CN113528678A

CN113528678A - 用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体***

Info

Publication number: CN113528678A
Application number: CN202111077375.4A
Authority: CN
Inventors: 王永林; 武瑾; 唐晨; 尹康权; 李学武
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2021-09-15
Filing date: 2021-09-15
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-09-15
Also published as: CN113528678B

Abstract

本发明公开了一种用于检测松材线虫的gRNA，包含a)向导序列例如SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。本发明还公开了一种用于检测松材线虫的试剂盒，包含所述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA。本发明还公开了载体***，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码所述gRNA的核苷酸片段。

Description

用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体***

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体***。

背景技术

松材线虫病，即松树萎蔫病是当今世界四大林木病害之一，被称为松树的“癌症”，而引起该病害的病原为松材线虫，在我国属于二级检疫对象。由于松材线虫肉眼不可直接观察，需要依靠专业的设备和人员，区分和鉴定松材线虫对检疫人员来说不仅任务繁重，而且是一个很大的挑战。对松材线虫进行有效识别，对于控制其危害，及时阻断其传播、扩散，起着至关重要的作用。目前，进出境口岸对松材线虫种类鉴定的主要手段是形态学观察、生化检测和分子生物学检测三大类，但是这些检测手段远远不能满足口岸部门对于松材线虫病高效、精准的检出要求。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。尽管现有技术中已有一些利用分子生物学手段对松材线虫进行特异性检测和鉴定，如：特异性引物PCR法、ITS-PCR-RFLP法和实时荧光定量PCR法等，这些方法具有快速、高效、低污染等优点，但是特异性引物PCR法和ITS-PCR-RFLP法需要电泳、染色、成像等多个步骤，而实时荧光定量PCR法所使用的仪器设备投入大，标记探针、试剂成本高，普适性较差，在检疫性鉴定应用方面存在缺陷，不能满足口岸和林间日常检测筛查的需要。

近年来，随着CRISPR基因编辑技术兴起，科学家基于RPA技术开发了以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术（SHERLOCK技术），还开发了以Cas12酶为核心的诊断技术。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

基于此，有必要针对松材线虫的检测问题，提供一种用于检测松材线虫的crRNA、试剂盒及载体***。

本发明的目的之一在于提供一种用于检测松材线虫的gRNA，包含a)向导序列为SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测松材线虫的试剂盒，包含所述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA。

本发明的目的之三在于提供一种载体***，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码所述gRNA的核苷酸片段。

本发明利用CRISPR/Cas技术实现松材线虫核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到2.8´10³ copies/μL，说明本发明方法敏感性较好。

附图说明

图1为本发明一实施例的敏感性检测结果图，其中，N表示阴性对照，Bx表示Bursaphelenchusxylophilus (松材线虫)，Bm表示Bursaphelenchusmucronatus (拟松材线虫)；

图2为本发明一实施例的特异性检测结果图，其中，N1表示阴性对照，N2表示RAA扩增反应阴性，1表示2.8´10⁸copies/μL，2表示2.8´10⁷copies/μL，3表示2.8´10⁶copies/μL，4表示2.8´10⁵copies/μL，5表示2.8´10⁴copies/μL，6表示2.8´10³copies/μL，7表示2.8´10²copies/μL。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

如本文所用，术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH7~pH9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH（参见例如，Mohan，Buffers，Aguide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999）。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液（PBS）、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇（TRIS）缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液（TBS）和TRIS/EDTA（TE）。

如本文所用，术语“扩增(ampIifying或amplification)”在“核酸”此用语的上下文中共同出现时，指产生多个拷贝的多核苷酸、或多核苷酸的部分，通常从少量的多核苷酸开始（例如，少至单个多核苷酸分子），其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶促方法。在聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)或连接酶链反应(LCR)过程中从一个或几个拷贝的靶DNA或模板DNA分子产生多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增不限于起始分子的严格复制。例如，使用逆转录RT -PCR从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子是扩增的形式。此外，在转录过程期间从单一DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的形式。

如本文所用，术语“扩增引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，所述寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下），所述寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的，以用于扩增的最大效率，但可选地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前，首先将引物处理以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长，以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，在一些实施方案中，引物范围为10~100或更多个核苷酸（例如 10~300、15~250、15~200、15~150、15~100、15~90、20~80、20~70、20~60、20~50个核苷酸等）。

在一些实施方案中，引物包含不与目标核酸杂交的另外的序列。术语“引物”包括化学修饰的引物、荧光修饰的引物、功能引物(融合引物）、序列特异性引物、随机引物、具有特异性和随机序列的引物、及DNA和RNA引物。

如本文所用，“靶序列”是靶标核酸中的碱基序列，并且可以指双链靶标的有义链和/或反义链，并且除非上下文另有规定，否则还涵盖与初始靶标核酸的以扩增的拷贝数再生的或复制的延伸产物或扩增产物相同的碱基序列。

如本文所用，术语“gRNA”是指向导RNA，其引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA。

如本文所用，术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR***分类中V-A型(type V-A)的酶。

如本文所用，术语“Cas12b”，“C2c1”可互换使用，是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR***分类中V-B型(type V-B)的酶。

如本文所用，术语“RPA”，全称为重组酶聚合酶扩增，其原理是重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

本发明的第一方面在于提供一种用于检测松材线虫的gRNA，包含a)向导序列例如SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。

在本发明中，所述向导序列可以包括SEQ ID NO：1所示的核酸片段，或者与SEQ IDNO：1所示核酸片段实质上相同的核酸片段。

“实质上相同的核酸片段”是指在严格条件下能够与SEQ ID NO：1所对应的靶序列杂交的核酸片段。这样的核酸片段可以相较于SEQ ID NO：1替换、增加或减少1、2、3或更多个核酸碱基或碱基类似物【例如4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、Q核苷等】，或者是部分碱基具有某些修饰（例如甲基化修饰，通常这种修饰对gRNA与靶核酸的杂交是无关紧要的），长度优选控制在18bp～24bp的核酸片段。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES（pH6.4）和1mM EDTA的杂交液中于65℃杂交12~16小时，然后在65℃下用含0.1%SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15~60分钟。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

通常一条Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段只与一条与靶核酸结合的向导序列连接。

本发明的第二方面在于提供一种用于检测松材线虫的试剂盒，其包含上述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA。

为了便于保存和降低成本，试剂盒中可以选择该可转录为所述gRNA的DNA，后续经转录得到gRNA。

在一些实施方式中，所述可转录为所述gRNA的DNA选自例如SEQ ID NO:10。

优选地，所述试剂盒还包含Cas核酸酶、信号报告分子、阳性对照和用于CRISPR检测体系的缓冲液中的至少一种。

在一些实施方式中，Cas核酸酶选自Cas12。

在一些实施方式中，所述Cas12核酸酶选自Cas12a和/或具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶。

在一些实施方式中，所述Cas12a核酸酶选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中的至少一种。

本发明提供了基于Cas12a、Cas12b等酶在核酸检测中的应用。以下以Cas12a为例进行描述。Cas12a具有trans切割(反式切割)的活力，即一旦靶标DNA、gRNA和Cas12a蛋白形成三元复合体时，会切割体系中其他的单链DNA(旁路单链DNA)。通过检测单链DNA是否被切割即可判断反应体系中是否含有靶核酸。根据这一原理设计了特异性核酸检测方法。

所述gRNA的结构为5’-与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段-向导序列-3’。

在一些实施方式中，所述Cas12a为LbCas12a，所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段如SEQ ID NO:2所示。

在一些实施方式中，所述具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶为Cas12b核酸酶。

在一些实施方式中，所述Cas12b核酸酶选自AacCas12b、Aac2Cas12b、AkCas12b、AmCas12b、AhCas12b和AcCas12b中的至少一种。

阳性对照通常以质粒的形式存在，其中含有所述gRNA对应的靶序列。

在一些实施方式中，所述信号报告分子为信号报告单链DNA分子，所述信号报告单链DNA分子为具有信号报告功能的DNA分子，当其中的DNA序列被降解时，可报告阳性信号并被检测到。

在一些实施方式中，所述信号报告单链DNA分子的5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。

在一些实施方式中，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种。

在一些实施方式中，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse以及NFQ-MGB中的任一种。

在一些实施方式中，所述信号报告单链DNA分子的两端分别标记有不同的标记物，分别为第一标记物和第二标记物。如此，当所述信号报告单链DNA分子被CRISPR检测体系切割时，所述第一标记物与所述第二标记物分离。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包含试剂条，所述试纸条用以与所述信号报告单链DNA分子作用并显示所述信号报告分子的信号结果。

在一些实施方式中，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；

其中：

所述检测区固定包被信号物质，所述信号物质上标记有针对所述第一标记物的第一抗标记物；

所述质检区固定包被有针对所述第二标记物的抗体；

所述第一标记物与所述第一抗标记物能够形成标记物-抗标记物复合物，且所述第一抗标记物与所述第二标记物的抗体不同。

在一些实施方式中，所述标记物-抗标记物复合物中标记物/抗标记物的组合选自生物素或其衍生物/链霉亲和素，生物素或其衍生物/亲和素，生物素或其衍生物/中性抗生物素蛋白，半抗原/抗体，抗原/抗体，受体/配体，地高辛/地高辛配基，碳水化合物/凝集素和多核苷酸/互补的多核苷酸。

其中生物素的衍生物为D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素及脱硫生物素中的任一种。

其中抗原和半抗原可以是多肽，也可以是蛋白或蛋白亚基，这样的蛋白或蛋白亚基本身也可以是抗体或抗体片段。

“抗体”为与其抗原结合的物质。此用语可包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。

反应膜通常为微孔滤膜，例如NC膜。

本发明优选生物素/生物素集合的蛋白家族，以及地高辛/地高辛配基。

生物素结合的蛋白家族包括上述的链霉亲和素（streptavidin）、亲和素（avidin）和中性抗生物素蛋白（neutravidin），每个蛋白都能够以高度的亲和力和特异性结合四个生物素分子。其中最常使用的是链霉亲和素，它未经糖基化且具有很低的非特异性结合水平。亲和素则是一种高度阳离子化的糖蛋白，等电点在10.5左右，它的正电荷残基和低聚糖成份能够介导非特异性结合，从而在某些应用中导致本底过高的问题。中性抗生物素蛋白经过去糖基化处理和降低等电势点，从而减少了其背景着色。

地高辛配基可以为抗体。

在一些实施方式中，信号物质指可用于提供可检测的（优选可定量的）效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。信号物质包括但不限于染料；放射性标记，诸如³²P；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。信号物质可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。信号物质可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。信号物质可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测（例如，直接读取序列）。

在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子（如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团），也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物（比如拟肽），非天然核酸及其类似物（拟核苷酸）和纳米结构（包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等）中的至少一种。

在一些实施方式中，所述标记物之一是荧光团。

在一些实施方式中，所述荧光团可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。

在一些实施方式中，所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素（FITC）、羟基荧光素（FAM）、四氯荧光素（TET）等。

在一些实施方式中，所述罗丹明类染料包括R101、四乙基罗丹明（RB200）和羧基四甲基罗丹明（TAMRA）等。

在一些实施方式中，所述菁染料主要选自两类，一类是噻唑橙（thiazole orange,TO）、噁唑橙（oxazole orange, YO）系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。

在一些实施方式中，荧光团还可以选择下述染料：二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。

作为优选，所述标记物之二是生物素。

作为优选，信号物质为胶体金。

在一些实施方式中，所述第一标记物为荧光团，所述第二标记物为生物素，所述信号物质为胶体金。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包含RNA聚合酶、扩增引物、DNA聚合酶、dNTPs、扩增缓冲液、样品预处理试剂和水中的至少一种。

其中，所述扩增引物用于扩增含有所述gRNA靶向序列的核酸片段。

所述RNA聚合酶用于将可转录为所述gRNA的DNA转录为gRNA。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

在一些实施方式中，所述样品预处理试剂中包含提取DNA所用的试剂，这样的试剂进一步优选为可用于酚氯仿法、NaOH法、树脂提取法、盐析法、十六烷基三甲基溴化胺法、硅胶膜吸附法、FTA卡法、硅珠法或磁珠提取法提取的试剂。

其中：

酚氯仿法通常是指通过酚氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，保留DNA于水相溶液中的DNA提取方法。

NaOH法一般是强碱溶解、变性蛋白质，破坏细胞膜及核膜，变性核酸酶，释放DNA，NaOH不破坏DNA一级结构。

树脂提取法常用Chelex100法，通过Chelex螯合镁、钠和钾等离子，使降解DNA的核酸酶失去活性的DNA提取方法。

盐析法通常是将细胞破碎并离心后，用约6M的饱和NaCl沉淀蛋白质，离心上清中DNA用无水乙醇沉淀，用TE溶解。

十六烷基三甲基溴化胺法通常是通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织，并与DNA形成复合物，分离DNA与蛋白质及多糖类物质的DNA提取方法。

硅胶膜吸附法通常指通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA，并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的DNA提取与纯化方法。

FTA卡法通常指通过FTA卡裂解细胞释放DNA，从血液、口腔上皮细胞中获得DNA的方法。

硅珠法通常是指在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子的DNA提取方法。

磁珠法通常是指在胍盐存在条件下，通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠，特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA的DNA提取与纯化方法。

在一些实施方式中，所述水通常为核酸和/或无核酸酶的水，例如双蒸水或去离子水。

在一些实施方式中，所述扩增引物是特异性引物。

优选地，所述扩增基于RPA反应。所述试剂盒含有RPA反应试剂。RPA反应可实现快速扩增。RPA反应试剂包括缓冲液、RPA引物和乙酸镁。

在一些实施方式中，RPA引物的上游引物，可在5’端加入启动子序列，以用于扩增产物后续进行体外转录。

所述启动子可以选择T7、T3、SP6等，优选为T7启动子。

需要说明的是，本发明RPA反应的模板(待检片段)既可以是DNA，也可以是RNA；当模板是RNA时，需使用用于RNA的RPA酶预混液，以实现反转录功能。

本发明还涉及载体***，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码如上所述gRNA的核苷酸片段。

所述Cas核酸酶能够在所述gRNA的配合下特异性切割靶序列。

Cas核酸酶可以与gRNA位于相同或不同的载体上。

本发明还涉及一种杀灭松材线虫的方法，包括使用CRISPR-Cas核酸酶体系切割靶DNA以改变基因产物的表达；

所述CRISPR-Cas核酸酶体系包含如上所述gRNA和/或如上所述的载体***。

所述基因产物优选为松材线虫相关蛋白。

根据本发明的第三方面，本发明还涉及如上所述的gRNA、或如上所述的试剂盒在检测松材线虫或松材线虫病中的用途。

松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus），属线虫动物门、线虫纲、滑刃目、滑刃科、伞滑刃属。雌虫体约长0.81mm，雄体长约0.73mm，雌虫尾部近圆锥形，末端圆；雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲。

本发明可检测的松材线虫源自松树或者其他非松树的植物或非植物。

松树主要为马尾松、油松、白皮松、罗汉松、华山松、大别山五针松、红松、赤松、黑松、黄山松、云南松、金钱松、樟子松、雪松等。

这样的用途可以是诊断或非诊断目的。

这样的用途可以用于防治松材线虫引起的松材线虫病，又称松树萎蔫病。

以下为具体实施例。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。

以下为具体实施例。

实施例1用于松材线虫的CRISPR/Cas12a检测引物gRNA的设计及筛选

1、靶标序列的选定

在前期研究基础上，经过多重筛选和比对，以松材线虫和其近缘种拟松材线虫的5S rDNA区域内一段约20个碱基差异的序列，如SEQ ID NO:4，选定为靶标序，该序列作为松材线虫的特异性保守序列，可以将松材线虫特异性检出。

2、特异性靶向松材线虫5S rDNA基因的gRNA的设计

对于LbCas12agRNA的设计遵循以下四个原则：

（1）gRNA序列格式为：5’-与LbCas12a核酸酶相互作用的框架核酸片段-向导序列-3’。LbCas12a对应的框架核酸片段为AAUUUCUACUGUUGUAGAU(SEQ ID NO:2)；

（2）将与LbCas12a核酸酶相互作用的框架核酸片段与向导序列连接以产生完整的gRNA序列；

（3）gRNA的向导序列与靶标DNA中的目标位点序列反向互补；

（4）gRNA的向导序列长度为24个碱基，其与靶标DNA的识别依靠一个短的T碱基丰富的前间区序列邻近基序 protospacer-adjacent motif (PAM)，即“TTTV”。

针对已有的松材线虫5S rDNA基因的RAA引物扩增片段，根据gRNA的设计原则，选择表1所示位点，利用软件设计得到多条gRNA，但是经过序列比对验证后，绝大部分无法实际应用，仅有一条有效的序列如gRNA-1所示。

向导序列：AAUAAAGAAAUCAGAACCGUAUU(SEQ ID NO:1)；

gRNA-1：AAUUUCUACUGUUGUAGAUAAUAAAGAAAUCAGAACCGUAUU(SEQ ID NO:3)。

表1 筛选5S rDNA靶标序列gRNA位点

3、gRNA的制备

为方便实验保存及扩增的需要，本发明将gRNA合成为DNA序列，实际使用时利用体外转录的方法使DNA转录为RNA；体外转录方法要求在合成的DNA序列5’添加T7启动子序列(SEQ ID NO:25--GAAATTAATACGACTCACTATAGGG)。该DNA序列由上海生工生物工程有限公司合成。用于转录为gRNA的DNA序列如下表1所示。

表2 用于制备松材线虫gRNA的模板序列（oligo DNA）

实施例2、检测松材线虫的方法的建立

1、人工合成oligo DNA，并转录为gRNA

使用rTaq 10X PCR buffer （TaKaRa）将gRNA的oligo DNA模板退火成双链DNA。退火体系如下表3所示。

表3

上述反应体系中，oligo DNA和T7 promoter的浓度为100µM，Standard Taqbuffer浓度为10×。

退火程序如下所示：

95℃ 5min；94℃ to 25℃(0.1℃/s)；25℃ ∞。

根据HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit（New EnglandBiolabs）的说明，利用T7 RNA聚合酶，将上一步得到的退火产物dsDNA（gRNA）进行转录，得到gRNA。

上述转录体系如下表4所示。

表4

上述反应体系中，NTP buffer的终浓度为6.7mM，dsDNA（gRNA）的终浓度为1µg/µl。

转录反应程序为：37℃孵育16h；在反应体系中加入20µl无核酸酶水，吸打混匀后加入2µl DNaseⅠ；37℃孵育15min。

转录反应完成后，利用RNA Clean＆Concentrator kit进行gRNA的体外纯化；Nanodrop2000测纯化后的gRNA的浓度，使用DEPC水将gRNA的浓度稀释至10ng/µl(将稀释好的gRNA分装成20µl每管，-80℃保存，便于后续使用)。

2、人工合成信号单链DNA探针

由于重组蛋白酶对T碱基的亲和性，非特异性DNase活性的单链DNA碱基组成一般为“TTATT”，其5’端用FAM标记，3’端用生物素（Biotin）标记，直接合成带标签的信号报告单链DNA分子。

该信号报告单链DNA分子在LbCas12a和gRNA结合并切割靶标序列后，会产生断裂，两个标签在侧流层析试纸条反应中会产生显色结果。

3、核酸制备及载体构建

以（中科院动物研究所提供）的松材线虫为材料，使用CTAB法提取松材线虫基因组DNA，-20℃保存。

以得到的DNA为模板，对5S rDNA基因片段进行常规PCR反应，获长度556bp的单一条带。

PCR反应体系如表5所示。

表5

上述反应体系中，上下游引物浓度均为10µM。

PCR反应程序如下所示：

94℃ 5min；94℃30s，55℃ 30s，72℃ 20s，30 cycles；72℃ 10min；4℃ ∞。

将获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳、切胶回收并纯化目的片段。

将目的片段连接pMD-19T克隆载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株并过夜摇菌，提取质粒并送测序，将序列鉴定正确的阳性质粒命名为pMD-19T Bx-5S，-20℃保存备用。使用分光光度计测定质粒标准品OD值为：287.7ng/µl，稀释成100 ng/µl。拷贝数计算公式：拷贝(copies/μL)＝(6.02×10²³×浓度×10^-9)/(660×碱基数)，根据公式计算100 ng/µl pMD-19T Bx-5S标准品的拷贝数为2.8×10¹⁰copies/µl。将质粒进行10倍的梯度稀释，将其作为CRISPR/Cas12a可视化检测方法的标准品。

4、重组酶聚合酶扩增（RAA）

按照(RAA)试剂盒说明书操作，向每管冻干粉末中加入如表6所示的47.5μL反应混合液，使冻干粉末充分溶解均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μL 280mM乙酸镁溶液，加完盖上管盖，用手指轻弹使得管内试剂充分混匀，低速离心3-5s，37℃反应40min。

表6 RAA反应混合液

5、基于CRISPR/Cas12a***检测松材线虫DNA

反应体系如下表7所示，特异性gRNA采用实施例1中制备的gRNA-1。

阴性对照设置为DEPC水代替表4中的模板DNA，且保持其他试剂组分不变。

表7 CRISPR/Cas12a检测体系

上述反应体系中，LbCas12a的终浓度为30nM，gRNA的终浓度为30nM，信号单链DNA分子的终浓度为100nM，模板DNA的浓度为1ng~1fg。

上述反应体系中，DEPC水、LbCas12a蛋白、10×NEBuffer和gRNA需要先预先混合好后，25℃处理10min，再在恒温37℃条件下孵育1小时。

向反应后的PCR管中加入30μlDEPCH₂O，将试纸条***管中静待2-3分钟，读取结果。其中，信号单链DNA分子为FAM-DNA-生物素。试纸条的检测区固定包被胶体金，胶体金上标记有抗FAM抗体；质检区固定包被有生物素配体。

结果判定：对于阴性样品，胶体金颗粒抗FAM抗体与FAM-DNA-生物素报告分子充分偶联，偶联物在质检区被生物素配体截获仅质检区条带显色，检测区条带不显色；对于阳性样品，FAM-DNA-生物素报告分子被Cas12a切割，胶体金颗粒-抗FAM抗体-FAM的结合物在检测区条带处积累，在检测区条带显色，而在质控区条带处颜色降低甚至不显色。

试验结果表明，阳性对照以及含有松材线虫DNA的样品能够检测Test line和Control line，阴性对照以及不含有松材线虫DNA的样品未检测到Test line，且只有Control line。

实施例3、特异性和敏感性试验

1、试验方法

1.1 特异性试验

用CTAB法提取松材线虫和拟松材线虫基因组DNA。以上述基因组DNA为模板进行RAA预扩增并应用实施例2已经建立的体系进行CRISPR/Cas12a侧向流动试纸条检测，同时设置阴性对照，验证该方法的特异性。

1.2 敏感性试验

以10倍梯度稀释的pMD-19T Bx-5S标准品质粒(2.8×10⁸copies/μL-2.8×10²copies/μL)为模板进行敏感性检测，以DEPCH₂O为阴性对照，以测试线无明显条带的最低浓度作为检测方法的灵敏度。

2、试验结果

2.1 特异性检测结果

分别检测松材线虫和拟松材线虫对CRISPR/Cas12a横向流动检测的特异性进行评估。

检测结果如图1所示，仅在检测松材线虫的试纸条上出现测试带的显色，检测拟松材线虫的试纸条均被判定为阴性，结果证明本发明建立的检测方法特异性良好。

2.2 敏感性检测结果

将标准质粒进行10倍梯度稀释用于检测该方法的灵敏度，检测结果图2所示, 最低检测限可达到2.8´10³ copies/μl，说明本发明方法检测灵敏度较高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体***

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aauaaagaaa ucagaaccgu auu 23

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aauuucuacu guuguagau 19

<210> 3

<211> 42

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aauuucuacu guuguagaua auaaagaaau cagaaccgua uu 42

<210> 4

<211> 530

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gtgtacgccc atagcccgtt gaaagcacgc catcccgtcc gatctggcaa gttaagcaac 60

gctgcgcttg attagtactt ggatcggaga cgtccttgga atctcaagtg gcgtacgcgt 120

ttttgacttt tttgatttga ataaagaaat cagaaccgta ttttagatgg tatatcatga 180

attaaaatac gtttgaattg atatttgttt gactttttag tcaaactttc caaaattttc 240

tttttcagcc acacttttca ggagctggaa tctcaagcta acctttaact tgggaaatta 300

atccgaagat agaatgaaag agccagctta cctctgatcc accctttcct ttttggctgg 360

ggaatttacg ctatttctgt gtggtctctc caaaaacaca atctctaatt tttctgtgtt 420

agtgacgtca ttattgacta aattttcaag aaaatctcga aaaagtagcc ccggccgtgg 480

actgggtgga attgcaggga aaggaatcaa aagtggaaag ggaagggagt 530

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aataaagaaa tcagaaccgt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

actttttagt caaactttcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

caaaattttc tttttcagcc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gaaagtttga ctaaaaagtc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tttttcagcc acacttttca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

agccacactt ttcaggagct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aggagctgga atctcaagct 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

acttgggaaa ttaatccgaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ccaagttaaa ggttagcttg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ctttttggct ggggaattta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gctggggaat ttacgctatt 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cgctatttct gtgtggtctc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tgtgtggtct ctccaaaaac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

gagagaccac acagaaatag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

tgtgttagtg acgtcattat 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

agtcaataat gacgtcacta 20

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

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<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

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<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

cacttttgat tcctttccct 20

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

gaaattaata cgactcacta taggg 25

<210> 26

<211> 67

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

aatacggttc tgatttcttt attatctaca acagtagaaa ttccctatag tgagtcgtat 60

taatttc 67

Claims

1.用于检测松材线虫的gRNA，其特征在于，包含a)向导序列为SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。

2.用于检测松材线虫的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA；

还包含Cas核酸酶、信号报告分子、阳性对照和用于CRISPR检测体系的缓冲液中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述可转录为所述gRNA的DNA选自SEQID NO:10。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，Cas核酸酶选自Cas12核酸酶；

所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求2~4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述信号报告分子为信号报告单链DNA分子，所述信号报告单链DNA分子为具有信号报告功能的DNA分子，当其中的DNA序列被降解时，可报告阳性信号并被检测到。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包括试纸条，所述试纸条用以与所述信号报告单链DNA分子作用并显示所述信号报告单链DNA分子的信号结果。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述信号报告单链DNA分子的两端分别标记有第一标记物和第二标记物，如此，当所述信号报告单链DNA分子被CRISPR检测体系切割时，所述第一标记物与所述第二标记物分离；

所述试剂盒还包含试剂条，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；

其中：

所述质检区固定包被有针对所述第二标记物的抗体；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述信号物质选自荧光团、比色标记、量子点、胶体金、生物素、用于拉曼衍射成像的炔烃基团、用于click反应的环烯烃、用于聚合物标记的引发基团、多肽/蛋白分子、LNA/PNA、非天然氨基酸及其类似物、非天然核酸及其类似物和纳米结构中的至少一种；

所述纳米结构包括无机纳米颗粒、NV-center、聚集/组装诱导发光分子、稀土离子配体分子以及多金属氧簇。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含RNA聚合酶、扩增引物、DNA聚合酶、dNTPs、扩增缓冲液、样品预处理试剂和水中的至少一种；

其中所述扩增引物用于扩增含有所述gRNA靶向序列的核酸片段。

10.载体***，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码权利要求1所述gRNA的核苷酸片段。