CN113493751A

CN113493751A - 一株动物双歧杆菌在潜在干预糖尿病的应用

Info

Publication number: CN113493751A
Application number: CN202110645457.8A
Authority: CN
Inventors: 孟祥晨; 朱宗涛; 尚佳萃; 赵乐
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2021-06-10
Filing date: 2021-06-10
Publication date: 2021-10-12

Abstract

本发明公开一株动物双歧杆菌作为潜在的干预糖尿病作用菌株的应用，属于食品微生物及乳酸菌益生技术领域。以阳性对照菌株动物双歧杆菌BB12、受试菌株20‑9和15‑2为研究对象，分析三者的抗氧化性质，α‑葡萄糖苷酶活力抑制能力，对酸、胆盐和模拟消化道环境的抗性、粘附能力和粘附抑制能力。结果表明：动物双歧杆菌15‑2完整细胞和细胞提取物的羟自由基清除能力和还原能力高于菌株20‑9和菌株BB12，α‑葡萄糖苷酶活力抑制能力高于菌株20‑9，两者抑制率分别为26.90％和12.83％。菌株15‑2经模拟消化道后的存活率和对Caco‑2细胞的粘附率均强于菌株20‑9和菌株BB12。菌株15‑2对酸耐受性高于菌株20‑9和BB12，在胆盐和粘附抑制能力方面虽略逊于菌株BB12，但仍优于菌株20‑9。因此，动物双歧杆菌15‑2可以作为潜在的干预糖尿病作用菌株进一步用于动物实验。研究结果为进一步研究动物双歧杆菌对糖尿病的潜在干预作用奠定基础。

Description

一株动物双歧杆菌在潜在干预糖尿病的应用

技术领域

本发明属于乳酸菌益生及食品微生物技术领域，涉及一株动物双歧杆菌在潜在的干预糖尿病的应用。

背景技术

随着城市化的发展和生活方式的改变，人们逐渐形成了高脂饮食、运动量减少等不良的生活***衡肠道微生物和调节免疫等方式来降低血糖。氧化应激是指损害脂质、蛋白质和DNA的氧自由基水平升高。α- 葡萄糖苷酶是来自小肠刷状缘膜的酶，其功能是促进淀粉和多糖等碳水化合物水解成易被吸收单糖，抑制其活性，可以降低葡萄糖吸收，利于降低餐后血糖。

研究表明动物双歧杆菌01具有抗氧化作用；两歧双歧杆菌F-35发酵上清具有抑制α-葡萄糖苷酶活力的能力；鼠李糖乳杆菌CCFM0528可以降低Ⅱ型糖尿病小鼠的餐后血糖水平，这可能与鼠李糖乳杆菌CCFM0528抑制α-葡萄糖苷酶活力有关，并且体外实验已经证实了鼠李糖乳杆菌CCFM0528具有抑制α-葡萄糖苷酶活力的能力。本研究主要比较了两株动物双歧杆菌包括DPPH清除能力、羟自由基清除能力、还原能力在内的抗氧化能力、α-葡萄糖苷酶活力抑制能力、对模拟消化道环境的抗性和粘附Caco-2细胞的能力，通过体外筛选方法，获得具有潜在干预糖尿病作用的双歧杆菌菌株，为糖尿病的预防与治疗提供参考。

发明内容

发明目的：提供一株动物双歧杆菌在潜在的干预糖尿病的应用。

本发明解决的技术问题：提供一株动物双歧杆菌在潜在的干预糖尿病的应用，帮助解决以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病的问题，同时为本领域人员进一步研究预防与治疗糖尿病提供研究基础。

本发明公开了以下技术效果：本发明通过体外筛选方法，获得具有潜在干预糖尿病作用的双歧杆菌菌株。结果表明动物双歧杆菌15-2具有潜在的干预糖尿病作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；

图1为菌株完整细胞和细胞提取物的DPPH清除能力(a)羟自由基清除能力(b)及还原能力(c)；

图2为菌株在pH＝2和pH＝3条件下37℃孵育时的存活率；

图3为菌株对不同浓度胆盐的耐受性；

图4为菌株黏附Caco-2细胞的能力；

图5为菌株的竞争性粘附抑制(a)，排除性粘附抑制(b)和替代性粘附抑制(c) 能力；

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

实施例1

一株动物双歧杆菌在潜在干预糖尿病的应用

1.材料与方法

1.1实验材料

一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)H15-2，所述动物双歧杆菌H15-2为双歧杆菌属(Bifidobacterium)，已保藏于东北农业大学菌种库，保藏日期为2017年6月20 日，保藏编号为H15-2。

α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡葡糖苷(PNPG)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司；1，10-邻菲罗啉、三氯乙酸(TCA)、30％过氧化氢(H₂O₂)、硫酸亚铁(FeSO₄)、铁***、三氯化铁(FeCl₃)国产分析纯；Caco-2细胞中国科学院上海细胞库。

1.2菌株完整细胞和无细胞提取物的制备

将在mMRS培养基中培养18h的菌液在4℃、8000r/min离心10min。PBS清洗2 次后，菌体重悬于PBS中，并将菌体调整到1×10⁹CFU/mL，此为完整细胞菌悬液。此菌悬液在冰浴条件下进行超声破碎，超声破碎条件为：功率200W，每工作5s，停8s，共10min。超声后的破碎液在12000r/min条件下离心20min，上清经过0.22μm的滤膜过滤，即为无细胞提取物。

1.3菌株抗氧化能力的测定

1.3.1乳酸菌无细胞提取物DPPH清除率的测定

取乳酸菌无细胞提取物1mL加入试管中，再加入1mL 0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，充分混匀后，避光反应30min，然后取上清液，于517nm处测定吸光值，以等体积的PBS代替样品溶液作为对照组。按照以下公式计算：DPPH自由基清除率(％)＝(1-A₅₁₇样品/A₅₁₇对照)×100。式中：A₅₁₇样品和A₅₁₇对照分别为样品组和对照组在517nm处测得的吸光值。

1.3.2乳酸菌无细胞提取物清除羟自由基能力的测定

将2.5mmol/L的1，10-菲啰啉溶液、PBS(pH7.4)和样品溶液各1mL混匀，再加入1 mL2.5mmol/L的FeSO₄溶液，充分混匀后加入1mL 20mmol/L的H₂O₂溶液。将混合液放入37℃水浴中恒温反应1.5h。6000r/min离心10min收集上清，于536nm波长处测定其吸光值。同时按照上述方法，以1mLPBS替代混合液中1mL待测样品溶液作为空白对照组，测定在536nm处的吸光值。按照以下公式计算：羟自由基清除率(％)＝(1-A₅₃₆样品/A₅₃₆对照)×100。式中：A₅₃₆样品和A₅₃₆对照分别为样品组和对照组在波长536nm处测得的吸光值。

1.3.3乳酸菌无细胞提取物还原能力的测定

取0.5mL待测无细胞提取物，向其中加入0.5mL 1％铁***溶液及0.5mL PBS(pH6.6)，混匀后置于50℃水浴恒温反应20min。从水浴中取出后放入冰浴中急速冷却，再加入0.5mL10％的三氯乙酸溶液，混匀后离心收集上清(3000r/min，10min)。取上清液1mL，再加入1mL 0.1％的三氯化铁溶液，混合均匀。10min后在700nm处测定其吸光值，其中以L-半胱氨酸盐酸盐作为标品。同时，将上述混合液中的样品换成蒸馏水作为对照组，于 700nm波长处测定其吸光值。吸光值越大表示待测样品的还原能力越强。

1.4菌株对α-葡萄糖苷酶活力抑制能力的测定

将20μL 0.1mol/L的PBS(pH 7.0)，20μL 2.5mmol/L PNPG，20μL 0.2U/mL的α- 葡萄糖苷酶溶液与20μL菌悬液或无细胞提取物充分混合，在37℃水浴15min，加入80μL0.2mol/L的Na₂CO₃终止反应。在405nm处测量反应液的吸光值。吸光值与对硝基酚(PNP) 的游离量成正比。反应体系中采用pH 7.0的0.1mol/L PBS作为α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的空白对照，采用以下公式计算样品的抑制活性：酶活性抑制率(％)＝[1-(C-D)/(A-B)]×100。式中：A为含有α-葡萄糖苷酶不含样品的测定吸光值；B为不含α-葡萄糖苷酶及样品的测定吸光值；C为含有α-葡萄糖苷酶及样品的测定吸光值；D为不含α-葡萄糖苷酶但含样品的测定吸光值。

1.5菌株耐受性实验

1.5.1酸耐受实验

在37℃，pH2、3的条件下对菌株进行孵育，并测定存活率，存活率为各自pH条件下不同孵育时间活菌数的对数值与其孵育0h活菌数对数值比值的百分数。

1.5.2胆盐耐受实验

参照1.5.1所述方法，在胆盐浓度0.3％、0.5％和1％的条件下进行实验。

1.5.3模拟消化道耐受实验

参照1.5.1所述方法。

1.6菌株粘附能力实验

黏附试验需在孔板中进行，12孔板铺板过程如下(接种密度为2×10⁵cells/well)：在孔板各孔中加入500μL经PBS洗涤2遍、胰酶消化、离心并重悬于DMEM培养基中的Caco-2 细胞悬液，补加500μL细胞培养基使培养体系为1mL/well，以8或十字型充分混合均匀(非常关键)以防止细胞在孔板中分散不均而脱落，封口置于CO₂培养箱中培养。每2d换一次液。待细胞长至单层后(即达到完全分化状态，约7d左右)方可进行黏附试验(试验前24 h需将细胞培养基换为无双抗培养基)：培养好的双歧杆菌过夜培养物经离心、洗涤2遍后悬于无双抗的DMEM培养基中，调整菌体浓度为10⁸CFU/mL。弃去孔板中旧的培养基，洗涤细胞层2遍后按1mL/well加入菌悬液，置于培养箱中培养2h。培养结束后，细胞和黏附的菌体经漂洗5遍、消化5min、终止消化后将洗脱下来的细胞与黏附的菌体收集到离心管中。稀释并涂布于mMRS固体琼脂培养皿上，通过计算每孔黏附后菌数与黏附前加入每孔菌数的比值来评价黏附能力的大小。

1.7统计分析

采用SPSS 20.0进行数据处理及显著性分析，每个实验重复3次。

2结果

2.1DPPH清除能力

如图1所示，动物双歧杆菌BB12、H15-2和H20-9的完整细胞和细胞提取物都具有DPPH清除能力。动物双歧杆菌H15-2和H20-9-完整细胞DPPH清除率均显著低于BB12(p ＜0.05)，菌株H15-2和H20-9之间无显著差异(p＞0.05)。菌株H15-2和H20-9细胞提取物 DPPH清除率显著高于BB12(p＜0.05)，其中，菌株H20-9高于菌株15-2，两者之间差异显著(p＜0.05)。

2.2羟自由基清除能力

动物双歧杆菌BB12，15-2和20-9完整细胞和细胞提取物都具有羟自由基清除能力。动物双歧杆菌15-2和20-9完整细胞羟自由基清除率都显著高于BB12(p＜0.05)，其中，15-2的清除率最高为24.59％，显著高于20-9(p＜0.05)。15-2细胞提取物的羟自由基清除率显著高于BB12和20-9(p＜0.05)。20-9低于BB12，两者之间无显著差异(p＞0.05)。

2.3还原能力

动物双歧杆菌BB12、15-2和20-9的完整细胞和细胞提取物都有一定还原能力。动物双歧杆菌15-2的完整细胞和细胞提取物还原能力都显著高于菌株BB12。菌株20-9完整细胞还原能力与菌株BB12无显著差异，但却显著低于菌株15-2(p＜0.05)。菌株20-9的细胞提取物还原能力显著高于菌株BB12(p＜0.05)，低于菌株15-2，两者无显著差异。

2.4菌株的α-葡萄糖苷酶活力抑制能力

动物双歧杆菌15-2对α-葡萄糖苷酶抑制率显著高于菌株20-9(p＜0.05)，两者分别为26.90％和12.83％，而菌株BB12对α-葡萄糖苷酶活力无抑制作用。

2.5菌株的酸耐受性

如图2所示，酸性条件下，随孵育时间延长，动物双歧杆菌BB12、15-2和20-9的存活率皆下降。然而，动物双歧杆菌15-2在pH2时的存活率显著高于菌株BB12(p＜0.05)，而菌株20-9显著低于菌株BB12(p＜0.05)，菌株15-2和菌株20-9之间有显著差异(p＜0.05)。在pH3条件下孵育0～3h的过程中，动物双歧杆菌15-2的存活率一直高于BB12，而菌株 20-9一直低于菌株BB12。在孵育3h时，15-2的存活率显著高于菌株BB12(p＜0.05)，菌株20-9显著低于菌株BB12，且三者之间均有显著差异(p＜0.05)。

2.6菌株的胆盐耐受性

如图3所示，在含0.3％、0.5％和1％胆盐条件下，随孵育时间的延长，动物双歧杆菌BB12、15-2和20-9的存活率均呈下降趋势。在0.3％胆盐条件下孵育8h时，动物双歧杆菌15-2的存活率为72.41％，虽高于菌株BB12，但两者间无显著差异，而菌株20-9存活率显著低于BB12(p＜0.05)。菌株15-2和菌株20-9两者间存活率差异显著(p＜0.05)。在 0.5％的胆盐浓度下孵育8h时，菌株15-2和BB12、菌株20-9和BB12及菌株15-2和20-9 之间存活率均无显著差异。在1％的胆盐条件下孵育8h时，动物双歧杆菌20-9的存活率显著低于菌株BB12(p＜0.05)，菌株15-2的存活率与菌株BB12之间无显著差异，而菌株20-9 和菌株15-2之间差异也不显著。

2.7对Caco-2细胞的粘附能力

如图4所示，动物双歧杆菌15-2和20-9对Caco2细胞的粘附率皆高于BB12，但两者都与BB12无显著差异，菌株15-2的粘附率最高为27.59％，与菌株20-9无显著差异。

2.8菌株的粘附抑制能力

如图5所示，动物双歧杆菌BB12、15-2和20-9对大肠杆菌ATCC25922都有竞争性粘附抑制作用，动物双歧杆菌20-9的粘附抑制率显著低于BB12(p＜0.05)，15-2和BB12 之间无显著性差异，而菌株15-2的粘附抑制率显著高于20-9(p＜0.05)。三者对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028也有粘附抑制作用，动物双歧杆菌15-2低于BB12，两者间有显著差异 (p＜0.05)，虽菌株20-9粘附抑制率低于BB12，但两者间无显著差异(p＞0.05)，菌株20-9 高于菌株15-2，两者间差异不显著。

动物双歧杆菌BB12、20-9和15-2都对大肠杆菌ATCC25922有排除性粘附抑制作用，三者的粘附抑制率分别为25.22％、12.53％和18.65％，其中，菌株20-9和15-2粘附抑制率都显著低于BB12(p＜0.05)，而菌株15-2粘附抑制率显著高于20-9(p＜0.05)。三株菌株也对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028有粘附抑制作用，菌株20-9的粘附抑制率显著低于BB12，虽然15-2的-粘附抑制率高于BB12，但无显著差异，而动物双歧杆菌15-2显著高于20-9(p ＜0.05)。

动物双歧杆菌BB12，15-2和20-9对大肠杆菌ATCC25922有替代性黏附作用，菌株BB12的粘附抑制率最高为24.36％，菌株15-2和20-9的粘附抑制率显著低于BB12(p＜0.05)，而菌株20-9的粘附抑制率最低为6.41％，显著低于菌株15-2(p＜0.05)。三者对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028也有粘附抑制作用，动物双歧杆菌20-9粘附抑制率显著低于BB12(p＜ 0.05)，而菌株15-2低于BB12，两者间无显著差异，菌株15-2高于20-9，两者间有显著差异(p＜0.05)。

3.结论

本实验中，动物双歧杆菌15-2在抗氧化能力(羟自由基清除能力和还原能力)高于菌株20-9和菌株BB12；α-葡萄糖苷酶活力抑制能力高于菌株20-9和菌株BB12；菌株15-2经模拟消化道后的存活率和对Caco-2细胞的粘附率强于菌株20-9和菌株BB12；菌株15-2对酸耐受性也高于菌株20-9和BB12，对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028和大肠杆菌ATCC25922粘附抑制能力等方面虽略逊于菌株BB12，但仍优于菌株20-9。因此动物双歧杆菌15-2可作为潜在的干预糖尿病作用受试菌株用于下一步的动物实验。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)H15-2，其特征在于，所述动物双歧杆菌H15-2为双歧杆菌属(Bifidobacterium)，已保藏于东北农业大学菌种库，保藏日期为2017年6月20日，保藏编号为H15-2。

2.一种权利要求1所述的动物双歧杆菌H15-2可作为潜在的干预糖尿病作用菌株。

3.一种权利要求1所述的动物双歧杆菌H15-2可增强机体的抗氧化能力，其完整细胞羟自由基清除率高达24.59％，对α-葡萄糖苷酶抑制率高达26.90％。