CN113493520A - 靶向双特异性位点的双car及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及及靶向双特异性位点的双CAR结构，以及包含双特异性位点的双CAR结构的表达载体、免疫细胞和应用。所述双CAR结构为ScFv1‑铰链‑跨膜‑41BB胞内信号‑CD3ζ‑自剪切多肽‑ScFv2‑铰链‑跨膜‑CD28胞内信号‑CD3ζ或ScFv1‑铰链‑跨膜‑CD28胞内信号‑CD3ζ‑自剪切多肽‑ScFv2‑铰链‑跨膜‑41BB胞内信号‑CD3ζ。所述双CAR结构的构建克服现有技术中双靶点CAR的技术效果缺陷，可同时靶向两个不同的肿瘤抗原，提高对肿瘤细胞杀伤，减少其免疫逃逸的几率。

Description

靶向双特异性位点的双CAR及其应用

技术领域

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及及靶向双特异性位点的双CAR 结构，以及包含双特异性位点的双CAR结构的表达载体、免疫细胞和应用。

背景技术

CAR-T(嵌合抗原受体T)细胞疗法在治疗血液***恶性肿瘤中已取得了显著成果。但是由于肿瘤尤其是实体瘤的异质性，往往肿瘤细胞表面不止表达一个靶抗原，并且随着研究的进展研发人员还发现经CAR-T细胞治疗的少部分患者出现肿瘤细胞下调或突变其表面表达的CAR-T靶点抗原产生逃逸(Robbie G.Majzner et al.(2018)Tumor AntigenEscape from CAR T-cell Therapy)，造成治疗效果较差以及复发等情况。因此设计针对多靶点的CAR结构十分有必要，简单的同时表达2个不同靶点的CAR涉及到不同的CAR结构感染能力不同，会产生多种CAR-T细胞亚群，不利于产品临床应用；如果仅是简单的两个不同靶点CAR结构串联于一个载体，这样CAR载体较大不易转导T细胞，不同的结构涉及到CAR载体病毒制备能力不同，CAR转导能力不同，对T细胞产生的刺激不同，疗效不同等多种因素。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种靶向双特异性位点的双CAR结构，以及包含所述双CAR结构的表达载体和免疫细胞。所述靶向双特异性位点的双CAR可以同时识别CD19和CD22双靶点，可以避免表达CD19肿瘤对CD19 CART的免疫逃逸，对经CD19 CART治疗后复发但CD19为阴性的患者也可以起到治疗作用。

随着CAR-T治疗临床数据的积累，研究者们发现在CAR-T治疗后复发的患者体内CAR-T针对的靶抗原被下调甚至“丢失”，本发明设计可同时识别两个肿瘤相关靶点的双特异性嵌合抗原受体来避免肿瘤表面其中之一抗原丢失，而导致的CAR-T细胞就失去“杀伤目标”。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述双CAR结构为ScFv1-铰链-跨膜-41BB胞内域-CD3ζ-自剪切多肽 -ScFv2-铰链-跨膜-CD28胞内域-CD3ζ或ScFv1-铰链-跨膜-CD28胞内域 -CD3ζ-自剪切多肽-ScFv2-铰链-跨膜-41BB胞内域-CD3ζ。

进一步，所述靶向双特异性位点的双CAR结构Linker结构的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

进一步，所述的靶向双特异性位点的双CAR结构，所述自剪切多肽选自T2A、P2A、E2A、F2A以及内部核糖体进入位点IRES。

优选的，所述自剪切多肽为P2A。

优选的，靶向双特异性位点的双CAR结构，其特征在于，所述ScFv1 为靶向CD19抗原的ScFv，所述ScFv2为靶向CD22抗原的ScFv；所述双特异位点的双CAR结构为：CD19的ScFv-铰链-跨膜-41BB胞内域-CD3ζ -自剪切多肽-靶向CD22的ScFv-铰链-跨膜-CD28胞内域-CD3ζ或CD19 的ScFv-铰链-跨膜-CD28胞内域-CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22的ScFv- 铰链-跨膜-41BB胞内域-CD3ζ

进一步，所述靶向CD19的ScFv的结构为靶向CD19的ScFv轻链可变区-Linker-靶向CD19的ScFv重链可变区，所述靶向CD22的ScFv的结构为靶向CD22的ScFv的重链可变区-Linker-靶向CD22的ScFv的轻链可变区。

进一步，所述双CAR结构为靶向CD19的ScFv轻链可变区-Linker-靶向CD19的ScFv重链可变区-铰链-跨膜-41BB-CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22 的ScFv的重链可变区-Linker-靶向CD22的ScFv的轻链可变区-铰链-跨膜 -CD28-CD3ζ。

进一步，所述双CAR结构为靶向CD19的ScFv轻链可变区-Linker-靶向CD19的ScFv重链可变区-铰链-跨膜-CD28-CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22 的ScFv的重链可变区-Linker-靶向CD22的ScFv的轻链可变区-铰链-跨膜-41BB-CD3ζ。

进一步，所述靶向CD19的ScFv的结构为VL-Linker-VH，靶向CD22的 ScFv的结构为VH-Linker-VL。

进一步，所述靶向CD19的ScFv的氨基酸序列如的SEQ ID NO.13或其功能性变体所示，所述靶向CD22的ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.14或其功能性变体所示。

进一步，靶向CD19的ScFv核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，靶向CD22 的ScFv核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述双特异位点的双CAR结构为：CD19的ScFv-铰链 -CD8TM-41BB胞内域-CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22的ScFv-铰链 -CD28TM-CD28胞内域-CD3ζ或CD19的ScFv-铰链-CD28TM-CD28胞内域 -CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22的ScFv-铰链-CD8TM-41BB胞内域-CD3ζ；所述铰链的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或其功能性变体所示，所述跨膜的氨基酸序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17，或其功能性变体所示，所述 CD28的氨基酸序列如SEQ IDNO.19或其功能性变体所示，所述41BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或其功能性变体所示,所述CD3ζ的氨基酸序列如 SEQ ID NO.20或其功能性变体所示。

进一步，所述铰链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述跨膜的核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示，所述CD28的核苷酸序列如 SEQ ID NO.11所示，所述41BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10或其功能性变体所示，所述CD3ζ的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，所述自剪切多肽为P2A，所述P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.6。某些实施例中，所述嵌合抗原受体结构中的铰链区序列可以来源于：IgG、CD8、CD7、CD4；所述嵌合抗原受体中跨膜区可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、CD137、 CD80以及CD86；所述嵌合抗原受体中胞内信号区可来源于：CD3、CD137、 CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD-1、PD1L、B7-H3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、ICAM-1、CD7、NKG2C、CD83、CD86以及CD127。

具体的，所述“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能(例如，可以具备所述嵌合抗原受体的性质)，且与其具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能。

具体的，CAR结构中的铰链区序列可以来源于：IgG、CD8、CD7、C D4；CAR结构中跨膜区可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、 CD137、CD80以及CD86；CAR结构中胞内信号区可来源于：CD3、CD1 37、CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD-1、PD1L、B 7-H3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、ICAM-1、CD7、NKG2C、CD8 3、CD86以及CD127。

在某些实施例中，抗原识别区可以为识别靶抗原的配体/受体；在某些实施例中，ScFv可以是鼠源抗体或全人源抗体或人鼠嵌合抗体的ScFv，也可以是鲨鱼、羊驼或骆驼抗体等单域抗体，也可以是人工设计的识别特定靶点的靶点特异性纤连蛋白III型(FN3)结构域组合。

进一步，包含所述的双CAR结构的表达载体。

进一步，所述表达载体包含如SEQ ID NO:22的氨基酸序列或如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

进一步，所述表达载体包含如SEQ ID NO:21的氨基酸序列或如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

进一步，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。

在某些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visn a-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。

在某些实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒LTR。

在某些实施例中，CAR包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)以及优化的土拔鼠转录后调节元件(oPRE)。

进一步，包含所述表达载体的免疫细胞。

进一步，所述免疫细胞为NK细胞、T细胞、B细胞。

优选的，所述免疫细胞为T细胞。

具体的，所述细胞可以与其他可增强CAR表达活性的活性剂和/或治疗组合使用。

具体的，所述活性剂和/或治疗可以是手术、化疗、放射、免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablati veagents)例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(cytoxa n)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapam ycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、FR901228、细胞因子和辐射。

在某些实施例中，所述细胞可以表达其它活性剂，例如，增强CAR表达细胞活性的活性剂。活性剂可以是阻断抑制性分子的活性剂。抑制性分子如PD1可以在一些实施方案中降低CAR表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、 BTLA、TIGIT,LAIR1、CD160、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、 CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIG、LAIR1、CD160、2B4、CD80、 CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、 KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、TGFR(TGFRβ)和TGFR β。所述抑制性分子的胞外结构域可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如PD1 CAR。

本发明的目的之二在于提供一种目的一所述的双CAR结构以及包含所述CAR结构的表达载体和免疫细胞的一种应用。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述应用具体为在制备肿瘤药物中的应用。

进一步，所述肿瘤为恶性肿瘤，包括急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、***癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和皮肤癌；所述肿瘤高表达CD19、CD20、CD123、CD22、BCMA、RO R1、CEA、间皮素、PSCA、PSMA、c-Met、GPC-3、Her2、EGFRvIII、 GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR中的一种或多种。

进一步，所述肿瘤高表达CD19和CD22。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供了一种可同时识别CD19和CD22的双CAR，可降低肿瘤免疫逃逸的风险，降低CAR-T治疗后肿瘤复发；

2)本发明提供的双特异性嵌合抗原受体，可以有效的表达于T淋巴细胞，增强CAR-T有效性，提高CAR-T细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗；

3)本发明提供包含双CAR结构的表达载体制备病毒容易，CAR转导效率高，适合工业化生产。

附图说明

图1为双CAR结构图。

图2为双CAR结构在CHO细胞表达检测。

图3为靶细胞抗原表达。

图4为双CAR结构在T淋巴细胞中表达检测。

图5为双CAR体外杀伤结果。

图6为小鼠荷瘤靶细胞表型检测。

图7为双CAR体内杀伤结果。

图8为双CAR回输后荷瘤小鼠生存曲线。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1：质粒构建

设计如图1所示的CAR结构，核酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2 所示，利用双酶切分别切割并回收片段，基因片段进行连接、转化并挑单克隆，获得载体编号分别为15、16。CAR结构原件包含：核苷酸序列如SEQ ID NO:3，氨基酸序列如SEQ ID NO:13的靶向CD19的ScFv；核苷酸序列如SEQ ID NO:4，氨基酸序列如SEQ ID NO:14的靶向CD22的ScFv；连接ScFv重链VH和轻链VL的Linker，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；核苷酸序列如SEQ ID NO:7，氨基酸序列如SEQ ID NO:15的铰链hinge结构；核苷酸序列如SEQ ID NO:8，氨基酸序列如SEQ ID NO:16的跨膜结构；核苷酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11，氨基酸序列如SEQ ID NO:18 或SEQ ID NO:19的胞内共刺激结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO:12，氨基酸序列如SEQ ID NO:20的胞内活化信号；双靶向CAR的氨基酸序列如 SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22。

实施例2：制备慢病毒及感染T淋巴细胞

本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体为：用含10％FBS(w/v)的 DMEM培养基培养293T细胞至较佳状态，包装质粒(RRE:REV:2G)和表达质粒按一定比列加入到1.5的离心管中，加入CaCl2和2×HBS，混匀后室温静置后加入到处理好的293T细胞培养液中，3-5h后再次换液至10mL 含10％FBS的DMEM培养基，48h或72h后收集细胞上清，纯化病毒，滴度测定。

制备的慢病毒感染CHO细胞，分别将感染CHO细胞后的CD19CART、 CD22CAR-T、双CART19和双CART20采用CD19-FC，CD22-His(Acro， 2028b-81XF1-KY)流式标记试剂标记后检测双CAR结构中靶向CD19 CAR 和靶向CD22 CAR的表达，用Protein-L检测总的CAR表达，结果如图2 和表1所示：CD19CAR-T仅能识别CD19-FC，CD22CART仅能识别 CD22-His，而双CAR-T15和16可以识别CD19-FC和CD22-His双靶点，并且CAR阳性率大于50％。

表1

细胞名称	Protein L(％)	CD19-Fc(％)	CD22-His(％)
				Control-T	0.8	0.2	0.3
CD19CAR-T	99	87	0.4
				CD22CAR-T	99.7	0.1	100
15	96.6	97.3	95.4
				16	96.9	97.5	95.3

利用梯度离心法进行淋巴细胞分离；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，生理盐水洗涤，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，获得人 PBMC细胞。获得的PBMC细胞经抗CD3、CD28单克隆抗体活化24h后，按一定的感染复数(MOI)感染已活化的PBMC，在病毒感染的第12天检测CAR-T的阳性率，检测方法为流式检测，抗体为：Protein-L-PE，Protein-L 可识别抗体轻链，CAR抗原识别区的ScFv序列的轻链可被Protein-L识别，因此利用Protein-L可检测CAR阳性率和CAR表达强度。

结果如图3所示：在PBMC细胞CAR能够正常表达。

实施例3：靶细胞制备和靶抗原检测

以K562-Luc为模式细胞分别构建外源高表达CD19、CD22、共表达 CD19和CD22的靶细胞，并采用抗CD19抗体和抗CD22抗体(Acro， 2028b-81XF1-KY)检测靶细胞表面抗原表达。结果见图4所示：K562-CD19 为仅CD19阳性细胞，K562-CD22为仅CD22阳性细胞，K562-CD19-CD22 为CD19和CD22双阳性细胞。

实施例4：双靶点CAR-T有效性验证

分别以CD19单阳性的K562-CD19细胞、CD22单阳性的K562-CD22 细胞，CD19和CD22双阳性的K562-CD19-CD22细胞作为靶细胞验证双靶点CAR-T有效性功能，证明双靶点CAR结构的有效性。将效应细胞(CAR-T 细胞)按照一定的效靶比铺于靶细胞中，使用

Luciferase Assay System(Promega Cat.#E2520)试剂盒提供的标准方法检测杀伤效果，杀伤率用下列公式计算：

杀伤结果如图5所示：我们设计的双CAR结构表达的CAR-T细胞不仅对CD19靶点有杀伤效果还对CD22靶点同样具有杀伤效果，还可以对CD19 和CD22双阳性的K562-CD19-CD22细胞进行杀伤，并且杀伤效果不亚于单靶点CART对单靶点肿瘤细胞的杀伤。

实施例5、双靶点CAR-T细胞在动物模型中的抗肿瘤效果验证

使用CD19阳性的K562-CD19细胞和CD22阳性的K562-CD22细胞采用1:1混合的方式进行尾静脉回输，构建双靶点小鼠动物模型。图6为靶细胞K562-CD19：K562-CD22＝1:1混合后表型检测结果，混合后的靶细胞分别具有CD19和CD22的表达。

体内验证使用小鼠为NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，简称NOG 小鼠，由日本实验动物研究所(CIEA)的Mamoru Ito培育而成，为国际上 CAR-T体内相关成瘤实验最常见品系。体内验证使用的成瘤靶细胞为K562-CD19：K562-CD22＝1:1。选择6-8周鼠龄雌性NOD/SCID小鼠，标记耳号后，尾静脉注射K562-CD19：K562-CD22＝1:1混合细胞1×106/只细胞量。成瘤第3天测量小鼠肿瘤荧光强度，根据肿瘤体积随机分为生理盐水组、Control T组、CD19 CAR-T组、CD22 CAR-T组以及双CAR 15结构、双CAR 16结构。成瘤第3天向不同分组小鼠尾静脉注射对应的CAR-T细胞3*10^6CAR-T细胞/只；Control T组于第3天回输总数相同的T淋巴细胞，生理盐水组回输对应体积的生理盐水。

结果如图7所示：与Control T细胞相比，双靶点CAR-T 15和16具有优异的体内杀伤效果，并且双靶点CART 16的杀伤细胞优于CD19或CD22 单靶点CART体内效果。

生存曲线如图8所示：双靶点CAR-T 15和16治疗的小鼠具有更高的存活时间，CAR16的治疗效果更是优于单独CD19和单独CD22 CART。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆精准生物技术有限公司

<120> 靶向双特异性位点的的双CAR及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3045

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcactgc cagtgaccgc cctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgcagcacgc 60

ccagacatcc agatgacaca gtcccccagc tccctgtctg ccagcgtggg cgaccgggtg 120

accatcacat gcagagcctc tcaggatatc agcaagtatc tgaactggta ccagcagaag 180

ccaggcaagg cccccaggct gctgatctat cacacctccc gcctgcactc tggagtgcca 240

agccggttct ccggatctgg aagcggaacc gactacaccc tgacaatctc tagcctgcag 300

cctgaggatt tcgccacata ctattgccag cagggcaata ccctgccata tacatttggc 360

ggaggaacca ggctggagat caagggatcc acatctggaa gcggcaagcc aggatccgga 420

gagggatcta ccaagggaca ggtgcagctg caggagtccg gacctggact ggtgaagcca 480

agccagacac tgtccctgac ctgtacagtg agcggcgtgt ccctgcctga ttacggcgtg 540

tcctggatca gacagccacc tggcaaggcc ctggagtggc tgggcgtgat ctggggctct 600

gagaccacat actattccac ctctctgaag accaggctga caatctctaa ggacaacagc 660

aagaatcagg tggtgctgac catgacaaac atggaccctg tggataccgc cacatactat 720

tgtgccaagc actactatta cggcggcagc tatgccatgg attactgggg ccagggctcc 780

tctgtgaccg tgagctccct cgagaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gcgacttctg ggtgctggtc 960

gtggtgggtg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga cagtggcctt catcatcttt 1020

tgggtgagga gcaagcggag cagaggcggc cacagcgact acatgaacat gaccccccgg 1080

aggcctggcc ccacccggaa gcactaccag ccctacgccc ctcccaggga cttcgccgcc 1140

taccggagcc gggtgaagtt cagccggagc gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag 1200

agccagctgt acaacgagct gaacctgggc cggagggagg agtacgacgt gctggacaag 1260

cggagaggcc gggaccctga gatgggcggc aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc 1320

ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1380

ggcgagcggc ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc 1440

aaggatacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc ctcgcgaatt cggaagcgga 1500

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg 1560

gcactgcctg tgaccgccct gctgctgcca ctggccctgc tgctgcacgc agcaaggcca 1620

caggtgcagc tgcagcagag cggaccagga ctggtgaagc catcccagac cctgtctctg 1680

acatgcgcca tctccggcga ttctgtgagc tccaacagcg ccgcctggaa ttggatccgg 1740

cagtccccca gccggggcct ggagtggctg ggacggacat actatagatc caagtggtac 1800

aacgattatg ccgtgagcgt gaagtcccgg atcaccatca accccgacac atctaagaat 1860

cagttcagcc tgcagctgaa cagcgtgacc cctgaggaca cagccgtgta ctattgtgcc 1920

agagaggtga ccggcgacct ggaggatgcc tttgacatct ggggccaggg caccatggtg 1980

acagtgtcta gcggcagcac atccggatct ggcaagccag gaagcggaga gggctccacc 2040

aagggcgata tccagatgac acagtccccc tcctctctga gcgcctccgt gggcgacagg 2100

gtgaccatca catgccgcgc ctctcagacc atctggagct acctgaactg gtatcagcag 2160

aggccaggca aggcacctaa tctgctgatc tacgcagcca gctccctgca gtccggagtg 2220

ccttctaggt tcagcggaag gggatctgga accgacttca ccctgacaat ctctagcctg 2280

caggccgagg acttcgccac atactattgt cagcagtctt atagcatccc acagaccttt 2340

ggccagggca caaagctgga gatcaagctc gagaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 2400

acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 2460

gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 2520

gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 2580

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 2640

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 2700

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac 2760

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 2820

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tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 2940

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 3000

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 3045

<210> 2

<211> 3045

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcactgc cagtgaccgc cctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgcagcacgc 60

ccagacatcc agatgacaca gtcccccagc tccctgtctg ccagcgtggg cgaccgggtg 120

accatcacat gcagagcctc tcaggatatc agcaagtatc tgaactggta ccagcagaag 180

ccaggcaagg cccccaggct gctgatctat cacacctccc gcctgcactc tggagtgcca 240

agccggttct ccggatctgg aagcggaacc gactacaccc tgacaatctc tagcctgcag 300

cctgaggatt tcgccacata ctattgccag cagggcaata ccctgccata tacatttggc 360

ggaggaacca ggctggagat caagggatcc acatctggaa gcggcaagcc aggatccgga 420

gagggatcta ccaagggaca ggtgcagctg caggagtccg gacctggact ggtgaagcca 480

agccagacac tgtccctgac ctgtacagtg agcggcgtgt ccctgcctga ttacggcgtg 540

tcctggatca gacagccacc tggcaaggcc ctggagtggc tgggcgtgat ctggggctct 600

gagaccacat actattccac ctctctgaag accaggctga caatctctaa ggacaacagc 660

aagaatcagg tggtgctgac catgacaaac atggaccctg tggataccgc cacatactat 720

tgtgccaagc actactatta cggcggcagc tatgccatgg attactgggg ccagggctcc 780

tctgtgaccg tgagctccct cgagaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1200

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcgaattcg gaagcggagc tactaacttc 1500

agcctgctga agcaggctgg agacgtggag gagaaccctg gacctatggc actgcctgtg 1560

accgccctgc tgctgccact ggccctgctg ctgcacgcag caaggccaca ggtgcagctg 1620

cagcagagcg gaccaggact ggtgaagcca tcccagaccc tgtctctgac atgcgccatc 1680

tccggcgatt ctgtgagctc caacagcgcc gcctggaatt ggatccggca gtcccccagc 1740

cggggcctgg agtggctggg acggacatac tatagatcca agtggtacaa cgattatgcc 1800

gtgagcgtga agtcccggat caccatcaac cccgacacat ctaagaatca gttcagcctg 1860

cagctgaaca gcgtgacccc tgaggacaca gccgtgtact attgtgccag agaggtgacc 1920

ggcgacctgg aggatgcctt tgacatctgg ggccagggca ccatggtgac agtgtctagc 1980

ggcagcacat ccggatctgg caagccagga agcggagagg gctccaccaa gggcgatatc 2040

cagatgacac agtccccctc ctctctgagc gcctccgtgg gcgacagggt gaccatcaca 2100

tgccgcgcct ctcagaccat ctggagctac ctgaactggt atcagcagag gccaggcaag 2160

gcacctaatc tgctgatcta cgcagccagc tccctgcagt ccggagtgcc ttctaggttc 2220

agcggaaggg gatctggaac cgacttcacc ctgacaatct ctagcctgca ggccgaggac 2280

ttcgccacat actattgtca gcagtcttat agcatcccac agacctttgg ccagggcaca 2340

aagctggaga tcaagctcga gaagcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 2400

gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 2460

gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgcg acttctgggt gctggtcgtg 2520

gtgggtggcg tgctggcctg ctacagcctg ctggtgacag tggccttcat catcttttgg 2580

gtgaggagca agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac cccccggagg 2640

cctggcccca cccggaagca ctaccagccc tacgcccctc ccagggactt cgccgcctac 2700

cggagccggg tgaagttcag ccggagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagagc 2760

cagctgtaca acgagctgaa cctgggccgg agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg 2820

agaggccggg accctgagat gggcggcaag ccccggagaa agaaccctca ggagggcctg 2880

tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc 2940

gagcggcgga ggggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 3000

gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 3045

<210> 3

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacatccaga tgacacagtc ccccagctcc ctgtctgcca gcgtgggcga ccgggtgacc 60

atcacatgca gagcctctca ggatatcagc aagtatctga actggtacca gcagaagcca 120

ggcaaggccc ccaggctgct gatctatcac acctcccgcc tgcactctgg agtgccaagc 180

cggttctccg gatctggaag cggaaccgac tacaccctga caatctctag cctgcagcct 240

gaggatttcg ccacatacta ttgccagcag ggcaataccc tgccatatac atttggcgga 300

ggaaccaggc tggagatcaa gggatccaca tctggaagcg gcaagccagg atccggagag 360

ggatctacca agggacaggt gcagctgcag gagtccggac ctggactggt gaagccaagc 420

cagacactgt ccctgacctg tacagtgagc ggcgtgtccc tgcctgatta cggcgtgtcc 480

tggatcagac agccacctgg caaggccctg gagtggctgg gcgtgatctg gggctctgag 540

accacatact attccacctc tctgaagacc aggctgacaa tctctaagga caacagcaag 600

aatcaggtgg tgctgaccat gacaaacatg gaccctgtgg ataccgccac atactattgt 660

gccaagcact actattacgg cggcagctat gccatggatt actggggcca gggctcctct 720

gtgaccgtga gctcc 735

<210> 4

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggtgcagc tgcagcagag cggaccagga ctggtgaagc catcccagac cctgtctctg 60

acatgcgcca tctccggcga ttctgtgagc tccaacagcg ccgcctggaa ttggatccgg 120

cagtccccca gccggggcct ggagtggctg ggacggacat actatagatc caagtggtac 180

aacgattatg ccgtgagcgt gaagtcccgg atcaccatca accccgacac atctaagaat 240

cagttcagcc tgcagctgaa cagcgtgacc cctgaggaca cagccgtgta ctattgtgcc 300

agagaggtga ccggcgacct ggaggatgcc tttgacatct ggggccaggg caccatggtg 360

acagtgtcta gcggcagcac atccggatct ggcaagccag gaagcggaga gggctccacc 420

aagggcgata tccagatgac acagtccccc tcctctctga gcgcctccgt gggcgacagg 480

gtgaccatca catgccgcgc ctctcagacc atctggagct acctgaactg gtatcagcag 540

aggccaggca aggcacctaa tctgctgatc tacgcagcca gctccctgca gtccggagtg 600

ccttctaggt tcagcggaag gggatctgga accgacttca ccctgacaat ctctagcctg 660

caggccgagg acttcgccac atactattgt cagcagtctt atagcatccc acagaccttt 720

ggccagggca caaagctgga gatcaag 747

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaagcacct ccggatctgg caagcctgga tccggagagg gctctacaaa ggga 54

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 7

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 9

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttctgggtgc tggtcgtggt gggtggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgacagtg 60

gccttcatca tcttttgggt g 81

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 11

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 60

ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggacttcgc cgcctaccgg 120

agc 123

<210> 12

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 13

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Thr Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr

195 200 205

Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 14

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser

115 120 125

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile

130 135 140

Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

145 150 155 160

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn

165 170 175

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala

180 185 190

Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly

195 200 205

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp

210 215 220

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 15

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 16

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 17

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 18

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

1 5 10 15

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

20 25 30

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

35 40

<210> 19

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 20

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

1 5 10 15

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

20 25 30

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

35 40 45

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

50 55 60

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

65 70 75 80

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

85 90 95

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 21

<211> 993

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Thr Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr

195 200 205

Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

245 250 255

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

260 265 270

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

275 280 285

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

290 295 300

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

305 310 315 320

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met

325 330 335

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

340 345 350

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg

355 360 365

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Ser Gln Leu Tyr Asn

370 375 380

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

385 390 395 400

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

405 410 415

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

420 425 430

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

435 440 445

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

450 455 460

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Ser Gly Ala

465 470 475 480

Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

485 490 495

Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu

500 505 510

Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

515 520 525

Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser

530 535 540

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln

545 550 555 560

Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser

565 570 575

Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile

580 585 590

Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val

595 600 605

Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly

610 615 620

Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

625 630 635 640

Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu

645 650 655

Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

660 665 670

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

675 680 685

Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala

690 695 700

Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

705 710 715 720

Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

725 730 735

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

740 745 750

Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

755 760 765

Leu Glu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

770 775 780

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

785 790 795 800

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

805 810 815

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

820 825 830

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

835 840 845

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

850 855 860

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

865 870 875 880

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln

885 890 895

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

900 905 910

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

915 920 925

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

930 935 940

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

945 950 955 960

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

965 970 975

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

980 985 990

Arg

<210> 22

<211> 993

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Thr Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr

195 200 205

Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

245 250 255

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

260 265 270

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

275 280 285

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

290 295 300

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

305 310 315 320

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

325 330 335

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

340 345 350

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

355 360 365

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

370 375 380

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

385 390 395 400

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

405 410 415

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

420 425 430

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

435 440 445

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

450 455 460

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser

465 470 475 480

Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala

485 490 495

Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala

500 505 510

Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

515 520 525

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val

530 535 540

Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg

545 550 555 560

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn

565 570 575

Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr

580 585 590

Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp

595 600 605

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp

610 615 620

Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly

625 630 635 640

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

645 650 655

Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

660 665 670

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser

675 680 685

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu

690 695 700

Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

705 710 715 720

Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

725 730 735

Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro

740 745 750

Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Leu Glu Lys Pro

755 760 765

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

770 775 780

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

785 790 795 800

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val

805 810 815

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

820 825 830

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly

835 840 845

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

850 855 860

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

865 870 875 880

Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

885 890 895

Gly Gln Ser Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

900 905 910

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

915 920 925

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

930 935 940

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

945 950 955 960

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

965 970 975

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

980 985 990

Arg

Claims (17)

1.一种靶向双特异性位点的双CAR结构，其特征在于，所述双CAR结构为ScFv1-铰链-跨膜-41BB胞内域-CD3ζ-自剪切多肽-ScFv2-铰链-跨膜-CD28胞内域-CD3ζ或ScFv1-铰链-跨膜-CD28胞内域-CD3ζ-自剪切多肽-ScFv2-铰链-跨膜-41BB胞内域-CD3ζ。

2.根据权利要求1所述的靶向双特异性位点的双CAR结构，其特征在于，所述自剪切多肽选自T2A、P2A、E2A、F2A以及内部核糖体进入位点IRES。

3.根据权利要求1所述的靶向双特异性位点的双CAR结构，其特征在于，所述ScFv1为靶向CD19抗原的ScFv，所述ScFv2为靶向CD22抗原的ScFv；所述双特异位点的双CAR结构为：CD19的ScFv-铰链-跨膜-41BB胞内域-CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22的ScFv-铰链-跨膜-CD28胞内域-CD3ζ或CD19的ScFv-铰链-跨膜-CD28胞内域-CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22的ScFv-铰链-跨膜-41BB胞内域-CD3ζ。

4.权利要求3所述的双CAR，其特征在于，所述靶向CD19的ScFv的氨基酸序列如的SEQID NO.13或其功能性变体所示，所述靶向CD22的ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.14或其功能性变体所示。

5.根据权利要求2所述的靶向双特异性位点的双CAR结构，其特征在于，靶向CD19的ScFv核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，靶向CD22的ScFv核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求1所述的靶向双特异性位点的双CAR结构，其特征在于，所述双特异位点的双CAR结构为：CD19的ScFv-铰链-CD8TM-41BB胞内域-CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22的ScFv-铰链-CD28TM-CD28胞内域-CD3ζ或CD19的ScFv-铰链-CD28TM-CD28胞内域-CD3ζ-自剪切多肽-靶向CD22的ScFv-铰链-CD8TM-41BB胞内域-CD3ζ；所述铰链的氨基酸序列如SEQ IDNO.15或其功能性变体所示，所述跨膜的氨基酸序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17，或其功能性变体所示，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO.19或其功能性变体所示，所述41BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或其功能性变体所示,所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ IDNO.20或其功能性变体所示。

7.根据权利要求6所述的靶向双特异性位点的双CAR结构，其特征在于，所述铰链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述跨膜的核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示，所述CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述41BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10或其功能性变体所示，所述CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述自剪切多肽为P2A，所述P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.6。

8.包含权利要求1-7任一项所述的的靶向双特异性位点的双CAR结构的表达载体。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如SEQ ID NO:22的氨基酸序列或如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如SEQ ID NO:21的氨基酸序列或如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

11.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。

12.包含权利要求8-11任一项所述的表达载体的免疫细胞。

13.根据权利要求12所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞。

14.提升识别CD19和/或CD22靶点效应细胞的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求8-11任一项所述的表达载体载体转导T细胞。

15.权利要求1所述的双CAR结构或权利要求8所述的表达载体或权利要求12所述的免疫细胞在制备肿瘤药物中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤，包括急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、***癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和皮肤癌；所述肿瘤高表达CD19、CD20、CD123、CD22、BCMA、ROR1、CEA、间皮素、PSCA、PSMA、c-Met、GPC-3、Her2、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR中的一种或多种。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述肿瘤高表达CD19和CD22。

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