CN113512535A - 改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用，将短的DNA片段***特定DNA区域，改变靶标DNA序列，此方法可以被应用于基因修复和基因治疗。例如，用于造血干细胞HBB基因修复，利用基因编辑技术靶向修复β‑地中海贫血41/42(‑TCTT)型突变，通过设计并合成能识别引导核酸酶至目标基因靶序列的sgRNA，将其与核酸酶混合引入β‑地贫密码子41/42(‑TCTT)造血干细胞中，同时引入缺失的41/42(‑TCTT)双链片段高效修复该突变位点的移码突变，恢复蛋白基因的正常表达。本发明修复效率高，修复后的患者造血干细胞在自体移植后可以重建患者血液***并治疗地中海贫血疾病。

Description

改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用。
背景技术
近年细菌和古细菌中一种用来抵御噬菌体和质粒等外源DNA片段入侵的获得性免疫机制得到了阐释。该***由Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats(CRISPR)和CRISPR-associated(CAS)基因组成。CRISPR***的免疫干扰过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。适应阶段，CRISPR***会将来自噬菌体或质粒的DNA短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复-间隔序列单元。表达阶段，CRISPR基因座会被转录成一段CRISPR RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)，该前体在Cas蛋白和反式编码小RNA(trans-encoded smallRNA，tracrRNA)的存在下会在重复序列处被进一步加工成小的crRNA。成熟的crRNA与Cas蛋白形成Cas/crRNA复合体。干扰阶段，crRNA通过其与靶序列互补的区域引导Cas/crRNA复合体寻找靶点，并在靶点位置通过Cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链DNA断裂，从而使靶标DNA失去原有功能。其中与靶点3′端紧邻的3个碱基必须是5′-NGG-3′的形式，从而构成Cas/crRNA复合体识别靶点所需的PAM(protospacer adjacent motif)结构。
CRISPR***分为I，II，III型三个家族，其中II型***仅需要Cas9蛋白即可在tracrRNA的协助下将pre-crRNA加工成与tracrRNA结合的成熟crRNA。人们发现通过人工构建模拟crRNA：tracrRNA复合体的单链嵌合体引导RNA(guide RNA，又称sgRNA)，即可有效的介导Cas9蛋白对靶点的识别和切割，从而为在目标物种中利用CRISPR***对目标DNA进行修饰提供了广阔的前景。
β-地中海贫血是一种常见的由于β-珠蛋白基因(HBB基因)缺陷导致成人血红蛋白异常的遗传性疾病，我国“地贫”基因携带者约3000万人，涉及近3000万家庭、1亿人口，重型和中间型“地贫”患者约30万人。其中，密码子(Codon)41/42(-TCTT)基因型是我国“地贫”中最为多见的一种，发病机制为HBB基因密码子41/42(-TCTT)移码突变造成氨基酸编码异常并形成终止密码子导致蛋白翻译的提前终止，使得HBB基因的功能丧失。目前，中间型和重型患者需要长期输血和去铁治疗来维持生命，唯一根治方式为异体造血干胞移细植术，但主要实施障碍是我国血液资源的紧缺、异体造血干细胞配型困难及移植相关并发症等。其中，利用慢病毒载体进行基因治疗，表现出极大的潜力，但是半随机的载体整合方式，具致癌风险。同时慢病毒中的表达元件在造血干细胞长期归巢和自我更新的过程中会逐渐沉默，使得疗效下降，极有可能无法达到终身治愈的目的。另外，临床所需的高浓度、高质量的慢病毒对设备和技术的要求极高，成本很难降低。因此，并行的、更加安全、成本更低的临床方案是非常有必要的。
理想的基因治疗方法，是修复或破坏患者造血干细胞DNA中传统的地贫突变，使之重新恢复基因功能，并在内源转录控制因子的作用下永久产生野生型成体β-珠蛋白，从而正常分化为红系细胞。DNA序列在基因编辑后的修复方式以非同源性末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)修复为主，同源重组介导的修复(Homology directedrepair，HDR)所占的比例较低，而修复缺失突变需要高效的HDR效率。并且，传统的HDR修复用的是很长的双链或者单链DNA模板，两边必须得有比较长的片段作为同源臂，然后通过细胞内源的同源重组(DNA错配修复通路中的一种)把模板DNA交换上去。此外，人体内能够长期归巢并自我更新的长期造血干细胞(long-term hematopoietic stem cell，LT-HSC)是一群处于G0期的细胞，而研究表明G0期细胞中DNA修复很少以HDR的方式进行，主要通过NHEJ方式进行。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种能够不依赖于HDR的、可改变或者修复特定DNA序列的改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用。例如，对HBB基因密码子41/42(-TCTT)缺失导致的氨基酸编码异常进行修复。
本发明利用基因编辑技术对密码子41/42(-TCTT)导致的氨基酸编码异常进行修复。
本发明针对密码子41/42(-TCTT)移码突变导致的氨基酸编码异常进行了深入的研究，发现密码子41/42(-TCTT)的突变使得编码HBB基因的第42个密码子处缺失TCTT从而造成氨基酸编码的紊乱，并在缺失位点后不远处形成终止密码子使得蛋白翻译提前终止，导致基因功能的丧失。
理论上，CRISPR-Cas***切割目标DNA位点产生双链断裂，会出现大概率的移码突变，其中在致病位点处indel后碱基数的改变若为3n+4(n为整数)，即有可能修复患者基因型中的氨基酸编码紊乱，本发明采用***双链缺失片段的策略大大增加了DNA修复的概率，可增加基因组区域正常转录产生的β-珠蛋白mRNA比例，并翻译产生正常的β-珠蛋白。
本发明针对致病位点的移码突变，靶向切割目标DNA并引入缺失供体实现不依赖同源重组的高效修复。在临床上，只需将基因编辑后较高修复比例的自体造血干细胞移植回体内，便可达到治愈的目的。
本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：将短的DNA片段***特定DNA区域，改变靶标DNA序列。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：所述短的DNA片段包括2-15个碱基。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：包括以下步骤：
步骤1，设计并制备能够识别并引导核酸酶至缺陷细胞的向导RNA，所述向导RNA为能够引导核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA的向导RNA；
步骤2，采用基因编辑技术靶向所述缺陷细胞DNA异常突变位点造成双链断裂，同时提供短的DNA片段：向所述缺陷细胞中引入所述向导RNA、所述向导RNA能够识别并引导的核酸酶和所述短的DNA片段，所述向导RNA引导所述核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA，并***所述短的DNA片段进行非同源末端连接修复。
向导RNA引导核酸酶对造血干细胞DNA序列进行特异性的切割，切割将形成双链断裂(double strand break,DSB)，该损伤通过易错性的非同源末端连接(Non-homologousend joining，NHEJ)进行修复，加之***缺失双链片段的方式对致病位点处目标基因的突变进行高效完全修复。
基因编辑技术为CRISPR-Cas***，具体地，CRISPR-Cas***是指适合被人工改造的CRISPR-Cas***、源于古细菌II型(CRISPR)-CRISPR-associated protein(Cas)***的核酸酶体系，与ZFN和TALEN相比，该体系更简单、操作更方便。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：所述缺陷细胞为G0期原代细胞。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：所述缺陷细胞为造血干细胞HBB基因的G0期原代细胞。优选的，造血干细胞为CD34+的造血干祖细胞。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：所述向导RNA为能够引导核酸酶在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割所述造血干细胞DNA的向导RNA。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述向导RNA的靶向序列为以下序列中的任意一种或多种：
TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)；
CCCCAAAGGACTCAACCTCT(SEQ ID No.2)；
GGACTCAACCTCTGGGTCCA(SEQ ID No.3)；
GACTCAACCTCTGGGTCCAA(SEQ ID No.4)；
GACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID No.5)；
ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT(SEQ ID No.6)；
CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID No.7)。
优选的，所述向导RNA的靶向序列为TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述向导RNA(sgRNA)为碱基经过化学修饰的RNA。具体地，对sgRNA的5’末端第1-n位碱基的任意一个或任意几个碱基进行化学修饰，和/或3’末端第1至n位碱基的任意一个或任意几个碱基进行化学修饰；所述n选自2、3、4、5、6、7、8、9或10。优选的，对sgRNA的5’末端一个、两个、三个、四个或五个碱基进行化学修饰，和/或3’末端一个、两个、三个、四个或五个碱基进行化学修饰。例如，在sgRNA的5’末端第1位碱基、第2位碱基、第3位碱基、第4位碱基、第5位碱基或第1-2位碱基、第1-3位碱基、第1-4位碱基、第1-5位碱基进行化学修饰；和/或，在sgRNA的3’末端第1位碱基、第2位碱基、第3位碱基、第4位碱基、第5位个碱基或第1-2位碱基、第1-3位碱基、第1-4位碱基、第1-5位碱基进行化学修饰。
优选的，化学修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中任意一种或几种。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述短的DNA片段为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(-TCTT)对应序列的双链片段，且所述短的DNA片段为两条互补的单链短片段oligo退火后产物。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述短的DNA片段的序列为TTCT和AGAA。优选的，所述短的DNA片段采用HPLC纯化。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：其中，将所述核酸酶、所述向导RNA或所述缺失的双链供体引入造血干细胞的方式包括：载体转化、转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、纳米颗粒介导的导入。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：其中，将所述核酸酶、所述向导RNA或所述短的DNA片段采用电穿孔的方式引入造血干细胞：
将所述核酸酶和所述向导RNA形成第一复合物，再将所述第一复合物通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中，将所述短的DNA片段通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中；或者
将所述核酸酶、所述向导RNA和所述短的DNA片段形成第二复合物，再将所述第二复合物通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1、Cas12家族中的任意一种或几种，或者其点突变及改造衍生物。优选的，所述核酸酶为Cas9；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。所述Cas9可以选自野生型的Cas9，也可以选自突变型的Cas9，所述突变型的Cas9不导致Cas9的切割活性和靶向活性丧失。
进一步，在本发明提供的改变细胞内基因组序列的方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述核酸酶为Cas9，Cas9和所述向导RNA的摩尔比为1:(0.5-3)，优选的，Cas9和所述向导RNA的摩尔比为1:(1-2)，更优选的Cas9和所述向导RNA的摩尔比为1:1。优选的所述短的DNA片段的引入量为100μM。Cas9和所述向导RNA通过温育形成第一复合物，温育的温度为20℃-50℃，温育的时间为2-30分钟，优选的，温育的温度为25-37℃，温育的时间为5-20分钟。所述第一复合物通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中，Cas9和所述向导RNA形成的第一复合物与造血干细胞的用量比为20-100μg第一复合物:1×102-1×106个造血干细胞，优选的，Cas9和所述向导RNA形成的第一复合物与造血干细胞的用量比为30μg第一复合物：(1×103-1×105个)造血干细胞。
本发明还提供了一种采用上述改变细胞内基因组序列的方法制备得到的基因编辑细胞。优选的，基因编辑细胞为造血干细胞的基因编辑细胞，更有选的，造血干细胞为CD34+的造血干祖细胞；更优选的，所述造血干细胞为离体细胞。
本发明还提供了一种上述基因编辑细胞在治疗和/或预防相应的基因缺陷疾病中的药物应用。
进一步，在本发明提供的药物应用中，还可以具有这样的特征：所述基因缺陷疾病为β-地中海贫血症。
本发明具有如下优点：
本发明所涉及的改变细胞内基因组序列的方法，直接用CRISPR在靶标位点切开一个切口，然后短的DNA片段自己被直接插进去(通过的是NHEJ修复通路)，不需要同源臂，因此更适用于造血干细胞等G0期原代细胞。
针对缺陷细胞DNA异常突变位点的靶向区域设计了sgRNA，为在基因组上进行更为精确和灵活的编辑提供了可能。将sgRNA与核酸酶引入缺陷细胞，能够高效切割致病位点，通过DNA双链断裂(double strand break,DSB)以及***缺失的双链片段最大可能修复目标基因的移码，快速高效恢复HBB基因的表达，从而使得患有相关基因缺陷疾病的人的相关蛋白表达得到极大提高。
具体地，针对HBB基因的密码子41/42(-TCTT)的靶向区域设计了sgRNA，为在基因组上进行更为精确和灵活的编辑提供了可能。将上述sgRNA与Cas9蛋白引入β-地贫密码子41/42(-TCTT)的造血干细胞，能高效切割致病位点，通过DNA双链断裂(double strandbreak,DSB)以及***缺失的双链片段最大可能修复目标基因的移码，快速高效恢复HBB基因的表达，使β地贫病人的β-珠蛋白表达得到了极大提高。
本发明的修复效率可超过20％，显著高于采用ZFN、TALEN所能达到的效率，此外，本发明的修复方式不依赖于同源重组，回输后能高效维持长期造血干细胞的功能，修饰自体造血干细胞持久平衡造血***，大大节省实验时间以及人力物力的投入。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9***作用原理示意图；
图2为β-地贫密码子41/42(-TCTT)移码突变位点及sgRNAs的示意图；
图3为对照实施例一Sanger测序结果示意图；
图4为对照实施例二Sanger测序结果示意图；
图5为实验实施例一中电转sgRNA-1+dsODNSanger测序结果示意图；
图6为对照实施例二深度测序结果示意图；
图7为实验实施例一中电转sgRNA-1+dsODN深度测序结果示意图；
图8为患者造血干细胞致病位点修复分化后珠蛋白qPCR示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明的改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用作具体阐述。
实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。
如图1所示，本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向破坏β-地中海贫血中异常突变位点密码子41/42(-TCTT)，构建能识别并引导Cas9蛋白至目标基因靶序列的引导RNA序列(sgRNA)。CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种靶向致病目标DNA并使其发生改变的方法，该方法包括：向缺陷造血干细胞引入识别目标基因的sgRNA编码核酸及Cas9蛋白，从而对目标基因组DNA序列进行识别和切割并***缺失的双链供体进行修复。
其中，修复方式包括：(a)非同源末端连接修复：导致基因突变(碱基***、缺失)被引入到目的基因组序列中。(b)***缺失双链片段修复：将缺失片段***到目标基因组DNA序列中，完成内源目标基因序列的修复。本实施方式中，引入供体修复模板(dsODN)作为外源供体。
本发明中所用造血干细胞为离体细胞，本发明所述的基因修复方法为对离体细胞进行的基因修复。
<实验实施例一>
本实施例中的造血干细胞为β-地贫CD41-42纯合子的患者所提供。
造血干细胞HBB基因修复的方法为：
步骤1，设计能够识别并引导Cas9蛋白至造血干细胞的向导RNA，向导RNA为能够引导Cas9蛋白在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割造血干细胞DNA的向导RNA。
基于密码子41/42(-TCTT)致病位点前1bp处有合适的PAM靶向切割，在致病位点处设计多条sgRNA，如图2所示，各条sgRNA的靶向序列如下：
sgRNA-1：TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)，
sgRNA-2：CCCCAAAGGACTCAACCTCT(SEQ ID No.2)，
sgRNA-3：GGACTCAACCTCTGGGTCCA(SEQ ID No.3)，
sgRNA-4：GACTCAACCTCTGGGTCCAA(SEQ ID No.4)，
sgRNA-5：GACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID No.5)，
sgRNA-6：ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT(SEQ ID No.6)，
sgRNA-7：CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID No.7)。
制备上述序列的sgRNA-1～7和CAS9蛋白。sgRNA是将天然存在的II型CRISPR-Cas***中的CRISPR RNAs(crRNAs)与trans-activating crRNA(tracrRNA)融合成一条单链向导RNA(sgRNA)。sgRNA-1～7均需要经过化学修饰合成。sgRNA-1～7均为在sgRNA的5’末端第1-2位碱基进行化学修饰。
设计和制备供体修复模板。供体修复模板为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(-TCTT)对应序列的双链片段，且供体修复模板为两条互补的单链短片段oligo退火后产物。供体修复模板的序列为TTCT(SEQ ID No.8)和AGAA(SEQ ID No.9)。供体修复模板均采用HPLC纯化。
步骤2，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向造血干细胞DNA异常突变位点密码子41/42(-TCTT)造成双链断裂，同时提供供体修复模板进行修复。具体过程为：
将经由化学修饰合成的sgRNA-1～7分别与Cas9蛋白按摩尔比1:1混合，在20℃的温度下孵育10min后形成第一复合物，然后加入1μl浓度为100μM的供体修复模板，制备得到7种sgRNA、Cas9蛋白和供体修复模板的第二复合物。7种第二复合物分别按照如下方式电转：
按电转试剂盒比例混合电转液，取患者来源造血干细胞，电转数量不超过105个，将细胞离心后使用电转液重悬，再与上述孵育的sgRNA和Cas9蛋白、***供体的第二复合物轻轻混匀(sgRNA和Cas9蛋白的第一复合物与造血干细胞的用量之比为30μg第一复合物：1×105个造血干细胞)后转移至电转杯，操作过程中避免产生气泡；使用CD34细胞电转程序EO-100进行电转(Lonza-4D电转仪)；
确认电转成功后待细胞室温静置孵育5min，重新离心去除Cas9蛋白和电转液，CD34+EDM-1培养基重悬细胞后加入细胞培养板，在37℃的温度下分化培养，完成对患者缺陷型造血干细胞致病突变位点的破坏。
<对照实施例一>
本实施例为实验实施例一的空白对照组1(CK1)。按照实验实施例一的方法进行，与实验实施例一中不同之处在于：电转靶细胞为健康人来源造血干细胞，步骤2中，将sgRNA、Cas9蛋白和供体修复模板的第二复合物替换为等体积的水。
<对照实施例二>
本实施例为实验实施例一空白对照组2(CK2)。按照实验实施例一的方法进行，电转靶细胞为β-地贫CD41-42纯合子患者来源造血干细胞，与实验实施例一中不同之处在于：步骤2中，将sgRNA、Cas9蛋白和供体修复模板复合物替换为等体积的水。
<实验实施例二>
本实施例中的造血干细胞为β-地贫CD41-42纯合子的患者所提供。
造血干细胞HBB基因修复的方法为：
步骤1，设计能够识别并引导Cas9蛋白至造血干细胞的向导RNA，向导RNA为能够引导Cas9蛋白在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割造血干细胞DNA的向导RNA。
基于密码子41/42(-TCTT)致病位点前1bp处有合适的PAM靶向切割，在致病位点处设计多条sgRNA，如图2所示，各条sgRNA的靶向序列如下：
sgRNA-1：TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)，
sgRNA-2：CCCCAAAGGACTCAACCTCT(SEQ ID No.2)，
sgRNA-3：GGACTCAACCTCTGGGTCCA(SEQ ID No.3)，
sgRNA-4：GACTCAACCTCTGGGTCCAA(SEQ ID No.4)，
sgRNA-5：GACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID No.5)，
sgRNA-6：ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT(SEQ ID No.6)，
sgRNA-7：CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID No.7)。
制备上述序列的sgRNA-1～7和Cas9蛋白。sgRNA-1～7均为经过化学修饰合成的。sgRNA-1～7均为在sgRNA的3’末端第1-3位碱基进行化学修饰。
设计和制备供体修复模板。供体修复模板为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(-TCTT)对应序列的双链片段，且供体修复模板为两条互补的单链短片段oligo退火后产物。供体修复模板的序列为TTCT(SEQ ID No.8)和AGAA(SEQ ID No.9)。供体修复模板均采用HPLC纯化。
步骤2，采用基因编辑技术靶向造血干细胞DNA异常突变位点密码子41/42(-TCTT)造成双链断裂，同时提供供体修复模板进行修复。具体过程为：
将经由化学修饰合成的sgRNA-1～7分别与Cas9蛋白按摩尔比1:0.5混合，在30℃的温度下，孵育50min后形成7种sgRNA、Cas9蛋白的第一复合物，7种第一复合物和供体修复模板分别按照如下方式电转：
按电转试剂盒比例混合电转液，取患者来源造血干细胞，电转数量不超过105个，将细胞离心后使用电转液重悬，再与上述孵育的sgRNA、Cas9蛋白的第一复合物、1μl浓度为100μM的供体修复模板轻轻混匀(sgRNA和Cas9蛋白的第一复合物与造血干细胞的用量之比为20μg第一复合物：1×102个造血干细胞)后转移至电转杯，操作过程中避免产生气泡；使用CD34细胞电转程序EO-100进行电转(Lonza-4D电转仪)。
确认电转成功后待细胞室温静置孵育5min，重新离心去除Cas9蛋白和电转液，CD34+EDM-1培养基重悬细胞后加入细胞培养板，在37℃的温度下分化培养，完成对患者缺陷型造血干细胞致病突变位点的破坏。
<实验实施例三>
本实施例中的造血干细胞为β-地贫CD41-42纯合子的患者所提供。
造血干细胞HBB基因修复的方法为：
步骤1，设计能够识别并引导Cas9蛋白至造血干细胞的向导RNA，向导RNA为能够引导Cas9蛋白在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割造血干细胞DNA的向导RNA。
基于密码子41/42(-TCTT)致病位点前1bp处有合适的PAM靶向切割，在致病位点处设计多条sgRNA，如图2所示，各条sgRNA的靶向序列如下：
sgRNA-1：TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)，
sgRNA-2：CCCCAAAGGACTCAACCTCT(SEQ ID No.2)，
sgRNA-3：GGACTCAACCTCTGGGTCCA(SEQ ID No.3)，
sgRNA-4：GACTCAACCTCTGGGTCCAA(SEQ ID No.4)，
sgRNA-5：GACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID No.5)，
sgRNA-6：ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT(SEQ ID No.6)，
sgRNA-7：CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID No.7)。
制备上述序列的sgRNA-1～7和Cas9蛋白。sgRNA-1～7均为经过化学修饰合成的。sgRNA-1～7均为在sgRNA的3’末端第1位碱基进行化学修饰。
设计和制备供体修复模板。供体修复模板为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(-TCTT)对应序列的双链片段，且供体修复模板为两条互补的单链短片段oligo退火后产物。供体修复模板的序列为TTCT(SEQ ID No.8)和AGAA(SEQ ID No.9)。供体修复模板均采用HPLC纯化。
步骤2，采用基因编辑技术靶向造血干细胞DNA异常突变位点密码子41/42(-TCTT)造成双链断裂，同时提供供体修复模板进行修复。具体过程为：
将经由化学修饰合成的sgRNA-1～7分别与Cas9蛋白按摩尔比1:3混合，在50℃的温度下，孵育2min后形成第一复合物，然后加入1μl浓度为100μM的供体修复模板，制备得到7种sgRNA、Cas9蛋白和供体修复模板的第二复合物。7种第二复合物分别按照如下方式电转：
按电转试剂盒比例混合电转液，取患者来源造血干细胞，电转数量不超过105个，将细胞离心后使用电转液重悬，再与上述孵育的sgRNA和Cas9蛋白、***供体的第二复合物轻轻混匀(sgRNA和Cas9蛋白的第一复合物与造血干细胞的用量之比为100μg第一复合物：1×106个造血干细胞)后转移至电转杯，操作过程中避免产生气泡；使用CD34细胞电转程序EO-100进行电转(Lonza-4D电转仪)。
确认电转成功后待细胞室温静置孵育5min，重新离心去除Cas9蛋白和电转液，CD34+EDM-1培养基重悬细胞后加入细胞培养板，在37℃的温度下分化培养，完成对患者缺陷型造血干细胞致病突变位点的破坏。
<实验实施例四>
本实施例中的造血干细胞为β-地贫CD41-42纯合子的患者所提供。
造血干细胞HBB基因修复的方法为：
步骤1，设计能够识别并引导Cas3蛋白、Cas8a蛋白、Cas8b蛋白、Cas10d蛋白、Cse1蛋白至造血干细胞的向导RNA，向导RNA为能够引导Cas3蛋白在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割造血干细胞DNA的向导RNA。
基于密码子41/42(-TCTT)致病位点前1bp处有合适的PAM靶向切割，在致病位点处设计多条sgRNA，如图2所示，各条sgRNA的靶向序列如下：
sgRNA-1：TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)，
sgRNA-2：CCCCAAAGGACTCAACCTCT(SEQ ID No.2)，
sgRNA-3：GGACTCAACCTCTGGGTCCA(SEQ ID No.3)，
sgRNA-4：GACTCAACCTCTGGGTCCAA(SEQ ID No.4)，
sgRNA-5：GACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID No.5)，
sgRNA-6：ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT(SEQ ID No.6)，
sgRNA-7：CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID No.7)。
制备上述序列的sgRNA-1～7和Cas3蛋白、Cas8a蛋白、Cas8b蛋白、Cas10d蛋白、Cse1蛋白。sgRNA-1～7均为经过化学修饰合成的。sgRNA-1～7均为在sgRNA的5’末端第2位碱基进行化学修饰。
设计和制备供体修复模板。供体修复模板为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(-TCTT)对应序列的双链片段，且供体修复模板为两条互补的单链短片段oligo退火后产物。供体修复模板的序列为TTCT(SEQ ID No.8)和AGAA(SEQ ID No.9)。供体修复模板均采用HPLC纯化。
步骤2，采用基因编辑技术靶向造血干细胞DNA异常突变位点密码子41/42(-TCTT)造成双链断裂，同时提供供体修复模板进行修复。具体过程为：
将经由化学修饰合成的sgRNA-1～7分别与核酸酶(Cas3蛋白、Cas8a蛋白、Cas8b蛋白、Cas10d蛋白、Cse1蛋白)按摩尔比1:1混合，在20℃的温度下孵育10min后形成第一复合物，然后加入1μl浓度为100μM的供体修复模板，制备得到7种sgRNA、核酸酶和供体修复模板的第二复合物。7种第二复合物分别按照如下方式电转：
按电转试剂盒比例混合电转液，取患者来源造血干细胞，电转数量不超过105个，将细胞离心后使用电转液重悬，再与上述孵育的sgRNA和核酸酶、***供体的第二复合物轻轻混匀(sgRNA和核酸酶的第一复合物与造血干细胞的用量之比为30μg第一复合物：1×105个造血干细胞)后转移至电转杯，操作过程中避免产生气泡；使用CD34细胞电转程序EO-100进行电转(Lonza-4D电转仪)。
确认电转成功后待细胞室温静置孵育5min，重新离心去除核酸酶和电转液，CD34+EDM-1培养基重悬细胞后加入细胞培养板，在37℃的温度下分化培养，完成对患者缺陷型造血干细胞致病突变位点的破坏。
<实验实施例五>
本实施例中的造血干细胞为β-地贫CD41-42纯合子的患者所提供。
造血干细胞HBB基因修复的方法为：
步骤1，设计能够识别并引导Csy1蛋白、Csn2蛋白、Cas4蛋白、Cas10蛋白、Csm2蛋白、Cmr5蛋白、Fok1蛋白、Cpf1蛋白至造血干细胞的向导RNA，向导RNA为能够引导Csy1蛋白、Csn2蛋白、Cas4蛋白、Cas10蛋白、Csm2蛋白、Cmr5蛋白、Fok1蛋白、Cpf1蛋白在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割造血干细胞DNA的向导RNA。
基于密码子41/42(-TCTT)致病位点前1bp处有合适的PAM靶向切割，在致病位点处设计多条sgRNA，如图2所示，各条sgRNA的靶向序列如下：
sgRNA-1：TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)，
sgRNA-2：CCCCAAAGGACTCAACCTCT(SEQ ID No.2)，
sgRNA-3：GGACTCAACCTCTGGGTCCA(SEQ ID No.3)，
sgRNA-4：GACTCAACCTCTGGGTCCAA(SEQ ID No.4)，
sgRNA-5：GACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID No.5)，
sgRNA-6：ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT(SEQ ID No.6)，
sgRNA-7：CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID No.7)。
制备上述序列的sgRNA-1～7和Csy1蛋白、Csn2蛋白、Cas4蛋白、Cas10蛋白、Csm2蛋白、Cmr5蛋白、Fok1蛋白、Cpf1蛋白。sgRNA-1～7均为经过化学修饰合成的。sgRNA-1～7均为在sgRNA的5’末端第1-2位碱基进行化学修饰。
设计和制备供体修复模板。供体修复模板为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(-TCTT)对应序列的双链片段，且供体修复模板为两条互补的单链短片段oligo退火后产物。供体修复模板的序列为TTCT(SEQ ID No.8)和AGAA(SEQ ID No.9)。供体修复模板均采用HPLC纯化。
步骤2，采用基因编辑技术靶向造血干细胞DNA异常突变位点密码子41/42(-TCTT)造成双链断裂，同时提供供体修复模板进行修复。具体过程为：
将经由化学修饰合成的sgRNA-1～7分别与核酸酶(Csy1蛋白、Csn2蛋白、Cas4蛋白、Cas10蛋白、Csm2蛋白、Cmr5蛋白、Fok1蛋白、Cpf1蛋白)按摩尔比1:1混合，在20℃的温度下孵育10min后形成第一复合物，然后加入1μl浓度为100μM的供体修复模板，制备得到7种sgRNA、核酸酶和供体修复模板的第二复合物。7种第二复合物分别按照如下方式电转：
按电转试剂盒比例混合电转液，取患者来源造血干细胞，电转数量不超过105个，将细胞离心后使用电转液重悬，再与上述孵育的sgRNA和核酸酶、***供体的第二复合物轻轻混匀(sgRNA和核酸酶的第一复合物与造血干细胞的用量之比为30μg第一复合物：1×105个造血干细胞)后转移至电转杯，操作过程中避免产生气泡；使用CD34细胞电转程序EO-100进行电转(Lonza-4D电转仪)；确认电转成功后待细胞室温静置孵育5min，重新离心去除核酸酶和电转液，CD34+EDM-1培养基重悬细胞后加入细胞培养板，在37℃的温度下分化培养，完成对患者缺陷型造血干细胞致病突变位点的破坏。
目标基因编辑的鉴定
(1)基因组DNA的突变鉴定
将实验实施例一、对照实施例一、对照实施例二、实验实施例二、实验实施例三、实验实施例四、实验实施例五中电转后的造血干细胞体外分化培养3-4天后，收集适量细胞，提取基因组，PCR扩增后Sanger测序及深度测序检测修复效率(即HBB恢复正常的细胞数量占被检细胞数量的比例)，剩余细胞继续在EDM-1培养基中分化7天，提取所得细胞的基因组DNA进行基因型鉴定，确定突变效率。
其中，PCR扩增引物序列如下：
41/42-check-F：GCTTCTGACACAACTGTGTTC(SEQ ID No.10)；
41/42-check-R：CCACACTGATGCAATCATTCG(SEQ ID No.11)。
深度测序引物序列如下：
41/42-deep seq-F：
GAATTCATCACGGGATCCAGGAGACCAATAGAAACTGGGC(SEQ ID No.12)；
41/42-deep seq-R：
GAGTTGGATGCTGGATGGCACTAAAGGCACCGAGCACT(SEQ ID No.13)。
实验实施例一、实验实施例二、实验实施例三、实验实施例四、实验实施例五中测序峰图均显示从sgRNA切割位点处由于随机数目碱基的indel而产生杂峰。深度测序结果显示，电转后患者来源造血干细胞(sgRNA-1+dsODN)目标位点的完全修复效率足够高，均可达20％以上。
图3-图7中提供了空白对照组1、空白对照组2、和实验实施例一(电转sgRNA-1+dsODN)的Sanger测序结果示意图和深度测序结果示意图。
图3空白对照组1(健康人来源造血干细胞，未导入任何RNP(核糖核蛋白))，测序峰图正常；图4空白对照组2(CD41-42患者来源造血干细胞，未导入任何RNP)，测序峰图显示CD41-42(-TCTT)纯合缺失；图5实验实施例一(电转sgRNA-1+dsODN)，测序峰图显示从sgRNA切割位点处由于随机数目碱基的indel而产生杂峰。
图6、图7深度测序结果显示，相对空白对照组2(CD41-42纯合患者来源未编辑的造血干细胞)，实验实施例一中电转后患者来源造血干细胞(sgRNA-1+dsODN)目标位点的完全修复效率足够高，可达20％以上。
(2)q-PCR分析致病位点突变后的造血干细胞中β珠蛋白含量变化。
待Sanger测序后确定目标位点突变成功后即可在EDM-2培养基中继续分化4天，此阶段细胞可大量扩增，待EDM-2分化阶段结束，将细胞转移至EDM-3中继续分化7天，待分化结束后提取造血干细胞RNA反转录获得cDNA，q-PCR分析致病位点突变后的造血干细胞HBBmRNA含量变化。
其中，q-PCR特异检测HBA(内参)和HBB所用引物对序列如下：
HBA-S：GCCCTGGAGAGGATGTTC(SEQ ID No.14)；
HBA-AS：TTCTTGCCGTGGCCCTTA(SEQ ID No.15)；
HBB-S：TGAGGAGAAGTCTGCCGTTAC(SEQ ID No.16)；
HBB-AS：ACCACCAGCAGCCTGCCCA(SEQ ID No.17)。
结果：与健康人来源的造血干细胞相比，患者来源的造血干细胞的HBB与HBA的mRNA比值几近为零，而实验实施例一、实验实施例二、实验实施例三、实验实施例四、实验实施例五中编辑后的造血干细胞中，HBB与HBA的mRNA比值均增加到了30％以上。此比例足以消除HBA水平过高导致的红细胞毒性，可以有效缓解地中海贫血症状。图8中提供了实验实施例一中经sgRNA-1+dsODN编辑后的造血干细胞中修复分化后珠蛋白qPCR示意图，图8显示，HBB与HBA的mRNA比值增加到了30％以上。
在治疗地中海贫血症状时，只需将基因编辑后较高修复比例的自体造血干细胞移植回体内，便可达到治愈的目的。
本发明所涉及的改变细胞内基因组序列的方法、基因编辑细胞及应用并不限于具体实施例的范围。以上内容仅为本发明的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (17)

1.一种改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
将短的DNA片段***特定DNA区域，改变靶标DNA序列。
2.根据权利要求1所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述短的DNA片段包括2-15个碱基。
3.根据权利要求1所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，设计并制备能够识别并引导核酸酶至缺陷细胞的向导RNA，所述向导RNA为能够引导核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA的向导RNA；
步骤2，采用基因编辑技术靶向所述缺陷细胞DNA异常突变位点造成双链断裂，同时提供短的DNA片段：向所述缺陷细胞中引入所述向导RNA、所述向导RNA能够识别并引导的核酸酶和所述短的DNA片段，所述向导RNA引导所述核酸酶在所述缺陷细胞DNA异常突变位点上游切割所述缺陷细胞DNA，并***所述短的DNA片段进行非同源末端连接修复。
4.根据权利要求3所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述缺陷细胞为G0期原代细胞。
5.根据权利要求4所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述缺陷细胞为造血干细胞HBB基因的G0期原代细胞。
6.根据权利要求5所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述向导RNA为能够引导核酸酶在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割所述造血干细胞DNA的向导RNA。
7.根据权利要求6所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述向导RNA的靶向序列为以下序列中的任意一种或多种：
TCCCCAAAGGACTCAACCTC；
CCCCAAAGGACTCAACCTCT；
GGACTCAACCTCTGGGTCCA；
GACTCAACCTCTGGGTCCAA；
GACCCAGAGGTTGAGTCCTT；
ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT；
CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG。
8.根据权利要求3-7任一权利要求所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述向导RNA为碱基经过化学修饰的RNA。
9.根据权利要求4所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述短的DNA片段为包括正常的HBB基因缺失的密码子41/42(-TCTT)对应序列的双链片段，且所述短的DNA片段为两条互补的单链短片段oligo退火后产物。
10.根据权利要求9所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述短的DNA片段的序列为TTCT和AGAA。
11.根据权利要求3所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
将所述核酸酶、所述向导RNA或所述短的DNA片段引入造血干细胞的方式包括：载体转化、转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、病毒、纳米颗粒介导的导入。
12.根据权利要求11所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
将所述核酸酶、所述向导RNA或所述缺失的双链供体采用电穿孔的方式引入造血干细胞：
将所述核酸酶和所述向导RNA形成第一复合物，再将所述第一复合物通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中，将所述缺失的双链供体通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中；或者
将所述核酸酶、所述向导RNA和所述缺失的双链供体形成第二复合物，再将所述第二复合物通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中。
13.根据权利要求3所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1、Cas12家族中的任意一种或几种，或者其点突变及改造衍生物。
14.根据权利要求13所述的改变细胞内基因组序列的方法，其特征在于：
所述核酸酶为Cas9，Cas9和所述向导RNA的摩尔比为1:(0.5-3)，所述缺失的双链供体的引入量的浓度为100μM，Cas9和所述向导RNA通过温育形成第一复合物，温育的温度为20℃-50℃，温育的时间为2-30分钟，所述第一复合物通过电穿孔的方式引入到造血干细胞中，Cas9和所述向导RNA形成的第一复合物与造血干细胞的用量比为20-100μg第一复合物:1×102-1×106个造血干细胞。
15.一种采用权利要求1-14所述的改变细胞内基因组序列的方法制备得到的基因编辑细胞。
16.一种权利要求15中所述的基因编辑细胞在治疗和/或预防相应的基因缺陷疾病中的药物应用。
17.根据权利要求16中所述的药物应用，其特征在于：所述基因缺陷疾病为β-地中海贫血症。
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