CN1135470A - 固氮芽孢菌肥及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型微生物肥料——固氮芽孢菌肥及其制造方法。本发明的菌肥含有能产芽孢的固氮菌。由于所述微生物固氮酶活性高、耐干燥、抗逆性强，因此本发明的菌肥不仅肥效好，而且耐贮存并便于运输，有利于菌肥推广应用。

Description

固氮芽孢菌肥及其制造方法

本发明涉及一种新型微生物肥料及其制造方法。更具体地说，本发明涉及一种含有固氮芽孢菌的新型微生物菌肥和该菌肥的制造方法。

我国微生物肥料中所用固氮菌种(包括根瘤菌及自生固氮菌等)皆为不能产生芽孢的细菌类，虽有固氮能力但抗逆性低，不耐高温干燥，因而只能制成液体菌剂或吸附在草炭中制成含水菌剂使用。此类菌剂极易污染杂菌变质或失水干燥而失效，不能长期(半年以上)贮存，又不便于运输，影响到微生物肥料的商品化和推广应用。

本发明的目的是筛选出能产芽孢的固氮菌种，在此基础上制造出一种能长期贮存，便于运输，且肥效良好的微生物肥料，即固氮芽孢菌肥。

本发明发明人经过长期研究，从我国农田土壤中分离到一株能产芽孢的固氮芽孢菌，经发酵培养、肥料基质吸附及后处理等步骤，获得了一种固氮芽孢菌肥，从而达到了本发明的目的。

从国内8省、市采集土壤样品，制成土壤悬液后先经80℃加热10分钟处理以消除无芽孢菌类，然后将稀释的土壤悬液接种到无氮培养基中，30℃保温培养2天后挑选孤立菌落纯化培养。将纯化后的菌种编号移种到试管斜面保存，用气相色谱议检测所有菌株的固氮酶活性，挑选产生芽孢而固氮酶活性高的菌株留作进一步检测。经反复检测比较，结果在江西红壤中分离筛选到一株固氮酶活性高而稳定的芽孢杆菌，该菌株具有如下特征：

1、菌落形态特征：在无氮培养基上保温30℃好气培养2天后形成直径2—5毫米无色半透明、园形凸起菌落，边缘整齐或微波状，微粘稠。继续培养2—3天后，菌落中心渐变厚而浑浊，但边缘仍透明，2周后对光源可见到菌落有3—5个同心圈。

2、菌体形态特征：菌体杆状，单个菌体直径1微米，长3—6微米；有小荚膜，微弱运动，革兰氏染色阳性或可变。培养5天后因形成孢子囊使菌体膨大为纺锤形或梭形，成熟的芽孢卵园形或椭园形，中生或次端生。

3、主要生理、生化特性：除乳糖外，可利用多种糖类产酸产气，不水解明胶和酪素：在肉汤培养基上生长微弱，而在无氮培养基上生长良好，可利用空气中N₂为氮源。石蕊牛奶反应为酸凝，可耐1—2％Nacl生长。最适培养温度为32℃，低于10℃或高于42℃不生长；最适pH为7.7。好气或兼性厌氧。

4、固氮酶活性：在有氧或无氧条件皆能表达固氮酶活性，但在无氧环境中固氮酶活性更高，而在含氧量超过5％时则固氮活性降低，在空气中固氮活性比无氧条件下降低60％。经多次精细检测，CN9506菌株固氮酶活性为509.7±85.8毫微克分子乙烯/管/小时，固氮效率为1100—3200毫微克分子乙烯/毫克蛋白/小时。

根据该菌株以上各特性，按照《伯吉氏细菌分类手册》及《一般细菌常用鉴定方法》(科学出版社，1986)分类鉴定，该菌株为固氮芽孢杆菌(Bacillus azotofixans)。因此，将其命名为固氮芽孢杆菌CN9506。固氮芽孢杆菌CN9506已于1995年8月4日在中国专利局指定的保藏单位——中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M95040。此后将这一菌株称作固氮芽孢杆菌CCTCC M95040，为便于叙述，本文将这一菌株简称为“固氮菌”。

本发明的固氮芽孢菌肥含有固氮芽孢杆菌CCTCC M95040菌剂(此后简称“固氮菌菌剂”)和肥料基质，还可以含有磷细菌菌剂、钾细菌菌剂。其组成比例为：

固氮菌菌剂    5—30％(重量)

磷细菌菌剂    0—15％(重量)

钾细菌菌剂    0—15％(重量)

肥料基质      70—95％(重量)优选的组成比例为：

固氮菌菌剂    5—15％(重量)

磷细菌菌剂    5—10％(重量)

钾细菌菌剂    5—10％(重量)

肥料基质      75—85％(重量)

除上述组分外，本发明的菌肥还可以包括其它对作物生长有益的成分如杀虫剂、除草剂、植物生长调节剂、肥料增效剂、土壤改良剂等。

最典型的固氮芽孢菌肥由固氮菌菌剂、磷细菌菌剂、钾细菌菌剂和肥料基质组成，其组成比例为如上所述的优选的含量范围。

所述的固氮菌菌剂是指固氮芽孢杆菌CCTCCM95040经发酵培养后获得的发酵液，也包括其浓缩发酵液。

所述的磷细菌菌剂是指巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)ACCC 10010经发酵培养后获得的发酵液，也包括其浓缩发酵液。巨大芽孢杆菌ACCC 10010能分解有机磷，因此俗称为磷细菌。

所述钾细菌菌剂是指胶冻样芽孢杆菌(Bacillus muci lagino-sus)ACCC 10013经发酵培养后获得的发酵液，也包括其浓缩发酵液。胶冻样芽孢杆菌ACCC 10013具有解钾功能，因此俗称为钾细菌。

所述磷细菌、钾细菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心保藏，ACCC 10010和ACCC 10013分别为所述磷细菌和钾细菌在该保藏中心的保藏号，公众可按保藏号向该保藏中心购买磷细菌和钾细菌。

所述的肥料基质是指由选自城市污水站污泥、禽畜类(鸡粪、猪类、牛粪等)、草碳土、塘泥、有机质废渣及无机化肥中的两种或多种组份复混而成的基质，其中的无机化肥包括农用常用的各种化学肥料，优选的是硫酸铵、尿素或复合肥。

优选的肥料基质组成与含量如下：

城市污水站污泥    60—75％

禽畜粪            20—30％

无机化肥          5—10％

固氮芽孢菌肥的制造方法包括制备菌剂，制备肥料基质和后处理三个步骤。

1、制备菌剂

制备菌剂包括发酵培养固氮菌(CCTCC M95040)、磷细菌和钾细菌液。

固氮菌的发酵培养可以使用公知的培养条件和方法。一般培养时间是20—24小时，培养温度是25—30℃，培养pH是7.0—7.4，通气量是0.5—1∶1立方米/吨，搅拌速度200—300转/分。本菌种优选的培养时间是30小时，培养温度32℃，培养pH7.7，通气量0.5∶1立方米/吨，罐压0.5kg/cm²。搅拌速度200转/分。培养固氮菌优选的培养基如下：

筛选及保存固氮芽孢杆菌CCTCC M95040的无氮培养基为：

蔗糖                    1.0％

酵母膏                  0.01％

硫酸镁(M9SO₄·7H₂O)  0.05％

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)   0.02％

磷酸氢二钾(K₂HPO₄)   0.008％

氯化钠(NaCl)            0.001％

碳酸钙(CaCO₃)         0.50％

钼酸钠(Na₂MoO₄)      0.0005％

硫酸亚铁(FeSO₄)       0.00015％

琼脂                    2.0％

pH＝7.7

用于CCTCC M95040摇瓶培养和发酵生产的培养基是在上述无氮培养基的基础上另加如下成份：

玉米粉    1％    硫酸铵    0.1％

蛋白胨    0.1％

磷细菌的培养及发酵按已出版的《磷细菌》(陈廷伟等编，农业出版社，1959年，北京)一书中的方法进行。

钾细菌的培养及发酵按已出版的《钾细菌》(陈廷伟编，农业出版社，1959，北京)一书中的方法进行。

按以上所述方法培养发酵后所得的发酵液即为固氮菌菌剂，磷细菌菌剂，钾细菌菌剂。

2、制备肥料基质

肥料基质各组分需要先经风干后粉碎过筛(80—100目)，再经200℃热风滚筒烘干杀灭病菌和虫卵，然后加入5—10％无机化肥充分混合即制成肥料基质。

3、后处理：

将菌剂和肥料基质均匀混合即制得粉状固氮芽孢菌肥，也可以按以下方法制得颗粒状固氮芽孢菌肥：将肥料基质送入成球盘内，当肥料基质在成球盘内滚动时，喷洒菌剂滚动成球后过筛，选取3—5mm直径园形颗粒输送到低温(80℃)热风滚筒干燥3分钟即成为颗粒菌肥。

按上述方法制成的固氮芽孢菌肥为粉状或园球形颗粒，仅含有固氮菌的菌肥中固氮菌含量为1—5亿个/克。在加有磷细菌和钾细菌的复合菌肥中，固氮菌、钾细菌和钾细菌各含有1/3，总菌数为1—5亿个/克。

本发明制得的固氮芽孢菌肥具有有效菌含量高、耐高温(80℃)干燥，可长期贮存，便于长途运输等优点。而且本发明的菌肥制造成本低、原料来源广泛。田间试验表明，该菌肥可使小麦、水稻、玉米及蔬菜作物明显增产，并可节省化肥用量和成本。1994年农业部全国农业技术推广总站在国内21省(市、区)的23个县(市)布点，对本发明的固氮芽孢菌肥的肥效进行多种作物田间小区试验，在粮食作物及蔬菜田按每亩用量为50公斤代替化肥作基肥。试验结果证明，有增产效果的占85.7％，增产幅度为10—30％(参见全国农业技术推广总站[1995](农技3)字第05号文)。

下面结合实施例说明本发明：

实施例1

1、固氮菌剂的制备

将固氮芽孢杆菌CCTCC M95040接种到盛有1000ml的如前所述的用于本发明固氮菌摇瓶培养的培养基的三角瓶中摇瓶培养16小时，然后按1％接种容量接种到200升种子发酵罐(培养基与三角瓶中的培养基相同)中，通气(1∶0.5)，于30℃培养16小时，再按10％接种量接种到200升大发酵罐中，于30℃发酵培养20小时后升温至35℃再培养10小时，待80％菌体形成芽孢后即可出罐成为有芽孢的固氮菌发酵液，此即固氮菌菌剂。

2、肥料基质的制备：

将城市污水站污泥60kg和鸡粪30kg粉碎(过80—100目筛)，经200℃热风滚筒烘干杀灭病菌和虫卵，然后和10kg硫酸铵混合。

3、后处理：

取10kg如上步骤1制得的固氮菌菌剂和90kg如上步骤2中制备的肥料基质混合，在成球盘中滚动制成直径3—5mm的球形颗粒。经80℃热风干燥即制成颗粒状固氮芽孢菌肥。

其有效菌含量为1亿个/克，干燥条件下贮存二年以上，活性保持80％以上。

实施例2

1、固氮菌复合菌剂的制备

按实施例1中所述的方法发酵培养固氮芽孢杆菌CCTCC M95040制成固氮菌菌剂。在另外发酵罐中分别发酵培养磷细菌和钾细菌，其培养条件如下：

磷细菌发酵培养基为淀粉3％，豆饼粉1％，玉米浆0.1％，KH₂PO₄ 1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，CaCO₃ 0.5％，pH＝7.2-7.4。磷细菌的摇瓶培养及从种子罐到发酵罐培养发酵条件和方法与固氮芽孢菌相同。

钾细菌发酵培养基为淀粉0.5％，蔗糖0.1％，K₂HPO₄ 0.2％，(NH₄)₂SO₄ 0.1％，MgSO₄ 0.05％，FeCl₃ 0.001％，CaCO₃ 0.01％，酵母膏0.02％，pH＝7.2-7.4，其余发酵条件和方法与固氮芽孢菌及磷细菌相同。

将以上三种菌分别发酵制成的菌剂等量混合即成为固氮菌、磷细菌和钾细菌复合菌剂。

2、肥料基质的制备

如实施例1中所述肥料基质制备方法制备肥料基质，所不同的原料及用量为：城市污水站污泥75kg。

猪牛粪   20kg

尿素     5kg

3、后处理：

将85kg肥料基质送入成球盘中，再喷洒上述复合菌剂，经滚动成球再经热风干燥即制成直径3—5毫米的球形颗粒。此颗粒菌肥中含固氮菌、磷细菌、钾细菌总共为1.5亿个/克，可干燥贮存二年，活性保持80％以上。

实施例3

按实施例2的方法制备复合菌剂和肥料基质，将75kg肥料基质送入成球盘中，再喷洒25kg复合菌剂，然后用与实施例2相同的处理方法制成颗粒菌肥。该菌肥有效菌总量为2.5亿个/克，干燥贮存二年，活性保存80％以上。

Claims (5)

1、一种固氮芽孢菌肥，其特征在于它含有：

5—30％(重量)     固氮菌菌剂

70—95％(重量)    肥料基质

其中所说的固氮菌菌剂是指固氮芽孢杆菌CCTCC M95040经发酵培养后获得的发酵液，肥料基质是指由选自城市污水站污泥、禽畜粪、草碳土、塘泥、有机废渣和无机化肥中的二种或多种组份复混而成的基质，其中无机化肥是农田常用的各种化学肥料。

2、根据权利要求1所述的固氮芽孢菌肥，其特征在于它还含有：

0—15％(重量)    磷细菌菌剂

0—15％(重量)    钾细菌菌剂

其中所说的磷细菌菌剂是指巨大芽孢杆菌ACCC 10010经发酵培养后获得的发酵液，钾细菌菌剂是指胶冻样芽孢杆菌ACCC10013经发酵培养后获得的发酵液。

3、根据权利要求2所述的固氮芽孢菌肥，其特征在于它含有：

5—15％(重量)    固氮菌菌剂

5—10％(重量)    磷细菌菌剂

5—10％(重量)    钾细菌菌剂

75—85％(重量)   肥料基质

4、根据权利要求1—3所述的固氮芽孢菌肥，其特征在于其中所说的肥料基质是指由：

60—75％    城市污水站污泥

20—30％    禽畜类

5—10％    无机化肥

复配而成的基质，其中的无机化肥是指硫酸铵、尿素或复合肥。

5、一种如权利要求1—4所述制作固氮芽孢菌肥的方法，其特征在于它包括以下步骤：

1)制备菌剂

a、发酵培养固氮芽孢杆菌CCTCC M95040制成固氮菌菌剂；

b、发酵培养巨大芽孢杆菌ACCC 10010制成磷细菌菌剂；

c、发酵培养胶冻样芽孢杆菌ACCC 10013制成钾细菌菌剂。

2)制备肥料基质

将基质原料粉碎、灭菌，然后按所需比例复混制成肥料基质；

3、后处理将步骤1)a和步骤2)制得的物质按所需比例均匀混合或者将步骤1)和步骤2)制得的所有物质按所需比例均匀混合，或者将所述物质在成球盘上造粒。