CN113533267A - 一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用 - Google Patents

一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用 Download PDF

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顾辰辉
林贤丰
范顺武
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Hangzhou Yuanbao Biotechnology Co.,Ltd.
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Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of School of Medicine Zhejiang University
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Abstract

本发明一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用。本发明通过将FITC通过化学修饰或物理吸附方式结合于待测表面，并设立标准pH对照，可通过荧光强度比率测定待测表面pH，该方法可用于测定细胞微环境pH，从而对细胞微环境特征进行定量分析。采用FITC作为荧光探针，获取简单，成本低；且本发明可对特定细胞微环境pH进行测定，实现对细胞微环境的定量分析。

Description

一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭 区中的应用
技术领域
本发明属于生物技术方法领域，具体涉及一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用。
背景技术
FITC(异硫氰酸荧光素)是一种被广泛使用的荧光素，在生物技术领域，常用于对二抗的荧光标记，从而实现对蛋白的示踪，其主要原理是利用FITC上的N＝C＝S基团和蛋白质上游离的-NH2发生化学反应，而后在特定波长光源的激发下即可观测到荧光信号。
pH测定试剂已经得到了十分广泛的研发和应用，其主要方式为利用不同pH标准品建立pH测定试剂在荧光、吸光度、特定反应等方面的标准曲线，并测定待测物在该指标的数值，通过标准曲线确定待测物pH。
细胞微环境是影响细胞生长分化的重要因素，其中pH在细胞调控中十分重要，对于细胞微环境的pH目前已有有种估计方法，但目前尚缺乏一种精确的测定方法。
目前对FITC的应用主要限于荧光示踪，而pH测定试剂的制备均存在操作门槛及流程复杂性。申请号为CN201310685086.1的专利公布了一种使用荧光染料FITC与MITO鉴定混合***的方法，使用FITC标记***，从而实现示踪效果，其应用仅限于FITC的荧光属性，未探讨从不同环境因素影响FITC荧光从而实现新应用。申请号为CN201510880704.7的专利公开了一种光开关型测定溶液pH的探针方法，自行合成了一种用于pH测定的荧光探针，但合成步骤复杂，应用范围小。诸如此类的专利均未实现FITC性质的充分利用和对于细胞微环境的pH测定。因此需要一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，利用简单的FITC即可实现对细胞微环境pH的定量分析。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出了一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法及其在破骨细胞封闭区中的应用。通过将FITC结合于待测表面，通过荧光强度比率测定待测表面pH，该方法可用于测定细胞微环境pH，从而对细胞微环境特征进行定量分析。
一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，该方法具体为：通过将FITC通过化学修饰或物理吸附方式结合于待测表面，所述化学修饰为FITC的N＝C＝S基团和待测表面氨基的共价键形成，所述物理吸附方式为通过电荷作用实现FITC在待测表面的结合，并设立标准pH对照，通过荧光强度比率测定待测表面特定区域pH。
作为优选，所述标准pH对照选择pH已知的缓冲液。
作为优选，所述荧光强度测定方式为通过荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜测定。
作为优选，所述标准pH对照采用pH已知的PBS缓冲液。
本发明相比现有pH测定方式，本发明显著的进步在于：
1)采用FITC作为荧光探针，获取简单，成本低。
2)可对特定细胞微环境pH进行测定，实现对细胞微环境的定量分析。
因此，基于FITC的细胞微环境pH测定方法十分简便易行，并且获得pH数值准确，具有显著原创性。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供以下附图进行说明：
图1FITC溶液在不同pH下的荧光比较。
图2FITC荧光强度与pH的标准曲线。
图3pH引起FITC荧光改变的组织学验证。
图4破骨细胞封闭区FITC的荧光3D重建。
图5破骨细胞封闭区与标准pH下FITC的荧光强度计算。
图6破骨细胞封闭区的pH计算。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明中的基于FITC的细胞微环境pH测定方法的优选方案为将FITC通过共价键与骨表面氨基连接，通过与标准pH的荧光强度比率测定破骨细胞封闭区pH。具体步骤如实施例1。
本发明还可以使用其他上述结合方式、其他上述pH标准品、其他上述荧光测定方式，均可获得相同的技术效果。
实施例1、FITC共价交联骨片以PBS为pH标准使用共聚焦荧光显微镜测定荧光强度。
步骤一：将0.1M的FITC溶液与骨片在37摄氏度共孵育1h；
步骤二：采用PH为7.4的PBS缓冲液清洗骨片三次；
步骤三：将BMDM细胞按10000每孔接种于骨片，加入M-CSF和RANKL诱导；
步骤四：5天后破骨细胞形成，固定细胞并对细胞进行细胞核和骨架染色；
步骤五：弃上清，加入PH为7.4的PBS缓冲液；
步骤六：使用共聚焦荧光显微镜分别测量破骨细胞封闭区与无细胞区域骨片荧光强度；
步骤七：根据标准曲线计算破骨细胞封闭区pH。
实施例2、FITC共价交联骨片以NaCl为pH标准使用共聚焦荧光显微镜测定荧光强度。
步骤一：将0.1M的FITC溶液与骨片在37摄氏度共孵育1h；
步骤二：采用PH为7.4的PBS缓冲液清洗骨片三次；
步骤三：将BMDM细胞按10000每孔接种于骨片，加入M-CSF和RANKL诱导；
步骤四：5天后破骨细胞形成，固定细胞并对细胞进行细胞核和骨架染色；
步骤五：弃上清，加入生理盐水；
步骤六：使用共聚焦荧光显微镜分别测量破骨细胞封闭区与无细胞区域骨片荧光强度；
步骤七：根据标准曲线计算破骨细胞封闭区pH。
实施例3、FITC物理吸附细胞爬片以PBS为pH标准使用普通荧光显微镜测定荧光强度。
步骤一：将0.1M的FITC溶液与细胞爬片在37摄氏度共孵育1h；
步骤二：弃去上清，加入培养基；
步骤三：将BMDM细胞按10000每孔接种于爬片，加入M-CSF和RANKL诱导；
步骤四：5天后破骨细胞形成，固定细胞并对细胞进行细胞核和骨架染色；
步骤五：弃上清，加入PH为7.4的PBS缓冲液；
步骤六：使用荧光显微镜分别测量破骨细胞封闭区与无细胞区域骨片荧光强度；
步骤七：根据标准曲线计算破骨细胞封闭区pH。
实施例1中FITC溶液在不同pH下的荧光比较。
1、将0.1M的FITC分别加入pH为4-10的比色皿溶液中
2、使用488nm激光激发，拍摄不同pH下的FITC荧光强度，如图1。
实施例1FITC荧光强度与pH的标准曲线。
1、将0.1M的FITC分别加入pH为4-10的96孔板溶液中
2、使用488nm激光激发，实用多功能酶标仪测定不同pH下的FITC荧光强度，并绘制标准曲线，如图2。
实施例1中pH引起FITC荧光改变的组织学验证。
1、使用荧光显微镜观察破骨细胞及pH标准区域，显示破骨细胞封闭区使FITC荧光大幅度下降。如图3。
2、拍摄荧光图片，并进行分组多样本分析。
实施例1中破骨细胞封闭区FITC的荧光3D重建。
1、使用荧光显微镜观察破骨细胞及pH标准区域，进行3D重建。
2、绘制不同区域的荧光强度曲线，显示破骨细胞封闭区FITC荧光与其他通道分离。如图4。
实施例1中破骨细胞封闭区与标准pH下FITC的荧光强度计算。
1、分别拍摄破骨细胞封闭区与pH标准区的3D重建。
2、计算破骨细胞封闭区与pH标准区荧光强度分数。如图5。
实施例1中破骨细胞封闭区的pH计算。
1、将pH标准区荧光强度分数带入标准曲线，得出荧光强度。
2、将破骨细胞封闭区与pH标准区荧光强度比值带入，得到破骨细胞封闭区pH。如图6。
对实施例2、3所得的基于FITC的细胞微环境pH测定方法分别进行FITC溶液在不同pH下的荧光比较、FITC荧光强度与pH的标准曲线、pH引起FITC荧光改变的组织学验证、破骨细胞封闭区FITC的荧光3D重建、破骨细胞封闭区与标准pH下FITC的荧光强度计算、破骨细胞封闭区的pH计算。与实施例1中基于FITC的细胞微环境pH测定方法结果相似，这表明可通过其他上述结合方式、其他上述pH标准品、其他上述荧光测定方式，实现效果类似的间基于FITC的细胞微环境pH测定。
由上述实施例可知，本发明提供的基于FITC的细胞微环境pH测定方法，通过将FITC结合于待测表面，通过荧光强度比率测定待测表面pH，该方法可用于测定细胞微环境pH，从而对细胞微环境特征进行定量分析。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本技术领域的技术人员来应当理解，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围，不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，其特征在于，该方法具体为：通过将FITC通过化学修饰或物理吸附方式结合于待测表面，所述化学修饰为FITC的N＝C＝S基团和待测表面氨基的共价键形成，所述物理吸附方式为通过电荷作用实现FITC在待测表面的结合，并设立标准pH对照，通过荧光强度比率测定待测表面特定区域pH。
2.根据权利要求1所述的一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，其特征在于：所述标准pH对照选择pH已知的缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，其特征在于：所述荧光强度测定方式为通过荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜测定。
4.根据权利要求1所述的一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，其特征在于：
步骤一：将0.1M的FITC溶液与骨片在37摄氏度共孵育1h；
步骤二：采用PH为7.4的PBS缓冲液清洗骨片三次；
步骤三：将BMDM细胞按10000每孔接种于骨片，加入M-CSF和RANKL诱导；
步骤四：5天后破骨细胞形成，固定细胞并对细胞进行细胞核和骨架染色；
步骤五：弃上清，加入PH为7.4的PBS缓冲液；
步骤六：使用共聚焦荧光显微镜分别测量破骨细胞封闭区与无细胞区域骨片荧光强度；
步骤七：根据标准曲线计算破骨细胞封闭区pH。
5.根据权利要求1所述的一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，其特征在于：
步骤一：将0.1M的FITC溶液与骨片在37摄氏度共孵育1h；
步骤二：采用PH为7.4的PBS缓冲液清洗骨片三次；
步骤三：将BMDM细胞按10000每孔接种于骨片，加入M-CSF和RANKL诱导；
步骤四：5天后破骨细胞形成，固定细胞并对细胞进行细胞核和骨架染色；
步骤五：弃上清，加入生理盐水；
步骤六：使用共聚焦荧光显微镜分别测量破骨细胞封闭区与无细胞区域骨片荧光强度；
步骤七：根据标准曲线计算破骨细胞封闭区pH。
6.根据权利要求1所述的一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，其特征在于：
步骤一：将0.1M的FITC溶液与细胞爬片在37摄氏度共孵育1h；
步骤二：弃去上清，加入培养基；
步骤三：将BMDM细胞按10000每孔接种于爬片，加入M-CSF和RANKL诱导；
步骤四：5天后破骨细胞形成，固定细胞并对细胞进行细胞核和骨架染色；
步骤五：弃上清，加入PH为7.4的PBS缓冲液；
步骤六：使用荧光显微镜分别测量破骨细胞封闭区与无细胞区域骨片荧光强度；
步骤七：根据标准曲线计算破骨细胞封闭区pH。
7.根据权利要求2所述的一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法，其特征在于：所述标准pH对照采用pH已知的PBS缓冲液。
8.一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法在破骨细胞封闭区中的应用，其特征在于：一种基于FITC的细胞微环境pH测定方法在破骨细胞封闭区中的应用。
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