CN113552068A - 一种异喹啉生物碱的快速精准检测方法、应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明为一种采用8‑羟基‑1，3，6‑芘三磺酸钠盐(HPTS)作为有机荧光探针快速、精准检测异喹啉类生物碱，特别是盐酸小檗碱的方法，及其在中药黄连生产工艺中的应用，以及一种异喹啉类生物碱快速检测试剂盒。

Description

一种异喹啉生物碱的快速精准检测方法、应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种采用8-羟基-1，3，6-芘三磺酸钠盐(HPTS)作为有荧光探针，快速精准检测异喹啉类生物碱，特别是盐酸小檗碱的 方法，及其在跟踪黄连生产工艺中的应用，以及一种异喹啉类生物碱快速检测试 剂盒。

发明背景

异喹啉类生物碱是最大的一类生物碱。以异喹啉或四氢异喹啉为母核，根据 连接基团的不同，可分为：简单异喹啉类、苄基异喹啉类、阿朴菲类、双苄基异 喹啉类、小檗碱类、普罗托品类、***类和苯菲啶类。异喹啉类生物碱具有多种 生物活性，如抗肿瘤、抗炎、镇痛、免疫调节和抗氧化作用等。

研究显示，黄连、黄柏的药理活性主要与其所含的多种季铵型异喹啉类生物 碱有关，包括盐酸小檗碱(以下简称小檗碱)、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、药 根碱等，其中以小檗碱的含量最高。五种主要生物碱均具有季铵基团，在分子结 构特点上均属异喹啉类生物碱。

小檗碱是黄连、黄柏等中药材的主要活性成分之一，属于异喹啉类，特别是 单苄异喹啉类季铵型生物碱，具有抗菌、消炎、抗心律失常、降血脂、降血糖以 及抗肿瘤等多种药理活性。由于药源十分丰富，价格相对适中，不良反应少，小 檗碱作为一种广谱的抗菌药物被广泛用于现代制药行业。

小檗碱含量测定是衡量黄连质量的重要指标，其测定方法主要有高效液相色 谱法、SDS法、双波长薄层扫描法、化学发光法、毛细管电泳法和电化学分析法 等。一些传统的分析方法具有量化小檗碱的能力，但大多数方法需要昂贵的仪器， 复杂和耗时的操作步骤。

目前，大生产实践中，缺少一种快速、精准检测异喹啉类生物碱，特别是小 檗碱的方法。同时，荧光方法用于异喹啉生物碱，特别是小檗碱检测的研究也十 分有限，特别是工业化生产中的快速检测。

发明内容

本发明针对异喹啉生物碱实施快速精准检测的问题，采用荧光法，特别是有 机荧光探针法，基于荧光“开关”原理，对小檗碱进行快速检测。

本发明有动机地设计大量的、不同的有机荧光探针、无机荧光探针实验，筛 选、对比、优化。申请人对荧光素类、罗丹明类、香豆素类、苯并噻唑类等有机 类荧光探针和碳点、量子点、金纳米簇等无机类荧光探针进行了筛选。最终得到 了一种采用HPTS作为有机荧光探针快速精准检测异喹啉类生物碱的方法。

本发明建立小檗碱快速检测技术方法；确定工艺判定标准，将快速检测小檗 碱的方法应用于黄连生产工艺；跟踪并检测黄连提取各工序中的小檗碱的浓度； 为大生产提供能够快速精准检测小檗碱的试剂盒实物。

本发明从以下几方面进行了设计研究(1)从发光材料中筛选高量子产率和 长荧光寿命的有机探针；(2)建立小檗碱快速检测方法，并进行方法学考察；(3) 跟踪黄连生产工艺，验证检测方法，确定检测操作方法及工艺判定标准；(4)制 作成品检测试剂盒。

申请人发现，由于HPTS和小檗碱之间的静电相互作用和π-π堆积形成了复 合物导致HPTS荧光猝灭。HPTS对小檗碱的检测方法成本较低、灵敏度高、易 于观察且响应速度快，参见图1。

本发明HPTS速检测小檗碱的方法，具有量子产率高、荧光寿命长、易于可 视化且检测结果的准确度较高、成本较低的特点。

本发明检测方法对大生产中的黄连样品进行了实测，相较HPLC等其他检测 方法，检测时间大幅缩短，每个样品在荧光光度计中的检测时间低于1分钟，甚 至低于30秒，比HPLC方法缩短了约2个数量级。

本发明方法考虑了成本的经济性，适用于工业化大生产。

说明书附图

图1：HPTS与小檗碱结合前后的示意图；

图2：HPTS检测不同浓度小檗碱结果图；

其中，图2(A)：不同浓度的小檗碱对HPTS荧光响应的照片；

图2(B)不同浓度的小檗碱对HPTS的荧光滴定光谱；

图2(C)HPTS相对小檗碱浓度的相对强度图；

图2(D)和图2(E)：分别为(F/F0)与小檗碱浓度在0.74至7.44 μg/mL和7.442至26.03μg/mL之间的线性关系；

图3：利用HPTS对第一批样品浓度的计算过程图；

图4：利用HPTS对第二批样品浓度的计算过程图；

图5：HPTS对小檗碱的检测机理数据分析图；

其中，图5(A)含和不含小檗碱的HPTS(1μM)的荧光寿命衰减曲线；

图5(B)不同温度对荧光响应F/F0的影响；

图6：HPTS对样品的测定值与液相值的对比图；

图7：HPTS检测中的样品、仪器图；

图8：HPTS检测黄连样品的步骤图；

图9：荧光分光光度计参数配置图。

具体实施方式

实施例1HPTS探针的合成

探针HPTS的制备过程

在三口烧瓶中加入浓硫酸，搅拌下加入芘(芘与浓硫酸的质量比例为3∶25)， 升温使其全部溶解，加热至90℃并保温1小时。对三口烧瓶用水浴降温至40℃ 以下，滴加液态SO₃(芘与液态SO₃的质量比例为1∶4)，3小时滴加完毕。滴加 液态SO₃完毕后，保持温度100℃左右反应5小时，降至室温。把上述三口烧瓶 中物料倒入冰水中(芘与冰水的质量比例为1：5)，形成粘稠物，过滤抽干得滤饼， 得到芘四磺酸。将芘四磺酸溶于水中，搅拌下用片状NaOH中和至中性后；再 加入片状氢氧化钠(芘与片状NaOH的质量比例为1：2.5)，慢慢升温至微沸状态 下保温5小时。降至室温后，先用盐酸中和到pH值为7，再加入NaCl(芘与 NaCl的质量比例为1.2∶1)搅拌溶解，慢慢析出淡黄色固体8-羟基-1，3，6-芘三磺 酸钠盐(HPTS)。

实施例2HPTS检测盐酸小檗碱

配制HPTS母液：首先，准确称取0.0262g HPTS固体粉末置于50mL容量 瓶中，用水定容并摇匀。然后从上述溶液中取2mL加入另一50mL容量瓶中， 用水定容并摇匀，即得到浓度为40μmol/L的HPTS母液。

配制小檗碱标准品溶液：准确称取0.0214g小檗碱标准品，置于25mL容 量瓶中，并用乙醇进行定容。即得到2mmol/L浓度的小檗碱标准品溶液，此时 小檗碱标准品溶液的质量体积浓度为0.0214g/25mL＝0.86mg/mL。

小檗碱标准品溶液对HPTS的荧光滴定实验：取若干个体积为10mL的容 量瓶进行标号，并使用微量移液器在每个容量瓶中都加入100μL的HPTS荧光 探针母液，然后再按标号分别加入0、10、20、30、40、50、75、100、125、150、 200、250、300、350μL的小檗碱标准品溶液，并用蒸馏水进行定容。充分摇匀 混合溶液在室温下静置10min以使其充分反应。然后将它们放入紫外箱中，如 图2A所示，在365nm紫外灯的照射下，随着小檗碱浓度的增加，HPTS的绿色 荧光逐渐减弱，肉眼可清楚地观察到荧光猝灭现象。然后利用荧光分光光度计进行混合溶液荧光强度的准确测定。

仪器参数设置：将仪器扫描模式调整为发射模式，然后将激发波长设置为 400nm，发射起始波长设置为420nm，发射终止波长设置为700nm，同时将激 发狭缝和发射狭缝均设置为5nm，然后开始进行扫描，并做好数据的记录和保 存。以上实验在相同的条件下平行三次。

浓度之间的换算关系：根据C_xV_x＝C_yV_y，此式中C_x为2mmol/L，V_x为每个 容量瓶中所加入的小檗碱标准品溶液的体积(0、10、20、30、40、50、75、100、 125、150、200、250、300、350μL)，V_y为10mL(所用容量瓶的规格)，由以 上稀释定律可以得到每个容量瓶中小檗碱的浓度Cy(μmol/L)。由C_yM/1000即 得到每个容量瓶中小檗碱的质量体积浓度C(μg/mL)。浓度之间的换算关系见 下表1。

表1浓度之间的换算关系

用Origin软件进行线性曲线的绘制：首先，将第一次实验得到的荧光滴定 数据导入Origin，以发射波长为横坐标(X)，荧光强度为纵坐标(Y)进行折 线图的绘制，此图即为不同浓度的小檗碱对HPTS的荧光响应图(图2B)，该 图显示HPTS的荧光强度随着加入小檗碱浓度的增加而降低。将三次平行实验得 到的荧光滴定数据导入Origin，以发射波长为横坐标(X)，荧光强度为纵坐标 (Y)，然后选中荧光滴定数据中发射波长为518nm所对应的那一行荧光强度 值，复制，粘贴到Excel中。

(1)计算标准偏差。将未加入小檗碱的HPTS溶液的三组荧光强度数据输 入Excel，分别计算三组平行实验数据的平均值得到

然后将加入不同浓度小 檗碱后对应的荧光强度数据输入Excel，计算出

分别计算三组平行实验数 据的平均值

【接下来用F/F₀表示

】，待用。在“统计”类 别中选择函数“STDEVA”，然后分别计算三组

数据的标准偏差，待用。

(2)将X轴数据、

的平均值、标准偏差输入origin，然后选中标准偏差 所在列右键单击，选择-设置为Y误差。

以表1中最后一行为横坐标、以相应浓度对应的荧光响应(F/F₀)为纵坐标 做散点图2C，即得到HPTS相对小檗碱浓度的相对强度图。分别取0.74至7.44 μg/mL之间的小檗碱浓度为横坐标，相应的荧光响应(F/F₀)为纵坐标；7.44至 26.03μg/mL之间的小檗碱浓度为横坐标，相应的荧光响应(F/F₀)为纵坐标进 行线性拟合，得到线性曲线。图2D和图2E分别为(F/F₀)与小檗碱浓度在0.74 至7.44μg/mL和7.44至26.03μg/mL之间的线性关系。(F/F₀)与小檗碱浓度在 0.74至7.44μg/mL之间的线性方程为：

F/F₀＝-0.0708C+0.9336 公式(1)

根据LOD＝3σ/K，检出限为0.96mg/mL。(F/F₀)与小檗碱浓度在7.44至 26.03μg/mL之间的线性方程为：

F/F₀＝-0.0153C+0.5167 公式(2)

根据LOD＝3σ/K，检出限为4.43mg/mL。

其中，图2(A)为不同浓度的小檗碱对HPTS荧光响应的照片；(B)不同 浓度的小檗碱对HPTS的荧光滴定光谱；(C)HPTS相对小檗碱浓度的相对强 度图；(D)和(E)分别为(F/F0)与小檗碱浓度在0.74至7.44μg/mL和7.442 至26.03μg/mL之间的线性关系。

实施例3第一批样品的检测

黄连样品在申请人相关药品生产工序采集。

各工序样品溶液配制：首先，取若干个25mL容量瓶，分别标号，然后分 别精确称取0.017g调酸后的黄连样品、0.017g调碱后的黄连样品以及用微量移 液器移取25μL黄连浓缩膏分别加入到对应的容量瓶中，并用乙醇定容，然后将 所有样品溶液超声10min至全溶，置于室温下静置，待用。

黄连样品用量条件的摸索：首先各取1个调酸后的黄连样品母液、调碱后的 黄连样品母液以及加入25μL的黄连浓缩膏样品母液，然后进行对照实验。调酸 后黄连样品用量条件的摸索：取4个10mL容量瓶，分别标号，然后在每个容 量瓶中都加入100μL HPTS探针母液，并分别加入200、400、600、800μL体积 的调酸后的黄连样品母液，并用蒸馏水定容，摇匀，静置10min以使其充分反 应。然后利用荧光分光光度计进行荧光强度的准确测定，测定方法及参数设置均 同小檗碱标准品溶液荧光测定一致。同理，调碱后的黄连样品母液也是照此进行。 加入25μL黄连浓缩膏样品母液设置了3个对照实验，即取3个10mL容量瓶， 分别标号，然后在每个容量瓶中都加入100μL HPTS探针母液，并分别加入50、 100、150μL黄连浓缩膏样品母液，并用蒸馏水定容，摇匀，静置10min后开始 测其荧光强度。之后，又取1组样品进行了对照实验。通过小檗碱标准曲线得出 样品中小檗碱含量，经过和液相分析相比，发现加入600μL调酸后的黄连样品 母液、600μL调碱后的黄连样品母液、100μL黄连浓缩膏样品母液所测得的样品 中小檗碱含量与液相分析的结果最接近，因此在后续实验中我们将按照这个标准 进行取样。

待检测溶液的配制：首先，取出若干个10mL容量瓶，分别进行标号(0、 J-89、J-90、J-91、J-92、J-95、J-96...J-104；S-89、S-90、S-91、S-92、S-95、S-96...S-104； P-89、P-90、P91-92、P97-98、P99-100、P101-102、P103-104)，然后在每个容 量瓶中都加入100μL HPTS探针母液，并分别加入600μL调酸后的黄连样品母 液、600μL调碱后的黄连样品母液以及100μL黄连浓缩膏样品母液的上清液到 相应的容量瓶中，并用蒸馏水定容到10mL，放置10min，以使其充分反应，然 后开始测定其荧光强度。

样品中小檗碱浓度的检测：参数设置和测定方法均与上述小檗碱标准品溶液 荧光测定相同，将所测荧光数据导入到Origin中，并进行绘制折线图。然后选 中518nm发射波长处所对应的那一行荧光强度值，进行复制，并在Origin表格 中进行转置粘贴，然后将此列数据重新选中进行复制并粘贴到Excel表格中，此 列数据即为所测的荧光强度值F。其中加入样品量为0μL的样品所对应的荧光 强度值为F0，然后利用公式求出F/F₀得到新的一列。若F/F₀＞0.417，则可利用公 式(1)求出对应的C₁(单位：μg/mL)，若F/F₀＜0.417，则利用公式(2)求出 对应的C₁(单位：μg/mL)，得到新的一列即为C₁，然后我们根据C₁V₁＝C₂V₂， 此式中V₁为10mL(容量瓶规格)，V2视每个取样的样品而定，若为调酸后的或 调碱后的黄连样品母液则V2为600μL，则输入公式“＝C₁/60”可得到一列与之对 应的C₂(单位为mg/mL)，若为黄连浓缩膏样品母液则V2为100μL，则输入公 式“＝C₁/10”可得到与之对应的C₂(单位为mg/mL)。然后我们通过公式 “＝C₂×25/0.017”将调酸或调碱后的黄连样品母液对应的一系列C₂(mg/mL)转换 为C₃(单位为mg/g)，即为调酸或调碱后的黄连样品中的异喹啉生物碱含量C₃。 同理，通过公式“＝C₂×25/(100×10^-3)”将黄连浓缩膏样品母液对应的一系列C₂转换为C₃(单位为mg/mL)，即为黄连浓缩膏样品中的异喹啉生物碱含量C₃。以上 计算过程，见图3。

与液相分析相比，探针HPTS检测的样品中小檗碱浓度基本一致，仅存在 0-50mg/g左右的差异，表明本发明快速检测方法快速、准确。

实施例4第二批样品的检测

HPTS对第三批样品的检测及计算过程见图4，检测步骤与对第二批样品的 检测类似。结果表明本发明快速检测方法快速、准确。

实施例5HPTS对小檗碱的检测机理分析

HPTS具有良好的水溶性，并带有很强的负电荷。小檗碱是一种带正电荷的 分子，可能促进HPTS和小檗碱之间的静电相互作用。为了研究HPTS在小檗碱 存在下显著荧光猝灭的机理，我们进行了以下测量。首先，研究了在无小檗碱和 有小檗碱情况下HPTS的荧光寿命。从图5A中可以发现，添加小檗碱后，HPTS 的荧光寿命几乎没有影响，这表明小檗碱对HPTS很可能发生了静态猝灭。另外， 在小檗碱存在下，从HPTS的温度依赖性荧光光谱(图5B)可以看出，在低温 下，荧光猝灭的效果更好。这些结果表明HPTS荧光猝灭不是由动态猝灭引起的， 而是由HPTS和小檗碱之间的复合物形成的。这些结果表明，HPTS可以通过静 电相互作用和π-π堆积等非共价协同作用选择性结合小檗碱，从而导致荧光猝灭。

其中，图5(A)含和不含小檗碱的HPTS(1μM)的荧光寿命衰减曲线； 图5(B)不同温度对荧光响应F/F0的影响。

实施例6HPTS对样品的测定值与液相值的对比

样品调碱、调酸的方法参照实施例3。

表2本法对调碱样品的测定值与液相值的对比

表3本法对调酸样品的测定值与液相值的对比

表4本法对黄连浓缩膏的测定值与液相值的对比

相关的数据拟合曲线请见图6。可以看出，本法测定值与液相测定值基本一 致，呈现良好的拟合关系，满足大生产检测要求。

实施例7HPTS对小檗碱荧光检测试剂盒的实验操作方法

准备25mL和10mL的试剂瓶或容量瓶若干；100μL和200μL的微量移液 器各一个，移液器吸头若干；胶头滴管；小烧杯；ZF-20D暗箱式紫外分析仪； 港东科技的F-380荧光分光光度计。HPTS探针母液、小檗碱标准品溶液和黄连 样品母液的配置详见实施例1。

ZF-20D暗箱式紫外分析仪的使用。先打开“电源”开关，再打开“365nm”开 关，肉眼观察暗箱中样品的荧光。观察完毕后，先关闭“365nm”开关，再关闭“电 源”开关。

F-380荧光分光光度计的使用。

1、开机：启动计算机，开启仪器主机电源。2、双击桌面图标(ZWin荧光 分光光度计软件)。主机自行初始化，扫描界面自动进入。初始化结束后，须预 热15-20分钟。3、参数设置：点击扫描界面右侧“测量方法”，然后点击“仪器” 进行主要参数设置；扫描模式：发射。数据模式：荧光强度。激发波长：400nm。 发射起始波长：420nm。发射终止波长：700nm。激发狭缝：5nm。发射狭缝： 5nm。4、扫描测试：(1)将制备的样品加入样品池中，样品体积在1/2-2/3之间， 然后打开光度计上方的盖子将样品池放入其中，最后盖上光度计的盖子。(2)点击扫描界面右侧“扫描”，窗口出现扫描谱图。5、按住Ctrl+S，对文件进行保存。

研究发现，由于HPTS和小檗碱之间的静电相互作用和π-π堆积形成了复合 物导致HPTS的荧光猝灭，HPTS对小檗碱的检测方法成本较低、灵敏度高、易 于观察且响应速度快，检出限可达4.43mg/mL。荧光探针法完全适用于黄连提 取工艺中小檗碱含量的快速、实时监测。

Claims (7)

1.一种异喹啉类生物碱的检测方法，其特征在于采用HPTS作为有机荧光探针。

2.权利要求1所述的检测方法，其中HPTS探针采用如下方法合成：

在浓硫酸中加入芘(芘与浓硫酸的质量比例为3∶25)，升温溶解，加热至90℃并恒温；再用水浴降温至40℃以下，滴加液态SO₃(芘与液态SO₃的质量比例为1∶4)，100℃左右反应5小时，降至室温；再将反应物倒入冰水中(芘与冰水的质量比例为1∶5)，过滤抽干得滤饼；将滤饼溶于水，碱中和至中性；再加入氢氧化钠，升温至微沸状态下保温5小时；降至室温后，盐酸中和至中性，再加入NaCl，搅拌溶解，析出固体，即得HPTS。

3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于：

配制HPTS母液；

配制异喹啉类生物碱溶液；

取HPTS荧光探针母液，加入异喹啉类生物碱标准品溶液，蒸馏水定容，摇匀、静置；利用荧光分光光度计进行混合溶液荧光强度测定。

4.权利要求2所述的检测方法，其采用的荧光分光光度计参数为：激发波长为400nm，发射起始波长为420nm，发射终止波长为700nm，激发狭缝5nm，和发射狭缝5nm。

5.权利要求1-4所述的检测方法，其特征在于异喹啉类生物碱选自小檗碱。

6.权利要求1-4所述的检测方法，在黄连提取物生产中的应用。

7.一种异喹啉类生物碱检测试剂盒，其特征在于采用权利要求1-4任一项所述的方法。

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