CN113523297B - 一种利用牡丹提取物制备纳米银的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用牡丹提取物制备纳米银的方法，用无菌蒸馏水制备硝酸银，与牡丹提取物混合置于光化学反应仪中，磁力搅拌，即得到纳米银溶胶，用水和无水酒精分别清洗、干燥即得干燥的纳米银。该方法不需任何化工合成还原剂和稳定剂，采用牡丹提取物为还原剂，在光化学反应仪中，以硝酸银为前驱体制备纳米银，反应条件温和、环保、简单易操作，反应产物稳定，且能达到显著的抑菌效果。

Description

一种利用牡丹提取物制备纳米银的方法
技术领域
本发明涉及纳米材料合成领域，尤其涉及一种利用牡丹提取物制备纳米银的方法。
背景技术
纳米银由于自身独特的物理、化学和生物特性，在生物传感、生物医药、环境治理、催化、导电、导热等领域具有广阔的应用前景。目前而言，制备纳米银的方法有很多，大致可分为物理法、化学法和生物法。物理法原理较简单，很少使用甚至不使用化学品。但物理法制备纳米银的成本高，所用的设备一般需要受过专业训练的人来操作，且制备的纳米银稳定性一般较差。此外，这些方法一般需要强光、高热或高能的实验条件，这本身也具有一定的安全隐患。化学法是制备纳米银最常见的方法，一般包括化学还原法、光化学还原法、电化学还原法及超声波还原法等。利用化学法制备纳米银，仅需使用单一的还原剂和封端剂，便可使其具有特定的形状和大小，这也是该方法的主要优势。然而，该方法使用有毒化学品，反应条件较苛刻，同时残留的有毒化学品易于吸附在纳米银的表面，极大限制了化学法制备的纳米银在医药和卫生保健领域的应用。此外，化学法制备的纳米银易于团聚，在水中溶解度变小，使得其在生命***中应用时的稳定性和安全性引发关注。近十几年来，研究者们开始集中开发制备纳米银的绿色方法。对于微生物体系法而言，纳米银的制备耗时较长，培养条件的维护较繁琐，且在抗菌、药物传输和水净化等应用中存在微生物污染的风险，而植物提取物法无此类的缺点，此外，与化学法和物理法相比，植物提取物法制备纳米银还具有多种优势，例如，无需使用有毒还原剂和封端剂、辐射、高温高压，植物抽提物在纳米银的还原过程中不但具有还原剂的作用，还可以充当分散剂等。因此，近年来利用植物提取物法制备纳米银引起研究者们的极大兴趣。虽然，目前已有不少植物的提取物被用于纳米银的制备，但研究发现，由于不同的植物提取物中的成分不同，其催化合成的纳米银的粒子尺寸、分布和稳定性、纯度、形状密度以及抗菌能力均不相同。因此，人们需要不断开发和利用新的生物材料，用以制备出更加高效、稳定的纳米银抑菌剂。
牡丹包含丰富的营养成分，根据中国科学院的测定，发现牡丹花瓣和花粉内存在13种氨基酸，其中8种是人体所必需的，此外，目前的研究显示，牡丹花的主要成分是挥发性物质、花色苷、糖苷、酚酸、黄酮类等。从牡丹花中分离的原花色素大量是具有很强的抗氧化活性的物质。目前，对于牡丹花主要集中于牡丹花的化学成分和抗氧活性等研究。迄今为止，牡丹提取物在催化纳米银方面的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用牡丹提取物合成纳米银抑菌剂的方法，该方法不需任何化工合成还原剂和稳定剂，采用牡丹提取物为还原剂，在光化学反应仪中，以硝酸银为前驱体制备纳米银，反应条件温和、环保、简单易操作，反应产物稳定，且能达到显著的抑菌效果。
一种利用牡丹提取物制备纳米银的方法，包括如下步骤：
(1)材料的预处理
先将牡丹花去除表面损伤和微生物污染部分，用自来水冲洗干净后，用双蒸水冲洗3-5次，再干燥至恒重，干燥温度为50-70℃，然后将牡丹花研磨至粉末。
(2)牡丹提取物的制备
取上述粉末与提取溶剂按照1:5-30的比例混合，加热回流，过滤，离心，取上清液，浓缩，冻干成粉末，粉末溶于蒸馏水，置于4℃备用；所述的提取溶剂为蒸馏水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯中的任意一种；
所述加热回流温度控制在40-90℃，加热回流时间0.5-3小时，所述提取溶剂乙醇的浓度为50-90％，所述离心在离心机内进行，离心机的转速为5000-10000rpm，离心10-15min。
(3)纳米银的制备
避光条件下，用无菌蒸馏水制备1-10mM硝酸银水溶液，用无菌蒸馏水制备浓度为1-20mg/mL牡丹提取物水溶液，其中硝酸银水溶液与牡丹提取物水溶液体积比为1:0.25-1:9；混合好的水溶液置于光化学反应仪中，光照强度400-800w，磁力搅拌，反应5-20min即得到纳米银溶胶，纳米银溶胶用水和/或无水酒精分别清洗2-3次后，在真空条件下干燥即得干燥的纳米银。
进一步的，所述的纳米银真空干燥前可进行旋转浓缩。
本发明的有益效果在于，与现有技术相比，本发明在光化学反应仪中采用牡丹花提取物还原制备了纳米银，其具有优异的抗菌活性，纳米银溶胶稳定，并通过牡丹提取物中的活性成分作为稳定剂，形成单分散的颗粒，因此，本发明不但用生物方法合成了纳米银，同时实现了纳米银的载体负载，操作简便，生产成本低，反应条件温和环保。
附图说明
图1是本发明不同浓度牡丹提取物制备得到纳米银的紫外-可见吸收光谱。
图2是本发明不同浓度硝酸银制备得到纳米银的紫外-可见吸收光谱。
图3是本发明不同浓度硝酸银制备得到纳米银的最大吸光度值趋势图。
图4是本发明实施例4硝酸银水溶液和牡丹提取物水溶液按4:6体积比反应得到的纳米银SEM表征。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为用乙醇提取牡丹提取物的制备工艺，包括以下步骤：
1、材料的预处理
先将牡丹花去除表面损伤和微生物污染部分，用自来水冲洗干净后，用双蒸水冲洗5次，60℃干燥至恒重，得到干燥的牡丹花，然后研磨成粉末。
2、牡丹提取物的制备
称取上述牡丹花粉末40g于1000mL圆底烧瓶中，加入400mL70％乙醇，60℃下流浸提2h，通过真空过滤收集滤液，重复2次。获得的滤液在离心机内进行离心，离心机的转速为8000rpm，离心15min，取上清液，4℃下真空旋转蒸发浓缩，静置24h，上清液低温冷冻干燥获得牡丹花提取物冻干粉。
实施例2
本实施例为1mM硝酸银水溶液与不同浓度牡丹提取物水溶液反应，制备纳米银的制备工艺
避光条件下，取16.987mg AgNO3，溶于100mL无菌蒸馏水中，即可得到1mM硝酸银水溶液，取实施例1制备的牡丹提取物冻干粉，分别配置1、2、4、8、14、20mg/mL牡丹提取物水溶液，取6只试管分别加入上述硝酸银水溶液5mL，再分别加入不同浓度上述牡丹提取物水溶液5mL，置于光化学反应仪中，光照强度600w，磁力搅拌，反应20min即得到纳米银溶胶，反应后的纳米银溶胶用水和无水酒精分别清洗3次，将纳米银溶胶在真空条件下干燥24h以后即可得到干燥的纳米银。如图1为不同浓度牡丹提取物制备得到纳米银的紫外-可见吸收光谱，在1mg/m L-2mg/m L的范围内，随着牡丹提物浓度的增大，纳米银溶胶最大吸收峰的强度逐渐增强，在4mg/m L时达到最大，之后继续增大牡丹提物的浓度，其吸收峰强度反而逐渐减小，该现象的可能原因是牡丹提物浓度较低时，还原剂的量不足以将Ag+完全还原为纳米银，而当Ag+被完全还原为纳米银后，继续增大牡丹提物的浓度会使纳米银表面包覆更多的牡丹提取物，从而导致纳米银表面的等离子体共振强度降低。同时，由最大吸收峰的位置可以判断纳米银的粒径变化，紫外吸收峰发生蓝移，说明纳米银的粒径在逐步变小，当牡丹提取物浓度为4mg/mL时紫外吸收峰蓝移最多，说明此时纳米银的粒径最小。当牡丹提取物浓度大于4mg/mL时，紫外吸收峰发生红移，粒径逐渐增大。
实施例3
本实施例为4mg/mL牡丹提取物水溶液，与不同浓度的硝酸银水溶液反应，制备纳米银的制备工艺
避光条件下，用无菌蒸馏水制备1、2、4、8、9、10mM硝酸银水溶液，取实施例1制备的牡丹提取物冻干粉，用无菌蒸馏水制备浓度4mg/mL牡丹提取物水溶液，取6只试管分别加入不同浓度上述硝酸银水溶液5mL，再分别加入上述牡丹提取物水溶液5mL，置于光化学反应仪中，光照强度800w，磁力搅拌，反应5min即得到纳米银溶胶，反应后的纳米银溶胶用水清洗2次以后，将纳米银溶胶在真空条件下干燥24h以后即可得到干燥的纳米银。如图2为不同浓度硝酸银制备得到纳米银的紫外-可见吸收光谱，随着AgNO3含量的不断增大，牡丹提取物的最大吸收峰强度逐渐增大，这是由于牡丹提取物与Ag+的络合作用所导致，且当硝酸银浓度达到9mM时，牡丹提取物的最大吸收峰强度会达到平台，其原因是Ag+已完全被牡丹提取物络合，当继续增加硝酸银浓度液不会使纳米银的产量提高。图3为不同浓度硝酸银制备得到纳米银的最大吸光度值趋势图，其中a为1mM AgNO3，b为2mM AgNO3，c为4mM AgNO3，d为8mM AgNO3，e为9mM AgNO3，f为10mM AgNO3。
实施例4
本实施例为9mM硝酸银水溶液与4mg/mL牡丹提取物水溶液，按不同体积比反应，制备纳米银的制备工艺
取152.883mg AgNO3，溶于100mL无菌蒸馏水中，即可得到9mM硝酸银水溶液，取实施例1制备的牡丹提取物冻干粉，用无菌蒸馏水制备浓度4mg/mL牡丹提取物水溶液，硝酸银水溶液和牡丹提取物水溶液按1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1体积比，置于光化学反应仪中，光照强度400w，磁力搅拌，反应10min即得到纳米银，当体积比为8:2和9:1时，所制备的纳米银颜色偏黑，可能是牡丹提取物水溶液浓度较低，生成的纳米银量较少，随着牡丹提取物水溶液浓度的增加颜色逐渐趋于棕色，判断生成了大量的纳米银溶胶，且静置24h后不会沉淀。当硝酸银水溶液和牡丹提取物水溶液按4:6体积比时生成的纳米银颜色最深，判断此时生成的纳米银溶胶量最大，因此，4:6体积比是合成纳米银的最佳反应比例。反应后的纳米银溶胶用水和无水酒精分别清洗3次以后，将纳米银溶胶在真空条件下干燥24h以后即可得到干燥的纳米银。图4为本实施例硝酸银水溶液和牡丹提取物水溶液按4:6体积比反应得到的纳米银SEM表征，扫描电子显微镜扫描的图片可以清晰的看出用牡丹取物还原制备的银纳米粒子为球形，并无明显的团聚，粒径均匀，粒径分布范围20～40nm，平均粒径约为30nm。
实施例5
本实施例为牡丹提取物储备液用无菌蒸馏水提取，并制备纳米银的工艺
与实施例1不同的是将提取溶剂400mL70％乙醇更换为400mL无菌蒸馏水，其他条件完全相同制备得到牡丹提取物冻干粉。取该牡丹提取物冻干粉，用无菌蒸馏水制备浓度4mg/mL牡丹提取物水溶液，9mM硝酸银水溶液和牡丹提取物水溶液按4:6体积比，置于光化学反应仪中，其他与实施例4相同制备纳米银溶胶。
实施例6，产率计算
取实施例4的硝酸银水溶液和牡丹提取物水溶液按4:6体积比反应生成的纳米银溶胶50mL离心，吸取上清液0.8mL，用蒸馏水定容至1000mL，使用原子分光光度计测得所剩余的Ag+浓度，计算产率。
产率＝(1-反应后Ag+浓度/反应前Ag+浓度)×100％
反应前Ag+浓度为388.8mg/L(0.009mol/L×108×1000×4mL÷10mL)，反应后Ag+浓度通过原子分光光度法测得0.31mg/L，计算为387.5mg/L(0.31mg/L×1000mL÷0.8mL)，计算得纳米银产率为99.7％。
实施例7，产率计算
与实施例6不同的是取实施例5制备的纳米银溶胶，反应前Ag+浓度仍为388.8mg/L，反应后Ag+浓度通过原子分光光度法测得0.29mg/L，计算为362.5mg/L，计算得纳米银产率为93.2％。
实施例8
本实施例为纳米银溶胶的抑菌活性效果的测定(纸片扩散法)
纸片扩散法的原理：将含有定量抑菌物质的纸片贴在已经接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的抑菌物质便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。通过测定抑菌圈的直径大小，可以判断抑菌物质的强弱，抑菌圈的直径越大表示药物抑菌作用越强。
首先，根据试验菌所需营养物质配制相应的固体培养基，将融化并冷却到45—50℃的培养基倾入12—15mL于培养皿上，摇匀，冷凝，然后吸取1×106CFU/mL的菌悬液(孢子悬液)100μL于相应的培养基上，然后涂布均匀备用。其次，滤纸片的制备：取直径6mm的滤纸片，160℃干热，灭菌0.5h，用无菌镊子将滤纸片贴于培养基表面，再从纸片中心缓慢滴加10μL 20mg/mL各对比例。在接种后15min内完成以上操作，每皿2—3张纸片(以抑菌圈明显，且无重叠为准)，重复3皿。再次，将培养皿倒置于生化培养箱中，细菌在37℃下孵育24h，酵母菌和霉菌在28℃下孵育48h，用游标卡尺十字交叉法量取抑菌圈直径。其结果如表1所示，从表1中可以看出，牡丹提取物水溶液本身就具有一定的抑菌活性，但使用牡丹提取物制备纳米溶胶后，其抑菌活性明显强于牡丹提取物水溶液本身，其抑菌范围较广，对革兰氏阳性菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抑制作用。
表1纳米银溶胶的抑菌效果
Figure BDA0003159776100000071
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种利用牡丹提取物制备纳米银的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)材料的预处理
将牡丹花干燥至恒重，研磨至粉末；
(2)牡丹提取物的制备
取上述粉末与提取溶剂按照1:5-30的比例混合，加热回流，过滤，离心，取上清液，浓缩，冻干成粉末，粉末溶于无菌蒸馏水，置于4℃备用；所述的提取溶剂为蒸馏水或乙醇；
(3)纳米银的制备
避光条件下，用无菌蒸馏水制备1-10mM硝酸银水溶液，用无菌蒸馏水制备浓度为1-20mg/mL牡丹提取物水溶液，其中硝酸银水溶液与牡丹提取物水溶液体积比为1:0.25-1:9；混合好的水溶液置于光化学反应仪中，磁力搅拌，反应5-20min即得到纳米银溶胶，纳米银溶胶用水和/或无水酒精分别清洗，在真空条件下干燥即得干燥的纳米银。
2.根据权利要求1所述的利用牡丹提取物制备纳米银的方法，其特征在于，步骤(1)中先将牡丹花去除表面损伤和微生物污染部分，用自来水冲洗干净后，用双蒸水冲洗3-5次，再干燥至恒重，干燥温度为50-70℃。
3.根据权利要求1所述的利用牡丹提取物制备纳米银的方法，其特征在于，步骤(2)中所述加热回流温度控制在40-90℃，加热回流时间0.5-3小时，所述离心在离心机内进行，离心机的转速为5000-10000rpm，离心10-15min。
4.根据权利要求3所述的利用牡丹提取物制备纳米银的方法，其特征在于，所述提取溶剂为乙醇，且乙醇的浓度为50-90％。
5.根据权利要求1所述的利用牡丹提取物制备纳米银的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的光化学反应仪，光照强度400-800w。
6.根据权利要求1所述的利用牡丹提取物制备纳米银的方法，其特征在于，步骤(3)所述的纳米银真空干燥前进行旋转浓缩。
7.一种纳米银粒子，其特征在于，所述的纳米银粒子按照权利要求1-5任意一种方法所制备。
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