经尾静脉注射前后不同时间点荷瘤小鼠肿瘤的T2/T1双模态MRI图(A),相应肿瘤部位的T2 MR信噪比变化图(B)和T1 MR信噪比变化图(C);
图15分别为荷瘤小鼠的治疗过程示意图(A),各组小鼠的相对肿瘤体积变化(B),各组小鼠的体重变化情况(C),各组小鼠在治疗结束后获取的肿瘤图像(D),各组小鼠在治疗结束后第14天肿瘤组织H&E和TUNEL染色结果(E);标尺(Scale bar)为50μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明,否则所有化学试剂都是可商购的,无需进一步纯化即可直接使用。聚二甲基硅氧烷(PDMS)购自美国Dow Corning公司。氯化铁(III)购自Adamas试剂有限公司(中国上海)。柠檬酸钠、无水乙酸钠和盐酸多巴胺购自国药控股化学试剂有限公司(中国上海)。胱胺二盐酸盐购自西格玛奥德里奇贸易有限公司(中国上海)。顺铂购自北京华丰科技有限公司(中国北京)。EDC和NHS购自百灵威科技有限公司(中国上海)。SDS样品缓冲液和SDS-聚丙烯酰胺凝胶购自Tanon Science&Technology Co.,Ltd.(中国上海)。DMEM培养基、胎牛血清(FBS,GIBCO)、青霉素-链霉素(HyClone,Thermo Scientific,Logan,UT)和胰蛋白酶0.25%溶液(HyClone)购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国杭州)。C11 BODIPY581/591购自上海宏叶生物科技有限公司(中国上海)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自7Sea Biotech Co.,Ltd.(中国上海)。GSH与GSSH检测试剂盒和ROS检测试剂盒购自上海碧云天生物公司(中国上海)。Avanti挤出机购自Avanti Polar Lipids,Inc.(美国阿拉巴马州)。4T1细胞(鼠类乳腺癌细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。4-5周龄的裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国上海)。所有实验中使用的电阻率高于18.2MΩ.cm的水均通过实验室水净化***(CascadaI,PALL,北京,中国)进行净化。截留分子量(MWCO)为10000的再生纤维素透析膜购自Fisher(宾夕法尼亚州匹兹堡)。
实施例1
(1)利用Auto CAD软件设计微流控通道结构,微流控通道设计采用逐渐扩大的S形通道,包括:五个入口、一个出口、逐渐扩大的S形微流控通道,通道的高度都为50μm,进样口1、2、3的微流控通道宽度为100μm,其余的微流控通道宽度都为300μm,通道入口到出口的总长度为37.8mm(如图1所示);然后把设计好的芯片利用高分辨率的打印机打印出掩膜版,再利用光刻技术在硅片上制备出微流控芯片模具,最后利用制备好的芯片模具进行倒模,将聚二甲基硅氧烷(PDMS)与固化剂按质量比10:1混匀,真空下排出气泡后倒入模具,然后在80℃下真空干燥2h,得到相应的聚二甲基硅氧烷PDMS微流控通道盖片;通过等离子键合技术,设置真空度为20Pa,空气氛围下处理80s,将载玻片作为基底,与上述PDMS微流控通道盖片键合,得到微流控芯片。
(2)取0.6484g无水三氯化铁溶解在40mL二乙二醇中,然后将0.471g柠檬酸钠(Na3Cit)溶解在上述溶液中,并于空气气氛下80℃搅拌2h,待柠檬酸钠完全溶解后,温度降至55℃,再将1.312g无水醋酸钠加入到上述溶液中,持续搅拌至醋酸钠粉末完全溶解,然后将溶液转移至50mL高压反应釜中,于200℃反应4h;反应结束后,自然冷却至室温,将产物转移至50mL离心管中,以转速13000rpm离心30min,弃上清液,沉淀用无水乙醇回溶,13000rpm离心30min,重复操作3次,然后将沉淀物在真空干燥箱中60℃烘干,即得到表面柠檬酸稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4 NPs)。
(3)取50mg Fe3O4 NPs溶解在15mL超纯水中,持续搅拌,往溶液中滴加EDC(206.5mg,1mL超纯水),30min后,再往溶液中滴加NHS(124.02mg,1mL超纯水),活化Fe3O4NPs上的羧基3h。随后,将胱胺二盐酸盐水溶液(98.5mg,1mL超纯水)滴入上述溶液中,室温下反应72h,再用截留分子量为10000的纤维膜透析袋于PBS缓冲液(10mM,pH=7.4)透析1天,再在超纯水中透析2天,即得Fe3O4 NCs溶液。
(4)取呈对数生长期的4T1细胞107个,离心(1000rpm,5min)得细胞沉淀,用无菌的PBS溶液清洗一次,再往沉淀中加入3mL的低渗细胞裂解缓冲溶液(含体积分数为10%的PMSF),冰浴15min,采用冻融法反复冻融(-20℃快速冷冻,40℃快速融化)3次。设置离心温度为4℃,以700g的离心力离心15min,去沉淀;将上清再以13500rpm的转速离心30min,留沉淀,将沉淀重悬于500μL的PBS溶液中,即得4T1细胞膜的悬液;使用Avanti微型挤出机将细胞膜悬液挤出11次,得到细胞膜囊泡悬液。
(5)将超小四氧化三铁纳米团簇(Fe3O4 NCs)溶液(1.39mg/mL,5mL)与盐酸多巴胺溶液(16mg/mL,165μL)混合,超声3min使其混匀,由微量注射泵注入到第一进样口1中,流速为5mL/h;将Tris缓冲液(pH=8.5,10mM,0.5mL)由微量注射泵注入到第二进样口2中,流速为0.5mL/h;Tris缓冲液(pH=8.5,10mM,56mL)由微量注射泵注入到第三进样口3中,流速为28mL/h;顺铂水溶液(1.2mg/mL,8.7mL)由微量注射泵注入到第四进样口4中,流速为8.7mL/h,通过出样口5收集,得到载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDP)。
(6)将超小四氧化三铁纳米团簇(Fe3O4 NCs)溶液(1.39mg/mL,5mL)与盐酸多巴胺溶液(16mg/mL,165μL)混合,超声3min使其混匀,由微量注射泵注入到第一进样口1中,流速为5mL/h;将细胞膜囊泡溶液(2.0mg/mL,0.5mL)由微量注射泵注入到第二进样口2中,流速为0.5mL/h;Tris缓冲液(pH=8.5,10mM,56mL)由微量注射泵注入到第三进样口3中,流速为28mL/h,Tris缓冲液(pH=8.5,10mM,8.7mL)由微量注射泵注入到第四进样口4中,流速为8.7mL/h,通过出样口5收集,得到细胞膜包裹的超小四氧化三铁纳米团簇(FDC)。
(7)将超小四氧化三铁纳米团簇(Fe3O4 NCs)溶液(1.39mg/mL,5mL)与盐酸多巴胺溶液(16mg/mL,165μL)混合,超声3min使其混匀,由微量注射泵注入到第一进样口1中,流速为5mL/h;将细胞膜囊泡溶液(2.0mg/mL,0.5mL)由微量注射泵注入到第二进样口2中,流速为0.5mL/h;Tris缓冲液(pH=8.5,10mM,56mL)由微量注射泵注入到第三进样口3中,流速为28mL/h;顺铂水溶液(1.2mg/mL,8.7mL)由微量注射泵注入到第四进样口4中,流速为8.7mL/h;通过出样口5收集,得到细胞膜包覆的载药超小四氧化三铁纳米团簇(FDPC)。
实施例2
对实施例1制备的Fe3O4 NPs、Fe3O4 NCs、FDP和FDPC进行表征。Fe3O4 NPs、Fe3O4NCs、FDP和FDPC的水动力学直径和zeta表面电势如表1所示,由于Fe3O4 NPs表面被羧基修饰,Fe3O4 NPs的电势为-32.1mV,水合粒径为154.4nm。当胱胺偶联Fe3O4 NPs形成Fe3O4 NCs时,电势变为-21.3mV,水合粒径增加至235.0nm,这是由于胱胺两端的氨基与Fe3O4 NPs表面的羧基发生酰胺反应,得到团簇结构的Fe3O4 NCs,使得水合粒径增大,电势升高。当Fe3O4NCs包裹聚多巴胺和上载化疗药物顺铂后,FDP的电势进一步升至-2.8mV,水合粒径变为222.3nm,这是由于聚多巴胺的包裹作用使得Fe3O4 NCs水合粒径缩小,而且聚多巴胺表面的酚羟基进一步与Pt配位,这证明了聚多巴胺的成功包裹和顺铂的成功负载。包覆细胞膜之后,FDPC的电势又降低至-16.3mV,水合粒径变为233.6nm,表明FDPC表面细胞膜的成功包覆。
表1
Sample | Zeta potential(mV) | Hydrodynamic(nm) | PDI |
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> NPs | -32.1±1.710 | 154.4±18.455 | 0.448±0.099 |
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub> NCs | -21.3±0.350 | 235.0±2.730 | 0.189±0.063 |
FDP | -2.8±0.615 | 222.3±28.290 | 0.224±0.014 |
FDPC | -16.3±0.191 | 233.6±16.020 | 0.401±0.072 |
如图3中A所示,Fe3O4 NCs包裹聚多巴胺后,在600-800nm的近红外光区观察到了聚多巴胺的特征吸收峰,证明了聚多巴胺的成功包裹。从图中可以看到,包裹细胞膜后,280nm蛋白的紫外吸收增强,表明了细胞膜的成功包覆。如图3中B所示,591cm-1附近的特征吸收峰归属于超小四氧化三铁纳米颗粒的Fe-O,557cm-1附近的特征吸收峰归属于胱胺的S-S,证明Fe3O4 NCs的成功合成。2923和2850cm-1附近增强的特征吸收峰为胱胺、聚多巴胺和膜蛋白的C-H的伸缩和弯曲振动特征吸收峰,1465cm-1附近的特征峰则归属于聚多巴胺和膜蛋白的–C=C–伸缩振动,证明了聚多巴胺和细胞膜的成功包裹。
如图3中C所示,在Fe3O4 NPs、Fe3O4 NCs、FDP和FDPC的XPS图谱中都观察到了Fe元素,并且Fe结合能的强度呈递减趋势,这是由于Fe3O4 NPs的表面依次被胱胺修饰、聚多巴胺包裹和细胞膜包覆,导致表面的Fe含量减少。在Fe3O4 NPs的XPS图谱中未观察到N元素,而在Fe3O4 NCs、FDP、FDPC的XPS图谱中都观察到了N元素,并且N结合能的强度呈上升趋势,进一步证明了Fe3O4 NPs表面依次被胱胺修饰、聚多巴胺包裹和细胞膜包覆。在FDP和FDPC的XPS图谱中观察到Pt元素,证明了Pt的成功负载。图3中D为FDPC的Fe 2p高分辨XPS图谱,710.52、712.84、724.08、726.65、715.17、719.14、729.49和733.21eV分别对应于Fe2+2p3/2、Fe3+2p3/2、Fe2+2p1/2、Fe3+2p1/2、Fe2+2p3/2 satellite、Fe3+2p3/2 satellite、Fe2+2p1/2satellite和Fe3+2p1/2 satellite,证明了FDPC中Fe3O4的存在。
图4为CM、FDPC和FDP的SDS-PAGE结果。用BCA蛋白定量试剂盒对细胞膜悬液和FDPC中的蛋白含量进行测定,再用PBS调节蛋白含量为1mg/mL。取5μL的蛋白Marker加入到第一条蛋白泳道,再分别取20μL的细胞膜悬液(CM)、FDPC和FDP(200μg溶于1mL PBS)依次加入泳道,设置跑胶电流为100A,时间30min。如图4所示,FDP组没有跑出具有蛋白条纹的泳道,而CM和FDPC组跑出了类似的蛋白条纹泳道,证明细胞膜在FDP表面的成功包覆。
图5中A为FDPC的TEM图,FDPC的大小分布非常均一,平均粒径为205.5nm,分散性良好。从图5B和5C中可以明显观察到在FDPC的***存在厚度为9.8nm的细胞膜,其核心为聚多巴胺包裹的超小四氧化三铁纳米团簇,粒径大小为17.6nm。如图5C所示,在聚多巴胺的内部可以观察到超小四氧化三铁纳米颗粒,粒径大小为3.0nm,综上所述,证明了FDPC的成功合成。
实施例3
通过ICP-OES测试法测定FDPC中Fe元素的含量。为测试FDPC的GSH响应性能,将FDPC分别配制为含GSH的水溶液,浓度梯度溶液各1mL(Fe元素浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mM)。分别测定FDPC在有无GSH存在情况下的T2和T1弛豫时间,将弛豫时间的倒数与Fe浓度进行线性拟合,其斜率即为弛豫率(如图6)(T1成像的弛豫率用r1表示,T2成像的弛豫率用r2表示)。通常,r2/r1小于5,则说明材料具有良好的T1成像性能;如果r2/r1大于5,则说明材料具有良好的T2成像性能。如图6所示,在无GSH存在的条件下,FDPC的r2为20.06mM-1s-1,而r1为1.05mM-1s-1,此时r2/r1大于5,说明在无GSH存在的条件下FDPC具有良好的T2成像性能。在GSH存在的条件下,FDPC的r2降低至3.73mM-1s-1,而r1上升至2.22mM-1s-1,此时r2/r1小于5,表明在GSH存在的条件下FDPC具有良好的T1成像性能,这是由于GSH使胱胺的二硫键断裂,破坏了FDPC的团簇结构。综合上述结果进一步说明,以GSH作为响应机制,FDPC具有良好的T2/T1双模态MRI性能,可作为MRI分子影像学诊断中良好的T2/T1双模态造影剂。
FDPC的体外光热性能测试结果如图7所示,图7中A为不同Fe浓度(25、50、100μg/mL)的FDPC在808nm激光照射下随时间的升温情况。在一定的功率密度(1W/cm2)下,FDPC的升温效应随着浓度的增加逐渐提高,在浓度为100μg/mL时,FDPC的温度升高了20.6℃,而水仅增加了0.9℃。FDPC(100μg/mL)的光热稳定性通过五次循环升降温进行测试,其中用808nm激光照射5min完成一个升温过程,然后关闭激光冷却至起始温度,完成一个降温过程,结果如图7中B所示,发现五个循环之间没有出现明显差异,表明制备的FDPC具有良好的光热稳定性。另外,根据图7中C中的升温冷却曲线,得到图7中D冷却时间与驱动温度的自然对数的相反数之间的关系,经线性拟合可知FDPC的热传递系数为171s,根据公式计算出其光热转换效率为46.2%。
分别配制pH=7.4、pH=6.5、含GSH且pH=7.4和含GSH且pH=6.5的四种PBS缓冲液,将制备的FDPC溶解于1mL上述四种PBS缓冲溶液,配置为Fe浓度为500μg/mL的溶液,再将其置于透析袋中,再将透析袋置于含有19mL上述四种不同缓冲溶液的容器中,置于37℃的恒温摇床中振荡。在不同的时间点吸取透析袋外液1mL,再向容器中补充对应的PBS缓冲溶液,1mL透析袋外液经王水消化后,由ICP-OES测试法测定Fe和Pt的含量。缓释结束后,绘制FDPC在不同条件下的药物释放曲线。如图8中A所示,在pH=7.4时,Fe的累积释放量只有5.8%,而当GSH(10mM)存在时,Fe的累积释放量可以增加到6.3%,这是由于GSH加速了团簇的解离。在pH=6.5时,Fe的累积释放量增加到11.9%,这是由于弱酸性条件下能够加速Fe3O4中Fe的释放;并且基于GSH对团簇的解离作用,在GSH存在的条件下,Fe的累积释放量上升至13.0%。从图8中B中可以看出,在pH=7.4时,Pt的累积释放量只有11.5%,而在pH=6.5时,Pt的累积释放量增加到27.6%,这是由于在酸性条件下,氢离子(H+)会与聚多巴胺表面的邻苯二酚羟基中氧原子的孤电子对相互作用,导致[Pt(H2O)2(NH2)2]2+脱离,实现Pt的酸响应释放;在此基础上,由于GSH的存在,Pt的累积释放量略微增加到29.3%,这得益于GSH改变甚至破坏了聚多巴胺的聚合状态。
实施例4
以4T1细胞为细胞模型来评价自由Pt、FDP、FDPC,以及激光参与下FDP和FDPC的细胞毒性。将4T1细胞按照1×104个细胞每孔的密度接种在5块96孔板中,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。然后将其中3块96孔板的培养基换成含有自由Pt、FDP、FDPC(Pt的浓度均设置为0μg/mL、1.3μg/mL、2.6μg/mL、5.2μg/mL、10.4μg/mL、20.8μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养4h,然后将培养基换成新DMEM培养基,继续在5%CO2、37℃条件下共培养至24h。其余2块96孔板细胞培养板的培养基分别换成含有FDP、FDPC(Pt的浓度均设置为0μg/mL、1.3μg/mL、2.6μg/mL、5.2μg/mL、10.4μg/mL、20.8μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养4h,然后其培养基换成新DMEM培养基,然后在808nm的激光下照射5min,继续在5%CO2、37℃条件下共培养至24h。对于5块96孔板的细胞培养板,用PBS洗三次,随后加入含10%(v/v)CCK-8(10μL)的DMEM培养基(100μL/孔)溶液,在培养箱继续培养4h。最后用酶标仪于波长为450nm处测试每孔的吸光度,以DMEM培养基处理的细胞作为空白对照,细胞活力标记为100%。CCK-8结果如图9所示,在相同的Pt浓度下,相比于自由Pt和FDP,FDPC表现出更强的细胞毒性,这是由于细胞膜具有靶向作用,能够增强细胞对纳米材料的摄取。同时,在相同Pt浓度下,相比于无808nm激光照射组(FDP和FDPC组)、FDP+NIR和FDPC+NIR实验组都表现出更强的细胞毒性,这得益于聚多巴胺良好的光热性能。综上所述,集光热治疗/化学动力治疗/化疗于一体的FDPC+NIR组对4T1细胞具有最强的杀伤作用。
实施例5
以4T1细胞为细胞模型来评价FDP、FDPC以及激光参与下FDP和FDPC对细胞内GSH含量的影响。将4T1细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在3块6孔板中,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。然后去除旧培养基,分别换成新DMEM培养基,含有FDP、FDPC(Fe的浓度均设置为50μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养4h,然后将培养基换成新DMEM培养基,每块6孔板的其中三个孔在808nm激光(1.0W/cm2)下照射5min,继续在5%CO2、37℃条件下共培养至24h。用PBS洗三次,随后用胰酶将细胞消化下来,1000rpm、5min离心后,用500μL PBS溶液重悬,再次离心收集细胞沉淀,使用GSH和GSSG检测试剂盒(购自碧云天生物技术公司)检测细胞内GSH水平。如图10中A所示,相比于PBS组,相同Fe浓度的FDP和FDPC处理的细胞GSH水平均发生了不同程度的降低,由于FDPC***细胞膜的靶向作用,FDPC处理的细胞内GSH水平更低。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组细胞内的GSH水平都略微下降,这是由于热疗对ROS产生的促进作用,从而进一步消耗GSH,表明激光照射下FDPC对细胞内GSH的消耗最明显。
以4T1细胞为细胞模型来定量评价FDP、FDPC以及激光参与下FDP和FDPC对细胞内ROS含量的影响。将4T1细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在3块6孔板中,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。然后去除旧培养基,分别换成新DMEM培养基,含有FDP、FDPC(Fe的浓度均设置为50μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养4h,然后将培养基换成新DMEM培养基,每块6孔板的其中三个孔在808nm激光(1.0W/cm2)下照射5min,继续在5%CO2、37℃条件下共培养至24h。用PBS洗三次,在避光条件下,每孔加2μL DCFH-DA和2000μL DMEM培养基,在培养箱中孵育20min,孵育结束后用PBS清洗三次,然后用胰酶将细胞消化下来,1000转、5min收集细胞,用PBS重悬细胞,通过流式细胞仪检测细胞内ROS含量。如图10中B所示,相比于PBS组,相同Fe浓度的FDP和FDPC处理的细胞内ROS含量都有不同程度的提高,由于FDPC***细胞膜的同源靶向作用,FDPC处理的细胞内ROS含量更高,是PBS组的1.9倍,而PBS+NIR组的ROS含量未出现明显变化,表明单独的近红外激光照射不会引起细胞内ROS的升高。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组细胞内的ROS含量更高,这得益于热疗促进了ROS的产生。
进一步以4T1细胞为细胞模型来定性评价FDP、FDPC以及激光参与下FDP和FDPC对细胞内ROS含量的影响。将4T1细胞按照1×104个细胞每孔的密度接种在6个confocal皿中,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。然后去除旧培养基,分别换成新DMEM培养基,含有FDP、FDPC(Fe的浓度均设置为50μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养4h,然后将培养基换成新DMEM培养基,其中3个confocal皿(DMEM培养基、FDP、FDPC)继续在5%CO2、37℃条件下共培养至24h,剩余3个confocal皿(DMEM培养基、FDP、FDPC)在808nm激光(1.0W/cm2)下照射5min,继续在5%CO2、37℃条件下共培养至24h,培养结束后用PBS清洗三次。在避光条件下,每孔加1μL ROS探针和1000μLDMEM培养基,在培养箱中孵育20min,孵育结束后用PBS清洗三次,然后用2.5%的戊二醛固定15min,固定后用DAPI染色5min,然后在油镜下观察细胞的绿色荧光信号。如图10中C所示,相比于PBS组,相同Fe浓度的FDP和FDPC处理的细胞都观察到不同强度的绿色荧光信号,由于FDPC包裹的细胞膜具有靶向特性,FDPC处理的细胞内绿色荧光信号更强,而PBS+NIR组未显示出明显ROS信号,表明单独的近红外激光照射不会引起细胞内ROS的升高。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组细胞内的绿色荧光信号更强,这同样得益于热疗对ROS产生的促进作用,证明了在激光照射下FDPC促进细胞内ROS的生成最明显。
实施例6
以4T1细胞为细胞模型来评价FDP、FDPC以及激光参与下FDP和FDPC对细胞内LPO含量的影响。将4T1细胞按照1×104个细胞每孔的密度接种在6个confocal皿中,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。然后去除旧培养基,分别换成新DMEM培养基,含有FDP、FDPC(Fe的浓度均设置为50μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养4h,然后将培养基换成新DMEM培养基,其中3个confocal皿(DMEM培养基,FDP,FDPC)继续在5%CO2、37℃条件下共培养至24h,剩余3个confocal皿(DMEM培养基、FDP、FDPC)在808nm激光(1.0W/cm2)下照射5min,继续在5%CO2、37℃条件下共培养至24h,培养结束后用PBS清洗三次。在避光条件下,每孔加1μL C11 BODIPY探针和500μL DMEM培养基,在培养箱中孵育20min,孵育结束后用PBS清洗三次,然后用2.5%的戊二醛固定15min,固定后用DAPI染色5min,然后在油镜下观察细胞的红色和绿色荧光信号。如图11所示,探针显示红色荧光时,代表探针未被LPO氧化(Non-Oxidized C11 BODIPY);探针显示绿色荧光时,代表探针被细胞内的LPO氧化(Oxidized C11 BODIPY)。相比于PBS组,FDP和FDPC处理的细胞的绿色荧光信号显著增强,而红色荧光信号显著降低,此外由于FDPC***细胞膜的靶向作用,其绿色荧光信号更强,而PBS+NIR组未表现出明显LPO水平上升,表明单独的近红外激光照射不会引起细胞内LPO的升高。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组细胞内的绿色荧光信号更强,红色荧光信号更弱,这是由于光热治疗促进了ROS的产生,从而加剧了细胞内LPO水平的升高,证明了在近红外激光照射下FDPC导致细胞内LPO的水平最高。
实施例7
以4T1细胞为细胞模型来评价FDP、FDPC以及激光参与下FDP和FDPC对细胞凋亡的影响。将4T1细胞按照2×105个细胞每孔的密度接种在3块6孔板中,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。然后去除旧培养基,分别换成新DMEM培养基,含有FDP、FDPC(Fe的浓度均设置为50μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养4h,然后将培养基换成新DMEM培养基,每块6孔板的其中三个孔在808nm激光(1.0W/cm2)下照射5min,继续在5%CO2、37℃条件下共培养2h。用PBS洗三次,然后用胰酶将细胞消化下来,1000转5min收集细胞,用PBS重悬细胞,在避光条件下,每管加入5μL Annexin V-FITC,室温下反应10min,再加入10μL PI染色液,室温下反应5min,通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。如图12所示,相比于PBS组,FDP和FDPC组的细胞凋亡率明显提高,此外由于FDPC***细胞膜的靶向作用,FDPC组显示出更高的凋亡率,是FDP组凋亡率的4倍,而PBS+NIR组未表现出明显的差异,表明单独的近红外激光照射不会造成细胞凋亡。相比于无激光照射组(FDP和FDPC),在激光照射下,FDP+NIR和FDPC+NIR组显示出更高的细胞凋亡率和细胞坏死率,这是由于光热治疗进一步促进了细胞的凋亡和坏死,表明光热治疗/化学动力治疗/化疗三模态联合治疗的抗肿瘤效果最好。
实施例8
体内热成像实验:在4-5周雌性裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型,分别尾静脉注射100μLPBS和溶于100μL PBS的FDC和FDPC(Fe浓度为1mg/mL),15min后用808nm近红外激光(1.0W/cm2)照射各组荷瘤小鼠的肿瘤部位,持续照射5min,用红外摄像仪记录肿瘤部位的升温情况,结果如图13所示。PBS作为空白对照组,在808nm近红外激光照射5min后,小鼠肿瘤部位的温度仅上升了1.9℃,这主要是由于生物体本身吸收激光辐射产生的少量热量造成的。相比于PBS组,由于聚多巴胺具有优异的光热转换效率,FDC和FDPC组小鼠肿瘤部位的温度分别上升了14.2和14.7℃,而且FDC和FDPC组之间未展现出显著差异。
实施例9
在4-5周雌性裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型,分别尾静脉注射100μL Fe3O4 NPs、Fe3O4NCs和FDPC的PBS缓冲液(Fe浓度为1mg/mL),通过核磁共振成像仪扫描荷瘤鼠在注射材料后不同时间点(0、15、30、45、75min)的肿瘤部位T2和T1 MRI,评价其T2/T1双模态MR造影效果(如图14)。如图14中A所示,由于Fe3O4 NPs缺乏靶向性和响应性,Fe3O4组的整个小鼠体内都观察到明显的T2和T1 MR信号,并且在不同的时间点(0、15、30、45、75min)未表现出动态T2/T1双模态MRI的特性。通过胱胺修饰得到的Fe3O4 NCs在尾静脉注射15min后,荷瘤小鼠肿瘤内部T2 MR信号达到最低值,并随着时间的推移,T2 MR信号强度逐渐上升(如图14中B);在注射30min后,肿瘤部位明显变亮(如图14中A),T1 MR信号达到峰值(如图14中C),说明肿瘤部位的高浓度GSH环境会使团簇结构的Fe3O4 NCs发生降解,从而实现肿瘤部位的动态T2/T1双模态MRI,但是由于缺乏靶向性,仍然可以在整个小鼠体内观察到明显的磁共振信号。由于FDPC包裹细胞膜的同源靶向特性,在尾静脉注射15min后,荷瘤小鼠肿瘤内部T2 MR信号达到最低值,并且明显比同一时间点Fe3O4 NCs组小鼠肿瘤内部的T2 MRI效果好(图14中A),随着时间的推移,T2 MR信号强度逐渐升高(如图14中B);在注射30min后,可以观察到肿瘤部位明显变亮,T1 MR信号达到峰值,且显著高于同一时间点Fe3O4 NCs组小鼠肿瘤内部的T1MR信号(如图14中C),进一步证明肿瘤部位的高浓度GSH会使二硫键断裂,促使团簇结构的FDPC发生降解,从而实现肿瘤部位的动态T2/T1双模态精准MRI。
实施例10
参见说明书附图15中B为联合治疗过程示意图。在裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型,待肿瘤体积达到200mm3左右,将荷瘤裸鼠随机分为6组(PBS、Pt、FDC、FDPC、FDC+NIR、FDPC+NIR),每组5只。其中4组分别尾静脉注射100μL的PBS、Pt、FDC和FDPC(Fe浓度为1mg/mL,对应的Pt浓度为208μg/mL);剩余2组分别尾静脉注射100μL的FDC和FDPC(Fe浓度为1mg/mL),并在15min后,用808nm近红外激光照射肿瘤部位5min(1.0W/cm2),每4天治疗一次,一个疗程共治疗3次,治疗过程如图15中A所示。小鼠肿瘤体积和小鼠重量每2天测量一次,肿瘤体积以及相对肿瘤体积用下面的公式(1)和(2)分别计算。
肿瘤体积(V)=a×b2/2 (1)
a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
相对肿瘤体积=V/V0 (2)
V和V0分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
3次治疗结束后至第14天,所有小鼠进行安乐死,然后取肿瘤组织分别进行H&E和TENEL染色。如图15中B和15中D所示,PBS对照组小鼠的肿瘤体积增大最多,细胞膜包裹的载药超小四氧化三铁纳米团簇联合光热治疗FDPC+NIR组肿瘤体积减小最大,表现出了最佳的治疗效果。如图15中C所示,在整个治疗过程Pt组小鼠的体重显著下降,说明Pt存在严重的毒副作用,而其它组小鼠的体重基本保持稳定,无明显变化,证明其它组材料均具有良好的生物相容性。如图15中E所示,通过H&E和TUNEL染色考察各治疗组小鼠肿瘤的坏死和凋亡情况,从图中看出FDPC+NIR组肿瘤组织的坏死和凋亡效果最明显,证明光热治疗/化学动力学治疗/化疗三模态联合治疗的效果最好。
Claims (6)
1.一种基于微流控芯片的载药超小四氧化三铁纳米团簇的制备方法,包括:
(1)将铁盐溶于溶剂中,超声,加入柠檬酸钠,搅拌,再加入无水乙酸钠,继续搅拌,然后溶剂热反应,冷却,离心,干燥,得到超小四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4 NPs;
(2)将步骤(1)中超小四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4 NPs分散在超纯水中,经EDC和NHS活化,然后滴入胱胺二盐酸盐溶液反应,透析,得到超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4 NCs溶液;
(3)将4T1细胞离心,向得到的4T1细胞沉淀中加入低渗细胞裂解液,反复冻融破碎,采用梯度离心提取4T1细胞膜,重悬于PBS溶液中,得到4T1细胞膜悬液,挤压,得到4T1细胞膜囊泡悬液;
(4)设计出包含五个进样口、一个出样口、逐渐扩大的S形微流控通道结构,然后打印出掩膜版,再在硅片上光刻制备出模具,然后倒模,将得到的微流控通道盖片以载玻片作为基底,通过等离子键合,得到微流控芯片,其中,倒模的温度为75~85℃;等离子键合的工艺参数为:真空度为18~22 Pa,空气中键合处理时间为70~90 s;
(5)将步骤(2)中超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4 NCs溶液与盐酸多巴胺溶液混合,超声,注入到步骤(4)中微流控芯片的第一进样口中,将步骤(3)中4T1细胞膜囊泡悬液注入到步骤(4)中微流控芯片的第二进样口中,将Tris缓冲液注入到步骤(4)中微流控芯片的第三进样口,将顺铂水溶液注入到步骤(4)中微流控芯片的第四进样口,所生成的细胞膜包覆的载药超小四氧化三铁纳米团簇FDPC通过出样口收集,其中,超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4 NCs、盐酸多巴胺、4T1细胞膜囊泡和顺铂的质量比为6~8:2~3:0.5~1.5:9~11;第一进样口、第二进样口、第三进样口和第四进样口的流速分别为4~6 mL/h、0.2~1mL/h、20~35 mL/h、8~9.5 mL/h。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中铁盐为三氯化铁;溶剂为二乙二醇;铁盐、溶剂、柠檬酸钠和无水乙酸钠的比例为0.60~0.66 g : 36~42 mL :0.46~0.48 g : 1.3~1.4 g。
3. 根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中搅拌为:空气氛围下75~85℃搅拌1~3 h;溶剂热反应温度为180~220℃,溶剂热反应时间为3~5 h。
4. 根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中超小四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4 NPs、EDC、NHS和胱胺二盐酸盐的质量比为40~60:196~216:114~134:88.5~108.5;反应温度为室温,反应时间为2~4天。
5. 根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中EDC和NHS活化为:先加入EDC,搅拌反应0.5~1.5 h,再加入NHS,搅拌反应2~4 h。
6. 根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中4T1细胞与低渗细胞裂解液的比例为107个 : 2~4 mL;反复冻融破碎的工艺参数为:-10~-30℃快速冷冻,30~50℃快速融化,重复2~4次;挤压为:使用Avanti微型挤出机将4T1细胞膜悬液挤出8~14次;4T1细胞膜囊泡悬液的蛋白浓度为1.8~2.2 mg/mL。
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