CN113546178A - 治疗眼部疾病或病症的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供治疗眼部疾病或病症的方法。所述方法涉及将包含生物活性多肽和生物相容性聚合物的缀合物直接施用到眼中。

Description

治疗眼部疾病或病症的方法
本申请是中国专利申请201680078324.4的分案申请。
交叉引用
本申请要求2015年12月9日提交的美国临时专利申请号 62/265,293的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
简介
当前用于患有糖尿病视网膜病变患者的抗血管生成多肽药物具 有在眼睛玻璃体中停留时间短的问题。为了维持药物抑制视网膜新血 管形成的生物有效剂量，需要患者定期每月接受药物注射，这经常导 致患者依从性低和疾病进展慢。
发明内容
本公开提供治疗眼部疾病或病症的方法。所述方法涉及将包含生 物活性多肽和生物相容性聚合物的缀合物直接施用到眼中。
本公开提供一种治疗个体的眼部疾病或病症的方法，所述方法包 括向所述个体施用有效量的缀合物，所述缀合物包含：a)具有约5kDa 至约2000kDa的分子量的生物活性多肽；以及b)具有至少约50,000 道尔顿的分子量的生物相容性聚合物，其中所述多肽直接或通过接头 共价连接至所述聚合物，并且其中所述生物活性多肽与所述聚合物的 摩尔比是至少约10:1，其中所述施用是通过玻璃体内施用进行。在一 些情况下，所述生物活性多肽是：i)受体；ii)受体的配体；iii)抗体； 或iv)酶。在一些情况下，所述聚合物是包含多个选自以下的亚基的 线性聚合物：透明质酸、丙烯酸、乙二醇、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、 甲基丙烯酸羟乙酯、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、***糖、牛磺酸、 甜菜碱、改性纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羟 乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、改性淀粉、疏 水改性淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、直链淀粉、支链淀粉、氧化 淀粉、heprosan、肝素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸肝素及其共聚物。 在一些情况下，所述聚合物是线性聚(丙烯酸)。在一些情况下，是透 明质酸。在一些情况下，所述生物活性多肽与所述聚合物的摩尔比是 约10:1至约25:1。在一些情况下，所述生物活性多肽与所述聚合物 的摩尔比是约25:1至约50:1。在一些情况下，所述生物活性多肽是 血管生成抑制剂。在一些情况下，所述生物活性多肽是可溶性血管内 皮生长因子(VEGF)受体、血管抑素、内皮抑素、血管形成抑制素或 VEGF特异性抗体。在一些情况下，所述生物活性多肽是可溶性血管 内皮生长因子(VEGF)受体，并且其中所述聚合物是透明质酸。在一 些情况下，所述透明质酸具有约600kDa至约700kDa的分子量。在 一些情况下，所述VEGF受体与所述透明质酸的摩尔比是约20:1。在 一些情况下，所述缀合物的玻璃体半衰期是至少7天。在一些情况下， 所述个体是人。在一些情况下，所述眼部病症是黄斑变性、脉络膜新 血管形成、黄斑水肿、视网膜新血管形成、增生性玻璃体视网膜病变、 青光眼或眼部炎症。在一些情况下，所述缀合物每两个月施用一次、 每三个月施用一次、每6个月施用一次或每年施用一次。在一些情况 下，所述缀合物的玻璃体半衰期比未缀合到所述生物相容性聚合物的 所述生物活性多肽的半衰期大至少5倍。
附图说明
图1是缀合物mvsFlt合成的示意性描绘。
图2A-2C描绘通过sFlt和mvsFlt进行的对角膜血管生成的抑制。
图3A-3B描绘mvsFlt在大鼠玻璃体中的停留时间。
图4A-4C描绘通过mvsFlt进行的对视网膜血管生成的抑制。
图5A-5B提供所提出的mvsFlt作用机制的示意性描绘。
图6描绘较高分子量葡聚糖的体内停留时间。
图7A-7D描绘多价sFlt合成和示意图。
图8A-8D描绘mvsFlt缀合效率和大小的表征。
图9A-9B描绘在VEGF165 ELISA和VEGF165依赖性HUVEC存 活测定中mvsFlt生物缀合物对于VEGF165依赖性活性的影响。
图10A-10E描绘mvsFlt对于HUVEC管形成的影响。
图11A-11B描绘mvsFlt对于VEGF165驱动的HUVEC迁移的影 响。
图12A-12C描绘sFlt与HyA缀合对于mvsFlt在HyA凝胶中的 移动和扩散的影响。
图13A-13B描绘显示与HyA缀合降低蛋白酶被MMP-7降解的 易发性的数据。
图14A-14B描绘HyA水凝胶的表征。
图15A-15E描绘来自凝胶释放数据的数据与Fickian扩散的拟 合。
图16A-16C描绘生物活性多肽的氨基酸序列。
图17描绘示例性生物活性多肽sFlt的氨基酸序列。
图18描绘scFv抗VEGF抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图19描绘VHH抗VEGF抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
图20A-20C描绘未缀合和缀合的抗VEGF抗体与VEGF-A165的 结合。
图21描绘与未缀合的VHH抗VEGF抗体相比，缀合的多价VHH 抗VEGF抗体的半衰期。
图22A-22B描绘在注射到大鼠眼睛中后，缀合的多价VHH抗 VEGF抗体和未缀合的VHH抗VEGF抗体的体内停留时间和回收的 蛋白质百分比。
图23A-23B使用ELISA测定将缀合的多价VHH抗VEGF抗体 与具有羧甲基纤维素(CMC)的缀合的多价VHH抗VEGF抗体的结合 到VEGF-A165的能力进行比较。
定义
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指任何 长度的氨基酸的聚合形式，其可包括编码和非编码氨基酸、化学或生 物化学修饰的或衍生的氨基酸以及具有修饰的肽骨架的多肽。术语 “多肽”包括融合蛋白，其包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋 白、具有异源和同源前导序列的融合体，具有或不具有N末端甲硫 氨酸残基；免疫标记蛋白；以及类似的蛋白质。术语“多肽”包括包含 脂肪酸部分、脂质部分、糖部分和碳水化合物部分中的一个或多个的 多肽。术语“多肽”包括翻译后修饰的多肽。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋 白、保留与抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、 单链Fv(scFv)和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、单结 构域抗体(VHH和VANR)以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区 或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗 体；线性抗体(Zapata等人，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单 链抗体分子；单结构域抗体(例如，骆驼抗体或“VHH”片段(参见，例 如Harmsen和De Haard(2007)Appl.Microbiol.Biotechnol.77:13)； VNAR；以及纳米抗体；参见，例如Wesolowski等人 (2009)Med.Microbiol.Immunol.198:157)；以及由抗体片段形成的多特 异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和残余“Fc”片段，其命名 反映易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且 仍能够交联抗原的F(ab')2片段。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这 些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步 在VH结构域与VL结构域之间包含使得sFv能够形成抗原结合所需结 构的多肽接头。关于sFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编, Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂的可逆结合的平衡常数 并且以解离常数(Kd)表示。与抗体对于不相关的氨基酸序列的亲和力 相比，亲和力可至少大1倍、至少大2倍、至少大3倍、至少大4倍、 至少大5倍、至少大6倍、至少大7倍、至少大8倍、至少大9倍、至少大10倍、至少大20倍、至少大30倍、至少大40倍、至少大 50倍、至少大60倍、至少大70倍、至少大80倍、至少大90倍、 至少大100倍或至少大1000倍或更大。抗体对靶蛋白的亲和力可以 是例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM) 或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更多。如本文所用，术语“亲合力” 是指在稀释后，两种或更多种试剂的复合物对于解离的抗性。术语“免 疫反应性”和“优先结合”在本文中关于抗体和/或抗原结合片段可互换 使用。
术语“结合”是指由于例如共价、静电、疏水性和离子和/或氢键相 互作用(包括诸如盐桥和水桥的相互作用)而引起的两个分子之间的直 接缔合。非特异性结合是指以小于约10-7M的亲和力进行的结合，例 如以10-6M、10-5M、10-4M等的亲和力进行的结合。
如本文所用，术语“共聚物”描述含有多于一种类型的亚基的聚合 物。所述术语涵盖包含两种、三种、四种、五种或六种类型的亚基的 聚合物。
术语“受试者”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文中可互换地用于 任何哺乳动物或非哺乳动物物种的一个或多个成员。因此，受试者和 患者包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、有蹄 类动物(例如马、牛、猪类(例如猪))、禽类、啮齿动物(例如大鼠，小 鼠)和其他受试者。非人动物模型，特别是哺乳动物，例如非人灵长 类动物、鼠科动物(例如小鼠、大鼠)、兔形目动物等可用于实验研究。
病状或疾病的“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”包括：(1)预防 病状的至少一种症状，即，使临床症状在可能暴露于或易患疾病但尚 未经历或表现出疾病症状的哺乳动物中不显著发展，(2)抑制疾病，即， 阻止或减少疾病或其症状的发展，或(3)减轻疾病，即，致使疾病或其 临床症状消退。
“治疗有效量(therapeutically effective amount)”或“有效量 (efficaciousamount)”意指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾 病时，与另一种试剂组合或以一个或多个剂量单独施用足以影响对疾 病的这种治疗的缀合物的量。“治疗有效量”可根据缀合物以及根据一 种或多种其他因素，诸如疾病及其严重程度、待治疗受试者的年龄、 体重等而变化。
如本文所用，术语“单位剂型”是指适合作为人和动物受试者的单 位剂量的物理离散单位，每个单位含有与药学上可接受的稀释剂、载 体或媒介物缔合的预定量的缀合物，其计算量足以产生所需效果。
“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上 可接受的载体”以及“药学上可接受的佐剂”意指可用于制备药物组合 物的通常安全、无毒以及既不是生物学上又不是其他方面上不合需要 的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂，并且包括兽医学使用以及人药学使 用可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。如在说明书和权利要求书 中所用，“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂”包括一种和 多于一种此类赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。
在进一步描述本发明之前，应理解本发明不限于所述的具体实施 方案，因而，当然也可有所变化。还应理解，本文所用的术语仅出于 描述具体实施方案的目的，并且不意图具有限制性，因为本发明的范 围将仅受所附权利要求限制。
在提供值的范围的情况下，应理解此范围的上限与下限之间的各 介入值，准确到下限的单位的十分之一(除非上下文另外清楚地指出)， 以及此所述范围内的任何其他所述值或介入值涵盖在本发明内。这些 较小范围的上限和下限可独立地包括在较小的范围内，并且也涵盖在 本发明内，从属于所述范围内的任何特定排除的限值。在所述范围包 括所述限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括的限值中的任 一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本 发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文 所述的那些相似或等同的任何方法和材料也可用于实践或测试本发 明中，但是现在描述优选的方法和材料。为了公开和描述公布在引用 时所涉及的方法和/或材料，本文中提到的所有公布均以引用的方式 并入本文。
必须指出，如在本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)/ 一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指 出。因此，例如，对“一种多肽-聚合物缀合物”的提及包括复数个此 类缀合物并且对“所述眼部病症”的提及包括对一种或多种眼部病症 及其本领域技术人员已知的等同物等的提及。还指出，权利要求书可 经拟订以排除任何任选的要素。因此，此表述意图作为在列举权利要 求要素时使用诸如“单独地”、“仅仅”等的独占性术语或使用“否定”限 制的先行基础。
应理解，出于清晰目的而在单独的实施方案的上下文中所描述的 本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反，出于简洁 目的而在单个实施方案的上下文中所描述的本发明的各种特征也可 单独地或以任何适合的子组合来提供。属于本发明的实施方案的所有 组合确切地涵盖在本发明中并且在本文中公开如同每个和每一种组 合均单独地和明确地公开一样。另外，各种实施方案及其元素的所有 子组合也确切地涵盖在本发明中并且在本文中公开如同每个和每一 种这样的子组合均单独地和明确地在本文中公开一样。
本文中讨论的公布仅仅提供它们在本申请的提交日期之前的公 开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认由于先前发明而使本发 明无权先于这些公布。此外，所提供的公布日期可不同于可能需要独 立确认的实际公布日期。
具体实施方式
本公开提供一种治疗个体的眼部疾病或病症的方法。所述方法大 体上涉及向有需要的个体施用有效量的包含生物活性多肽和生物相 容性聚合物的缀合物，其中所述施用直接施用到眼中，例如施用是玻 璃体内施用。
玻璃体内注射途径是将药物产品递送到位于后房中的眼内结构 的最有效方法。因此，它是递送在视网膜上起作用的药物的优选方法。 然而，由于干扰眼睛的完整性，每个玻璃体内注射均具有导致视网膜 脱离的风险。向后房增加体积导致眼内压升高，并且存在与眼睛不适 应缓解增加的压力相关联的风险。还存在将感染引入到眼睛中的风 险。这些并发症均具有视力受损的风险，这必须与使用玻璃体内途径 施用药物的可能益处进行权衡。
因此，强烈需要改善被设计来经由玻璃体内途径常规注射到玻璃 体中的药物的停留时间。可替代地，在一些情况下，为了增加其在后 房内的停留时间，化学修饰现有药物可能是实用的。此策略有可能减 少药物的施用频率，并且因此降低由于随时间施用药物而引起并发症 的总体风险。增加生物活性的持续时间也可产生增强的药物治疗结 果。
相对于必须更频繁地施用以达到等同的治疗功能的药物产品，表 现出更大的玻璃体内停留时间的药物对于患者而言可能是优选的。虽 然玻璃体内注射是在局部麻醉下执行的，并且通常不被认为是痛苦 的，但是对患者造成负担。它必须由临床医生执行，并且因此每次施 用药物均需要诊所就诊。由于撕裂增加，通常存在短期刺激和视力模 糊。注射部位附近的眼睛外观也可能存在短暂的撕裂变化。因此，患 者可能表现出对于需要较少的玻璃体内注射的等同治疗的偏好。
从医生的角度来看，对较不频繁的注射的需求也是优选的。玻璃 体内注射必须由眼科医生执行，并且因此此手术可占据其临床时间的 大部分。在实践中接受玻璃体内治疗的患者数量可能受限于每位患者 必须接受玻璃体内注射的频率。较不频繁的注射将增加能够接受治疗 方法的患者数量。更长效的药物对于贮库或长期药物递送装置也是优 选的，因为这些通常需要更长的植入手术并且进入手术室，这对于临 床医生而言可能抵消较不频繁施用的益处。
包含生物活性多肽和生物相容性聚合物的缀合物在玻璃体中表 现出比未缀合到生物相容性聚合物的生物活性多肽在玻璃体中的半 衰期更大的半衰期。缀合物在玻璃体中增加的半衰期赋予某些优点， 包括例如减轻患者负担；减少施用次数和/或频率；增加安全性；降 低感染发生率；增加患者依从性；以及增加疗效。另外，如本文所述 的缀合物允许使用多肽来治疗眼部病症，所述多肽将不以未缀合形式 在眼内保留适合治疗的时间段。
在一些情况下，缀合物的有效量是有效抑制个体眼内的病理性血 管生成的量。例如，在一些情况下，缀合物的有效量是与不用缀合物 治疗的情况下或用缀合物治疗之前眼内的病理性血管生成程度相比， 当以一个或多个剂量施用时，有效使个体眼内的病理性血管生成抑制 至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、 至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％或多于80％的量。
在一些情况下，缀合物的有效量是有效降低个体眼内的眼内压的 量。例如，在一些情况下，缀合物的有效量是与不用缀合物治疗的情 况下或用缀合物治疗之前眼内的眼内压相比，当以一个或多个剂量施 用时，有效使眼内压降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、 至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％ 或多于80％的量。
在一些情况下，缀合物的有效量是有效降低个体眼内的黄斑水肿 的量。例如，在一些情况下，缀合物的有效量是与不用缀合物治疗的 情况下或用缀合物治疗之前眼内的黄斑水肿的水平相比，当以一个或 多个剂量施用时，有效使黄斑水肿降低至少10％、至少15％、至少 20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至 少70％、或至少80％或多于80％的量。
在一些情况下，缀合物的有效量是有效增加个体眼内的视敏度的 量。例如，在一些情况下，缀合物的有效量是与不用缀合物治疗的情 况下或用缀合物治疗之前眼内的视敏度相比，当以一个或多个剂量施 用时，有效使个体眼内的视敏度增加至少至少10％、至少15％、至少 20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至 少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、 或至少10倍或多于10倍的量。
在一些情况下，缀合物的有效量是有效抑制个体眼部疾病进展的 量。例如，在一些情况下，缀合物的有效量是与不用缀合物治疗的情 况下或用缀合物治疗之前的进展相比，当以一个或多个剂量施用时， 有效使个体眼部疾病进展抑制至少10％、至少15％、至少20％、至 少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或 更多的量。
例如，在一些情况下，缀合物的有效量是当以一个或多个剂量施 用时，有效抑制非渗出性ARMD进展为渗出性ARMD或抑制非渗出 性ARMD进展为更严重形式的量。在一些实施方案中，缀合物的有 效量是有效抑制早期ARMD(AREDS 2)进展为中期ARMD(AREDS 3) 或进展为晚期ARMD(AREDS 4)的量。在一些实施方案中，缀合物的 有效量是有效抑制中期ARMD(AREDS 3)进展为晚期ARMD (AREDS 4)的量。
在一些情况下，缀合物的有效量是有效增强视网膜细胞的生物活 性的量，例如，其中视网膜细胞是光感受器、视网膜神经节细胞、缪 勒氏细胞(Muller cell)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色 素上皮细胞。
缀合物
在一些实施方案中，适用于本公开的方法的多肽-聚合物缀合物 (为了简单起见，在本文也称为“缀合物”)具有下式：
X-(Y)n-Z，
其中X是生物活性多肽；
Y是任选的接头部分，使得n是0或1至约10的整数；并且
Z是包含约50个亚基至100,000个亚基和/或具有10kDa至500 kDa的分子量的生物相容性聚合物。
包含生物活性多肽和生物相容性聚合物的缀合物在玻璃体中表 现出比未缀合到生物相容性聚合物的生物活性多肽在玻璃体中的半 衰期大至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少 约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、 至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约 100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍或多于1000 倍的半衰期。包含生物活性多肽和生物相容性聚合物的缀合物在玻璃 体中表现出比未缀合到生物相容性聚合物的生物活性多肽在玻璃体 中的半衰期大5倍至10倍的半衰期。
在一些情况下，包含生物活性多肽和生物相容性聚合物的缀合物 在玻璃体中表现出约12小时至约24小时、约1天至约3天、约3天 至约7天、一周至约2周、约2周至约4周或约1个月至约6个月的 半衰期。
在一些情况下，包含生物活性多肽和生物相容性聚合物的缀合物 在玻璃体中表现出约12小时至约24小时、约1天至约3天、约3天 至约7天、一周至约2周、约2周至约4周、约1个月至约3个月或 约3个月至约6个月的治疗有效停留时间。
缀合到聚合物底物的多肽的生物活性相对于呈可溶形式的多肽 的活性增强，例如，与未缀合到聚合物的多肽的活性相比增强。在一 些实施方案中，多肽-聚合物缀合物中多肽的生物活性比呈可溶(未缀 合)形式的多肽的生物活性大至少约25％、至少约50％、至少约75％、 至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20 倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少 约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、或至少约 1000倍或多于1000倍。
在一些实施方案中，合适的多肽-聚合物缀合物中多肽的生物活 性比以1:1摩尔比缀合到聚合物的多肽的生物活性大至少约25％、至 少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、 至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约 40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、 至少约500倍、或至少约1000倍或多于1000倍。
在一些实施方案中，合适的多肽-聚合物缀合物中多肽的生物学 活性比与聚合物混合存在的多肽的生物活性大至少约25％、至少约 50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少 约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、 至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约 500倍、或至少约1000倍或多于1000倍。
在一些情况下，主题多肽-聚合物缀合物中多肽的半数最大有效 浓度(EC50)比可溶性(未缀合形式)多肽的EC50低至少约10％、至少约 25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约 10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、 至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约 200倍、至少约500倍、或至少约1000倍或多于1000倍。
在一些情况下，主题多肽-聚合物缀合物中多肽的半数最大抑制 浓度(IC50)比可溶性(未缀合形式)多肽的IC50低至少约10％、至少约 25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约 10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、 至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约 200倍、至少约500倍、或至少约1000倍或多于1000倍。
多肽-聚合物缀合物中多肽的生物活性相对于呈可溶(未缀合)形 式的多肽的生物活性是否增加易于使用针对生物活性的一个或多个 适当测定来确定。
多肽与聚合物的摩尔比可在约5:1至约100:1，例如约5:1至约 7:1、约7:1至约10:1、约10:1至约12:1、约12:1至约15:1、约15:1 至约20:1、约20:1至约25:1、约25:1至约30:1、约30:1至约35:1、 约35:1至约40:1、约40:1至约45:1、约45:1至约50:1、约50:1至 约60:1、约60:1至约70:1、约70:1至约80:1、约80:1至约90:1或 约90:1至约100:1内变化。
例如，在多肽聚合物缀合物包含抑制血管生成的多肽(例如，多 肽是抗血管生成多肽)的情况下，在一些实施方案中，相比于通过与 聚合物混合存在、呈可溶(未缀合)形式或以1:1摩尔比缀合到聚合物 的抗血管生成多肽进行的血管生成的抑制程度，多肽-聚合物缀合物 的抗血管生成多肽使血管生成抑制至少约10％、至少约15％、至少约 20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约 60％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少 约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、 至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约 500倍、或至少约1000倍、或多于1000倍或更多。
聚合物
与生物活性多肽缀合的合适聚合物包括生物相容性聚合物，其包 含约50个至约100,000个亚基，例如约50个亚基至约100个亚基、 约100个亚基至约500个亚基、约500个亚基至约1,000个亚基、约 1,000个亚基至约5,000个亚基、约5,000个亚基至约10,000个亚基、 约10,000个亚基至约25,000个亚基、约25,000个亚基至约50,000个 亚基或约50,000个亚基至约100,000个亚基。在一些实施方案中，线 性聚合物包含多于100,000个亚基。
与生物活性多肽缀合的合适聚合物包括具有10千道尔顿(kDa) kDa至500kDa的分子量的生物相容性聚合物。例如，与生物活性多 肽缀合的合适聚合物包括具有10kDa至15kDa、15kDa至20kDa、 20kDa至25kDa、25kDa至50kDa、50kDa至75kDa、75kDa至 100kDa、100kDa至125kDa、125kDa至150kDa、150kDa至200kDa、200kDa至250kDa、250kDa至300kDa、300kDa至350kDa、350kDa 至400kDa、400kDa至450kDa或450kDa至500kDa的分子量的生 物相容性聚合物。与生物活性多肽缀合的合适聚合物包括具有大于 500kDa的分子量的生物相容性聚合物。与生物活性多肽缀合的合适 聚合物包括具有500kDa至2百万道尔顿(MDa)的分子量的生物相容 性聚合物。例如，与生物活性多肽缀合的合适聚合物包括具有500kDa至750kDa、750kDa至1MDa、1MDa至1.5MDa、1.5MDa至2MDa 或2MDa至3MD的分子量的生物相容性聚合物。
在一些情况下，亚基均是相同的，例如聚合物是均聚物。在其他 情况下，存在多于一种的亚基，例如聚合物是杂聚物或共聚物。在一 些情况下，聚合物是线性聚合物。在其他情况下，聚合物可包括一个 或多个分支。
合适的聚合物包括天然聚合物、半合成聚合物和合成聚合物。
合适的天然聚合物包括透明质酸、胶原、糖胺聚糖、纤维素、多 糖等。
合适的半合成聚合物包括但不限于与醛交联的胶原或其前体、二 羧酸或其卤化物、二胺、纤维素衍生物、透明质酸、几丁质、壳聚糖、 结冷胶、黄原胶、果胶或果胶酸、多聚糖、多聚甘露糖、琼脂、琼脂 糖、天然树胶和糖胺聚糖。
合适的合成聚合物包括但不限于由以下得到的聚合物或共聚物： 聚二氧杂环己烷、聚磷腈、聚砜树脂、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸)丁酯、 聚(乙二醇)、聚(丙烯)、聚氨酯树脂、聚(甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯 酸)-甲酯、聚(甲基丙烯酸)-正丁酯、聚(甲基丙烯酸)-叔丁酯、聚四氟 乙烯、聚全氟丙烯、聚N-乙烯基咔唑、聚(甲基异丙烯基酮)、聚α- 甲基苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚(甲醛)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚 氨酯、聚(乙烯醇)和聚对苯二甲酸乙二醇酯；乙烯乙烯醇共聚物(通常 以通用名EVOH或商品名EVAL著称)；聚甲基丙烯酸丁酯；聚(羟基 戊酸酯)；聚(L-乳酸)；聚己内酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚(羟基丁 酸酯)；聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)；聚二氧杂环己酮；聚原酸酯；聚 酐；聚(乙醇酸)(PGA)；聚(D,L-乳酸)(PLA)；PGA和PLA的共聚物； 聚(乙醇酸-共-碳酸三亚甲基酯)；聚磷酸酯；聚磷酸酯聚氨酯；聚(氨 基酸)；氰基丙烯酸酯；聚(碳酸三亚甲基酯)；聚(亚氨基碳酸酯)；共 聚(醚-酯)(例如PEO/PLA)；聚亚烷基草酸酯；聚磷腈；聚氨酯；硅 氧烷；聚酯；聚烯烃；聚异丁烯和乙烯-α烯烃共聚物；丙烯酸聚合物 和共聚物；乙烯基卤聚合物和共聚物，诸如聚氯乙烯；聚乙烯醚，诸 如聚乙烯甲基醚；聚偏二卤乙烯，诸如聚偏二氟乙烯和聚偏二氯乙烯； 聚丙烯腈；聚乙烯酮；聚乙烯基芳族化合物，诸如聚苯乙烯；聚乙烯 酯，诸如聚乙酸乙烯酯；乙烯基单体彼此和烯烃的共聚物，诸如乙烯 -甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS树脂和乙烯- 乙酸乙烯酯共聚物；聚酰胺，诸如尼龙66和聚己内酰胺；醇酸树脂； 聚碳酸酯；聚甲醛；聚酰亚胺；聚醚；环氧树脂；聚氨酯；人造丝； 人造丝-三醋酸酯；纤维素；醋酸纤维素；丁酸纤维素；醋酸丁酸纤 维素；玻璃纸；硝酸纤维素；丙酸纤维素；纤维素醚；无定形特氟隆； 以及羧甲基纤维素。
与生物活性多肽缀合的聚合物可包含多个选自以下的亚基：透明 质酸、丙烯酸、乙二醇、乙烯基、丙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯 酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、四氟乙烯、甲醛、糖(例如葡萄 糖、甘露醇、麦芽糖、***糖等)、牛磺酸、甜菜碱、改性纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙 基甲基纤维素、羧甲基纤维素、改性淀粉、疏水改性淀粉、羟乙基淀 粉、羟丙基淀粉、直链淀粉、支链淀粉、氧化淀粉、氨基酸以及前述 任一种的共聚物。在一些实施方案中，聚合物不包含氨基酸。在一些情况下，与生物活性多肽缀合的聚合物包含heprosan、肝素、软骨素、 硫酸软骨素或硫酸肝素。
在一些实施方案中，聚合物包含透明质酸或透明质酸衍生物。透 明质酸衍生物包括例如透明质酸酯，其中部分或全部羧酸官能团与脂 族、芳族、芳脂族、脂环族或杂环系列的醇发生酯化；琥珀酸与透明 质酸或与透明质酸的偏酯或全酯的半酯或琥珀酸与透明质酸或与透 明质酸的偏酯或全酯的半酯的重金属盐；硫酸化或N-硫酸化透明质 酸。在一些实施方案中，聚合物是透明质酸。在一些实施方案中，聚 合物是透明质酸衍生物。
生物活性多肽
多肽的大小可在2kDa至约2000kDa，例如约2kDa至约5kDa、 约5kDa至约10kDa、约10kDa至约25kDa、约25kDa至约50kDa、 约50kDa至约100kDa、约100kDa至约250kDa、约250kDa至约 500kDa、约500kDa至约1000kDa、约1000kDa至约2000kDa范 围内。
为了用于本公开方法的适于包含在缀合物中的生物活性多肽包 括但不限于神经保护性多肽、抗血管生成多肽、抗凋亡因子和增强视 网膜细胞功能的多肽。
为了用于本公开方法的适于包含在缀合物中的生物活性多肽包 括但不限于神经保护性多肽(例如GDNF、CNTF、NT4、NGF和NTN)； 抗血管生成多肽(例如可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体；VEGF 结合抗体；VEGF结合抗体片段(例如单链抗VEGF抗体)；内皮抑素；肿瘤抑素；血管抑素；可溶性Flt多肽(Lai等人(2005) Mol.Ther.12:659)；包含可溶性Flt多肽的Fc融合蛋白(参见，例如 Pechan等人(2009)Gene Ther.16:10)；色素上皮衍生因子(PEDF)；可 溶性Tie-2受体；等)；金属蛋白酶-3的组织抑制剂(TIMP-3)；光响应 性视蛋白，例如视紫红质；抗凋亡多肽(例如，Bcl-2、Bcl-Xl)；以及 类似的多肽。合适的多肽包括但不限于神经胶质衍生的神经营养因子 (GDNF)；成纤维细胞生长因子2；神经生长因子(NTN)；睫状神经营 养因子(CNTF)；神经生长因子(NGF)；神经营养蛋白-4(NT4)；脑衍 生神经营养因子(BDNF)；表皮生长因子；视紫红质；X连锁凋亡抑 制剂；以及音猬因子(Sonichedgehog)。
为了用于本公开方法的适于包含在缀合物中的生物活性多肽包 括但不限于可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体；血管抑素、内皮 抑素；血管形成抑制素；视网膜色素上皮特异性蛋白65kDa(RPE65)； 以及康普塔汀(compstatin)。在一些情况下，生物活性多肽是可溶性fms 样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)多肽。在一些情况下，生物活性多肽是单结构 域骆驼(VHH)抗VEGF抗体(VHH抗VEGF抗体)。在一些情况下，生 物活性多肽是单链Fv抗VEGF抗体(scFv抗VEGF抗体)。
为了用于本公开方法的适于包含在缀合物中的生物活性多肽包 括但不限于神经胶质衍生的神经营养因子、成纤维细胞生长因子2、 神经生长因子、睫状神经营养因子、神经生长因子、脑衍生神经营养 因子、表皮生长因子、视紫红质、X连锁凋亡抑制剂、视网膜劈裂蛋 白、RPE65、色素性视网膜炎GTP酶相互作用蛋白-1、外周蛋白、外 周蛋白-2、视紫红质和音猬因子。
合适的多肽还包括视网膜劈裂蛋白。合适的多肽包括例如色素性 视网膜炎GTP酶调节剂(RGPR)相互作用蛋白-1(参见，例如GenBan k登录号Q96KN7、Q9EPQ2和Q9GLM3)；外周蛋白-2(Prph2)(参 见，例如GenBank登录号NP_000313；以及Travis等人(1991)Geno mics10:733)；外周蛋白；视网膜色素上皮特异性蛋白(RPE65)(参见， 例如GenBank AAC39660；以及Morimura等人(1998)Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 95:3088)；以及类似的蛋白。
合适的多肽还包括：CHM(无脉络膜(Rab护送蛋白1))、当缺陷 或缺失时引起无脉络膜的多肽(参见，例如Donnelly等人(1994) Hum.Mol.Genet.3:1017；以及van Bokhoven等人(1994) Hum.Mol.Genet.3:1041)；以及碎屑同源物1(CRB1)、当缺陷或缺失时 引起利伯先天性黑和色素性视网膜炎的多肽(参见，例如den Hollander 等人(1999)Nat.Genet.23:217；以及GenBank登录号CAM23328)。
合适的多肽还包括当缺陷或缺失时导致色盲的多肽，其中此类多 肽包含例如视锥细胞cGMP-调控的通道亚基α(CNGA3)(参见，例如 GenBank登录号NP_001289；以及Booij等人(2011)Ophthalmology 118:160-167)；视锥细胞cGMP-调控的阳离子通道β-亚基(CNGB3)(参 见，例如Kohl等人(2005)Eur J Hum Genet.13(3):302)；鸟嘌呤核苷酸 结合蛋白(G蛋白)、α转导活性多肽2(GNAT2)(ACHM4)；和ACHM5； 以及当缺陷或缺失时导致各种形式的色盲的多肽(例如，L-视蛋白、 M-视蛋白和S-视蛋白)。参见Mancuso等人(2009)Nature 461(7265):784-787。
为了用于本公开方法的适于包含在缀合物中的生物活性多肽包 括抗体。合适的抗体包括例如VEGF特异性抗体；肿瘤坏死因子-α (TNF-α)特异性抗体；以及类似的抗体。
合适的抗体包括但不限于阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、 贝利木单抗、贝伐珠单抗、巴列津单抗、布罗达单抗、卡那单抗、赛 妥珠单抗、claakizumab、达利珠单抗、地诺单抗、依法珠单抗、依帕 珠单抗、埃达珠单抗、非扎奴单抗、芬妥木单抗、芳妥珠单抗、加沃坦珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、奈米布单抗、奈米布单抗、 那他珠单抗、纽珠单抗、nextomab、奥卡土珠单抗、奥法木单抗、奥 鲁凯珠单抗、帕特立珠单抗、普立昔单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、 苏金单抗、希瑞库单抗、松普希珠单抗、他贝鲁单抗、托珠单抗、托 利珠单抗、优特克单抗、伐利昔单抗、维多珠单抗、维妥珠单抗、维 西珠单抗、伏司妥珠单抗和齐拉木单抗。
在一些情况下，生物活性多肽是可溶性fms样酪氨酸激酶-1 (sFlt-1)多肽。在一些情况下，生物活性多肽包含与图16A中描绘的 氨基酸序列的具有100个氨基酸(aa)至200个aa、200个aa至300个 aa、300个aa至400个aa、400个aa至500个aa、500个aa至600 个aa、600个aa至700个aa或700个aa至755个aa的连续延伸具 有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％ 或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，生物活性 多肽包含与图16B中描绘的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、 至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一 性的氨基酸序列。在一些情况下，生物活性多肽包含与图16C中描绘 的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至 少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些 情况下，生物活性多肽包含与图17中描绘的氨基酸序列具有至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％ 氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，生物活性多肽包含 图17中描绘的氨基酸序列。肠激酶切割位点(DDDDK；SEQ ID NO:7) 和聚(His)序列(HHHHHH；SEQ ID NO:8)存在于图17中描绘的氨基 酸序列的羧基末端处。在一些情况下，sFlt多肽不包含肠激酶切割位 点或聚(His)序列。
在一些情况下，生物活性多肽是具有150个氨基酸至200个氨基 酸、200个氨基酸至250个氨基酸、250个氨基酸至300个氨基酸、 300个氨基酸至350个氨基酸或350个氨基酸至400个氨基酸的长度 的sFlt-1多肽。
在一些情况下，生物活性多肽是scFv抗VEGF抗体。可使用任 何合适的scFv抗VEGF抗体。在图18中提供scFv抗VEGF抗体的 氨基酸序列的非限制性实例。肠激酶切割位点(DDDDK；SEQ ID NO:7) 和聚(His)序列(HHHHHH；SEQ ID NO:8)存在于图18中描绘的scFv抗VEGF抗体的羧基末端处。在一些情况下，scFv抗VEGF抗体不 包含肠激酶切割位点或聚(His)序列。
在一些情况下，生物活性多肽是单结构域骆驼(VHH)抗VEGF抗 体。可使用任何合适的VHH抗VEGF抗体。在图19中提供VHH抗 VEGF抗体的氨基酸序列的非限制性实例。肠激酶切割位点(DDDDK； SEQ ID NO:7)和聚(His)序列(HHHHHH；SEQ ID NO:8)存在于图19 中描绘的VHH抗VEGF抗体的羧基末端处。在一些情况下，VHH 抗VEGF抗体不包含肠激酶切割位点或聚(His)序列。
接头
如上指出，在一些情况下，合适的多肽-聚合物缀合物包含将多 肽连接至聚合物的接头基团。合适的接头包括肽接头和非肽接头。
接头肽可具有各种氨基酸序列中的任一种。示例性肽接头的长度 在约6个氨基酸与约40个氨基酸之间，或者长度在约6个氨基酸与 约25个氨基酸之间。示例性接头包括聚(甘氨酸)接头(例如(Gly)n，其 中n是2至约10的整数)；包含Gly和Ser的接头；以及类似的接头。
缀合
各种缀合方法和化学可用于将多肽缀合至聚合物。可使用各种零 长度、同双官能和异双官能交联试剂。零长度交联试剂包括在不引入 外在材料下的情况下两种内在化学基团的直接缀合。催化二硫键形成 的试剂属于这一类。另一个实例是诱导羧基和伯氨基缩合以形成酰胺 键的试剂，诸如碳二亚胺、氯甲酸乙酯、伍德沃德试剂K(2-乙基-5- 苯基异恶唑-3'-磺酸盐)和羰基二咪唑。同和异双官能试剂通常分别含 有两个相同或两个不相同的位点，它们可与氨基、巯基、胍基、吲哚 或非特异性基团反应。
在一些实施方案中，聚合物包含用于与多肽上或接头上的伯胺基 团反应的氨基反应性基团。合适的氨基反应性基团包括但不限于N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、亚氨酸酯、异氰酸酯、酰卤、芳基叠氮化 物、对硝基苯基酯、醛和磺酰氯。
在一些实施方案中，聚合物包含巯基反应性基团，例如用于与多 肽中的半胱氨酸残基反应。合适的巯基反应性基团包括但不限于马来 酰亚胺、烷基卤化物、吡啶基二硫化物和硫代邻苯二甲酰亚胺。
在其他实施方案中，可溶于水和有机溶剂两者的碳二亚胺用作羧 基反应性试剂。这些化合物与游离羧基反应形成假脲，所述假脲然后 可偶联到可用的胺，从而产生酰胺键。
如上指出，在一些实施方案中，使用同双官能交联剂将多肽缀合 至聚合物。
在一些实施方案中，同双官能交联剂与伯胺反应。与伯胺反应的 同双官能交联剂包括NHS酯、亚氨酸酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、 酰卤、芳基叠氮化物、对硝基苯基酯、醛和磺酰氯。
同双官能NHS酯的非限制性实例包括二琥珀酰亚胺基戊二酸酯 (DSG)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二 酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒 石酸酯(磺基-DST)、双-2-(琥珀酰亚胺氧基羰氧基)乙基砜(BSOCOES)、双-2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰氧基)乙基砜(磺基 -BSOCOES)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺 基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸 酯)(DSP)和二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(磺基-DSP)。同双官能亚氨酸酯的非限制性实例包括丙二酰亚胺二甲酯(DMM)、琥珀酰亚 胺二甲酯(DMSC)、二甲基己二酰亚胺酯(DMA)、庚二酰亚胺二甲酯 (DMP)、辛二酰亚胺二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-氧代二丙酸酰亚胺酯 (DODP)、二甲基-3,3'-(亚甲基二氧基)二丙酸酰亚胺酯(DMDP)、二甲 基-3,3'-(二亚甲基二氧基)二丙酸酰亚胺酯(DDDP)、二甲基-3,3'-(四亚 甲基二氧基)二丙酸酰亚胺酯(DTDP)和二甲基-3,3'-二硫代丙酸酰亚 胺酯(DTBP)。
同双官能异硫氰酸酯的非限制性实例包括：对苯二异硫氰酸酯 (DITC)和4,4'-二异硫氰基-2,2'-二磺酸二苯乙烯(DIDS)。同双官能异氰 酸酯的非限制性实例包括二甲苯-二异氰酸酯、甲苯-2,4-二异氰酸酯、 甲苯-2-异氰酸酯-4-异硫氰酸酯、3-甲氧基二苯基甲烷-4,4'-二异氰酸 酯、2,2'-二羧基-4,4'-偶氮苯基二异氰酸酯和六亚甲基二异氰酸酯。同 双官能芳基卤化物的非限制性实例包括1,5-二氟-2,4-二硝基苯 (DFDNB)和4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基-砜。同双官能脂族醛试剂的非 限制性实例包括乙二醛、丙二醛和戊二醛。同双官能酰化试剂的非限 制性实例包括二羧酸的硝基苯基酯。同双官能芳族磺酰氯的非限制性 实例包括苯酚-2,4-二磺酰氯和α-萘酚-2,4-二磺酰氯。另外的氨基反应 性同双官能试剂的非限制性实例包括赤藓糖醇二碳酸酯，其与胺反应 产生双氨基甲酸酯。
在一些实施方案中，同双官能交联剂与游离巯基反应。与游离巯 基反应的同双官能交联剂包括例如马来酰亚胺、吡啶基二硫化物和烷 基卤化物。
同双官能马来酰亚胺的非限制性实例包括双马来酰亚胺己烷 (BMH)、N,N'-(1,3-亚苯基)双马来酰亚胺、N,N'-(1,2-亚苯基)双马来酰 亚胺、偶氮苯基二马来酰亚胺和双(N-马来酰亚胺基甲基)醚。同双官 能吡啶基二硫化物的非限制性实例包括1,4-二-3'-(2'-吡啶基二硫代) 丙酰胺基丁烷(DPDPB)。同双官能烷基卤化物的非限制性实例包括 2,2'-二羧基-4,4'-二碘乙酰胺基偶氮苯、α,α'-二碘-对-二甲苯磺酸、α,α'- 二溴-对-二甲苯磺酸、N,N'-双(b-溴乙基)苄胺、N,N'-二(溴乙酰基)苯 肼和1,2-二(溴乙酰基)氨基-3-苯基丙烷。
如上指出，在一些实施方案中，使用异双官能试剂将多肽缀合至 聚合物。合适的异双官能试剂包括包含吡啶基二硫化物部分的氨基反 应性试剂；包含马来酰亚胺部分的氨基反应性试剂；包含烷基卤化物 部分的氨基反应性试剂；以及包含烷基二卤化物部分的氨基反应性试 剂。
具有吡啶基二硫化物部分和氨基反应性NHS酯的异双官能试剂 的非限制性实例包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀酰亚胺基6-3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基己酸酯 (LC-SPDP)、磺基琥珀酰亚胺基6-3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基己酸酯(磺基-LCSPDP)、4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代) 甲苯(SMPT)、二乙烯基砜(DVS)和磺基琥珀酰亚胺基6-α-甲基-α-(2- 吡啶基二硫代)苯甲酸酰胺基己酸酯(磺基-LC-SMPT)。
包含马来酰亚胺部分和氨基反应性NHS酯的异双官能试剂的非 限制性实例包括马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺基酯(AMAS)、3-马来 酰亚胺基丙酸琥珀酰亚胺基酯(BMPS)、N-.γ.-马来酰亚胺基丁酰氧基 琥珀酰亚胺酯(GMBS)、N-.γ.-马来酰亚胺基丁酰氧基磺基琥珀酰亚胺 酯(磺基-GMBS)、6-马来酰亚胺基己酸琥珀酰亚胺基酯(EMCS)、3- 马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMB)、间马来酰亚胺基苯甲酰 基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺 基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸 琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基 琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰 亚胺基酯(SMPB)和4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺基 酯(磺基-SMPB)。
包含烷基卤化物部分和氨基反应性NHS酯的异双官能试剂的非 限制性实例包括N-琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、 磺基琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、琥珀酰亚 胺基-6-(碘乙酰基)氨基己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基-6-(6-((碘乙酰 基)-氨基)己酰基氨基)己酸酯(SIAXX)、琥珀酰亚胺基-6-(((4-(碘乙酰 基)-氨基)甲基)-环己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)和琥珀酰亚胺基 -4((碘乙酰基)-氨基)甲基环己烷-1-羧酸酯(SIAC)。
包含氨基反应性NHS酯和烷基二卤化物部分的异双官能试剂的 非限制性实例是N-羟基琥珀酰亚胺基2,3-二溴丙酸酯(SDBP)。包含 烷基卤化物部分和氨基反应性对硝基苯基酯部分的异双官能试剂的 非限制性实例包括对硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)。
组合物、制剂、剂量和施用途径
在一些情况下，本公开的方法包括向有需要的个体施用多肽-聚 合物缀合物，其中所述多肽-聚合物缀合物是均质的，例如多肽-聚合 物缀合物中所有多肽包含相同的氨基酸序列。例如，在一些实施方案 中，待施用给个体的组合物包含复数个(例如多个拷贝)多肽-聚合物缀 合物，其中每个多肽-聚合物缀合物分子包含全部具有相同氨基酸序 列的多肽。
在一些情况下，本公开的方法包括向有需要的个体施用包含多肽 -聚合物缀合物的组合物，其中所述组合物包含两种或更多种多肽-聚 合物缀合物，例如组合物包含第一多肽-聚合物缀合物，其中所述第 一多肽-聚合物缀合物包含具有第一氨基酸序列的多肽；以及至少第 二多肽-聚合物缀合物，其中所述第二多肽-聚合物缀合物包含具有不 同于第一氨基酸序列的第二氨基酸序列的多肽。在一些情况下，组合 物包含第三或另一种多肽-聚合物缀合物。作为一个非限制性实例， 第一多肽-聚合物缀合物包含为抗血管生成多肽的第一多肽；并且第 二多肽-聚合物缀合物包含抑制细胞信号传导通路的第二多肽。可使用第一、第二等多肽的各种其他组合。组合物中第一多肽-聚合物缀 合物与第二多肽-聚合物缀合物的比率可例如在约0:001至103至约 103至0.001内变化。相似地，在主题组合物包含第一、第二和第三 多肽-聚合物缀合物的情况下，第一、第二和第三多肽-聚合物缀合物的比率可变化。
除多肽-聚合物缀合物之外，适用于本公开方法的组合物可包含 以下一种或多种：盐，例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；缓冲剂， 例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N- 吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代) 丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶剂； 洗涤剂，例如非离子洗涤剂诸如吐温-20等；蛋白酶抑制剂；以及类 似的试剂。
适用于本公开方法的组合物可包含多肽-聚合物缀合物(如上所述) 和药学上可接受的赋形剂。合适的赋形剂媒介物是例如水、盐水、葡 萄糖、甘油、乙醇、或类似的媒介物及其组合。另外，如果需要，媒 介物可含有少量的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。对 本领域技术人员来说，制备此类剂型的实际方法是已知的，或将是显 而易见的。参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第17版,1985。待施用的组合物或制 剂将在任何情况下含有一定量的足以在所治疗的受试者中实现所需 状态的试剂。药学上可接受的赋形剂诸如媒介物、佐剂、载体或稀释 剂对公众而言易于得到。此外，药学上可接受的辅助物质，诸如pH 调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等对公众而言易于得 到。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的赋 形剂”可互换使用，并且包括当与多肽-聚合物缀合物组合时基本上不 影响缀合物的生物活性，不在宿主中诱导免疫应答，并且对宿主没有 任何实质的不利生理影响的任何材料。实例包括但不限于标准药学载 体，诸如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(诸如油/水乳剂)，以及各种类 型的润湿剂中的任一种。其他载体也可包括无菌溶液、包括包衣片剂 的片剂和胶囊。通常，此类载体含有赋形剂，诸如淀粉、牛奶、糖、 某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、 植物脂肪或油、树胶、二醇或其他已知的赋形剂。此类载体还可包含 风味和颜色添加剂或其他成分。包含此类载体的组合物可通过熟知的 常规方法加以配制。
可将药物组合物配制用于选择的施用方式，包括例如眼内施用， 例如玻璃体内施用。
包含缀合物的组合物可包含水性载体，例如水、缓冲水、盐水、 磷酸盐缓冲盐水等。根据需要，组合物可含有药学上可接受的辅助物 质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、 洗涤剂等。
组合物可通过常规灭菌技术灭菌，或可进行无菌过滤。可将得到 的水溶液包装用于原样使用，或冻干，在施用之前，将冻干的制剂与 无菌水性载体组合。可将得到的水溶液包装在玻璃注射器中。制剂的 pH可在3和11范围内，例如约pH 5至约pH 9，或约pH 7至约pH8。
用于本公开方法的缀合物的合适剂量包括约1μg至约10mg，例 如约1μg至约5μg、约5μg至约10μg、约10μg至约20μg、约20 μg至约25μg、约25μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg 至约150μg、约150μg至约250μg、约250μg至约500μg、约500μg 至约750μg、约750μg至约1mg、约1mg至约5mg或约5mg至约 10mg/剂量。在一些情况下，用于本公开方法的缀合物的合适剂量包 括10mg至100mg，例如10mg至20mg、20mg至25mg、25mg 至50mg、50mg至75mg或75mg至100mg/剂量。
在一些实施方案中，施用多剂量的缀合物。缀合物的施用频率可 根据各种因素中的任一种变化，例如症状的严重程度等。例如，在一 些实施方案中，缀合物每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周 (qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、 每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天(qd)、每天两次(qid)或每 天三次(tid)施用。在一些实施方案中，缀合物每两个月一次、每三个 月一次、每6个月一次或每年一次施用。
在一些情况下，包含缀合物的组合物通过玻璃体内、经巩膜、眼 周、结膜、筋膜下、前房内、视网膜下、结膜下、眼球后或小管内施 用途径施用。在一些情况下，包含缀合物的组合物通过玻璃体内施用。 在一些情况下，组合物通过玻璃体内递送或紧靠眼睛后段递送。在一 些情况下，组合物通过玻璃体内注射施用。在一些情况下，包含缀合 物的组合物通过眼内注射施用。
病症
可使用本公开的方法治疗的眼部病症包括但不限于黄斑变性、脉 络膜新血管形成、黄斑水肿、视网膜新血管形成、增生性玻璃体视网 膜病变、青光眼和眼部炎症。
可使用本公开的方法治疗的眼部疾病包括但不限于急性黄斑性 视神经视网膜病变；***(Behcet's disease)；脉络膜新血管形成； 糖尿病性葡萄膜炎；组织胞浆菌病；黄斑变性，诸如急性黄斑变性、 非渗出性年龄相关黄斑变性及渗出性年龄相关黄斑变性；水肿，诸如 黄斑水肿、黄斑囊样水肿及糖尿病性黄斑水肿；多灶性脉络膜炎；影 响眼后部位或位置的眼部创伤；眼肿瘤；视网膜病症，诸如视网膜中 央静脉闭塞、糖尿病性视网膜病(包括增生性糖尿病性视网膜病和糖 尿病性黄斑水肿)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视网膜动脉阻塞 性疾病、视网膜脱离、葡萄膜视网膜疾病；交感性眼炎；伏格特小柳-原田(Vogt Koyanagi-Harada，VKH)综合征；葡萄膜扩散；由眼睛激 光治疗引起或受其影响的眼后病状；由光动力学疗法引起或受其影响 的眼后病状；光焊接、辐射性视网膜病变；视网膜前膜病症；视网膜 分支静脉闭塞；缺血性前部视神经病变；非视网膜病糖尿病性视网膜 功能紊乱；视网膜劈裂；色素性视网膜炎；青光眼；厄舍综合征、锥 -杆变性；斯塔加特氏病(黄点状眼底)；遗传性黄斑变性；脉络膜视网 膜变性；利伯先天性黑；先天性静止性夜盲；无脉络膜；巴德-别德 尔综合征；黄斑毛细血管扩张；莱伯遗传性视神经病；早产儿视网膜 病变；以及色觉病症，包括全色盲、红色盲、绿色盲和第三色盲。
在一些情况下，眼部疾病是青光眼、色素性视网膜炎、黄斑变性、 视网膜劈裂、利伯先天性黑、糖尿病性视网膜病、全色盲或色盲。
适合治疗的受试者
适合用本公开的方法治疗的受试者包括已被诊断为患有眼部疾 病或病症(例如任何以上列出的眼部疾病或病症)的个体。适合用本公 开的方法治疗的受试者包括已针对眼部疾病或病症进行治疗并且对 治疗没有反应的个体。
适合用本公开的方法治疗的个体包括由于眼部疾病或病症而导 致视敏度下降的个体。适合用本公开的方法治疗的个体包括由于眼部 疾病或病症而具有异常高眼压的个体。适合用本公开的方法治疗的个 体包括由于眼部疾病或病症而在眼中具有病理性血管生成的个体。
视敏度可使用例如斯内伦视力表、Bailey-Lovie视力表、十进制 进度图表、弗莱堡视敏度测试、最小分辨角(MAR)测量等来进行测量。 视物变形症(视觉畸变)可使用Amsler图表进行测量。对比敏感度可使 用Pelli-Robson图表来进行测量。诊断性研究包括但不限于眼底的标 准眼科检查、黄斑的立体生物显微镜检查、静脉内眼底荧光素血管造影、眼底照相、吲哚花氰绿视频血管造影和光学相干断层扫描。显示 出这些诊断性研究中的一项或多项异常的受试者(例如，落在对于健 康眼睛被认为正常的范围之外的受试者)可根据本公开进行治疗。例 如，根据年龄相关性眼病研究中使用的分类方案，受试者可被分类为 具有早期、中期或晚期ARMD。落入其中描述的任何类别的受试者 可根据本公开的方法进行治疗。
实施例
提出以下实施例以便向本领域的普通技术人员提供如何制备和 使用本发明的完全公开和描述，并且并非意图限制本发明人看待其发 明的范围，也非意图表示以下实验是执行的全部或仅有的实验。已经 努力确保关于所用数值(例如量、温度等)的精确性，但一些实验误差 和偏差应加以说明。除非另外指示，否则份为重量份，分子量为重均 分子量，温度以摄氏度计，并且压力在大气压下或接近大气压。可使 用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec， 秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱 基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内的(肌内地)；i.p.，腹膜内的(腹膜内地)； s.c.，皮下的(皮下地)等。
实施例1：sFlt多价缀合物抑制血管生成并改善体内半衰期
为了改善抗VEGF药物的玻璃体内停留时间，合成抗VEGF蛋 白质的多价生物缀合物。缀合物包含共价接枝到透明质酸(HyA)的链 的可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt)。缀合物被称为mvsFlt。使用小 鼠角膜血管生成测定，证明与HyA链的共价缀合不降低sFlt的生物 活性，并且mvsFlt在抑制角膜血管生成方面与sFlt相当。在大鼠玻 璃体模型中，2天后观察到与未缀合的sFlt相比，mvsFlt具有显著增 加的玻璃体内停留时间。计算的sFlt和mvsFlt的玻璃体内半衰期分 别是3.3和35小时。此外，在氧诱导的视网膜病模型中显示mvsFlt 在抑制视网膜新血管形成方面比未缀合形式更有效，这种效应很可能 是由于mvsFlt在玻璃体中的半衰期更长。总之，结果指示sFlt与HyA 的缀合不影响其对于VEGF的亲和力，并且此缀合显著改善药物半衰 期。这些体内结果指示，多价缀合可基本上改善药物半衰期，并且 因此改善用于疾病(诸如糖尿病性视网膜病)的当前可用药物的疗效， 从而改善患者的生活质量。
材料和方法
可溶性Flt-1受体的表达
将sFlt-1的前3个Ig样胞外结构域的sFlt序列[13]克隆到 pFastBac1质粒(LifeTechnologies)中，并且然后转化到DH10Bac大肠 杆菌中，将其涂布在含有卡那霉素(50μg/mL Sigma Aldrich)、庆大霉 素(7μg/mL，Sigma Aldrich)、四环素(10μg/mL，SigmaAldrich)、IPTG (40μg/mL，Sigma Aldrich)和Bluo-gal(100μg/mL，Thermo FisherScientific)的三联抗生素平板上。将含有sFlt基因的杆粒从DH10Bac 大肠杆菌(LifeTechnologies)分离并转染到SF9昆虫细胞中用于病毒 产生(由Tissue CultureFacility，UC Berkeley提供)。然后使用病毒来 感染High Five昆虫细胞(由TissueCulture Facility，UC Berkeley提供) 以诱导sFlt蛋白表达。3天后，使用Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen Laboratories)从上清液纯化蛋白质。使用咪唑(Sigma Aldrich)梯度从 Ni-NTA珠洗脱重组sFlt，并且然后使用Amicon Ultra-15mL离心装置(EMD Millipore)将其浓缩并用10％甘油/PBS进行缓冲液交换。将蛋 白质溶液无菌过滤，并通过BCA测定(ThermoFisher Scientific)确定 浓度。
mvsFlt缀合物合成
sFlt与HyA的缀合根据图1中的示意图，并如先前所述进行 ([12,14-16])。为制备硫醇反应性HyA中间体，将3,3′-N-(ε-马来酰亚 胺基己酸)酰肼(EMCH,Pierce,1.2mg/mL)、1-羟基苯并***水合物 (HOBt,Sigma,0.3mg/mL)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺 盐酸盐(EDC,Pierce,10mg/mL)添加到650kDa HyA(Lifecore Biotechnology)在0.1M2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)(Sigma)缓冲液(pH 6.5)中的3mg/ml溶液，并使其在4℃下反应4h。然后将所述溶液透 析到含有10％甘油的pH 7.0磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将重组sFlt用 10摩尔过量的2-亚氨基四氢噻吩处理以产生用于与EMCH上的马来 酰亚胺基团缀合的硫醇基团。然后将活化的HyA-EMCH以1:10的摩 尔比(HyA与sFlt)添加到sFlt，并使其在4℃下过夜反应以合成最终的 mvsFlt缀合物。将mvsFlt缀合物用100kDa分子量截留(MWCO)Float-A-Lyzer G2(Spectrum Labs)在pH 7.0PBS中彻底透析以除去未 反应的sFlt。使用BCA测定来测量mvsFlt的浓度。
图1：mvsFlt合成示意图。mvsFlt生物缀合物使用3步反应合成， 其中HyA与EDC和EMCH反应以产生硫醇反应性HyA-EMCH中间 体。然后将sFlt用2-亚氨基四氢噻吩处理并与HyA-EMCH中间体反 应用以合成最终的mvsFlt生物缀合物。
角膜血管生成测定
所有实验均用野生型7至12周龄的雄性和雌性同窝出生FVB/n 小鼠执行。在UCSF屏障设施中将小鼠维持在无病原体的条件下，并 根据UCSF机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的程序进行。在 动工之前，所有实验均被UCSF IACUC批准。通过吸入异氟烷(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)，10mg/kg卡洛芬(Sigma,St.Louis,MO) 和通过局部施加放置在角膜上的0.5％丙美卡因(Bausch&Lomb, Rochester,NY)来将小鼠麻醉。碱性灼伤通过将浸泡在0.1N NaOH (Sigma Aldrich)中的直径2.5mm的滤纸施加到中央角膜30秒，接着 用250μL PBS冲洗来产生。化学灼伤治疗后，将局部0.5％丙美卡因 添加到角膜进行麻醉。灼伤后第1天和第3天给小鼠结膜下施用5μL sFlt(150μg/ml)、mvsFlt(150μg/ml)或PBS注射。治疗后10天，摘除 眼睛，并且解剖角膜并在4℃下在4％多聚甲醛中固定过夜。角膜用 3％BSA封闭并用DAPI、兔抗小鼠CD31一抗(Santa Cruz Biotechnology)和山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗(Life Technologies)染 色以用于血管的可视化和定量。将角膜切成四分体并使用 Fluoromount封固剂(Sigma Aldrich)将其平整封固到载玻片上。使用自 动载玻片扫描仪Zeiss Axioscan Z1(Zeiss Instruments)进行成像。使用 NIHImageJ软件通过比较总角膜面积与角膜血管化面积来定量角膜 血管覆盖率。
mvsFlt玻璃体内停留时间的确定
所有停留时间实验均针对获自Charles River Laboratories并根据 加州大学伯克利分校机构动物护理和使用委员会批准的方案进行处 理的8周龄Brown Norway大鼠执行。在动工之前，所有实验均被加 州大学伯克利分校IACUC批准。使用***和甲苯噻嗪(分别为50mg 和10mg/kg体重)的混合物将大鼠麻醉以进行手术程序。使用30号汉 密尔顿注射器以1mg/mL通过玻璃体内向眼睛的角膜缘后1mm处注 射5μl PBS、sFlt或mvsFlt，并且每天监测炎症迹象。选择此浓度以 使玻璃体中的荧光最大化，并在48小时后保持在荧光计的检测极限 内。在注射后0、4、12、24和48小时将各组中大鼠用CO2窒息处死， 并且立即摘除眼睛并置于干冰上。然后从眼睛取出冷冻的玻璃体并浸 入在100μL RIPA缓冲液中。在冰上振荡2小时后，将每个玻璃体样 品用组织粉碎器(Bio Spec Products公司)匀化，并使用荧光计 (Molecular Devices)测量荧光。通过将玻璃体样品的荧光归一化到其 相应组内的0小时玻璃体荧光读数来进行定量。根据等式1计算sFlt 和mvsFlt的半衰期：
Ct＝C0e-kt (1)
其中Ct是时间t处的浓度，C0是初始浓度并且k是由等式2给出的 消除常数：
k＝log(2)/t1/2 (2)
其中t1/2是药物半衰期。用于计算的值t1/2基于来自48小时时间 点的数据。
OIR大鼠血管生成模型
怀孕的Brown Norway大鼠获自Charles River Laboratories。所有 的动物实验的执行均符合ARVO关于眼科及视觉研究动物使用的声 明并被俄克拉何马大学机构动物护理和使用委员会批准。新生幼仔被 分配到PBS、sFlt或mvsFlt处理组。利用12小时打开，12小时关闭 方案来循环光照，并且将室温维持在大约21C下。将大鼠幼仔于出生 后第7天(P7)至P12暴露于高氧(75％O2)。将氧处理的大鼠安置在连 接到具有氧气和氮气的Oxycler Model A4(Redfield，NY)的培养箱中， 允许将氧气浓度调节至75％±2％。将大鼠置于具有足够的食物和水以 使其维持5天的氧气室中。在P12时，将动物返回室内空气，并以 150μg/mL向每只眼通过玻璃体内注射施用2μL PBS、sFlt或mvsFlt。 将P17的大鼠麻醉并用高分子量FITC-葡聚糖(2x106；Sigma-Aldrich， St.Louis MO)灌注，如Smith等人[17]所述。将视网膜解剖并平整封 固，并且使用荧光显微镜(CKX41；Olympus)对脉管***进行成像。 使用NIH ImageJ通过比较总视网膜面积与血管形成面积来定量P17 的血管覆盖率。
统计分析
数值表示为平均值±标准偏差(SD)。用双尾t-测试执行统计分析 以比较平均值。在适当的情况下，在定量测量中，也使用单向(利用 Tukey事后分析)和双向ANOVA(利用Bonferroni事后测试)来比较处 理组(Prism，GraphPad Software)。小于0.05的P值被视为在统计学上 是显著的。
结果
sFlt和mvsFlt等同地抑制角膜血管生成
使用基于化学损伤的角膜血管生成模型来确定sFlt与HyA的缀 合与体内sFlt相比是否降低mvsFlt的生物活性。在角膜损伤后10天， 用sFlt和mvsFlt处理的所有小鼠均显示出相似的角膜血管生成抑制 曲线(图2)。用PBS处理的角膜具有28.8±11.5％血管覆盖率，相比之 下，用sFlt和mvsFlt处理的角膜分别具有12.8±3.8％和15.8±7.1％血 管覆盖率。
图2A-2C：sFlt和mvsFlt等同地抑制角膜血管生成。A)示意图 描绘用于实施角膜灼伤模型的方法。小鼠在化学灼伤后第1天和第3 天用5μl PBS、sFlt或mvsFlt处理两次。B)用PBS、sFlt和mvsFlt处 理的眼睛的代表性图像。角膜血管的CD31阳性(绿色)染色。C)处理后第10天角膜血管生成的定量。单向ANOVA得到p值**<0.01(n.s.- 不显著；*p<0.05；**p<0.01)。比例尺对应于20μm。
mvsFlt在玻璃体中具有显著更长的停留时间
已经确认，Brown Norway大鼠的玻璃体可用于使用荧光标记的 变化大小的葡聚糖来确定不同大小的分子的玻璃体内停留时间(图 6)。sFlt与mvsFlt之间的停留时间差异在4小时处开始立即明显，此 时仅18.2±7.3％的sFlt保留，相比之下mvsFlt为105.8±9.8％(图3)。 到12小时，仅2.6±1.9％的sFlt保持可检测，相比之下mvsFlt为 62.9±14.1％。注射后2天，sFlt几乎检测不到(1.2±0.5％)，而66.2±28.6％ 的mvsFlt保留在玻璃体中。sFlt在玻璃体中的半衰期使用等式1和等 式2计算为3.3小时，相比之下mvsFlt为35小时。
图3A-3B：mvsFlt在大鼠玻璃体中具有更长的停留时间。A)示 意图描绘用于确定荧光标记的sFlt和mvsFlt在大鼠玻璃体中的半衰 期的方法。向玻璃体注射5μl AlexaFluor 488标记的sFlt或mvsFlt。 在0、4、12、24和48小时后，将大鼠处死并且将它们的眼睛摘除并 冷冻以用于分析。然后将玻璃体取出，浸入在RIPA缓冲液中并匀化 以用于随后的荧光测量。B)相比于sFlt，与HyA缀合显著改善48小 时后sFlt在玻璃体中的停留时间。结果表示为平均值±SD(*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001)。*指示在给定时间点处mvsFlt与sFlt之间的差 异。双向ANOVA得出p值***<0.001。
图6：较高分子量的葡聚糖显示出较长的体内停留时间。验证实 验证明大小对于荧光标记的葡聚糖的保留的影响。2MDa葡聚糖(实 线)在48小时内比40kDa(虚线)具有显著改善的停留时间。40kDa和 2MDa葡聚糖的半衰期分别是3.2小时和5小时。*指示在给定时间点 处40kDa与2MDa葡聚糖之间的差异。双向ANOVA得出p值*<0.05 (**对应于小于0.01的P值)。
mvsFlt是更有效的视网膜新血管形成抑制剂
使用视网膜血管生成测定的OIR模型来检查sFlt的HyA缀合对 抑制视网膜血管生成的影响。此短期模型允许间接检查mvsFlt半衰 期对于延长的血管生成抑制的影响。通过比较血管覆盖面积与总视网 膜面积来计算新血管覆盖率。处理5天后，注射PBS的眼睛的视网 膜血管覆盖率是84.3±3.8％，并且用玻璃体内注射sFlt进行处理的视 网膜是85.4±6.1％。相比之下，来自用玻璃体内注射mvsFlt进行处理 的大鼠的视网膜显著更低，并且具有72.9±3.4％的视网膜血管覆盖率 (图4)。
图4A-4C：mvsFlt抑制视网膜血管生成。A)示意图显示用于实 施OIR模型的方法。将新生大鼠幼仔从出生后第(P)0-7天安置在常 氧条件中(21％氧气，室内空气)以允许正常的视网膜脉管***发育， 并且然后从P7-P12转移至高氧条件，这诱导血管修剪。在P13时， 将幼仔转移回到常氧条件中，并且用2μl PBS、sFlt或mvsFlt处理并 在P17时处死。B)用PBS、sFlt和mvsFlt处理的视网膜的代表性图像。 绿色染色指示CD31+细胞。比例尺对应于250μm。虚线框放大组织 的此部分(比例尺对应于100μm)。C)处理5天后定量的视网膜血管形 成。通过比较图像中的血管形成面积与总视网膜面积来计算视网膜血 管形成百分比。单向ANOVA得出p值***<0.001(n.s.-不显著； **p<0.01)。
在注射时，sFlt和mvsFlt两者在玻璃体中具有相似的浓度(图5A)。 随着时间的推移，sFlt少到足以从玻璃体中清除，留下浓度低得多的 药物(图5B，顶部)。这允许增加玻璃体内VEGF浓度，这诱导血管 生成。相比之下，mvsFlt具有长得多的玻璃体内停留时间，并且因此 能够随时间起到VEGF的吸收体的作用(图5B，底部)，从而抑制血 管生成并维持视网膜血管形成的基本水平。
图5A-5B：示意图证明提出的mvsFlt作用机制。A)将sFlt(红色， 未缀合的)和mvsFlt(HyA的红色缀合的蓝色链)注射到存在高浓度的 VEGF(绿色圆圈)的糖尿病性视网膜中。B)在给定时间t后，大部分 sFlt已从玻璃体中清除，并且因此VEGF能够诱导血管生长。mvsFlt 在玻璃体中具有较长的停留时间并且能够在长得多的时间段内结合 并抑制VEGF，从而导致对视网膜血管生成的延迟抑制。
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实施例2：多价透明质酸生物缀合物改善sFlt体外活性
材料和方法
可溶性Flt-1受体的表达
将sFlt-1的前3个Ig样胞外结构域的sFlt序列[15]克隆到 pFastBac1质粒(LifeTechnologies)中，并且然后转化到DH10Bac大肠 杆菌中，将其涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL， Sigma Aldrich)、四环素(10μg/mL，Sigma Aldrich)、IPTG(40μg/mL， Sigma Aldrich)和Bluo-gal(100μg/mL，Thermo Fisher Scientific)的三 联抗生素平板上。将含有sFlt基因的杆粒从DH10Bac大肠杆菌(Life Technologies)分离并转染到SF9昆虫细胞中用于病毒产生(由Tissue Culture Facility，UC Berkeley提供)。然后使用病毒来感染High Five 昆虫细胞(由Tissue Culture Facility，UC Berkeley提供)以诱导sFlt蛋 白表达。3天后，使用Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen Laboratories)从上清 液纯化蛋白质。使用咪唑梯度从Ni-NTA珠洗脱重组sFlt，并且然后 使用Amicon Ultra-15mL离心装置(EMD Millipore)将其浓缩并用10％ 甘油/PBS进行缓冲液交换。将蛋白质溶液无菌过滤，并使用BCA测 定(Thermo Fisher Scientific)确定浓度。
mvsFlt缀合物合成
根据图1中的示意图进行sFlt与HyA的缀合，如先前所述 [16-18]。为制备硫醇反应性HyA中间体，将3,3′-N-(ε-马来酰亚胺基 己酸)酰肼(EMCH,Thermo FisherScientific,1.2mg/mL)、1-羟基苯并三 唑水合物(HOBt,Sigma Aldrich,0.3mg/mL)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC,Thermo Fisher Scientific,10mg/mL)添 加到各种分子量的HyA(Lifecore Biotechnology)在0.1M 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(MES)(Sigma Aldrich)缓冲液(pH 6.5)中的3mg/mL溶液，并使 其在4℃下反应4小时。然后将溶液透析到含有10％甘油的pH 7.0 PBS中。将重组sFlt用10摩尔过量的2-亚氨基四氢噻吩处理以产生 用于与EMCH上的马来酰亚胺基团缀合的硫醇基团。然后将sFlt以 10:1和30:1的sFlt与HyA的摩尔比添加到活化的HyA-EMCH以产 生mvsFlt生物缀合物并使其在4℃下反应过夜。将mvsFlt反应使用 100kDa分子量截留(MWCO)Float-A-Lyzer G2(SpectrumLabs)透析 管在pH 7.0 PBS中彻底透析以除去未反应的sFlt。使用BCA测定测 量mvsFlt生物缀合物的蛋白质浓度。缀合物在10:1sFlt与HyA摩尔 进料比的情况下被定义为‘低缀合比’(LCR)mvsFlt并且在30:1摩尔进 料比的情况下被定义为‘高缀合比’(HCR)mvsFlt。
mvsFlt的SEC-MALS表征
蛋白缀合使用具有多角度光散射的尺寸排阻色谱法(SEC-MALS) 来表征，如先前所述[19]。简而言之，SEC-MALS装置由具有 DAWN-HELEOS II多角度激光散射检测器的Agilent HPLC 1100和 Optilab相对折射干涉仪(Wyatt Technology，Santa Barbara，CA)组成。 使用690nm激光器差分测量折射率变化，并且使用二极管阵列检测 器在280nm下测量UV吸光度。使用Shodex OH pak SB-804柱用于 分离(Phenomenex公司)。在分析前，将mvsFlt缀合物通过0.45μm过 滤器无菌过滤并且以0.2-0.5mg/mL之间的HyA浓度注射200μL。使 用SEC-MALS确定HyA-EMCH和sFlt的dn/dc值分别是0.1447和 0.185。用于HyA-EMCH和sFlt的UV消光系数也根据SEC-MALS 确定，并且分别是0.022和0.894。数据分析使用Astra软件(Wyatt Technologies)进行。
mvsFlt的SDS-PAGE分析
使用5X SDS染料负载缓冲液、2-巯基乙醇制备样品，并且在95℃ 下煮沸5分钟。使预制的Mini-Protean TGX 4-20％梯度凝胶(Bio-Rad Laboratories)在110伏下运行90分钟。然后将凝胶用Bio-Safe考马斯 染剂(Bio-Rad Laboratories)染色2小时，并且然后使用BioRad分子成 像仪ChemiDoc XRS+进行成像。使用ImageJ分析堆叠和梯度凝胶中 的蛋白质强度，以确定缀合反应后缀合的蛋白质相对于没有从溶液透 析出来的游离未缀合蛋白质的量。
mvsFlt的DLS大小表征
使用Brookhaven测角仪和激光散射***(BI-200SM，Brookhaven Instruments公司)确定mvsFlt生物缀合物的流体动力学直径。将每个 样品在0.45μm下过滤并加载到150μL比色杯(BI-SVC，Brookhaven) 中。使用637nm激光器在90度下执行数据采集，持续2分钟。使用 BI-9000AT信号处理器，用BIC动态光散射软件(Brookhaven)进行数 据分析。使用非负最小二乘法(NNLS)分析方法获得强度平均粒度。
结合竞争ELISA
使用VEGF165 Quantikine夹心ELISA(R&D***)分析mvsFlt缀 合物以检查HyA缀合对于sFlt抑制VEGF165的影响。根据制造商的 说明书进行测定。简而言之，将VEGF165添加到具有不同浓度的sFlt 或mvsFlt的PBS中。使用辣根过氧化物酶缀合的检测抗体检测结合到平板表面上的捕获抗体的游离VEGF165，并使用分光光度计在450 nm下定量。
HUVEC内皮细胞存活测定
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自ATCC，并在37℃和5％CO2下，在湿润培养箱中在EBM-2培养基(Lonza)中培养。为了检查HyA 缀合对于sFlt结合VEGF165并抑制VEGF165体外活性的能力的影响， 使用在VEGF165和mvsFlt缀合物存在下生长的HUVEC进行存活测 定。在M199培养基中将HUVEC以10,000个细胞/孔添加到用0.2％ 明胶涂布的96孔板。在sFlt或mvsFlt存在下，使细胞在2％FBS和 20ng/mL VEGF165(R&D Systems)中生长。平板接种后72小时，吸出 培养基，并且用PBS洗涤细胞，然后冷冻以使用CyQuant(Life Technologies)进行分析。通过使用荧光计(Molecular Devices)在480nm 激发和520nm发射下读取荧光来确定每孔的总细胞数。
HUVEC管形成测定
HUVEC管形成测定在用80μL基质胶(Corning，NY)涂布并在 37℃下孵育1小时以允许发生凝胶化的96孔板中进行。将HUVEC 进行胰蛋白酶消化并且再悬浮于具有2％FBS和20ng/mL VEGF165的M199中并用mvsFlt LCR缀合物处理。在平板接种后18小时对孔 进行成像，并且使用ImageJ软件对管形成进行定量。
HUVEC迁移测定
将12孔板的孔用0.2％明胶涂布。将HUVEC以150,000个细胞/ 孔添加在EBM-2中并且使其附着并扩展过夜。使用1mL移液管尖端， 将十字划痕到HUVEC的汇合层中。然后将孔用过量PBS洗涤以去 除细胞碎片和培养基，并且用含有VEGF165和mvsFlt的培养基替换。 在划痕后0和24小时对划痕进行成像，并且使用ImageJ和T-scratch 软件(CSE Laboratorysoftware，ETH Zurich)对不含细胞的区域进行定 量。通过比较在24小时的开放划痕面积和在0小时的开放划痕面积 来计算开放伤口面积百分比。
mvsFlt在交联HyA凝胶中的保留
为了模制玻璃体的化学和网络结构，合成丙烯酸化HyA(AcHyA) 水凝胶，如先前所述[20，21]。简而言之，将己二酸二酰肼(ADH，Sigma Aldrich)以30摩尔过量添加到在去离子水(DI)中的HyA。将EDC(3 mmol)和HOBt(3mmol)溶于DMSO/水中并添加到HyA溶液。使溶液反应24小时，并且然后用DI水彻底透析。使HyA-ADH在100％乙 醇中沉淀并与丙烯酰氧基琥珀酰亚胺反应以在HyA上生成丙烯酸酯 基团。将得到的AcHyA彻底透析并冻干用于储存。使用H1-NMR确 认在HyA链上存在接枝的丙烯酸酯基团。
为制备1％AcHyA水凝胶，将8mg AcHyA溶于800μL三乙醇 胺缓冲液(TEOA；0.3M，pH8)中。在交联之前，将5μg Alexafluor 488 5-SDP酯(Life Technologies)标记的sFlt、650KDa LCR mvsFlt或牛血 清白蛋白(BSA)以50μL体积添加到AcHyA溶液。将硫醇化5kDa-PEG 交联剂(Laysan Bio公司)溶于100μL TEOA缓冲液中并添加到溶解的 AcHyA。将具有4μm大小孔的细胞培养***物(Millipore公司， Billerica，MN)添加到24孔板的孔，并且向每个***物添加70μL含有 sFlt、mvsFlt或BSA的凝胶。使凝胶在37℃下交联1小时，然后将150μL PBS添加到孔并浸没水凝胶。为了确定释放动力学，采集孔上 清液并且在0、1、2、3、7、10和14天完全替换。用荧光计读取样 品以检测上清液中荧光标记的sFlt、mvsFlt和BSA。
荧光漂白恢复(FRAP)扩散率测量
对含有FITC标记的sFlt和650kDa LCR mvsFlt的1％AcHyA水 凝胶执行FRAP测量。使用具有20X放大率物镜的Zeiss LSM710激 光扫描显微镜(Carl Zeiss，Jena，德国)以及设定在488nm下、具有50％ 功率的氩激光器获取水凝胶的总荧光强度。通过将视场中的100x100-μm点暴露于高强度激光来进行光漂白。在低激光强度(2％) 下通过15个预漂白扫描图像监测所述区域，然后在100％激光功率下 漂白至起始荧光强度的75％。每个样品总共采集约300次小于1秒的 图像扫描。荧光sFlt和mvsFlt分子在水凝胶内的移动分数通过比较 完全恢复后漂白区域中的荧光(F∞)与漂白前(F初始)和刚漂白后(F0)的 荧光来确定。根据等式(1)定义移动分数R：
Figure BDA0003181172780000471
用MMP-7进行的酶促降解
先前已显示基质金属蛋白酶-7(MMP-7)特异性地降解sFlt[22]。 为了确定HyA缀合是否阻止mvsFlt降解，用变化量的MMP-7(EMD Millipore)处理sFlt和mvsFlt。以高(1:1摩尔比的MMP-7:sFlt)、中(1:2) 和低(1:4)摩尔比的MMP-7与sFlt将sFlt和mvsFlt与基质金属蛋白酶 -7(MMP-7)一起在37C下孵育12小时，同时振荡。然后将酶处理的 sFlt和mvsFlt加载到预制的Mini-Protean TGX 4-20％梯度凝胶 (Bio-Rad Laboratories)中并在110伏下运行90分钟。然后根据制造商 的说明书使用银染色试剂盒(Thermo FisherScientific)将凝胶染色。通 过定量用MMP-7处理后凝胶中剩余的蛋白质的总量来评定酶促降解 的程度。将每个孔归一化到其相应的不含MMP-7的孔，并根据凝胶 上各组之间的空白孔减去背景强度。
统计分析
一式三份执行所有定量实验。数值表示为平均值±标准偏差(SD)。 在适当的情况下，在定量测量中，使用Tukey事后分析的单向ANOVA 用于比较处理组，并且使用p<0.05来评定统计学显著性。
结果
此研究的总体目标是合成蛋白质-聚合物生物缀合物以增加抗 VEGF药物在玻璃体内的停留时间用于治疗患有DR的患者。相比于 当前用于治疗DR的具有短半衰期的药物，开发对于VEGF165具有不 受干扰的亲和力和良好的酶稳定性的大的多价蛋白生物缀合物，所述 生物缀合物显示在玻璃体的体外模型中延迟的扩散和移动。
图7A-7D.多价sFlt合成和示意图。A)mvsFlt生物缀合物使用3 步反应合成，其中HyA与EDC和EMCH反应以产生半胱氨酸反应 性HyA-EMCH中间体。然后将sFlt用2-亚氨基四氢噻吩处理并且然 后与HyA-EMCH中间体反应用以合成最终产物。B)蛋白与HyA缀合 和随后与VEGF165结合的示意图。比率a:b表示与HyA单链(b)共价 结合的sFlt分子(a)的化合价。C)通过使10个sFlt分子与1个HyA链 反应合成的低缀合比(LCR)mvsFlt缀合物的示意图。此反应具有如通 过SEC-MALS确定的61％缀合效率(参见表1)。D)通过使30个sFlt 分子与1个HyA链(与(C)中HyA分子量相同)反应合成的高缀合比 (HCR)mvsFlt缀合物的示意图。此反应具有如通过SEC-MALS确定 的52％缀合效率(参见表1)。
根据图7A-7D所示的示意图进行mvsFlt缀合物的合成。在低 (LCR，图7C)和高(HCR，图7D)缀合比下产生mvsFlt以确定某种化 合价是否对VEGF结合提供增强作用。sFlt以若干种不同分子量的 HyA和化合价成功地与HyA缀合，其显著大于呈其未缀合形式的sFlt (图8A-8D)。如表1和图8A所示，使用SEC-MALS来表征缀合物的 蛋白质和聚合物组分的分子量。具有10:1的sFlt与HyA进料比(称为 低缀合比，LCR)的缀合物的缀合效率平均为61.2±12.5％，而具有30:1 的sFlt与HyA进料比(称为高缀合比，HCR)的缀合物具有平均51.8±4.1％的缀合效率。未结合的sFlt的SDS-PAGE显示在预测的 50kDa下的蛋白质条带。相反，mvsFlt生物缀合物仅迁移到凝胶的堆 叠部分中，这指示由于共价连接到大得多的多价缀合物而抑制移动 (图8B)。使用ImageJ的凝胶分析指示mvsFlt生物缀合物中平均 76.4±6.7％的sFlt共价结合，而其余检测到的sFlt可能与溶液中的透 明质酸链非特异性地相互作用，并且因此不能通过透析去除(图8C)。
表1：所有mvsFlt缀合物的SEC-MALS分析。
Figure BDA0003181172780000481
Figure BDA0003181172780000491
a数均分子量，以g/mol给出。
b重均分子量，以g/mol给出
c多分散指数，作为Mw/Mn给出
dsFlt与HyA的最终化学计量比，通过总附着蛋白质Mw除以
sFlt MW(50kDa)来计算
*LCR是低缀合比缀合物(10:1sFlt/HyA链进料比)
+HCR是高缀合比缀合物/(30:1sFlt/HyA链进料比)
所有mvsFlt缀合物也通过DLS表征以确定溶液中缀合物的流体 动力学直径，因为药物大小是决定其通过生物水凝胶(诸如玻璃体)的 移动的关键因素。未缀合的sFlt具有22.6nm±3.1nm的直径，而用分 子量为300kDa、650kDa和1MDa的HyA制备的mvsFlt缀合物分别具有123.9±23.1nm、236.3±38.7nm和223±13.9nm的直径(图8D)。 mvsFlt缀合物的大小取决于300和650kDa缀合物的HyA分子量； 然而，650kDa与1MDa缀合物之间没有显著差异(图8D)。有趣地是， 分子量为300和650kDa的HCR缀合物具有比其相应的LCR缀合物 更低的直径，这可能是由于带负电的HyA主链上来自sFlt的正电荷 随sFlt附着增加而增加，从而致使缀合物在其周围更紧密地折叠。
图8A-8D.表征mvsFlt缀合效率和大小。A)描绘650kDa LCR和 HCR生物缀合物的累积重量分数相对于摩尔质量的SEC-MALS色谱 图。点线、虚线和实线分别表示所有共价连接的sFlt蛋白质的总摩尔 质量、HyA摩尔质量和总生物缀合物摩尔质量(均作为g/mol给出)。B)sFlt和mvsFlt的4-20％SDS-page梯度凝胶。堆叠凝胶中的蛋白质 条带指示蛋白质与HyA成功缀合。凝胶内的蛋白质条带表示未缀合 结合，但在透析后保留在溶液中的蛋白质的比例。C)SDS-PAGE凝 胶的定量蛋白质条带强度。结合的sFlt百分比通过将堆叠凝胶中的蛋白质强度除以相应孔内的总蛋白质强度来确定。游离sFlt通过将分离 凝胶内的蛋白质强度除以相应孔内的总蛋白质强度来确定。D)缀合物 的动态光散射分析。sFlt显著小于所有mvsFlt生物缀合物(***p<0.001)。 在300和650kDa mvsFlt生物缀合物的情况下，LCRmvsFlt显著大于 其相应的HCR缀合物(**p<0.01)。数值作为±SD给出。
图9A-9B.所有mvsFlt生物缀合物在VEGF165 ELISA和VEGF165依赖性HUVEC存活测定中维持其抑制VEGF165依赖性活性的能力。 A)通过mvsFlt生物缀合物进行的对结合到捕获抗体的VEGF165的剂 量依赖性抑制。抑制与sFlt是否与HyA结合或游离于溶液中无关。 任何组之间没有显著差异(表2)。B)在VEGF165存在下，用不同分子 量和蛋白化合价的mvsFlt对HUVEC存活的剂量依赖性抑制。抑制 与sFlt是否与HyA结合或游离于溶液中无关(表2)。数值作为平均值 ±SD给出。
表2：来自检查mvsFlt抑制VEGF165的ELISA和HUVEC存活 测定的IC50值
ELISA(ng/mL) HUVEC存活(ng/mL)
未缀合的sFlt 3.8±2.4 39.3±4.4
300kDa LCR 4.5±1.5 46.9±9.9
300kDa HCR 4.7±1.7 44.4±2.6
650kDa LCR 3.9±2.6 41.7±6.7
650kDa HCR 2.0±0.1 43.2±13.6
1MDa LCR 2.2±0.1 44.9±10.7
1MDa HCR 3.3±1.6 45.4±2.2
采用若干不同的测定来确定sFlt与HyA的缀合是否影响sFlt亲 和性VEGF165并改变VEGF165依赖性细胞功能。使用VEGF165特异性ELISA，观察剂量依赖性响应；所述响应指示sFlt与HyA的缀合不 改变mvsFlt结合VEGF165的能力(图9A)。ELISA结果指示sFlt的IC50值为3.8±2.4ng/mL，并且各种mvsFlt缀合物的IC50值平均为3.4±1.1 ng/mL(表2)。
图10A-10E.mvsFlt抑制HUVEC管形成。A)当用1μg/mL的所 有LCR mvsFlt生物缀合物处理时，在基质胶(BD Biosciences)上抑制 的HUVEC管形成的代表性图像。将细胞以20,000个细胞/孔接种在 96孔板的100μL基质胶上，并在18小时处成像。比例尺＝500μm。 B-E)每孔的总管数(B)，平均管长度(C)，节点总数(分支点，D)和每孔 总管长度(E)的定量(***p<0.001)。
在使用HUVEC的存活测定中，mvsFlt表现出存活的剂量依赖性 下降，并且与ELISA结果相似，所述影响与HyA的缀合无关(图9B， 表2)。这些结果指示sFlt与HyA的共价缀合不降低sFlt结合VEGF 的能力。这是非常有前景的，这是因为以下事实：其他缀合技术(诸 如聚乙二醇化)先前已报道缀合显著降低蛋白质生物活性[23,24]。
对于随后的研究，仅研究不同分子量的LCR缀合物，因为当在 ELISA和存活测定中检查体外VEGF165抑制活性时，所有缀合物表现 同样好。体外管形成和迁移测定能够检查体外mvsFlt缀合物对体内 血管生成所涉及的两个另外的过程(组织化形成管和细胞迁移)的影 响。与存活数据相似，在其中添加sFlt和mvsFlt等同地抑制组织化 形成管(图10A-10E)和伤口闭合(图11A-11B)的这两个测定中，sFlt 和mvsFlt具有相似的VEGF165抑制曲线。总之，ELISA和体外血管 生成测定指示sFlt与HyA的缀合不影响sFlt结合VEGF165的能力， 并且所有mvsFlt缀合物维持其抑制由VEGF165信号传导介导的内皮 细胞功能的能力。
图11A-11B.mvsFlt抑制VEGF165驱动的HUVEC迁移。用变化 分子量的LCR mvsFlt生物缀合物进行的HUVEC迁移的抑制的代表 性图像。在划痕之前允许HUVEC在12孔板中生长至汇合并且在200 ng/mL mvsFlt存在下用20ng/mL VEGF165处理。接种前用CellTrackerGreen(Life Technologies)对细胞进行染色。比例尺＝20μm。B)用LCR mvsFlt处理后定量的HUVEC迁移，其显示通过比较在24小时处的 开放伤口面积与在时间0处的开放伤口面积计算的开放伤口面积百 分比(***p<0.001)。
交联的HyA凝胶[20,21]用于检查sFlt与HyA的扩散缀合如何影 响扩散。选择这种水凝胶作为研究主要基于与高HyA含量相关的玻 璃体具有组成相似性的体外玻璃体的模型***。HyA水凝胶的硬度 (图14A)高于检查牛和猪玻璃体硬度的已发表的报告[25]，这表明使 用此模型对从玻璃体清除药物的预测可能不足以估计实际的体内速 率。然而，鉴于所述模型与玻璃体具有组成相似性，预计sFlt和mvsFlt 通过这些凝胶的扩散将有助于预测与HyA缀合的益处。使用若干种 不同的模型来表征HyA水凝胶的网格大小(表3)。使用40kDa和2 MDa荧光标记的葡聚糖(Life Technologies)分析大小依赖性扩散的初 步实验来确认此水凝胶***适用于检查分子量和大小依赖性扩散(图 14B)。使用此***，分析sFlt和所有LCR mvsFlt生物缀合物从HyA 凝胶释放的动力学。预期mvsFlt生物缀合物的主要作用是移动的大 小依赖性降低。仅分析变化大小的缀合物，同时保持化合价恒定。14 天后，仅30.8±1.9％的sFlt保留在凝胶中，相比之下300kDa、650kDa 和1MDa LCR缀合物分别是38.3％±2.2％、63.8±0.5％和62.8％±0.4％ (图12A)。相比之下，24小时后BSA100％释放，这种差异更可能是 由于等电点显著不同(BSA是5.4[26]，并且sFlt是9.5[27])，并且对 于HyA的蛋白亲和力非常低而不是因为蛋白大小，因为BSA和sFlt 具有相似的分子量。
表3：基于膨胀和流变学数据的
Figure BDA0003181172780000521
和网格大小计算。
Figure BDA0003181172780000522
Figure BDA0003181172780000531
Figure BDA0003181172780000532
交联之间的分子量
+ξ-根据[31]计算的1％HyA凝胶的网格大小
Figure BDA0003181172780000533
由质量膨胀数据计算
Figure BDA0003181172780000534
由流变学数据计算
图12A-12C.sFlt与HyA缀合降低mvsFlt在HyA凝胶中的移动 和扩散。A)在第1天后，包封在1％HyA水凝胶中的Alexafluor 488- 标记的LCR mvsFlt生物缀合物650kDa和1MDa比未缀合的sFlt和 300kDa mvsFlt显著更慢地扩散出来(*p＜0.05)并且持续到第14天的最 后时间点(***p＜0.001)。B)对应于FITC标记的650kDa LCR mvsFlt的 FRAP实验的代表性共焦图像。F初始描绘漂白前凝胶中的mvsFlt。F0是在75％光漂白后立即进行的荧光测量；F∞对应于实验结束时荧光的 最大恢复。C)光漂白后FITC标记的sFlt和650kDa LCRmvsFlt的归 一化荧光恢复[f(t)]。
图14A-14B.表征HyA水凝胶。(A)1％HyA水凝胶的流变学特性。 (B)7天后，包封在HyA水凝胶中的荧光标记的40kDa葡聚糖比2 MDa葡聚糖显著更快地扩散出来(***p＜0.001)。
为了评定通过凝胶的扩散是否是Fickian扩散，使用等式(2)拟合 图12A中的曲线，如Ritger等人所述[32]：
Figure BDA0003181172780000535
扩散指数n指示扩散是否是Fickian扩散，并且如果n等于0.5， 则传输是Fickian式。BSA、sFlt和mvsFlt释放的n值被确定是0.3-0.4 (图15A-15E)，这指示通过凝胶的扩散不是Fickian扩散。由于蛋白质 的大小非常小，并且由于电荷排斥而与HyA水凝胶的亲和力非常低， BSA通过快速爆发释放从凝胶中耗尽，从而导致非Fickian扩散。相 比之下，部分地由于与HyA水凝胶的离子亲和力和大小，sFlt和 mvsFlt缀合物释放较慢。尽管sFlt和BSA的大小相似(分别是50kDa 和66kDa)，但是sFlt与基质具有强得多的离子相互作用，这减慢其 从凝胶的扩散，由于此强亲和力，也引起非Fickian扩散。300kDa mvsFlt缀合物的大小相对于估计的水凝胶ξ(表3)足够小(＜150nm， 参见图8D)而与sFlt一样快地释放。两种最大的缀合物的直径接近网 格大小(＞225nm)并且由于大小而显著阻碍其释放，从而引起遵循蠕 动扩散机制的凝胶释放[33]。
基于来自sFlt释放研究的数据，使用FRAP仅研究650kDa LCR 生物缀合物，因为与未缀合的sFlt相比，此缀合物表现出凝胶保留的 最大差异。sFlt在凝胶中的移动分数是73.8±4.4％，而mvsFlt在凝胶 内的移动分数是48.3±3.0％，这指示mvsFlt生物缀合物的显著部分足 够大而在凝胶内变得不可移动，这是由于mvsFlt与HyA凝胶的网格 大小之间的直径相似性。图12C中的实验数据根据Soumpasis[34]进 行拟合以获得特征性扩散时间。有趣地是，mvsFlt的特征性扩散时间 (94.8±19.5s)比sFlt(176±18.1s)显著更快。此差异可能是由于带正电 荷的sFlt被多价缀合物内带负电荷的透明质酸离子屏蔽，这降低缀合 物对于凝胶的总体亲和力，从而允许更快的扩散。相比之下，未缀合 的sFlt保持高度带正电荷，这引起减慢其特征性扩散时间的在HyA 凝胶内的更强的离子亲和力。水凝胶中的mvsFlt还将荧光恢复至显 著较低的程度85.3±0.8％，相比之下，sFlt将荧光恢复至91.6％±2.4％。 尽管mvsFlt缀合物显示出更快的扩散，但小得多的百分比的mvsFlt 生物缀合物实际上是可移动的，并且大小显著地限制总荧光恢复，结 果也由图12A中的凝胶释放数据支持。明显的是，尽管mvsFlt可扩 散得更快，如由图12B、12C中的FRAP所示，但是由于大小的原因， 此样品的小得多的部分能够移动，并且因此其随着时间释放少得多， 如由图12A中的凝胶释放数据所证明。总之，预计大小的影响是mvsFlt体内停留时间的最强决定因素。
图13A-13B.与HyA缀合降低通过MMP-7进行的蛋白酶降解的 易发性。A)在MMP-7与sFlt的高、中和低摩尔比(其对应于MMP-7 与sFlt的1:1、1:2和1:4摩尔比)下，用MMP-7处理12小时后，sFlt 和mvsFlt(650kDa LCR)的4-20％SDS-page梯度凝胶。将条带强度归 一化到每组内不用MMP-7的处理，并且使用空白孔从每个样品中减 去背景。B)在sFlt与MMP-7的高、中和低摩尔比下，用MMP-7处 理12小时的sFlt和mvsFlt的4-20％梯度凝胶的定量(*p<0.05； **p<0.01)。
图15A-15E.来自凝胶释放数据的数据拟合以检查Fickian扩散。 (A-E)用Ritger等人[13]等式(2)制作的拟合以确定扩散指数n和大分子 网络***和药物的特征常数k的图。
使用MMP-7研究sFlt与HyA缀合对蛋白酶降解sFlt蛋白的影响， MMP-7是一种已显示特异性降解sFlt的蛋白酶[22]。发现sFlt与HyA 缀合在MMP-7与sFlt的所有摩尔比下阻止sFlt的降解(图13A)。在 高浓度的蛋白酶(MMP-7与sFlt的1:1摩尔比)下，仅6.8±6.6％的sFlt 保持可检测到，相比之下mvsFlt为34.8±1.8％(图13B)。将MMP-7 与sFlt的比率从1:1降至1:4仍然引起sFlt的显著降解以及对缀合形 式的降解屏蔽，其中可检测的sFlt增至34±2.7％，相比之下可检测的 mvsFlt为74.8±4.9％(图3B)。据信对HyA的屏蔽作用提供维持mvsFlt 体内稳定性和生物利用度，这有助于mvsFlt生物缀合物的延长的抗 血管生成作用。
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[50]U.Laurent,P.
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K.Granath,K.Lilja-Englind,D. Ytterberg,Molecular weight and concentration of hyaluronan in vitreous humour fromdiabetic patients,Acta Ophthalmol.68(1990)109–112. doi:10.1111/j.1755-3768.1990.tb01972.x。
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实施例3：具有抗VEGF VHH或具有单链可变片段(scFv)抗 VEGF(抗VEGF scFv)的多价缀合物的生成
生成由两种不同抗VEGF抗体形式制备的两种多价缀合物：单链 可变片段(scFv)抗VEGF抗体和单结构域骆驼(VHH)抗VEGF抗体。
图20A-20C：使用ELISA测定将每种抗体缀合物结合人500pg VEGF-A165的能力与对应的未缀合抗体进行比较。两种多价缀合物均 用860kDa透明质酸(HyA)制备。scFv抗VEGF抗体和VHH抗VEGF 抗体的化合价分别是31和28。数据使用四参数逻辑曲线拟合并用于 计算每种处理的IC50。图20A示出未缀合的scFv抗VEGF抗体和缀 合的多价scFv抗VEGF抗体的未结合VEGF的百分比。图20B示出 未缀合的VHH抗VEGF抗体和缀合的多价VHH抗VEGF抗体的未 结合VEGF的百分比。图20C示出与图20A-20B的未缀合的抗体相 比图20A-20B的缀合抗体的IC50值。如图20C中总结，与未缀合抗 体相比，多价缀合对缀合物的IC50值没有实质影响。
实施例4：用HyA制备的抗VEGF VHH多价(mv抗VEGF)缀合 物显示增加的体外和体内半衰期
通过荧光标记蛋白质并将它们截留在由可商购获得的组分 (BioTime)制备的1％HyA-PEG水凝胶内，比较未缀合的抗VEGF抗 体VHH和多价抗VEGF抗体VHH(28VHH/860kDaHyA)的扩散速 率。估计交联之间的膨胀比和平均分子量。估计水凝胶的平均网格直 径为大约80nm。
图21：每2-3天测量从水凝胶释放的未缀合蛋白质和蛋白质缀合 物的浓度，并且将数据拟合成指数衰减曲线以估计其扩散半衰期。 VHH抗VEGF抗体缀合物的半衰期比未缀合的VHH抗VEGF抗体 的半衰期长大约4倍。图21中示出的结果是三次独立重复实验的平 均值。
注射到大鼠眼睛中后，比较未缀合的VHH抗VEGF抗体和多价 VHH抗VEGF抗体缀合物的体内停留时间。在此实验中，所有VHH 抗VEGF抗体被荧光标记为用于浓度测量的报道子，并且使用4个独 立批次的mv抗VEGF(860kDa MW HyA并且化合价在24-45范围 内)。在每只眼睛中，注射5μL 275μg/mL的VHH抗VEGF抗体或多 价VHH抗VEGF抗体缀合物溶液。每只眼睛接受总计1.375μg未缀 合或以任何化合价缀合的VHH抗VEGF抗体。在注射后0.5、4、22 和45小时，将大鼠安乐死并且如下将其眼睛摘除：n＝8只眼睛(0.5 小时)，n＝8只眼睛(4小时)，n＝4只眼睛(22小时)，以及n＝2只眼睛 (45小时)。
图22A示出未缀合的VHH和多价VHH抗VEGF抗体缀合物的 回收的蛋白质百分比。图22B示出未缀合的VHH抗VEGF抗体和缀 合的多价VHH抗VEGF抗体的半衰期。结果显示缀合的多价VHH 抗VEGF抗体具有21.9小时的体内半衰期，相比之下，未缀合的VHH 抗VEGF抗体具有1.9小时的体内半衰期。
实施例5：用羧甲基纤维素制备的VHH抗VEGF抗体多价缀合 物的生成
图23A-23B示出由单结构域骆驼(VHH)抗体的～17个重复序列和 羧甲基纤维素(CMC，～700 kDa)制备的多价缀合物的生成。使用如图 23A所示的ELISA测定，将此抗VEGF抗体(抗VEGF VHH-CMC) 缀合物结合人500 pg VEGF-A165的能力与对应的未缀合的VHH抗VEGF抗体进行比较。如图23B所示，数据使用四参数对数曲线拟合 并用于计算每种处理的IC50。
虽然本发明已经参考其特定实施方案进行描述，但是本领域技术 人员应理解，可进行各种改变并且可进行等同物替换而不脱离本发明 的真实精神和范围。另外，为了使特定情况、材料、物质组成、方法、 一个或多个方法步骤适应本发明的目的、精神和范围，可进行许多修 改。所有此类修改意图处于所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 加利福利亚大学董事会
<120> 治疗眼部疾病或病症的方法
<130> BERK-318WO
<150> US 62/265,293
<151> 2015-12-09
<160> 8
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 755
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His
1 5 10 15
Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala
20 25 30
Ala His Lys Trp Ser Leu Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg
35 40 45
Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys
50 55 60
Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr
65 70 75 80
Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu
85 90 95
Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu
100 105 110
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
115 120 125
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
130 135 140
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
145 150 155 160
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
165 170 175
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
180 185 190
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln
195 200 205
Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val
210 215 220
Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr
225 230 235 240
Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg
245 250 255
Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr
260 265 270
Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val
275 280 285
Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr
290 295 300
Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu
305 310 315 320
Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala
325 330 335
Phe Pro Ser Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr
340 345 350
Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys
355 360 365
Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile
370 375 380
Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn
385 390 395 400
Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro
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Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr
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Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His
435 440 445
Asn His Ser Glu Ala Arg Cys Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser
450 455 460
Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile
465 470 475 480
Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr
485 490 495
Leu Val Val Ala Asp Ser Arg Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala
500 505 510
Ser Asn Lys Val Gly Thr Val Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr
515 520 525
Asp Val Pro Asn Gly Phe His Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu
530 535 540
Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg
545 550 555 560
Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His
565 570 575
Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile
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Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr
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Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln
610 615 620
Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg
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Cys His Ala Asn Gly Val Pro Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn
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Asn His Lys Ile Gln Gln Glu Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser
675 680 685
Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr
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His Cys Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr
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Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr
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<212> PRT
<213> 智人
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Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His
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Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala
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Ala His Lys Trp Ser Leu Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg
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Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys
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Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu
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Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu
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Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
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Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
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Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
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Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val
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Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val
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Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile
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<211> 187
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro
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Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro
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Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met
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Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro
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Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile
180 185
<210> 4
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr
35 40 45
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Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val
100 105 110
Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile
115 120 125
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
130 135 140
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
145 150 155 160
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
165 170 175
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
195 200 205
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
210 215 220
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val
225 230 235 240
Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys
260 265 270
Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His
275 280 285
Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys
290 295 300
Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys
305 310 315 320
Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val
325 330 335
Lys His Cys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His
340 345 350
<210> 5
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Met Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser
145 150 155 160
Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr
180 185 190
Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp
225 230 235 240
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Pro Ser Thr
245 250 255
Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Gly Gly Cys Asp Asp Asp
260 265 270
Asp Lys His His His His His His
275 280
<210> 6
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Ser Asn Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
20 25 30
Ser Ser Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Phe Val Val Ala Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asp Ala Val
50 55 60
Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ser Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ala
100 105 110
Asp Thr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Gly Gly
130 135 140
Cys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His
145 150 155
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
His His His His His His
1 5

Claims (17)

1.一种治疗个体的眼部疾病或病症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的缀合物，所述缀合物包含：
a)具有约5kDa至约2000kDa的分子量的生物活性多肽；以及
b)具有至少约50,000道尔顿的分子量的生物相容性聚合物，
其中所述多肽直接或通过接头共价连接至所述聚合物，并且其中所述生物活性多肽与所述聚合物的摩尔比是至少约10:1，
其中所述施用是通过玻璃体内施用进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物活性多肽是：i)受体；ii)受体的配体；iii)抗体；或iv)酶。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物是包含多个选自以下的亚基的线性聚合物：透明质酸、丙烯酸、乙二醇、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、***糖、牛磺酸、甜菜碱、改性纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、改性淀粉、疏水改性淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、直链淀粉、支链淀粉、氧化淀粉、heprosan、肝素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸肝素及其共聚物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物是线性聚(丙烯酸)或羧甲基纤维素。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物是透明质酸。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述生物活性多肽与所述聚合物的摩尔比是约10:1至约25:1。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述生物活性多肽与所述聚合物的摩尔比是约25:1至约50:1。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述生物活性多肽是血管生成抑制剂。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述生物活性多肽是可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体、血管抑素、内皮抑素、血管形成抑制素或VEGF特异性抗体。
10.如权利要求1所述的方法，其中：a)所述生物活性多肽是可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体，并且所述聚合物是透明质酸；b)所述生物活性多肽是VEGF特异性抗体，并且所述聚合物是羧甲基纤维素；或者c)所述生物活性多肽是VEGF特异性抗体，并且所述聚合物是透明质酸。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述透明质酸具有约600kDa至约700kDa，或约750kDa至约1MDa的分子量。
12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述VEGF受体与所述透明质酸的摩尔比是约20:1。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述缀合物的所述玻璃体半衰期是至少7天。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述眼部病症是黄斑变性、脉络膜新血管形成、视网膜新血管形成、增生性玻璃体视网膜病变、青光眼或眼部炎症。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述缀合物每两个月施用一次、每三个月施用一次、每6个月施用一次或每年施用一次。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述缀合物的所述玻璃体半衰期比未缀合到所述生物相容性聚合物的所述生物活性多肽的所述半衰期大至少5倍。
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