CN113514632A

CN113514632A - 基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法

Info

Publication number: CN113514632A
Application number: CN202110434147.1A
Authority: CN
Inventors: 张青川; 饶得鹏; 吴尚犬
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2041-04-20
Also published as: CN113514632B

Abstract

一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，该微悬臂梁免疫传感方法包括：在微悬臂梁上修饰纳米抗体；在修饰有纳米抗体的微悬臂梁中加入缓冲液和待检测样品；待检测样品与修饰有纳米抗体的微悬臂梁反应后记录微悬臂梁的尖端位移；根据微悬臂梁的尖端位移确定待检测样品的浓度。本发明用纳米抗体替代整个抗体分子固定到微悬臂梁金表面上的方法，来达到提高微悬臂梁免疫传感灵敏度的目的；与已有的微悬臂梁免疫方法相比，纳米抗体作为最小的具有完整抗原结合位点的实体，大大提高了微悬臂梁表面的受体密度，并且可以定向固定，同时大大提高应力的传递效率。

Description

基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法

技术领域

本发明涉及免疫传感检测领域，具体涉及一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法。

背景技术

免疫传感技术的原理是基于检测抗原抗体的特异性配对反应，即针对需要检测的某种靶标分子(抗原)，通过生物免疫(把抗原注入小动物体内产生的)方法，产生出相应的探针分子(抗体)，提取、纯化出这种探针分子，再利用抗原抗体的特异性结合去检测样品中的靶分子。已有的免疫传感技术如：酶联免疫吸附试验(ELISA，原理是利用抗原与抗体的特异性反应与酶标的催化放大来进行)和免疫荧光法(IF，原理是用荧光片段标记抗原或抗体)，均需要标记物来示踪抗原抗体的反应结果，就是说仅有抗体，并不能建立相应的检测方法，还需要有酶标物或荧光标记物或蛋白复合物。而一些难制备的靶标分子的标记物价格昂贵，或几乎不可能制备或购买。同时酶联免疫试剂盒和蛋白芯片的检测从原理操作上都要求每一步反应完后进行清洗，标记过程繁琐耗时，是事后的检测，不能实时，原位、在线的检测。

基于表面应力检测的微悬臂梁免疫传感技术是近年出现的一种新的免疫生化传感方法，其原理是：把探针(抗原或抗体)分子用直接或间接的方式固定(修饰)到微悬臂梁一侧的镀金层上，当被检测样品液中的靶分子与微悬臂梁金表面上的探针分子发生免疫生化反应时，会使微悬臂梁表面应力改变，从而导致微悬臂梁弯曲变形，通过光学或电学方法检测这种变形的过程，可得到免疫生化反应的实时信息。基于免疫特异性识别建立的微悬臂梁免疫传感技术与传统的需要标记物的免疫传感方法相比，它无需使用任何酶标、荧光物质和放射性作为反应示踪剂，消除了标记过程的影响，灵敏度高(比酶联免疫试验高数倍)，还可以通过监测微悬臂梁变形来实时、定量的监测抗原抗体的反应过程，得到更丰富的免疫生化反应的信息。经过这些年的发展，微悬臂梁传感被作为一种新兴技术，在生物工程和环境污染监测技术等方面与传统的方法进行对比研究，如RNA转录因子、酶、汞排放及挥发性化合物等，优于常规的酶联免疫方法。但即使如此，微悬臂梁免疫传感技术的检测灵敏度还不足以在成本方面获得相对于常规酶联免疫法的巨大优势，即如果微悬臂梁免疫传感技术的灵敏度或检测极限只比酶联免疫法高数倍，而微悬臂梁免疫传感技术的设备成本与酶联免疫相对较高，使得微悬臂梁免疫传感技术难以商业化。

影响微悬臂梁免疫传感器灵敏度的因素主要有三个方面：探针分子的灵敏度(与靶分子的亲和性)、探针分子的固定和微悬臂梁的设计与信号读出。由于微悬臂梁的规格与信号读出方式在微悬臂梁免疫传感器***成型之后就无法改变，唯一可变的是探针分子。一种合适的探针分子和修饰方法，能使固定在微悬臂梁表面的探针分子与样品溶液中的靶分子充分结合，并能高效地将结合所产生的应力变化传递到微悬臂梁表面。探针分子在微悬臂梁表面固定的方向性、密度、活性以及探针分子与微悬臂梁表面之间的联接分子的长度与刚性都有可能影响最终检测的灵敏度。

传统微悬臂梁检测中最常用的探针分子是传统抗体，目前，国内外文献报道的方法主要是利用具有双功能基团的疏基化试剂的疏基(-SH)抓住微悬臂梁表面的金表面，和另一功能团抓住抗体，实现抗体在微悬臂梁镀金层上的固定。例如先将巯基化试剂11-羧酸硫醇结合到微悬臂梁的金表面，活化其上的羧基，使之与抗体上的氨基结合来固定抗体。或用一种巯基化试剂盐酸硫醇亚胺，通过与抗体反应，使抗体连接一个带巯基的分子基团，再通过这个巯基将抗体联结到微悬臂梁的金表面上。这些方法固定抗体，存在如下共同的问题：(1)Y字形抗体的Fc段或Fab段的顶端部，会等概率的被固定在金表面上，没有方向性。而当Fab段的顶端被固定在金表面上时，结合位点被遮挡，限制了抗体的抗原结合位点与抗原的充分结合，从而降低了微悬臂梁传感灵敏度；(2)抗体与微悬臂梁之间存在不同数目C原子的单链分子，降低了抗原抗体反应产生的应力传递到梁上的效率。同时这些化学处理会影响抗体的活性从而影响其与抗原的结合，此外，受限于抗体大的分子尺寸，微悬臂梁表面固定的数量有限，这些因素的共同作用下使得微悬臂梁表面能有效结合抗原的位点的数量很少。当靶分子抗原浓度比较低的时候，与抗体间特异性结合造成的偏转就会被非特异性相互作用的噪声所淹没，所以难以实现对靶分子的高灵敏和超灵敏检测。同时传统抗体的制备需要先用抗原免疫动物，再利用杂交瘤技术并通过纯化获得，周期长，产量很低，价格昂贵，增加了微悬臂梁检测的成本和难度。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的之一在于提出一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。

为了实现上述目的，本发明提供了一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，包括：

在微悬臂梁上修饰纳米抗体；

在修饰有纳米抗体的微悬臂梁中加入缓冲液和待检测样品；

待检测样品与修饰有纳米抗体的微悬臂梁反应后记录微悬臂梁的尖端位移；

根据微悬臂梁的尖端位移确定待检测样品的浓度。

基于上述技术方案可知，本发明的基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法相对于现有技术至少具有以下优势之一或一部分：

1)本发明用纳米抗体替代整个抗体分子固定到微悬臂梁金表面上的方法，来达到提高微悬臂梁免疫传感灵敏度的目的；与已有的微悬臂梁免疫方法相比，纳米抗体作为最小的具有完整抗原结合位点的实体，大大提高了微悬臂梁表面的受体密度；

2)同时由于纳米抗体的可编辑性，可通过蛋白质工程在远离抗原结合位点的C端加上一个半胱氨酸，从而可以通过S-Au共价键一步固定到微悬臂梁金表面，在实现定向固定，暴露出更多有效抗原结合位点的同时，大大简化了实验的准备过程，减少了时间，降低了技术培训的门槛；

3)纳米抗体较小的尺寸可以显著减小抗原结合区域到梁表面的距离，从而大大提高了应力的传递效率；这几个因素的结合，同时纳米抗体本身的亲和力不逊于传统抗体，从而可以大大提高微悬臂梁免疫传感的灵敏度，在针对癌胚抗原(CEA)的检测中，纳米抗体功能化的微悬臂梁相比传统抗体的检测极限降低了500倍；

4)纳米抗体具有很好的热稳定性，耐酸耐碱，这样提高了微悬臂梁检测结果的稳定性和重现性，同时芯片的重复利用能力相比传统抗体功能化的微悬臂梁有了显著提升，在我们的实验中经过氢氧化钠处理的微悬臂梁仍有80％左右的偏转响应；

5)纳米抗体可以通过蛋白质工程大量生产，成本得以大大降低，周期和稳定性也得以提升；而传统抗体需要对动物进行免疫，周期长，成功率低，成本高，这些都不利于微悬臂梁技术的大规模推广；

6)纳米抗体的小尺寸结构在针对一些特殊的蛋白结构，如口袋，仍旧可以免疫，但是传统抗体无法对口袋内的特异结构进行免疫，所以无法对这类特殊蛋白就行免疫，无法获得合适的靶分子，应用范围有局限性。

附图说明

图1为本发明实施例中基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法的原理示意图；

图2为本发明测试例中裸梁的原子力显微镜图；

图3为本发明测试例中纳米抗体功能化微悬臂梁的原子力显微镜图；

图4为本发明测试例中传统抗体功能化微梁的原子力显微镜图；

图5为本发明测试例中ELISA评价纳米抗体在微悬臂梁金表面的固定情况和活性示意图；

图6为本发明测试例中评价固定在微悬臂梁金表面的纳米抗体的活性的光电子能谱图；

图7为本发明测试例中纳米抗体功能化微悬臂梁对CEA检测的实时偏转曲线图；

图8为本发明测试例中传统抗体功能化微悬臂梁对CEA检测的实时偏转曲线图；

图9为本发明测试例中纳米抗体方法和传统方法检测极限比较图；

图10为本发明测试例中纳米抗体功能化微悬臂梁检测血清中CEA图；

图11为本发明测试例中纳米抗体功能化微悬臂梁对CEA检测的特异性结果图；

图12为本发明测试例中纳米抗体功能化微悬臂梁对CEA检测的稳定性结果图；

图13为本发明测试例中纳米抗体功能化微悬臂梁对CEA检测的芯片重复使用能力结果图；

图14为本发明测试例中纳米抗体功能化微悬臂梁对人表皮生长因子受体-2(HER2)检测实时偏转曲线图；

图15为本发明测试例中抗HER2传统抗体的检测效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明对基于力学原理的微悬臂梁传感技术进行了深入***的研究，尤其是针对微悬臂梁表面抗体的固定方法对表面应力影响的研究。对多种抗体固定方法进行了对比，发现抗体通过定向固定后有更多的位点朝向外面，从而结合更多的抗原，产生一个更大的合力，使微悬臂梁具有更高的灵敏度；连接抗体与微悬臂梁表面的碳链长度越短，抗原抗体结合后应力传递到微悬臂梁上的效率越高，微悬臂梁的灵敏度也就越高。可以看出，正是会破坏探针分子活性的化学处理、非定向的固定方法以及探针分子较大的尺寸制约着微悬臂梁检测灵敏度的进一步提高。因此，探针分子的选择及修饰方法的探索直接关系到微悬臂梁检测灵敏度的提高及其实用化，要实现极低浓度靶分子的微悬臂梁检测就要有尺寸小、亲和力高、特异性好的探针分子来发展简便、稳定、高应力效率的探针分子修饰方法。

鉴于微悬臂梁免疫传感检测技术中抗体固定的重要性及巯基化试剂参与抗体固定的复杂性，本发明提出在微悬臂梁镀金表面上修饰纳米抗体方法来实现微悬臂梁免疫检测。本发明用于解决上述问题的技术方案是在不降低与探针分子亲和力的基础上选择尺寸更小、固定效果更好的探针分子-纳米抗体，来提高抗原结合位点在微悬臂梁表面的有效修饰密度，以及分子间反应作用力传递到微悬臂梁上的效率，达到提高微悬臂梁免疫检测方法的灵敏度目的。

本发明实施例中采用的纳米抗体(IgG)的分子量约12～17kDa，长度为3～5纳米，宽度为2～3纳米。因为纳米抗体只有传统抗体分子量的1/10，因此本申请用纳米抗体替代传统抗体作为探针分子，并保持结合位点朝向固定表面的外法线方向，就能够提高应力的传递效率和探针分子在微悬臂梁表面的有效修饰密度，从而提高微悬臂梁免疫传感的灵敏度。

纳米抗体例如可以为anti-CEA Nb、anti-HER2 Nb、anti-PSA Nb、anti-AFP Nb等针对大分子的纳米抗体和anti-AFB1Nb、anti-ATP Nb等针对小分子的纳米抗体(PSA：***特异抗原，AFP：甲胎蛋白，AFB1：黄曲霉素B1，ATP：腺嘌呤核苷三磷酸)；待检测样品例如可以为CEA溶液、HER2溶液、PSA溶液、AFP溶液、AFB1溶液、ATP溶液等标准样品溶液以及血清、尿液、组织液等实际样品溶液。

如图1所示，本发明通过蛋白质工程在纳米抗体远离抗原结合部位的一端修饰一个半胱氨酸，通过半胱氨酸中的巯基与金表面形成的S-Au共价键可以在不损伤抗体活性的情况下实现纳米抗体在微悬臂梁表面的一步定向固定(图1中箭头3)。相比传统抗体复杂的固定过程，这大大简化了微悬臂梁表面探针分子的固定方法，并且大大提高其在金表面的结合密度的同时保持良好的定向效果，不会出现传统抗体固定中结合部位被其他区域遮挡的情况，有更多的抗原结合位点暴露在外面，同时纳米抗体的链长只有传统抗体的1/4到1/5，从而减少了应力传递的损失，大大提高了应力传递效率。所以当目标物质浓度很低时也能被识别出来，从而进一步提高微悬臂梁检测灵敏度。同时纳米抗体可以通过蛋白质工程大量在大肠杆菌和酵母细胞中表达，产量高、易于定制化修饰(如巯基化)、过程简单快速(图1中箭头3)，而传统抗体制备需要复杂的动物免疫过程，提纯等难度大，所以纳米抗体制备成本可以压缩90％以上；纳米抗体相对传统抗体结构简单，保守氨基酸序列更多，从而具有很高的稳定性，有时在高达90℃的温度下仍具有功能活性，同时还耐高压、酸碱、氯化胍、尿素、去污剂以及蛋白酶，降低了保存和运输的成本，提高了实验的稳定性和可靠性，且可以对实验后的微悬臂梁芯片进行化学处理从而重复利用，这些大大降低了微悬臂梁检测的成本，经济性的同时简便、灵敏、可靠，有望扫清在医疗保健***中等各个领域实施微悬臂梁纳米传感器的障碍。

本发明的基于所述纳米抗体修饰的微悬臂梁的免疫传感检测***和检测方法，所述***和方法可应用于疾病诊断、食品安全、环境污染、生物医学、科学研究和生产制造等领域的监控和检测。本发明可大大提高微悬臂梁检测灵敏度，同时简化操作流程和降低检测成本。

本发明公开了一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，包括：

在微悬臂梁上修饰纳米抗体；

在修饰有纳米抗体的微悬臂梁中加入缓冲液和待检测样品；

根据微悬臂梁的尖端位移确定待检测样品的浓度。

在本发明的一些实施例中，所述纳米抗体包括anti-CEA Nb、anti-HER2Nb、anti-PSA Nb、anti-AFP Nb、anti-AFB1 Nb、anti-ATP Nb中的任一种。

在本发明的一些实施例中，所述修饰有纳米抗体的微悬臂梁中纳米抗体的浓度为2至10μg/mL，例如可以为2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL。

在本发明的一些实施例中，所述待检测样品包括CEA溶液、HER2溶液、PSA溶液、AFP溶液、AFB1溶液、ATP溶液、血清、尿液、组织中的任一种。

在本发明的一些实施例中，所述待检测样品的浓度为0.1至50ng/mL，例如可以为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL。

在本发明的一些实施例中，所述待检测样品与修饰有纳米抗体的微悬臂梁反应步骤中，所述反应温度为25.00±0.02℃；反应时间为50至70min，例如可以为50min、55min、60min、65min、70min。

在本发明的一些实施例中，所述缓冲液包括PBS溶液。

在本发明的一些实施例中，所述在微悬臂梁上修饰纳米抗体步骤包括：

在微悬臂梁中加入纳米抗体溶液温育后得到固定有纳米抗体的微悬臂梁；

在固定有纳米抗体的微悬臂梁中加封闭剂培育，得到修饰有纳米抗体的微悬臂梁。

在本发明的一些实施例中，所述在微悬臂梁中加入纳米抗体溶液温育步骤中，温育温度为35至38℃，例如可以为35℃、36℃、37℃、38℃；温育时间为1.5至2.5小时，例如可以为1.5小时、2小时、2.5小时。

在本发明的一些实施例中，所述封闭剂包括6-巯基1-己醇、精氨酸、甘氨酸中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，在固定有纳米抗体的微悬臂梁中加封闭剂中培育步骤中，培育温度为35至38℃，例如可以为35℃、36℃、37℃、38℃；温育时间为0.5至1.5小时，例如可以为0.5小时、1小时、1.5小时。

以下通过具体实施例结合附图对本发明的技术方案做进一步阐述说明。需要注意的是，下述的具体实施例仅是作为举例说明，本发明的保护范围并不限于此。

下述实施例中使用的化学药品和原料均为市售所得或通过公知的制备方法自制得到。

实施例1

微悬臂梁表面纳米抗体的固定

1)清洗：将未使用的微悬臂梁(购自德国Micromotive公司)置入酶标孔板中，加入Piranha Dip(食人鱼溶液)溶液(V(H₂O₂)：V(H₂SO₄)＝1∶3)中浸泡15分钟，用去离子水冲洗，氮气吹干；

2)固定抗体：将清洗过的微悬臂梁放入新的板孔之中，加入200μL 5μg/mL anti-CEANb，37℃温育2小时，用PBST(每1L洗涤液中含有8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.96gNa₂HPO₄·12H₂O、1.0mL Tween-20，其余为水)冲洗，氮气吹干得到固定有纳米抗体的微悬臂梁。

3)封闭：修饰过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入6-巯基1-己醇(MCH，1mM)的酒精溶液中，培育1小时。然后以PBST清洗，氮气吹干。得到修饰好的微悬臂梁。

测试例

原子力显微镜(AFM)评价纳米抗体在微悬臂梁表面固定情况

分别用原子力显微镜(购自美国Bruker Nano公司)扫描由实施例1获得的固定好anti-CEA纳米抗体，传统抗体的微悬臂梁和裸梁，采用PeakForce QNM模式，扫描速率为2线/秒，获得的图片经过二阶平滑后通过NanoScope Analysis软件分析获得相应的粗糙度结果，如图2-4所示，图2为裸梁的原子力显微镜图；图3为纳米抗体功能化微悬臂梁的原子力显微镜图；图4为传统抗体功能化微梁的原子力显微镜图；由图2-4可知，裸梁和固定有纳米抗体的微悬臂梁的表面粗糙度(Rq)分别为1.2和1.5nm。后者粗糙度的增加说明anti-CEANb已经成功固定到微悬臂梁金表面。同时在固定有传统抗体的微悬臂梁(Rq：4.6nm)上观察到一个更大的表面粗糙度增加，这也与其大的多的分子量和尺寸相符。

ELISA评价纳米抗体在微悬臂梁金表面的固定情况和活性

如图5中(a)图所示，将一个用MCH封闭的微悬臂放入微板孔(孔1)中，并作为对照。将两个anti-CEANb固定的微悬臂分别放入两个微板孔中，而且往孔3中加入200μL CEA后在37℃下孵育30min。如图5中(b)图、(c)图所示，孔2和孔3都用PBST洗涤后，分别向清洗后的孔中加入200μL 2μg mL^-1anti-Myc mAb-HRP和2μg mL^-1anti-CEA mAb-HRP，分别不注入(孔2)和注入(孔3)CEA。然后在37℃下孵育30min。用PBST充分洗涤孔后，去除未结合的酶结合物。然后，将微悬液放入新孔中，加入100μL TMB，室温孵育10min后，用100μL停止液(2M硫酸)停止反应。最后，使用Multiskan MK3测定没有微悬架的反应溶液的吸光度(450nm)。

与对照孔的0.017的OD值相比，固定有anti-CEA Nb的微悬臂梁，读取的OD值为0.743，说明纳米抗体成功固定到了微悬臂梁金表面。而对于加入CEA进行反应的梁，读取的OD值为0.286，这说明成功固定在微悬臂梁金表面上的anti-CEANb仍能继续结合CEA。

光电子能谱(XPS)评价固定在微悬臂梁金表面的纳米抗体的活性

用ESCALAB 250Xi(购自美国Thermo Scientific)测量纳米抗体功能化的梁结合CEA前后的XPS谱图，使用单色Al KαX射线源。从图6可以看出，与纳米抗体固定的梁想比，当结合CEA后，观察到Au 4f，S 2p，O1s的结合能分别从83.91，162.01，532.31变为80，158.51，528.8eV。结合能的变化是由于化学键和化学环境的变化，表明固定在微悬臂梁金表面的纳米抗体可以成功地结合CEA。

实施例2

微悬臂梁传感器效果监测

1)清洗：无水乙醇、丙酮和PBS分别流经微悬臂梁传感***，流速0.5mL/min；

2)固定微悬臂梁：将实施例1中修饰有anti-CEA Nb的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感***的反应池中，流动PBS通过反应池子。排除反应池中的气泡后以0.1mL/min流动PBS。

3)调节光路：调节激光器与PSD(光电位置敏感器)的位置使的激光器发出的激光照在微悬臂梁的尖端并被PSD接收。

4)样品测定：当PSD接收的微悬臂梁偏转信号稳定后，加入2mL PBS稀释的人CEA标准样品。通过PSD实时记录微悬臂梁尖端位移信息。

如图7所示，图7展示了不同浓度标准样品和微梁上纳米抗体分子反应后微梁梁尖偏转随时间变化的实时曲线，首先针对标准样品检测了四个浓度50ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL的样品得到的位移量分别约为41nm、25nm、18nm和8nm，不同浓度的人CEA标准样品可以产生不同程度的微悬臂梁位移，为了去除非特异性反应对梁偏转信号的影响，本实施例同时做了两组实验，其中对照组1用anti-HER2 Nb代替anti-CEA Nb作为梁上捕获抗体，当加入500ng/mL的CEA标准样品溶液后，几乎检测不到偏转信号；对照组2保持anti-CEANb作为梁上的捕获抗体，而用500ng/mL的BSA(牛血清蛋白)标准样品溶液代替CEA标准样品溶液加入反应池，同样地，也只发现了很微弱的偏转响应。说明anti-CEANb能有效结合到微悬臂梁的金表面上并能对人CEA进行检测。然后使用抗CEA传统抗体来检测。图8展示了不同浓度CEA标准样品和微梁上抗CEA传统抗体反应后微梁梁尖偏转随时间变化的实时曲线，其中对照组用500ng/mL的BSA标准样品溶液代替CEA标准样品溶液加入反应池，可以看出当待测CEA标准样品浓度降低到50ng/mL后，微梁偏转只有4nm，与对照组的偏转已经很接近，而同样浓度(50ng/mL)下，anti-CEA Nb功能化的微梁的偏转要大10倍以上。进一步地，比较anti-CEANb和抗CEA传统抗体功能化的微梁的偏转随待测CEA标准样品浓度的S型曲线(图9)，微梁检测实验中环境噪声引起的梁偏转约为1nm，基于3倍噪声原则，发现纳米抗体功能化微梁的检测灵敏度提高了500倍，检测极限从50ng/mL降低到0.1ng/mL。最后同样针对血清样品进行了检测实验，结果如图10所示，图10展示了不同浓度CEA血清样品和微梁上anti-CEA Nb反应后微梁梁尖偏转随时间变化的实时曲线，含有500ng/mL BSA的血清样品作为对照组中的样品液，发不同浓度血清样品导致的微梁偏转能很好的区分开，同时5ng/mL的血清样品仍有很大的偏转响应，说明并具有良好的灵敏度。

如图11所示，验证了本发明实施例的特异性，对于anti-CEANb固定的梁，分别检测人表皮生长因子受体-2(HER2)，***特异性抗原(PSA)，牛血清白蛋白(BSA)和CEA，图11展示了不同种类标准样品和微梁上anti-CEA Nb反应后微梁梁尖偏转随时间变化的实时曲线，发现只有CEA加入时才有特异性响应，从而验证了方法的特异性。

如图12和图13所示，验证了芯片的稳定性和重复使用性能，分别比较了保存一周后微悬臂梁和刚准备的微悬臂梁的检测效果差别(图12)，并比较了微悬臂梁表面重生前后偏转响应的差别(图13)，很小的衰减说明纳米抗体功能化的微悬臂梁有很好的稳定性，并且可以重复使用。

如图14所示，最后为了验证方法的普适性，本申请使用anti-HER2 Nb固定的微悬臂梁去检测HER2，图14展示了不同浓度HER2标准样品和微梁上anti-HER2 Nb反应后微梁梁尖偏转随时间变化的实时曲线，发现HER2样品溶液浓度为2ng/mL时，微梁仍有很大的偏转(达7.3nm，远超出3倍噪声)，这说明anti-HER2 Nb功能化微梁对HER2的检测限会远低于2ng/mL，这低于现在临床上对乳腺癌早期诊断时使用的HER2浓度阈值，进一步地将结果与抗HER2传统抗体的检测效果进行对比(图15)，图15展示了不同浓度HER2标准样品和微梁上抗HER2传统抗体反应后微梁梁尖偏转随时间变化的实时曲线，发现当HER2标准样品浓度降低到50ng/mL后，微梁偏转只有3.6nm，相当于3倍噪声，说明这种基于传统抗体的微梁方法对HER2的直接检测极限只有50ng/mL。纳米抗体功能化微梁在对HER2的检测相比基于传统抗体的微梁检测方法同样发现了灵敏度巨大的提升，从而证明了方法的普遍性和在疾病诊断、环境监测、食品安全等领域广阔的应用前景。

实施例3

在微悬臂梁上修饰纳米抗体；其中纳米抗体为anti-CEANb；

在修饰有纳米抗体的微悬臂梁中加入缓冲液和待检测样品；其中，修饰有纳米抗体的微悬臂梁中纳米抗体的浓度为2μg/mL；

待检测样品与修饰有纳米抗体的微悬臂梁反应后记录微悬臂梁的尖端位移；其中，待检测样品为CEA溶液，浓度为50ng/mL；

根据微悬臂梁的尖端位移获得了待检测样品的浓度。

实施例4～8

实施例4～8与实施例3的区别仅在于纳米抗体分别替换为anti-HER2、Nbanti-PSANb、anti-AFP Nb、anti-AFB1 Nb、anti-ATP Nb，同样测得了待检测样品的浓度。

实施例9～11

实施例9～11与实施例3的区别仅在于纳米抗体的浓度分别为5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL，同样测得了待检测样品的浓度。

实施例12～15

实施例12～15与实施例3的区别仅在于待检测样品的浓度分别为0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、30ng/mL，同样测得了待检测样品的浓度。

实施例16～23

实施例16～23与实施例3的区别仅在于待检测样品分别替换为HER2溶液、PSA溶液、AFP溶液、AFB1溶液、ATP溶液、血清、尿液、组织，同样测得了待检测样品的浓度。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，包括：

在微悬臂梁上修饰纳米抗体；

在修饰有纳米抗体的微悬臂梁中加入缓冲液和待检测样品；

根据微悬臂梁的尖端位移确定待检测样品的浓度。

2.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述纳米抗体包括anti-CEA Nb、anti-HER2 Nb、anti-PSA Nb、anti-AFP Nb、anti-AFB1 Nb、anti-ATP Nb中的任一种。

3.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述修饰有纳米抗体的微悬臂梁中纳米抗体的浓度为2至10μg/mL。

4.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述待检测样品包括CEA溶液、HER2溶液、PSA溶液、AFP溶液、AFB1溶液、ATP溶液、血清、尿液、组织中的任一种。

5.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述待检测样品的浓度为0.1至50ng/mL。

6.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述待检测样品与修饰有纳米抗体的微悬臂梁反应步骤中，所述反应温度为25.00±0.02℃；反应时间为50至70min。

7.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述缓冲液包括PBS溶液。

8.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述在微悬臂梁上修饰纳米抗体步骤包括：

9.根据权利要求8所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述在微悬臂梁中加入纳米抗体溶液温育步骤中，温育温度为35至38℃；温育时间为1.5至2.5小时。

10.根据权利要求8所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，

所述封闭剂包括6-巯基1-己醇、精氨酸、甘氨酸中的至少一种；

在固定有纳米抗体的微悬臂梁中加封闭剂中培育步骤中，培育温度为35至38℃；温育时间为0.5至1.5小时。