CN113528369A - 一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法及其在废水处理中的应用，属于反硝化菌应用技术领域。该技术方法是在4℃条件下，以海藻酸钠和β‑环糊精为载体，以硫酸铁为交联剂，将反硝化细菌进行包埋形成球状体，球状体直径为2～5mm，球状体采用生理盐水洗净后进行风干得到厌氧反硝化菌剂。该技术主要包括：反硝化菌的活化，反硝化细菌扩大培养和固定化小球的制备，反硝化菌剂的使用条件和效果。本发明制作所需的原料环保可降解，制作工艺及设备要求简单。本发明获得的同步硝化反硝化菌剂在低氧条件下反硝化效果仍然明显，在同一个反应器内同时硝化和反硝化，克服传统工艺的缺点，降低污水处理过程中的基建和运行费用，拥有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于废水处理技术领域，涉及生物脱氮及细菌固定化技术，具体涉及一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法及其应用。
背景技术
目前现有的污水处理脱氮工艺大多采用传统的活性污泥法，总氮的去除多数通过微生物的氨化、硝化和反硝化过程来实现，这种技术意味着脱氮工艺必须分开实现，即硝化和反硝化在两个不同的反应器内进行，硝化液也需要回流，工艺复杂且运行费用高，同时在调试运行反应器时由于流动性及菌的悬浮状态导致优势菌难以保留，极易随流体流出，使得调试运行难度大，周期长。以应用最为广泛的A2O为例，氨氮经过好氧池硝化作用转化为硝酸盐，好氧池混合液回流进入缺氧池，再缺氧池中利用反硝化微生物在厌氧或者缺氧条件下，将硝酸盐转化为氮气，完成污水的生物脱氮过程。这种工艺基建费用高，污水、污泥以及回流***设计复杂，能耗较大且管理不便。另外，好氧池回流的混合液中溶解氧浓度较高，造成缺氧反硝化效果不好。
分析可知，现有脱氮技术效果不理想，出水很难达到总氮的新排放标准，传统技术急需升级，而造成目前污水处理***问题的根本原因在于溶解氧对反硝化过程的干扰。同步硝化反硝化是指在同一反应器内同步进行硝化反应和反硝化反应。在该反应中反硝化可以直接利用硝化作用转化的NO2-N进行反应，而不必将氨氮转化为NO3-N，减少能源消耗，以及对氧的要求。在同一个反应器内同时硝化和反硝化，便能够克服传统工艺的缺点，节省基建和运行费用。
固定化微生物技术是将特选的微生物固定在选证的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的生物技术。常用的固定技术有吸附法、包埋法、交联法和膜截留法。这种技术应用于废水处理，可以解决生物反应器内功能菌的难以培养、浓度低、难以成为优势菌等问题，而且反应器启动快、处理效率高、抗冲击力强，泥水易于分离，缩短处理所需的时间。
本专利是利用固定化微生物技术，利用海藻酸钠和β-环糊精将厌氧反硝化菌进行包埋，利用载体及铁离子对氧产生的扩散阻力在颗粒内部形成缺氧区和厌氧区，使反硝化细菌得以生存代谢，从而保证厌氧反硝化菌即使在好氧条件下也能获得较高的反硝化效果。该方法菌种容量高，对菌种活性影响小，操作简单。包埋材料为天然高分子多糖类，制备后的固定化细胞球的强度高，反应速率快，降解效率高。
发明内容
鉴于传统生物脱氮技术存在基建费用高，污水、污泥以及回流***设计复杂，能耗较大且管理不便以及氧气对传统反硝化效果影响较大等缺点，本发明提供了一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法及其应用。本方法制备的固定化反硝化菌球可以延长反硝化细菌在***中存留时间，减少并避免外界因素尤其是氧气对细菌的干扰，能够有效提高好氧反硝化效果。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
一、包埋菌种悬浮液的制备：在厌氧条件下，将斜面保存的反硝化细菌菌种接种于活化培养基上，在温度25-35℃、130-180r/min的条件下，培养18-24h；挑取活化培养基上的菌种，接种与发酵培养基上，在25-35℃、130-180r/min的条件下陪养20-28h，获得扩大培养的反硝化细菌菌液或浓缩液。将菌液或浓缩液置于转速为3000～5000r/min下离心15min，倾去上清液，用生理盐水离心洗涤2-3次，再用生理盐水稀释至OD600值为0.3～0.5左右，于0～10℃贮藏备用。
所述活化培养基为液体LB培养基，具体配方如下：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母粉10g/L，pH 7.0-7.2。
所述发酵培养基具体成分：
有机碳源5～28g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，Na2HPO4·2H2O7.9g/L，KH2PO41.5g/L，KNO3/KNO22～6g/L，微量元素1mL/L，调节pH至7.2附近，培养基使用之前经过灭菌处理。
二、菌种固定化小球的制备：将制得的细菌悬浮液加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入柠檬酸铁溶液交联剂中，在0-10℃下交联12-36h，再用无菌蒸馏水洗净、干燥，得到球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含质量分数1～4％海藻酸钠和质量分数1～4％的β-环糊精混合液，将海藻酸钠和β-环糊精素加入水中，溶解、混合均匀、高温灭菌20min，冷却后获得，交联剂为柠檬酸铁。
所述反硝化细菌为厌氧反硝化菌，可通过购买或者人工筛选获得，本申请为购得的Paracoccus denitrificans为兼性厌氧反硝化细菌所述菌种悬浮液和包埋剂的体积比为1:(10-50)。所述CaCl2溶液交联剂的质量浓度为1-4％。所述小球状的好氧反硝化菌剂粒径为2～5mm。
上述好氧反硝化菌剂的制备方法制备得到的好氧反硝化菌剂及其在反硝化方面的应用。
具体步骤为
将制备得到的球状菌剂用蒸馏水洗净后按照1:(5～15)(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)的体积比倒入盛有反硝化培养基(或者含硝酸盐废水)的锥形瓶中，然后将锥形瓶置于恒温摇床中于28-30℃、150-180r/min的条件下，敞口好氧培养，每隔4h取一次样，分别用紫外分光光度法和重氮偶合分光光度法测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量，得出其反硝化效果。上述实验中所用的反硝化培养基配方如下：将0.35g NH4Cl、1.50gKNO3、3.0g葡萄糖、7.04g Na2HPO4、1.46g KH2PO4、0.06g MgSO4和0.06mL的微量元素溶解于600mL无菌水中，混合均匀即得反硝化培养基。
本发明的有益效果：本方法制备得到的小球状好氧反硝化菌剂将细菌与含氧的培养基(或水溶液)隔离，好氧反硝化菌剂凝胶小球状内部存在对氧扩散的限制，从而形成大环境的好氧区和内部微环境的缺氧及厌氧区，有利于脱氮副球菌进行厌氧反硝化，从而保证了在有氧气存在条件下的高反硝化效果。同时，本发明采用的海藻酸钠能够保持微生物较高的活性，具有吸附量大，机械强度好，生物可将降解、生物活性高的特点；β-环糊精能够降低分子之间本身的氢键作用，从而降低共混膜的强度，提高共混膜的伸长率，且具有良好的吸湿性。两者的结合使制成的凝胶小球具有更高的强度和活性。
本方法采用的柠檬酸铁作为交联剂有利于提高膜的阻隔性能、机械性能及抗水性能，且增强了海藻酸钠和β-环糊精的凝胶性，其中三价铁离子能够对氧进行有效阻隔。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明；其中，厌氧反硝化菌菌种Paracoccus denitrificans为市售品。
实施例1
一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1、包埋菌种悬浮液的制备：在厌氧条件下，将斜面保存的反硝化细菌菌种接种于活化培养基上，在温度25-35℃、130-180r/min的条件下，培养25h；挑取活化培养基上的菌种，接种与发酵培养基上，在25-35℃、130-180r/min的条件下陪养24h，获得扩大培养的反硝化细菌菌液或浓缩液。将菌液或浓缩液置于转速为3800r/min下离心15min，离心结束后，倾去上清液，用生理盐水洗涤3次，再用生理盐水稀释至OD600值为0.3左右，于4℃贮藏备用。
2、菌种固定化小球的制备：将步骤制得的细菌悬浮液按体积比1：40比例加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入柠檬酸铁溶液交联剂中，在4℃下，封口放置于冰箱内交联24h，再用无菌蒸馏水洗净、干燥，得到2～3mm的球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含质量分数2％海藻酸钠和质量分数2％的β-环糊精混合液，将海藻酸钠和β-环糊精素加入水中，溶解、混合均匀、高温灭菌20min，冷却后获得，交联剂为质量浓度2％的柠檬酸铁溶液。
3、步骤2小球状好氧反硝化菌剂在反硝化方面应用的具体步骤为：
本发明使用反硝化培养基验证好氧反硝化菌剂的应用效果，其反硝化培养基的配方如下：将将0.35g NH4Cl、1.50g KNO3、3.0g葡萄糖、7.04g Na2 HPO4、1.46g KH2 PO4、0.06gMgSO4和0.06mL的微量元素溶解于600mL无菌水中，混合均匀即得反硝化培养基。将制备得到的小球状好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后以1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入反硝化培养基中，然后将锥形瓶置于恒温摇床中于28℃、敞口好氧培养，转速150r/min，每隔4h取一次样，测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
测定结果如表1所示，初始的硝酸盐浓度为330.7mg/L时，随着反应的进行硝酸盐浓度逐渐下降，去除率逐步升高，如第12h，16h，20h和24h的硝酸盐去除率分别为23％，50％，86％和98％。
实施例2
1、包埋菌种悬浮液的制备：在厌氧条件下，将斜面保存的反硝化细菌菌种接种于活化培养基上，在温度25-35℃、130-180r/min的条件下，培养28h；挑取活化培养基上的菌种，接种与发酵培养基上，在25-35℃、130-180r/min的条件下陪养24h，获得扩大培养的反硝化细菌菌液或浓缩液。将菌液或浓缩液置于转速为4000r/min下离心10min，离心结束后，倾去上清液，用生理盐水洗涤3次，再用生理盐水稀释至OD600值为0.3左右，于4℃贮藏备用。
2、菌种固定化小球的制备：将步骤制得的细菌悬浮液按体积比1：20比例加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入柠檬酸铁溶液交联剂中，在4℃下，封口放置于冰箱内交联24h，再用无菌蒸馏水洗净、干燥，得到2～3mm的球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含质量分数3％海藻酸钠和质量分数1％的β-环糊精混合液，将海藻酸钠和β-环糊精素加入水中，溶解、混合均匀、高温灭菌20min，冷却后获得，交联剂为质量浓度2％的柠檬酸铁溶液。
3、步骤2小球状好氧反硝化菌剂在反硝化方面应用的具体步骤为：
将制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后，按体积比1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入含有反硝化培养基(配方与实施例1相同)的锥形瓶中，然后将锥形瓶置于恒温摇床中于28℃、敞口好氧培养，转速150r/min，每隔4h取一次样，测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
测定结果如表1所示，初始的硝酸盐浓度为330.07mg/L时，随着反应的进行硝酸盐浓度逐渐下降，去除率逐步升高，如第12h，16h，20h和24h的硝酸盐去除率分别为15％，36％，65％和98％。
实施例3
1、包埋菌种悬浮液的制备：在厌氧条件下，将斜面保存的反硝化细菌菌种接种于活化培养基上，在温度25-35℃、130-180r/min的条件下，培养28h；挑取活化培养基上的菌种，接种与发酵培养基上，在25-35℃、130-180r/min的条件下陪养24h，获得扩大培养的反硝化细菌菌液或浓缩液。将菌液或浓缩液置于转速为4000r/min下离心15min，离心结束后，倾去上清液，用生理盐水洗涤3次，再用生理盐水稀释至OD600值为0.3左右，于4℃贮藏备用。
2、菌种固定化小球的制备：将步骤制得的细菌悬浮液按体积比1：50比例加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入柠檬酸铁溶液交联剂中，在4℃下，封口放置于冰箱内交联24h，再用无菌蒸馏水洗净、干燥，得到2～3mm的球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含质量分数4％海藻酸钠和质量分数2％的β-环糊精混合液，将海藻酸钠和β-环糊精素加入水中，溶解、混合均匀、高温灭菌20min，冷却后获得，交联剂为质量浓度2％的柠檬酸铁溶液。
3、步骤2小球状好氧反硝化菌剂在反硝化方面应用的具体步骤为：
将制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后，按体积比1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入含有反硝化培养基(配方与实施例1相同)的锥形瓶中，然后将锥形瓶置于恒温摇床中于28℃、敞口好氧培养，转速150r/min，每隔4h取一次样，测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
测定结果如表1所示，初始的硝酸盐浓度为330.07mg/L时，随着反应的进行硝酸盐浓度逐渐下降，去除率逐步升高，如第12h，16h，20h和24h的硝酸盐去除率分别为18％，39％，52％和97％。
实施例4
1、包埋菌种悬浮液的制备：在厌氧条件下，将斜面保存的反硝化细菌菌种接种于活化培养基上，在温度25-35℃、130-180r/min的条件下，培养28h；挑取活化培养基上的菌种，接种与发酵培养基上，在25-35℃、130-180r/min的条件下陪养24h，获得扩大培养的反硝化细菌菌液或浓缩液。将菌液或浓缩液置于转速为4000r/min下离心10min，离心结束后，倾去上清液，用生理盐水洗涤3次，再用生理盐水稀释至OD600值为0.3左右，于4℃贮藏备用。
2、菌种固定化小球的制备：将步骤制得的细菌悬浮液按体积比1：20比例加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入柠檬酸铁溶液交联剂中，在4℃下，封口放置于冰箱内交联24h，再用无菌蒸馏水洗净、干燥，得到3～4mm的球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含质量分数3％海藻酸钠和质量分数1％的β-环糊精混合液，将海藻酸钠和β-环糊精素加入水中，溶解、混合均匀、高温灭菌20min，冷却后获得，交联剂为质量浓度2％的柠檬酸铁溶液。
3、步骤2小球状好氧反硝化菌剂在反硝化方面应用的具体步骤为：
将制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后，按体积比1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入含有反硝化培养基(配方与实施例1相同)的锥形瓶中，然后将锥形瓶置于恒温摇床中于28℃、敞口好氧培养，转速150r/min，每隔4h取一次样，测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
测定结果如表1所示，初始的硝酸盐浓度为330.07mg/L时，随着反应的进行硝酸盐浓度逐渐下降，去除率逐步升高，如第12h，16h，20h和24h的硝酸盐去除率分别为17％，57％，91％和98％。
实施例5
1、反硝化细菌菌液制备与实施例1相同。
2、反硝化细菌菌液等分为两份，一份按实施例1中的步骤2制作菌种固定化小球，一份冷藏保存。
3、制备反硝化培养基，方法同实施例1.
4、准备两个200mL锥形瓶，编号I、II。
编号I：将制备得到的小球状的好氧反硝化菌剂用蒸馏水洗净后，按体积比1:10(好氧反硝化菌剂与反硝化培养基体积比)加入含有反硝化培养基(配方与实施例1相同)的锥形瓶中，反硝化培养基为50mL，然后将锥形瓶置于恒温摇床中于28℃、敞口好氧培养，转速150r/min，每隔4h取一次样，分别用紫外分光光度法和重氮偶合分光光度法测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
编号II：向含有50mL反硝化培养基的锥形瓶中加入与编号I等量的游离态反硝化菌液，然后将锥形瓶置于恒温摇床中于28℃、敞口好氧培养，转速150r/min，每隔4h取一次样，分测定样品中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
5、经测定小球状同步硝化反硝化菌剂对硝态的还原能力明显高于游离态的反硝化菌液，总氮去除率达到90％，而游离态的反硝化菌液仅为18.8％。实验证明在有氧存在的条件下，小球状同步硝化反硝化菌剂的反硝化效果得到显著提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
表1
Claims (8)
1.一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、包埋菌种悬浮液的制备：在厌氧条件下，将斜面保存的反硝化细菌菌种接种于活化培养基上培养18-24h，挑取活化培养基上的菌种，接种与发酵培养基上，在25-35℃的条件下陪养20-28h，获得扩大培养的反硝化细菌菌液或浓缩液。将菌液或浓缩液置于转速为3000～5000r/min下离心15min，倾去上清液，用生理盐水离心洗涤2-3次，再用生理盐水稀释至OD600值为0.3～0.5，于0～10℃封口贮藏备用。
活化培养基具体为液体LB培养基：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母粉10g/L，pH 7.0-7.2。
所述发酵培养基具体成分:
有机碳源5～30g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，Na2HPO4·2H2O7.9g/L，KH2PO41.5g/L，KNO3/KNO21～6g/L，微量元素1mL/L，调节pH至7.2附近，培养基使用之前经过灭菌处理。
二、菌种固定化小球的制备：将制得的细菌悬浮液按菌种悬浮液和包埋剂的体积比为1:(30-50)，加入包埋剂中，搅拌混合均匀，然后将混合液逐滴加入柠檬酸铁溶液交联剂中，在0-10℃下交联反应8-36h，再用蒸馏水洗净、干燥，得到球状的好氧反硝化菌剂；其中，包埋剂为含质量分数1-4％海藻酸钠和质量分数1-4％的β-环糊精混合液，将海藻酸钠和β-环糊精素加入水中，溶解、混合均匀、高温灭菌20min，冷却后获得。
2.根据权利要求1所述的一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤一中，所述反硝化细菌为厌氧反硝化菌。
3.根据权利要求1所述的一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：所述反硝化细菌菌液或浓缩液OD600值为0.3左右，封口冷藏温度低于4℃。
4.根据权利要求1所述的一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤二中，所述菌种悬浮液和包埋剂的体积比为1：(10-40)。
5.根据权利要求1所述的一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤二中，所述交联剂为柠檬酸铁溶液交联剂的质量浓度为2-4％。
6.根据权利要求1所述的一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤二中，所述小球状的好氧反硝化菌剂粒径为2～3mm。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种同步硝化反硝化菌剂的制备方法制备得到的厌氧反硝化菌剂。
8.一种如权利要求7所述的同步硝化反硝化菌剂在反硝化方面的应用。
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