CN113509562B - 包含pd-l1结合多肽组合物的制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种组合物，其包含：(i)浓度为约0.1mg/mL至约50mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD‑L1)结合多肽和螯合剂；(ii)浓度为约10mM至约80mM的缓冲剂；和(iii)稳定剂和/或渗透压调节剂；其中，所述组合物的pH值不低于5。本申请的组合物在在保存过程中能够保持缀合物的物理稳定性、化学稳定性和生物稳定性。本申请还提供了所述组合物在检测PD‑L1中的应用。

Description

包含PD-L1结合多肽组合物的制剂及其制备方法

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种包含抗PD-L1抗体的组合物。

背景技术

程序性死亡-1(PD-1)是CD28受体家族的成员，该家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。该家族的最初成员CD28和ICOS通过添加单克隆抗体后增强T细胞增殖的功能而发现(Hutloff等(1999)，Nature 397:263-266；Hansen等(1980)，Immunogenics 10:247-260)。已经鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体，PD-L1和PD-L2，已经表明它们在与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌(Freeman等(2000)，J Exp Med15 192:1027-34；Latchman 等(2001)，Nat Immunol 2:261-8；Cater等(2002)，Eur J Immunol 32:634-43；Ohigashi等(2005)， Clin Cancer Res 11:2947-53)。PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)都是可与PD-1结合但是不与其他CD28家族成员结合的B7同源物(Blank等2004)。PD-L1的表达已经在几种鼠和人类癌症中发现，包括人肺癌、卵巢癌、结肠癌、黑色素瘤和各种骨髓瘤20(Iwai等(2002)，PNAS 99:12293-7；Ohigashi等(2005)，Clin Cancer Res11:2947-53)。已有的结果显示，肿瘤细胞高表达的PD-L1通过增加T细胞的凋亡从而在肿瘤的免疫逃逸中起着重要的作用。检测患者中的PD-L1的表达可用于肿瘤的诊断，或者为肿瘤的抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗提供临床诊断依据。然而，先前报道的针对PD-L1的抗体迄今并没有成功地用来有效地早期检测和/或诊断癌症。

发射型计算机断层成像术(Emission Computed Tomography，ECT)已用于肿瘤的诊断。ECT 包括单光子发射计算机断层成像术(Single-Photon Emission ComputedTomography，SPECT)和正电子发射断层成像术(Positron Emission Tomography，PET)，其提供了高分辨率的肿瘤成像并且可通过图像进行定量分析。

抗PD-L1抗体在溶液状态下较容易降解，物理稳定性较差，易形成沉淀颗粒或凝聚物，较难获得稳定的蛋白制剂。目前，适合于ECT检测的基于PD-L1抗体的制剂还未见报道。

发明内容

本申请目的在于提供一种能够在保存期内能保持理化性质稳定的适合于ECT检测的基于PD-L1抗体的制剂及其应用。

一方面，本申请提供了一种组合物，其包含：

(i)浓度为约0.1mg/mL至约50mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD- L1)结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约10mM至约80mM的缓冲剂；和

(iii)稳定剂和/或渗透压调节剂；

其中，所述组合物的pH值不低于5。

在某些实施方式中，其中所述组合物的pH值为约5.0-6.0。

在某些实施方式中，其中所述组合物的pH值为约5.2-5.8。

在某些实施方式中，其中所述组合物的pH值为约5.4-5.6。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂的浓度为约100mM至约300mM。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂的浓度为约140mM至约220mM。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂的浓度为约150mM至约200mM。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸中的一种或多种混合。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂包括蔗糖。

在某些实施方式中，其中所述蔗糖浓度为约150mM至约200mM。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂还包括蛋氨酸。

在某些实施方式中，其中所述蛋氨酸浓度为约0.2mM至约20mM。

在某些实施方式中，其中所述缀合物浓度为约0.2mg/mL至约40mg/mL。

在某些实施方式中，其中所述缀合物浓度为约0.5mg/mL至约20mg/mL。

在某些实施方式中，其中所述缀合物浓度为约1mg/mL至约10mg/mL。

在某些实施方式中，其中所述缓冲剂包括醋酸盐、枸橼酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐中的一种或多种混合。

在某些实施方式中，其中所述缓冲剂的浓度为约10mM至80mM。

在某些实施方式中，其中所述缓冲剂的浓度为约40mM至60mM。

在某些实施方式中，其中所述渗透压调节剂包括氯化钠、氯化镁、葡萄糖、山梨醇、柠檬酸钠中的一种或多种混合。

在某些实施方式中，其中所述渗透压调节剂浓度为约100mM至约300mM。

在某些实施方式中，其中所述渗透压调节剂浓度为约120mM至约240mM。

在某些实施方式中，其中所述PD-L1结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方式中，其中所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或人抗体。

在某些实施方式中，其中所述抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)₂片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)、scFv和/或VHH。

在某些实施方式中，其中所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个可变结构域。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域包括VHH结构域。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的 CDR1；具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR3。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含：具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的 CDR1；具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR3。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含SEQ ID NO:1-2、6-10、和12-16中任一项所示氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含至少一个赖氨酸残基。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域包含3个赖氨酸残基。

在某些实施方式中，其中所述螯合剂选自：DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N′,N″-三乙酸)、NETA([4-[2-(二-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮壬烷-1-基}-乙酸)、p-NH2-Bn- NOTA(2-S-(4-氨基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、p-SCN-Bn-NOTA(2-(对异硫氰酸根合苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)。

在某些实施方式中，其中所述PD-L1结合多肽和螯合剂通过赖氨酸连接。

在某些实施方式中，其中所述螯合剂通过所述PD-L1结合多肽的氨基酸的伯胺直接附接到所述PD-L1结合多肽。

在某些实施方式中，其中所述螯合剂是p-SCN-Bn-NOTA。

在某些实施方式中，其中所述p-SCN-Bn-NOTA通过异硫氰根基团与所述PD-L1结合多肽的赖氨酸末端的氨基反应直接附接到所述PD-L1结合多肽。

在某些实施方式中，所述组合物还包含至少一种可检测标记。

在某些实施方式中，其中所述可检测标记与所述缀合物相结合。

在某些实施方式中，其中所述可检测标记选自放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁粒子和酶。

在某些实施方式中，其中所述放射性核素选自：¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁸Ge、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、^94mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、^52mMn、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr或其它γ-、β-、或正电子发射体。

在某些实施方式中，其中所述放射性核素为⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。

在某些实施方式中，所述可检测标记通过正电子发射断层摄影术可检测。

在某些实施方式中，所述的组合物包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含PD-L1结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约40mM至60mM的醋酸钠作为缓冲剂；

(iv)浓度为约120mM至约240mM的氯化钠作为渗透压调节剂；

其中所述制剂的pH为约5.2至约5.8。

在某些实施方式中，所述的组合物包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含PD-L1结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约40mM至60mM的醋酸钠作为缓冲剂；

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖作为稳定剂；

其中所述组合物的pH为约5.2至约5.8。

在某些实施方式中，所述组合物的pH为约5.4至约5.6。

在某些实施方式中，所述组合物的pH为约5.5。

在某些实施方式中，所述蔗糖的浓度为约160mM至约180mM。

在某些实施方式中，其还包含约0.2mM至约20mM的蛋氨酸作为稳定剂。

在某些实施方式中，所述PD-L1结合多肽为VHH。

在某些实施方式中，所述VHH包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述螯合剂为p-SCN-Bn-NOTA。

在某些实施方式中，所述组合物还包括可检测标记，所述可检测标记为⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。

另一方面，本申请还提供一种PD-L1检测方法，所述方法包括：施用有效量的前述的组合物。

在某些实施方式中，其中所述施用在体外或离体进行。

在某些实施方式中，其中所述施用包括使细胞、器官或组织与所述组合接触的任何方法。

在某些实施方式中，所述方法还包括检测或量化所述可检测标记。

在某些实施方式中，所述方法还包括获得表达PD-L1的细胞、器官或组织的图像。

另一方面，本申请还提供一种检测和/或诊断与PD-L1相关的疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用前述的组合物。

在某些实施方式中，所述方法还包括检测或量化所述可检测标记。

在某些实施方式中，所述方法还包括对受试者进行ECT成像。

在某些实施方式中，其中所述与PD-L1相关的疾病包括肿瘤。

在某些实施方式中，所述肿瘤高表达PD-L1。

另一方面，本申请还提供前述的组合物在制备药物中的应用，所述药物用于检测PD-L1。

在某些实施方式中，所述药物为PD-L1成像剂。

另一方面，本申请还提供一种PD-L1成像剂，所述PD-L1成像剂包含前述的组合物。

另一方面，本申请还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含前述的组合物。

在某些实施方式中，其中所述组合物与可检测标记存在于分开的剂型中。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：

图1显示的是本申请中缀合物SNA002的结构示意图；

图2显示的是本申请实施例1中的配方在不同保存条件下的UV280测定的结果；

图3显示的是本申请实施例1中的配方在不同保存条件下SEC测定的结果；

图4显示的是本申请实施例1中的配方在不同保存条件下的RP-HPLC测定的结果(Average DAR的变化率)；

图5显示的是本申请实施例1中的配方在不同保存条件下以T0作为参比的缀合物在ELISA测定中的结果；

图6显示的是本申请实施例2中的配方在不同保存条件下的UV280浓度测定的结果；

图7显示的是本申请实施例2中的配方在不同保存条件下的SEC测定的结果；

图8本申请实施例2中的配方在不同保存条件下的RP-HPLC测定的结果；

图9本申请实施例2中的配方在不同保存条件下以T0作为参比的缀合物在ELISA测定中的结果。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“缀合物”通常是指由两个或更多独立的部分接合在一起形成的任何物质。例如，缀合物可以包含由一段多肽与另一段或多段多肽连接而成的物质。例如，缀合物可以是小分子(例如螯合剂)与大分子诸如载体或多胺聚合物，特别是蛋白质(例如抗体) 接合在一起形成的物质。在一些实施方式中，小分子可接合在大分子的一个或多个活性位点处。

在本申请中，术语“PD-L1结合多肽”意指任何能够特异性结合PD-L1的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是抗体。在其它实施方案中，结合多肽是例如抗体模拟物、细胞表面受体、细胞因子或生长因子。例如本申请的特异性结合PD-L1的单域抗体。“PD-L1结合多肽”或者可以指结合PD-L1的单价多肽(即与PD-L1的一个表位结合的多肽)，以及二价或多价结合多肽(即结合一个以上表位的结合多肽)。本申请的“PD-L1结合多肽”可以包含至少一个结合PD-L1的免疫球蛋白单一可变结构域如VHH。

在本申请中，术语“螯合剂”通常是指能够与金属离子形成络合物的有机分子。螯合剂常用来标记物蛋白质或肽。金属离子缀合物的终产物用于放射免疫检测、放射免疫疗法、磁共振成像、光动力疗法或其他相似的模式。螯合剂的非限制性例子包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸酐)和其衍生物、NOTA和其衍生物如NODA-GA、DOTA和其衍生物、TETA和其衍生物、DTTA或NETA。这些和其他螯合剂从商业来源轻易可获得。

在本申请中，术语“抗体”是在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Milleretal(2003)Jour.ofImmunology170:4854-4861)。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合抗体，或源于其它物种。

在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL) 和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab’)₂片段，具有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的 Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“Binding Activities of a Repertoire ofSingle Immunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli,”Nature341:544-546(1989)，其以引用的方式整体并入本文)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)；(7)单链Fv(scFv)，例如源于scFV-文库。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但其可通过合成连接子使用重组方法接合，合成连接子使得其被制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))(可参见例如Huston等人,“Protein Engineering of Antibody Binding Sites:Recovery of SpecificActivity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichiacoli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))；和(8)VHH，“VHH”涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.， 74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)和/或单域抗体。这些抗体片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式评估所述片段的功能。

在本申请中，术语“可变结构域”通常是指能够特异性结合抗原表位的抗体的可变结构域。例如，抗体可变结构域VH及VL(VH结构域及VL结构域)。可变结构域的另一实例为“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、V_HH 结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G, Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid oflight chains”；Nature 363,446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(其在本文中称为“VH结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(其在本文中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规4链抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。

“可变结构域”通常具有相同的大体结构，每个结构域包含4个序列高度保守的框架(FR) 区，其中，FR区包括“框架区1”或“FR1”、 “框架区2”或“FR2”、 “框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”，FR区“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”连接。可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗体可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。

在本申请中，术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“V_HH结构域”、“VHH 抗体片段”、“VHH抗体”以及

及“

结构域”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。

例如Riechmann 及Muyldermans, J.Immunol.Methods 231,25-38 (1999)的图2中所示，对于骆驼科的 VHH结构域所应用的氨基酸残基，根据 Kabat等人给出的VH结构域的一般编号法来编号(“Sequence of proteins of immunological interest”, USPublic Health Services, NIH Bethesda, MD, 公开案第91号)。根据该编号法，FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，CDR1 包含在位置31-35 处的氨基酸残基， FR2 包含在位置36-49 处的氨基酸，CDR2包含在位置 50-65 处的氨基酸残基， FR3 包含在位置66-94 处的氨基酸残基，CDR3包含在位置 95-102 处的氨基酸残基，且FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。然而应注意，如本领域中对于VH 结构域及VHH 结构域所公知的，各CDR 中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat 编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat 编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat 编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat 的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。

在本申请中，术语“序列同一性”通常是指是使用序列比对程序比对时，两个或多个比对的序列相同的核酸或氨基酸序列。在此的术语“％序列同一性”通常指的是使用序列比对程序比对时，两个或多个比对序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI 数据库的BLAST 程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed., Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith, D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,Griffin, A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,20von Heinje,G.,Academic Press,1987和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991。

在本申请中，氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”通常是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的***、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及 Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基： His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、 Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代； Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被 Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu 被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、 Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe 取代；Val被Ile或Leu取代。

在本申请中，术语“可检测标记”通常是指具有可检测物理或化学特性的部分，标记可以产生能通过目视或仪器工具检测的信号。用于多肽的标记的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素、荧光标记(例如FITC、若丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团(其可通过经标记的抗生物素蛋白(例如含有抗生蛋白链菌素部分的分子)和荧光标记物或可通过光学方法或量热法检测的酶促活性来检测)和由二次报导子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。

在本申请中，术语“缓冲液”或“缓冲溶液”通常是指水性溶液，其包含酸(通常为弱酸，例如乙酸、柠檬酸、组氨酸的咪唑盐(imidazolium)形式)与其共轭碱(例如，乙酸盐或柠檬酸盐，例如乙酸钠、柠檬酸钠，或组氨酸)的混合物，或者碱(通常为弱碱，例如，组氨酸)与其共轭酸(例如，质子化的组氨酸盐)的混合物。由于“缓冲剂”赋予的“缓冲作用”，加入少量强酸或碱时，“缓冲溶液”的pH仅轻微改变。

在本申请中，术语“缓冲剂”通常是指缓冲液或缓冲溶液的酸或碱组分(通常为弱酸或弱碱)。缓冲剂有助于将给定溶液的pH维持在预定值或接近预定值，并且缓冲剂通常被选择为补足其预定值。适合地，缓冲剂是单一化合物，其产生所需的缓冲作用，尤其是当所述缓冲剂与适当量的(取决于所需的预定pH)其相应的“酸/碱共轭物”混合(并适当地能够进行质子交换)时，或者如果所需量的其相应“酸/碱共轭物”在原位形成——这可以通过加入强酸或碱直至达到所需pH而实现。例如，在乙酸钠缓冲***中，可以先使用乙酸钠(碱性)溶液，然后酸化其，例如用盐酸，或者加入到乙酸(酸性)、氢氧化钠或乙酸钠溶液中，直至达到所需的pH 值。

在本申请中，“稳定剂”通常是指有助于维持生物制药药物的结构完整性的组分，特别是在冷冻和/或冻干和/或储存期间(特别是当暴露于应激(stress)时)。这种稳定作用可以由于多种原因而产生，虽然通常这种稳定剂可起到减轻蛋白质变性的渗透剂的作用。如在本申请中所使用的，稳定剂可以是糖醇(例如，肌醇、山梨糖醇)、二糖(例如，蔗糖、麦芽糖)、单糖(例如，右旋糖(D-葡萄糖))、或者多种形式的氨基酸赖氨酸(例如，赖氨酸单盐酸盐、乙酸盐或一水合物)或者盐(例如，氯化钠)。

在本申请中，术语“稳定性”和“稳定的”通常是指在给定的制造、制备、运输、以及储存条件下，配制品中的抗体对聚集、降解或片段化的抗性。“稳定的”配制品在给定的制造、制备、运输、以及储存条件下保留生物活性。与参考配制品相比，如通过高压尺寸排阻色谱法(HP-SEC)、静态光散射(SLS)、傅立叶变换红外光谱法(FTIR)、圆二色性(CD)、尿素展开技术(urea unfolding technique)、内源色氨酸荧光、差示扫描量热法、和/或ANS结合技术所测量的，抗体的稳定性可以通过聚集、降解、或片段化的程度来评估。包含人PD-L1抗体的配制品的整体稳定性可以通过不同免疫学测定来评估，包括例如使用分离的抗原分子的ELISA和放射免疫测定。

在本申请中，术语“施用(administer)”和类似术语通常不限于身体施用，合适的方法包括体外、先体外后体内或体内方法。例如，可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与组合物接触的任何施用方法。例如，可以通过任意引入或递送途径将所述化合物引入需要治疗的受试者的身体中。在一些实施方案中，本申请的组合物可以口服、局部、鼻内、肌内、皮下、皮内、鞘内、腹膜内或经皮施用。

在本申请中，术语“离体”与“体外”可互换，通常是指在受控的环境中在已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官中进行的活动。

在本申请中，术语“诊断”通常是指检测疾病或病症，或测定疾病或病症的状态或程度。术语“诊断”也可以包括检测疾病或病症的诱因，测定药物治疗的治疗效果，或预测对药物治疗的响应模式。

在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/ 或病状相关联的症状消退。

在本申请中，术语“肿瘤”和“癌症”可互换使用，通常是指赘生性或恶性细胞生长。本申请的肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。本申请的肿瘤可能是实体的，也可能是非实体的。

在本申请中，肿瘤抗原或肿瘤抗原的“高表达”通常表示来自患者的特定组织或器官内的疾病区域如实体肿瘤的细胞中肿瘤抗原的表达水平相对于来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平异常。具有以肿瘤抗原高表达为特征的实体肿瘤或血液恶性病的患者可通过本领域已知的标准试验来确定。

在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴等。

在本申请中，“正电子发射断层摄影术”或“PET”通常是指产生身体中示踪剂位置的三维图像的非侵入性核医学技术。该方法检测由在生物活性分子上的引入身体内的正电子发射放射性核素(示踪剂)间接发射的伽马射线对。PET成像工具具有广泛多种用途并且在临床前和临床上都有助于药物开发。例示性应用包括直接可视化靶标的体内饱和；监测正常组织中的摄取以预期毒性或患者与患者之间的变化；量化病变组织；肿瘤转移；以及监测药物效力随时间的变化、或抗性随时间的变化。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约 9.5％、或约10％的范围内变动。

在本申请中，术语“包含”和其变形形式，包括“含有”、“包括”等其它形式，通常是指包含其它组分、元素、数值、步骤等。

发明详述

组合物

一方面，本申请提供了一种组合物，其可以包含：

(i)浓度为约0.1mg/mL至约50mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD- L1)结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约10mM至约80mM的缓冲剂；和

(iii)稳定剂和/或渗透压调节剂；

其中，所述组合物的pH值不低于5。

在某些实施方式中，其中所述组合物的pH值可以为约5.0-6.0。例如，所述组合物的pH 值可以为约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0。

在某些实施方式中，其中所述组合物的pH值可以为约5.5。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约0.1mg/mL至约50mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD- L1)结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约10mM至约80mM的缓冲剂；和

(iii)稳定剂和/或渗透压调节剂；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂的浓度可以为约100mM至约300mM。例如，所述稳定剂的浓度可以为约110mM至约280mM，约120mM至约260mM，约130mM至约240mM，约140mM至约220mM。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂的浓度可以为约150mM至约200mM。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂可以包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸中的一种或多种混合。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂可以包括蔗糖。

在某些实施方式中，其中所述蔗糖浓度可以为约150mM至约200mM。例如，蔗糖浓度可以为约6％(w/v)(约175mM)。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约0.1mg/mL至约50mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD- L1)结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约10mM至约80mM的缓冲剂；和

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，其中所述稳定剂还包括蛋氨酸。

在某些实施方式中，其中所述蛋氨酸浓度为约0.2mM至约20mM。例如，所述蛋氨酸浓度可以为约0.3mM至约18mM，0.4mM至约16mM，0.5mM至约14mM，0.6mM至约12mM， 0.7mM至约10mM，0.8mM至约8mM。又例如，所述蛋氨酸浓度可以为约0.2mM至约10mM， 0.2mM至约5mM，0.2mM至约4mM，0.2mM至约3mM，0.2mM至约2mM，0.2mM至约 1mM。

在某些实施方式中，其中所述蛋氨酸浓度可以为约0.8mM至约8mM。例如，所述蛋氨酸浓度可以为约1.2mg/mL(约8mM)。

在某些实施方式中，其中所述蛋氨酸浓度可以为约0.2mM至约1mM。例如，所述蛋氨酸浓度可以为约0.12mg/mL(约0.8mM)。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约0.1mg/mL至约50mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD- L1)结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约10mM至约80mM的缓冲剂；和

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖，浓度为约0.8mM至约8mM的蛋氨酸；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，其中所述缀合物浓度可以为约0.2mg/mL至约40mg/mL。例如，所述缀合物浓度可以为约0.3mg/mL至约30mg/mL，约0.4mg/mL至约25mg/mL，约0.5mg/mL 至约20mg/mL，约0.6mg/mL至约18mg/mL，约0.7mg/mL至约16mg/mL，约0.8mg/mL至约 14mg/mL，约0.9mg/mL至约12mg/mL，约1.0mg/mL至约10mg/mL。

在某些实施方式中，其中所述缀合物浓度可以为约1mg/mL至约10mg/mL。例如，所述缀合物浓度可以为约1mg/mL，约2mg/mL，约3mg/mL，约4mg/mL，约5mg/mL，约5mg/mL，约7mg/mL，约8mg/mL，约9mg/mL，约10mg/mL。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD-L1) 结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约10mM至约80mM的缓冲剂；和

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖，浓度为约0.8mM至约8mM的蛋氨酸；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，其中所述缓冲剂可以包括醋酸盐、枸橼酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐中的一种或多种混合。例如，所述缓冲剂可以为醋酸盐，又例如，所述醋酸盐可以为醋酸钠。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD-L1) 结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约10mM至约80mM的醋酸钠；和

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖，浓度为约0.8mM至约8mM的蛋氨酸；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，其中所述缓冲剂的浓度可以为约10mM至80mM。例如，所述缓冲剂的浓度为约10mM至80mM，约20mM至70mM，约30mM至60mM，约40mM至60Mm。

在某些实施方式中，其中所述缓冲剂的浓度可以为约40mM至60mM。例如，所述缓冲剂的浓度为约40mM，约41mM，约42mM，约43mM，约44mM，约45mM，约46mM，约 47mM，约48mM，约49mM，约50mM，约51mM，约52mM，约53mM，约54mM，约55mM，约56mM，约57mM，约58mM，约59mM，约60mM。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD-L1) 结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约40mM至约60mM的醋酸钠；和

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖，浓度为约0.8mM至约8mM的蛋氨酸；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，其中所述渗透压调节剂可以包括氯化钠、氯化镁、葡萄糖、山梨醇、柠檬酸钠中的一种或多种混合。例如，所述渗透压调节剂可以为氯化钠。

在某些实施方式中，其中所述渗透压调节剂浓度可以为约100mM至约300mM。例如，所述渗透压调节剂浓度可以为约110mM至约270mM，约120mM至约240mM，约130mM 至约210mM，约140mM至约180mM。

在某些实施方式中，其中所述渗透压调节剂浓度可以为约140mM至约180mM。例如，所述渗透压调节剂浓度可以为约140mM，约145mM，约150mM，约155mM，约160mM，约165mM，约170mM，约175mM，约180mM。又例如，所述渗透压调节剂浓度可以为约 150mM。又例如，所述渗透压调节剂浓度可以为约0.9％(w/v)(约154mM)。

在某些实施方式中，所述的组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含PD-L1结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约40mM至60mM的醋酸钠作为缓冲剂；

(iv)浓度为约120mM至约240mM的氯化钠作为渗透压调节剂；

其中所述制剂的pH为约5.2至约5.8。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD-L1) 结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约40mM至约60mM的醋酸钠；和

(iii)浓度为约140mM至约180mM的氯化钠；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，其中所述PD-L1结合多肽可以包括抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方式中，其中所述抗体可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或人抗体。

在某些实施方式中，其中所述抗原结合片段可以包括Fab片段、F(ab’)₂片段、Fd片段、 Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)、scFv和/或VHH。

在某些实施方式中，其中所述抗体或其抗原结合片段可以包含至少一个可变结构域。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以包含1个，2个或3个可变结构域。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包括VHH结构域。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以包含1个VHH结构域。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含：

CDR1，其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3具有一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；

CDR2，其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4具有一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，例如包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列；和

CDR3，其包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:5具有一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。

例如，其中所述可变结构域可以包含：具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR3。

例如，其中所述可变结构域可以包含：具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR3。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含SEQ ID NO:1-2、6-10、和12-16中任一项所示氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含至少一个赖氨酸残基。例如，所述可变结构域可以包含1个，2个，3个，2个，4个，5个，6个，7个，8个，9个赖氨酸残基。

在某些实施方式中，其中所述可变结构域可以包含3个赖氨酸残基。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD-L1) 结合多肽和螯合剂；所述PD-L1结合多肽为VHH，所述VHH包含SEQ ID NO:1-2、6-10、和12-16中任一项所示氨基酸序列；

(ii)浓度为约40mM至约60mM的醋酸钠；和

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖，浓度为约0.8mM至约8mM的蛋氨酸；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，其中所述螯合剂可以选自：DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10- 四乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷- N,N′,N″-三乙酸)、NETA([4-[2-(二-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮壬烷-1-基}-乙酸)、 p-NH2-Bn-NOTA(2-S-(4-氨基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、p-SCN-Bn-NOTA(2-(对异硫氰酸根合苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)。

在某些实施方式中，其中所述PD-L1结合多肽和螯合剂可以通过赖氨酸连接。

在某些实施方式中，其中所述螯合剂可以通过所述PD-L1结合多肽的氨基酸的伯胺直接附接到所述PD-L1结合多肽。

在某些实施方式中，其中所述螯合剂可以是p-SCN-Bn-NOTA。

在某些实施方式中，其中所述p-SCN-Bn-NOTA可以通过异硫氰根基团与所述PD-L1结合多肽的赖氨酸末端的氨基反应直接附接到所述PD-L1结合多肽。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD-L1) 结合多肽和螯合剂；所述PD-L1结合多肽为VHH，所述VHH包含SEQ ID NO:1-2、6-10、和12-16中任一项所示氨基酸序列；所述螯合剂可以是p-SCN-Bn-NOTA；所述p-SCN-Bn-NOTA可以通过异硫氰根基团与所述PD-L1结合多肽的赖氨酸末端的氨基反应直接附接到所述PD-L1结合多肽；

(ii)浓度为约40mM至约60mM的醋酸钠；和

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖，浓度为约0.8mM至约8mM的蛋氨酸；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

在某些实施方式中，所述VHH与1个、2个或3个p-SCN-Bn-NOTA结合。

在某些实施方式中，所述组合物还可以包含至少一种可检测标记。

在某些实施方式中，其中所述可检测标记可以与所述缀合物相结合。

在某些实施方式中，其中所述可检测标记可以选自放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁粒子和酶。

本申请的缀合物可以根据标记的不同可应用于单光子发射计算机断层成像术(Single- Photon Emission Computed Tomography，SPECT)和正电子发射断层成像术(Positron Emission Tomography，PET)。在肿瘤诊断中可提供高分辨率的肿瘤成像并且可通过图像进行定量分析。所述SPECT成像还可以包括SPECT/CT成像，且所述PET成像还可以包括PET/CT成像，其可以提供更优的成像效果。

在某些实施方式中，其中所述放射性核素可以选自：¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁸Ge、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、^94mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、^52mMn、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr或其它γ-、β-、或正电子发射体。

在某些实施方式中，其中所述放射性核素可以为⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。

在某些实施方式中，所述可检测标记通过正电子发射断层摄影术可检测。

在某些实施方式中，所述的组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含PD-L1结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约40mM至60mM的醋酸钠作为缓冲剂；

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖作为稳定剂；

其中所述组合物的pH可以为约5.2至约5.8。

在某些实施方式中，所述组合物的pH可以为约5.4至约5.6。

在某些实施方式中，所述组合物的pH可以为约5.5。

在某些实施方式中，所述蔗糖的浓度可以为约160mM至约180mM。

在某些实施方式中，其还可以包含约0.2mM至约20mM的蛋氨酸作为稳定剂。

在某些实施方式中，所述PD-L1结合多肽可以为VHH。

在某些实施方式中，所述VHH可以包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述螯合剂可以为p-SCN-Bn-NOTA。

在某些实施方式中，所述组合物还可以包括可检测标记，所述可检测标记为⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。

例如，所述组合物可以包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD-L1) 结合多肽和螯合剂；所述PD-L1结合多肽为VHH，所述VHH包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列；所述螯合剂是p-SCN-Bn-NOTA；所述p-SCN-Bn-NOTA通过异硫氰根基团与所述PD-L1结合多肽的赖氨酸末端的氨基反应直接附接到所述PD-L1结合多肽；其中所述缀合物可以与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga结合；

(ii)浓度为约40mM至约60mM的醋酸钠；和

(iii)浓度为约160mM至约180mM的蔗糖，浓度为约0.8mM至约8mM的蛋氨酸；

其中，所述组合物的pH值可以为约5.5。

检测/诊断用途

另一方面，本申请还提供一种PD-L1检测方法，所述方法可以包括：施用有效量的前述的组合物。

在某些实施方式中，其中所述施用可以在体外或离体进行。

在某些实施方式中，其中所述施用可以包括使细胞、器官或组织与所述组合接触的任何方法。

例如，所述方法可以包括：

a)在本申请的缀合物与PD-L1之间能够形成复合物的条件下，使生物学样品(例如，细胞、器官或组织)和对照样品接触本申请的组合物；

b)检测复合物的形成，

其中所述生物学样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中PD-L1的存在和/或 PD-L1的表达水平。

在某些实施方式中，所述方法还包括检测或量化所述可检测标记。

在某些实施方式中，所述方法还包括获得表达PD-L1的细胞、器官或组织的图像。

另一方面，本申请还提供一种检测和/或诊断与PD-L1相关的疾病的方法，所述方法可以包括：向受试者施用前述的组合物。

在某些实施方式中，所述方法还可以包括检测或量化所述可检测标记。

在某些实施方式中，所述方法还可以包括对受试者进行ECT成像。在一些实施方案中，所述ECT成像可以是SPECT成像。在一些实施方案中，所述ECT成像可以是PET成像。用于通过SPECT或PET扫描的成像技术和装置是本领域公知的且可使用任何此类己知的ECT 成像技术和装置。

例如，所述方法可以包括：

a)对有此需要的受试者施用本申请所述的组合物；和

b)获得所述受试者的至少一部分的放射性图像以检测所述组合物的存在或缺乏；

其中高于背景的组合物的存在和位置指示PD-L1或表达PD-L1的肿瘤的存在和位置。

在某些实施方式中，其中所述与PD-L1相关的疾病可以包括肿瘤。

在某些实施方式中，所述肿瘤可以高表达PD-L1。非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤(例如转移的恶性黑色素瘤)、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、***、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本申请的方法检测和/或诊断的其他癌症的例子包括但不限于：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、***癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***癌、***癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、输尿管癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、 T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。本发明也可用于检测和/或诊断转移性癌，特别是表达PD-L1的转移性癌(Iwai等(2005)Int Immunol 17： 133-144)。

本申请还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其可以包括：

a)对有此需要的受试者施用本申请所述的组合物，并且获得受试者的至少一部分的图像 (静态或动态)，以确定PD-L1在一个多个肿瘤中的存在；并且如果受试者在一个肿瘤或在几个肿瘤中具有的PD-L1水平等于或高于需要用PD-1或PD-L1拮抗剂治疗的水平，那么，

b)对所述受试者施用抗肿瘤治疗，例如，抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用的药剂(PD- 1或PD-L1拮抗剂)。

本申请还提供了一种监测针对受试者中的表达PD-L1的肿瘤的抗肿瘤治疗的进展的方法，所述方法可以包括：

a)在第一时间点对有此需要的受试者施用本申请所述的组合物并获得受试者的至少一部分的图像以确定肿瘤的大小；

b)对受试者施用抗肿瘤治疗；

c)在一个或多个随后的时间点对受试者施用所述组合物，并且获得在每个时间点的受试者的至少一部分的图像；

其中在每个时间点的肿瘤的尺寸和位置指示疾病的进展。

试剂盒与成像剂

另一方面，本申请还提供前述的组合物在制备药物中的应用，所述药物用于检测PD-L1。

在某些实施方式中，所述药物为PD-L1成像剂。

另一方面，本申请还提供一种PD-L1成像剂，所述PD-L1成像剂包含前述的组合物。

在某些实施方案中，所述PD-L1成像剂包含PD-L1结合多肽(例如包含SEQ ID NO:1-2、 6-10、和12-16中任一项所示氨基酸序列的抗PD-L1抗体)、螯合剂p-SCN-Bn-NOTA和放射性核素⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。

另一方面，本申请还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含前述的组合物。

在某些实施方式中，其中所述组合物与可检测标记可以存在于分开的剂型中。

在某些实施方式中，所述试剂盒可以包括容器和标签。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。所述容器可以容纳本申请所述的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的活性剂是本申请所述的缀合物或其衍生物或前体。所述制品可以进一步包括第二容器。第二容器包含本申请所述的可检测标记。它可以进一步包括立足于商业和用户立场所需的其他物品，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装说明书。

本申请包含以下实施方案：

1.一种组合物，其包含：

(i)浓度为约0.1mg/mL至约50mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD- L1)结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约10mM至约80mM的缓冲剂；和

(iii)稳定剂和/或渗透压调节剂；

其中，所述组合物的pH值不低于5。

2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述组合物的pH值为约5.0-6.0。

3.根据实施方案1-2中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH值为约5.2-5.8。

4.根据实施方案1-3中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH值为约5.4-5.6。

5.根据实施方案1-4中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂的浓度为约100mM至约 300mM。

6.根据实施方案1-5中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂的浓度为约140mM至约 220mM。

7.根据实施方案1-6中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂的浓度为约150mM至约 200mM。

8.根据实施方案1-7中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸中的一种或多种混合。

9.根据实施方案1-8中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂包括蔗糖。

10.根据实施方案9所述的组合物，其中所述蔗糖浓度为约150mM至约200mM。

11.根据实施方案1-10中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂还包括蛋氨酸。

12.根据实施方案11所述的组合物，其中所述蛋氨酸浓度为约0.2mM至约20mM。

13.根据实施方案1-12中任一项所述的组合物，其中所述缀合物浓度为约0.2mg/mL至约 40mg/mL。

14.根据实施方案1-13中任一项所述的组合物，其中所述缀合物浓度为约0.5mg/mL至约 20mg/mL。

15.根据实施方案1-14中任一项所述的组合物，其中所述缀合物浓度为约1mg/mL至约 10mg/mL。

16.根据实施方案1-15中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包括醋酸盐、枸橼酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐中的一种或多种混合。

17.根据实施方案1-16中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约10mM至80mM。

18.根据实施方案1-17中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约40mM至 60mM。

19.根据实施方案1-18中任一项所述的组合物，其中所述渗透压调节剂包括氯化钠、氯化镁、葡萄糖、山梨醇、柠檬酸钠中的一种或多种混合。

20.根据实施方案1-19中任一项所述的组合物，其中所述渗透压调节剂浓度为约100mM 至约300mM。

21.根据实施方案1-20中任一项所述的组合物，其中所述渗透压调节剂浓度为约120mM 至约240mM。

22.根据实施方案1-21中任一项所述的组合物，其中所述PD-L1结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。

23.根据实施方案1-22中任一项所述的组合物，其中所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或人抗体。

24.根据实施方案1-23中任一项所述的组合物，其中所述抗原结合片段包括Fab片段、 F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)、scFv和/或VHH。

25.根据实施方案22-24中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个可变结构域。

26.根据实施方案25所述的组合物，其中所述可变结构域包括VHH结构域。

27.根据实施方案25-26中任一项所述的组合物，其中所述可变结构域包含：具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQID NO:5所示氨基酸序列的CDR3。

28.根据实施方案25-27中任一项所述的组合物，其中所述可变结构域包含：具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的CDR2；和具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR3。

29.根据实施方案25-28中任一项所述的组合物，其中所述可变结构域包含SEQ IDNO: 1-2、6-10、和12-16中任一项所示氨基酸序列。

30.根据实施方案25-29中任一项所述的组合物，其中所述可变结构域包含至少一个赖氨酸残基。

31.根据实施方案25-30中任一项所述的组合物，其中所述可变结构域包含3个赖氨酸残基。

32.根据实施方案1-31中任一项所述的组合物，其中所述螯合剂选自：DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、 NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N′,N″-三乙酸)、NETA([4-[2-(二-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基- [1,4,7]三氮壬烷-1-基}-乙酸)、p-NH2-Bn-NOTA(2-S-(4-氨基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、p-SCN-Bn-NOTA(2-(对异硫氰酸根合苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)。

33.根据实施方案1-32中任一项所述的组合物，其中所述PD-L1结合多肽和螯合剂通过赖氨酸连接。

34.根据实施方案1-33中任一项所述的组合物，其中所述螯合剂通过所述PD-L1结合多肽的氨基酸的伯胺直接附接到所述PD-L1结合多肽。

35.根据实施方案1-34中任一项所述的组合物，其中所述螯合剂是p-SCN-Bn-NOTA。

36.根据实施方案35所述的组合物，其中所述p-SCN-Bn-NOTA通过异硫氰根基团与所述PD-L1结合多肽的赖氨酸末端的氨基反应直接附接到所述PD-L1结合多肽。

37.根据实施方案1-36中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种可检测标记。

38.根据实施方案37所述的组合物，其中所述可检测标记与所述缀合物相结合。

39.根据实施方案37-38中任一项所述的组合物，其中所述可检测标记选自放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁粒子和酶。

40.根据实施方案39所述的组合物，其中所述放射性核素选自：：¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁸Ge、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、^94mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、^52mMn、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr或其它γ-、β-、或正电子发射体。

41.根据实施方案40所述的组合物，其中所述放射性核素为67Ga或68Ga。

42.根据实施方案37-41中任一项所述的组合物，所述可检测标记通过正电子发射断层摄影术可检测。

43.根据实施方案1-42中任一项所述的组合物，其包含

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含PD-L1结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约40mM至60mM的醋酸钠作为缓冲剂；

(iv)浓度为约120mM至约240mM的氯化钠作为渗透压调节剂；

其中所述制剂的pH为约5.2至约5.8。

44.根据实施方案1-42中任一项所述的组合物，其包含：

(i)浓度为约1mg/mL至约10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含PD-L1结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为约40mM至60mM的醋酸钠作为缓冲剂；

(iii)浓度为约150mM至约200mM的蔗糖作为稳定剂；

其中所述组合物的pH为约5.2至约5.8。

45.根据实施方案44所述的组合物，所述组合物的pH为约5.4至约5.6。

46.根据实施方案44-45中任一项所述的组合物，所述组合物的pH为约5.5。

47.根据实施方案44-46中任一项所述的组合物，所述蔗糖的浓度为约160mM至约180mM。

48.根据实施方案44-47中任一项所述的组合物，其还包含约0.2mM至约20mM的蛋氨酸作为稳定剂。

49.根据实施方案1-48中任一项所述的组合物，所述PD-L1结合多肽为VHH。

50.根据实施方案1-49中任一项所述的组合物，所述VHH包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。

51.根据实施方案1-50中任一项所述的组合物，所述螯合剂为p-SCN-Bn-NOTA。

52.根据实施方案1-51中任一项所述的组合物，所述组合物还包括可检测标记，所述可检测标记为⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。

53.一种PD-L1检测方法，所述方法包括：施用有效量的实施方案1-52中任一项所述的组合物。

54.根据实施方案53所述的方法，其中所述施用在体外或离体进行。

55.根据实施方案54所述的方法，其中所述施用包括使细胞、器官或组织与所述组合接触的任何方法。

56.根据实施方案53-55中任一项所述的方法，所述方法还包括检测或量化所述可检测标记。

57.根据实施方案53-56中任一项所述的方法，所述方法还包括获得表达PD-L1的细胞、器官或组织的图像。

58.一种检测和/或诊断与PD-L1相关的疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用实施方案1-52中任一项所述的组合物。

59.根据实施方案58所述的方法，所述方法还包括检测或量化所述可检测标记。

60.根据实施方案58-59中任一项所述的方法，所述方法还包括对受试者进行ECT成像。

61.根据实施方案58-60中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1相关的疾病包括肿瘤。

62.根据实施方案61所述的方法，所述肿瘤高表达PD-L1。

63.实施方案1-52中任一项所述的组合物在制备药物中的应用，所述药物用于检测PD- L1。

64.根据实施方案63所述的应用，所述药物为PD-L1成像剂。

65.PD-L1成像剂，所述PD-L1成像剂包含根据实施方案1-52中任一项所述的组合物。

66.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案1-52中任一项所述的组合物。

67.根据实施方案66所述的试剂盒，其中所述组合物与可检测标记存在于分开的剂型中。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的组合物、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。在本申请中，抗PD-L1抗体如PCT/CN2019/093225 中所披露的，将所述文献通过引用以其全部内容并入本文。

实施例

材料与试剂

仪器

LabSolution版本6.72SP的SHIMADZU HPLC

Denovix DS-11分光光度计

TSKgel G2000SWXL，内径7.8mm×30cm，5μm，零件编号0008540

MabPac RP，2.1mm ID×100mm，4μm，PN088647

Thermo ProPac CEX-10，4x250mm，产品编号054993，序列号032566

集成电子多通道移液器，1250μL，300μL和50μL

Spectra Max Plus酶标仪

微孔板洗涤仪405TS

Thermo Orion star A215 pH/电导仪

方法

除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

SEC方法：

色谱柱为TSKgel G2000SWXL 7.8mm×300mm,5μm，硅胶填料；流动相为50mM PB，300mMNaCl，pH7.2；紫外检测波长280nm；流速为0.6ml/min；柱温为25℃，等度洗脱，洗脱时间25min,进样50μg。

RP-HPLC方法：

色谱柱为Thermo Scientific^TM MAbPac^TM RP,4μm，2.1×100mm，流动相A为0.1％TFA in UPW，流动相B为0.1％TFA in 90％ACN；紫外检测波长280nm；流速为0.6ml/min；柱温为80℃，梯度洗脱，洗脱时间31min。进样10μL。

UV280浓度检测方法：

本法基于sdAb和Nota-Lys在280nm处均有特征吸收进行分析，偶联产物sdAbC在280 nm处的OD值为Nota-Lys和sdAb的OD值之和。根据sdAb和Nota-Lys在280nm处的摩尔消光系数以及DAR值，可求得sdAbC的浓度。

结合活性方法：

96孔酶标板中包被PDL1-Fc蛋白，封闭后分别加入梯度稀释的参比品和供试品溶液进行抗体孵育，结束后再加入酶标二抗孵育，最后通过TMB显色及反应终止后，在酶标仪上读取 450nm波长处的吸光度值A450。A450值与偶联原液浓度反相关。以样品蛋白浓度为X轴， A450值为Y轴，使用SoftMax Pro计算机软件中的四参数拟合回归模型绘制曲线，得出各检测样品的EC50，通过计算标准品和样品的EC50比值来报告样品的相对活性。

实施例1

1.1预制剂配方

本实施例中，所述的缀合物为SNA002-NOTA，其由抗PD-L1单域抗体(VHH)和p-SCN-Bn-NOTA结合形成，所述VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，且所述VHH包含3个赖氨酸残基，所述p-SCN-Bn-NOTA通过其异硫氰根基团与所述VHH的赖氨酸末端的氨基反应直接附接到所述VHH，其结构示意图如图1所示。其中，所述p-SCN-Bn-NOTA可以通过配位作用与放射性元素(例如，⁶⁷Ga或⁶⁸Ga)连接。

如表1所示，将SNA002-NOTA配制成8种不同的3mg/mL或10mg/mL缓冲液。将预制剂在70±10℃，25±2℃/60±5％RH和40±2℃/75±5％RH的条件下保存最多四个星期。还通过在室温下以300rpm震荡(搅拌)72小时，并在-70±10℃下冷冻并在25℃下解冻(冻/融，Fz/Th)，最多5个循环来评估预制剂。通过SEC，RP-HPLC，UV280浓度和结合ELISA对样品进行测试。

表1预制剂配方

1.2实验结果

本申请实施例1中的配方在不同保存条件下外观表现为透明、无色溶液，所有样品基本上不含可见颗粒物。

本申请实施例1中的配方在不同保存条件下的UV280测定的结果如图2所示，SEC测定的结果如图3所示，平均药物/抗体比率(Average DAR)的变化率(RP-HPLC测定的结果)如图4所示。本申请实施例1中的配方在不同保存条件下以T0作为参比的缀合物在ELISA 测定中的结果如图5所示。

以上结果显示，在不同条件下，各条件样品的SEC和RP-HPLC检测没有明显差异，所有样品均未见残留NOTA增加。F2和F7制剂配方在所有试验条件下的变化最小。F3和F8 在40℃下保存4周相对活性有所下降，其他样品相对抗原结合力没有明显变化。将配方2或配方7用于下一轮配方确认研究。

实施例2

2.1制剂配方

将甲硫氨酸作为抗氧化剂添加到实施例1中的F7中。如表2所示，将SNA002-NOTA配制成4种不同的配方，pH为5.5，浓度为2mg/mL。制剂在-70±10℃，5±3℃和40±2℃/75±5％ RH下保存长达12周。还通过在室温下以300rpm震荡66小时，并冷冻/解冻(在-70±10℃下冷冻并在25℃下解冻)最多5个循环来评估制剂。通过SEC，RP-HPLC，UV280浓度和结合ELISA对样品进行测试。

表2制剂配方列表

2.2实验结果

本申请实施例2中的配方在搅拌条件下在样品中在UV 350nm测定中的结果如表3所示。

表3

制剂配方	350nm(Turbidity)	280nm(FIO)
			F1	1.2951	7.6049
F2	1.7457	8.7881
			F3	0.0441	5.4667
F4	1.7025	8.6107

结果显示，除了F3没有浑浊，其他均有升高，F2和F3只有L-甲硫氨酸的差异。后续确认实验仅采用F2和F3进行比较研究。

本申请实施例2中的配方在不同保存条件下的UV280浓度测定的结果如图6所示，SEC测定的结果如图7所示，RP-HPLC测定的结果如图8所示。本申请实施例2中的配方在不同保存条件下以T0作为参比的缀合物在ELISA测定中的结果如图9所示。

结果显示，F1、F2和F4在搅拌条件下呈现浑浊，分别检测UV350浊度、浓度、结合活性和SEC纯度，除F3外，其余各制剂配方均有显著降低。因此F1和F4在4周后停止研究。通过几种关键分析方法，F2和F3之间没有发现显著差异，只是F3是搅拌后候选物中最清晰的外观。F3比F2多了一种赋形剂蛋氨酸，蛋氨酸被认为是一种稳定剂，可以保护蛋白质免受构象不稳定、热应力和震荡(搅拌)应力引起的聚集以及化学降解的影响。

序列表

<110> 苏州智核生物医药科技有限公司

<120> 组合物及其用途

<130> 0173-PA-003

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Ser

            20                  25                  30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val Cys Gln Leu Val

        35                  40                  45

Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Lys

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Arg Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr Cys Glu Gly Asp

            100                 105                 110

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210> 2

<211> 142

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-chis

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Ser

            20                  25                  30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val Cys Gln Leu Val

        35                  40                  45

Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Lys

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Arg Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr Cys Glu Gly Asp

            100                 105                 110

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser

        115                 120                 125

Met Asp Pro Gly Gly Ser His His His His His His His His

    130                 135                 140

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1

<400> 3

Gly Phe Ser Leu Asp Asp Ser Asp Met Gly

1               5                   10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2

<400> 4

Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Lys Gly

1               5                   10                  15

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR3

<400> 5

Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr Cys Glu Gly Asp Phe

1               5                   10                  15

Ala Tyr

<210> 6

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-K86R&P87A-cHis

<400> 6

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val

            20                  25                  30

Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser

        35                  40                  45

Leu Asp Asp Ser Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val

    50                  55                  60

Cys Gln Leu Val Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr

65                  70                  75                  80

Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Arg Ala Lys Asn

                85                  90                  95

Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr

        115                 120                 125

Cys Glu Gly Asp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

    130                 135                 140

Ser Ser Gly Ser Met Asp Pro Gly Gly Ser His His His His His His

145                 150                 155                 160

His His

<210> 7

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-RDNSE-cHis

<400> 7

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val

            20                  25                  30

Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser

        35                  40                  45

Leu Asp Asp Ser Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val

    50                  55                  60

Cys Gln Leu Val Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr

65                  70                  75                  80

Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn

                85                  90                  95

Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr

        115                 120                 125

Cys Glu Gly Asp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

    130                 135                 140

Ser Ser Gly Ser Met Asp Pro Gly Gly Ser His His His His His His

145                 150                 155                 160

His His

<210> 8

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-K64Q-cHis

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val

            20                  25                  30

Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser

        35                  40                  45

Leu Asp Asp Ser Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val

    50                  55                  60

Cys Gln Leu Val Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr

65                  70                  75                  80

Pro Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Arg Ala Lys Asn

                85                  90                  95

Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr

        115                 120                 125

Cys Glu Gly Asp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

    130                 135                 140

Ser Ser Gly Ser Met Asp Pro Gly Gly Ser His His His His His His

145                 150                 155                 160

His His

<210> 9

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-R73N&K75E-cHis

<400> 9

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val

            20                  25                  30

Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser

        35                  40                  45

Leu Asp Asp Ser Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val

    50                  55                  60

Cys Gln Leu Val Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr

65                  70                  75                  80

Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Glu Asn

                85                  90                  95

Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr

        115                 120                 125

Cys Glu Gly Asp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

    130                 135                 140

Ser Ser Gly Ser Met Asp Pro Gly Gly Ser His His His His His His

145                 150                 155                 160

His His

<210> 10

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-K64Q-RDNSE-cHis

<400> 10

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val

            20                  25                  30

Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser

        35                  40                  45

Leu Asp Asp Ser Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val

    50                  55                  60

Cys Gln Leu Val Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr

65                  70                  75                  80

Pro Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn

                85                  90                  95

Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr

        115                 120                 125

Cys Glu Gly Asp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

    130                 135                 140

Ser Ser Gly Ser Met Asp Pro Gly Gly Ser His His His His His His

145                 150                 155                 160

His His

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2

<400> 11

Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Gln Gly

1               5                   10                  15

<210> 12

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-K86R&P87A

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Ser

            20                  25                  30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val Cys Gln Leu Val

        35                  40                  45

Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Lys

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Arg Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr Cys Glu Gly Asp

            100                 105                 110

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210> 13

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-RDNSE

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Ser

            20                  25                  30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val Cys Gln Leu Val

        35                  40                  45

Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Lys

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Ile Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr Cys Glu Gly Asp

            100                 105                 110

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210> 14

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-K64Q

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Ser

            20                  25                  30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val Cys Gln Leu Val

        35                  40                  45

Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Gln

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Arg Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr Cys Glu Gly Asp

            100                 105                 110

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210> 15

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-R73N&K75E

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Ser

            20                  25                  30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val Cys Gln Leu Val

        35                  40                  45

Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Lys

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Glu Asn Thr Ile Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr Cys Glu Gly Asp

            100                 105                 110

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210> 16

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 109-K64Q-RDNSE

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asp Ser

            20                  25                  30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Arg Gly Asn Val Cys Gln Leu Val

        35                  40                  45

Ser Thr Ile Ala Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Val Gln

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Ile Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Pro Arg Leu Ala Tyr Thr Thr Ala Met Thr Cys Glu Gly Asp

            100                 105                 110

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

Claims (11)

1.一种组合物，其组成为：

(i)浓度为1mg/mL至10mg/mL的缀合物，所述缀合物包含程序性死亡配体1(PD-L1)结合多肽和螯合剂；

(ii)浓度为40mM至60mM的醋酸钠作为缓冲剂；

(iii)浓度为160mM至180mM的蔗糖作为稳定剂；和(iv)浓度为0.2mM至1mM的蛋氨酸作为稳定剂；

其中，所述组合物的pH为5.4至5.6；所述PD-L1结合多肽为VHH，所述VHH为SEQ ID NO:10所示氨基酸序列，所述螯合剂为p-SCN-Bn-NOTA，所述p-SCN-Bn-NOTA通过异硫氰根基团与所述PD-L1结合多肽的赖氨酸末端的氨基反应直接附接到所述PD-L1结合多肽。

2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含至少一种可检测标记。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述可检测标记与所述缀合物相结合。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述可检测标记选自放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁粒子和酶。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述放射性核素选自：¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁸Ge、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、^94mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、^52mMn、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr或其它γ-、β-、或正电子发射体。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述放射性核素为⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。

7.根据权利要求2所述的组合物，所述可检测标记通过正电子发射断层摄影术可检测。

8.一种非诊断治疗目的的PD-L1检测方法，所述方法包括：施用有效量的权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述施用在体外或离体进行。

9.根据权利要求8所述的方法，所述方法还包括检测或量化所述可检测标记。

10.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-7中任一项所述的组合物。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述组合物与可检测标记存在于分开的剂型中。

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