CN113481260A - 一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，先用水热法处理木本原料，获得含低聚木糖的水溶液和滤渣；接着对滤渣用DES处理，获得富含纤维素的物料和富含木质素的预处理黑液；采用纤维素酶酶解得到的富含纤维素的物料，获得葡萄糖；其中，在纤维素酶酶解时加入酶解促进剂。本申请在纤维素酶酶解时加入酶解促进剂，有效减弱酶水解过程中木质素对纤维素酶的非特异性吸附，有利于促进纤维素酶水解的进行。试验结果表明，与现有研究结果相比，本申请的酶水解得率显著提高，几乎可以达到完全水解。同时，本方法实现了低聚木糖的联产，为杨木木屑的综合利用提供了新途径。

Description

一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法
技术领域
本发明涉及木屑预处理及酶解技术领域，具体涉及一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法。
背景技术
随着经济的快速发展，人类对化石资源的需求程度日益扩大和过度开采，地球上传统的化石资源不可避免地面临着枯竭殆尽的命运。因此，寻求一种低碳环保可持续发展的可再生资源已成为必然要求。木质纤维原料作为世界上储量丰富且广泛存在的可再生资源，它能够产生较低的碳排放量，通过植物光合作用将能量储存起来。同时利用现代工业生物技术手段将木质纤维原料转化为可替代的生物能源和高附加值化学品是缓解化石资源短缺的重要途径之一。目前我们熟知的木质纤维原料主要包括阔叶材、针叶材、能源作物、农作物秸秆、农林废弃物以及城市纤维垃圾等。杨树是一种人工种植面积大、生长迅速和分布广泛的经济树种，目前在我国已形成从育种、培育、加工利用和家具生产的完整产业链。在木材加工产业中产生的杨木锯末屑总量可观，但利用率低，大部分作为废弃物丢弃。因此，在能源制约及环境污染的大背景下，以杨木锯木屑为原料，通过工业生物技术，将其转化为能源或化学品具有重要的意义。
木质纤维原料由纤维素、半纤维素和木质素组成。目前，纤维素和半纤维素在造纸、制糖和生物乙醇燃料等生产方面已经得到广泛的利用。木质素是仅次于纤维素的第二大可再生生物质资源，占据生物质干重的10％～35％，但其蕴含的能量超过生物质所含总能量的40％，它是地球上含芳烃结构最多的可再生资源，也是唯一能提供可再生芳香基化合物最多的非石油资源。但是现在市场上由木质素生产的产品十分有限，大约有5％的木质素被用于商业应用，主要是一些低价值的分散剂或胶黏剂等产品。因此，综合利用杨树的三种组分纤维素、半纤维素和木质素共同生产附加值产品，有可能提高生物炼制过程的经济可行性。
与其他木质纤维原料一样，杨木锯木屑需要打破纤维素、半纤维素和木质素形成天然的物理屏障，使纤维素在纤维素酶催化下可降解成单糖，继而被不同微生物发酵成各种能源或化学品。因此，木质纤维原料在进行纤维素酶水解前必须进行预处理，从而破坏木质纤维素的致密结构，以达到提高酶水解效率的目的。然而，木质纤维原料的生物炼制比草本生原料更具挑战性，因为木本原料对酶和微生物降解的抗性更大。迫切需要一种合适的预处理技术来破坏杨树的抗性，从而提高其生物转化效率。
常用的预处理方法有稀酸预处理、蒸汽***预处理、碱法预处理、水热预处理等。水热预处理是一种只需加水的清洁工艺，近年来已广泛应用于木质纤维生物质中。水热预处理操作简单，生产成本低。在水热预处理过程中，原料中半纤维素大量水解成高附加值的低聚木糖(XOS)，产生的固体残渣中残留了大部分木质素，如果保留的木质素能产生价值，生物炼制经济将受益。低共熔溶剂(DESs)预处理是一种新型绿色的预处理方法，以氯化胆碱(ChCl)为基础的DESs体系已被开发出来，并显示出了脱木质素的能力，但其与其他预处理相结合，进行联合处理木本原料联产低聚木糖以及葡萄糖，还未见报道。
发明内容
针对现有木屑预处理效果差、酶解得率低的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，通过组合预处理技术促进木屑酶解，联产低聚木糖和葡萄糖。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，先用水热法处理木本原料，获得含低聚木糖的水溶液和滤渣；接着对滤渣用DES处理，获得富含纤维素的物料和富含木质素的预处理黑液；采用纤维素酶酶解得到的富含纤维素的物料，获得葡萄糖；其中，在纤维素酶酶解时加入酶解促进剂。
所述木本原料为杨木锯木屑。
所述水热预处理的条件为：180℃处理0.5h，木本原料和水溶的固液比为1g：10mL。
所述DES处理中，DES混合液为摩尔比为1∶2～10的氯化胆碱和乳酸。
所述酶解促进剂为乳清蛋白(蛋白质含量为80％的浓缩蛋白粉)、吐温80、牛乳清蛋白。
所述酶解体系中，纤维素的浓度为20g/L，纤维素酶的用量为2.5-40FPU/g纤维素。
所述酶解体系在45-55℃，pH 4.0-6.0条件下酶解72h。
所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，包括以下步骤：
(1)取杨木木屑，按固液比1∶10g/mL加入蒸馏水，于180℃下处理0.5h；结束后，进行固液分离，分别收集处理液和处理固体残渣；固体残渣经水洗、过滤后待用；
(2)取步骤(1)获得的固体残渣，按固液比1∶10g/g加入低共熔溶剂，于130℃下共处理1.5h；处理结束后，物料经水洗及过滤收集；获得富含纤维素的物料和富含木质素的预处理黑液；
(3)取富含纤维素的物料，加入柠檬酸缓冲液、酶解促进剂、纤维素酶，于pH4.0-6.0、45-55℃的恒温摇床中摇动酶解；酶解结束后，分离获得富含葡萄糖的上清液。
步骤(3)中，先添加BSA于150rpm、pH4.8、50℃的恒温摇床中吸附1h后，再添加纤维素酶酶解。
步骤(3)中，先将将富含纤维素的物料经水洗、过滤，洗去残余的低共熔溶剂、溶出的木质素及糖分，然后进行酶解；酶解体系中纤维素的浓度为20g/L，纤维素酶的用量为2.5-40FPU/g纤维素。
本申请人前期的研究表明，氯化胆碱-乳酸体系可以从杨木木屑中去除89.3％以上的木质素，使DES处理的杨木酶解得到75.8％的葡萄糖。此外，回收的木质素具有丰富的酚羟基，说明DES处理是一种有效分离和稳定木质素的方法。基于水热预处理和DES预处理的优势，将水热预处理和DES预处理结合在杨木锯木屑上以实现XOS、具有丰富功能基团的木质素馏分和富含纤维素的底物的共同生产。前期工作研究了单独预处理(水热和DES处理)对XOS产率和酶解的影响；进一步研究了水热预处理和DES处理对杨树酶消化率的协同效应，发现水热-DES联合预处理杨木的酶解效率明显低于单独DES预处理杨木。因此，为提高杨木木屑的纤维素酶水解性能，建立杨木木屑的高效预处理策略，本申请人进一步的研究出本申请的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法。
有益效果：与现有技术相比，本申请在水热处理后进行DES处理虽然能显著提高木质素的脱除效率，但预处理物料表面木质素含量显著增加，其是影响纤维素酶水解的主要因素。通过添加酶解促进剂有效减弱了酶水解过程中木质素对纤维素酶的非特异性吸附，有利于促进纤维素酶水解的进行。试验结果表明，与单独采用水热处理或DES预处理杨木木屑的酶解得率相比，本申请的组合预处理使得酶水解得率由16.62％提高至100％。同时本发明可实现低聚木糖联产，为木本原料各组分的综合利用提供了一个新途径
附图说明
图1为水热-DES联合处理杨木木屑添加不同酶解促进剂酶水解72h后结果图；
图2为水热-DES联合处理杨木木屑添加不同酶解促进剂不同酶用量的酶水解72h后结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例中，葡萄糖和木糖浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下：色谱仪：Agillent1200高效液相色谱仪；色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H；流动相：0.005mol/L硫酸，流速：0.6mL/min；柱温：55℃；检测器：示差折光检测器；进样量：10μL。外标法测定。
以下实施例中，水热处理液中低聚木糖浓度采用间接酸解法测定。具体测定方法为：取10mL水热处理液，用氢氧化钠将pH调节至7.0左右，并定容至50mL；取10mL处理后的样品溶液于酸解瓶中，并加入10mL 8％(w/v)硫酸，于121℃下处理60min。采用HPLC测定酸解后样品中和水热处理液中的木糖浓度，并通过酸解前后木糖浓度差计算低聚木糖浓度。低聚木糖浓度(g/L)＝酸解后样品中木糖浓度g/L×2×5-水热处理液中木糖浓度g/L。式中：2和5均为稀释倍数。
以下实施例中，氯化胆碱和乳酸混合液(低共熔溶剂)用量以水热处理杨木木屑绝干重计，以10g绝干水热处理杨木屑为例，指预处理10g绝干水热处理杨木木屑，低共熔溶剂用量为100g。
实施例1
一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，步骤如下：
(1)称取绝干重为200g杨木木屑，用2000mL蒸馏水，于固液比1：10(g/mL，下同)，180℃下处理0.5h。
(2)水热处理结束后，进行固液分离，分别收集处理液和处理固体残渣；固体残渣经水洗、过滤后待用。水热处理杨木木屑的主要成分分析见表1。
(3)称取绝干重为10g上述水热处理后的杨木木屑(即固体残渣)，用100g摩尔比为1∶10的低共熔溶剂，固液比1∶10g/g，130℃下共处理1.5h。
(4)组合处理结束后，物料经水洗及过滤收集。DES辅助组合处理杨木木屑的主要成分分析见表2。
(5)分别称取纤维素绝干重为1.00g(步骤3的残渣)的上述组合处理杨木木屑于250mL水解瓶中，在每个水解瓶中加入1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL、乳清蛋白4.5mL、酶用量为5FPU/g纤维素的纤维素酶和适量蒸馏水，使酶解体系中水分总体积为50mL，用玻棒将反应体系充分混匀后盖上盖子，于150rpm、pH 4.8、50℃的恒温摇床中酶解72h。上述酶解体系中，添加BSA于150rpm、pH 4.8、50℃的恒温摇床中吸附1h，再添加纤维素酶酶解72h。
酶解结束后，分别将水解物用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的葡萄糖浓度，并计算酶水解得率，数据取双平行试验平均值。其中，纤维素酶解得率(％)＝(水解液中葡萄糖浓度g/L×0.9)×0.05÷(底物绝干重g×葡聚糖含量)×100％。式中：0.9为葡萄糖与纤维素的转换系数；0.95为纤维二糖与纤维素的转换系数；0.05为水解液体积，L。
水热处理杨木木屑主要成分分析及低聚木糖得率见表1。
表1水热处理杨木木屑主要成分分析及低聚木糖得率
Figure BDA0003177716600000051
表1结果表明，水热处理使得杨木木屑中木聚糖水解为木糖及低聚木糖，木聚糖含量显著下降，而葡聚糖和酸不溶木质素含量略显升高。此外，在水热处理液中检测到低聚木糖，基于未处理杨木木屑中木聚糖的含量计算其低聚木糖得率达53.20％。
添加低共熔溶剂(DES)的组合处理杨木木屑主要成分分析以及酶解得率见表2。
表2低共熔溶剂(DES)辅助组合处理杨木木屑的主要成分分析及酶解得率
Figure BDA0003177716600000052
Figure BDA0003177716600000061
表2结果表明，水热-DES联合处理杨木木屑葡聚糖含量增加，酸不溶木质素含量降低，同时纤维素酶解得率达到86.71％。
实施例2
一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，即采用低共熔溶剂对水热处理的杨木木屑进行预处理，步骤同实施例1中的步骤(1)、(2)、(3)、(4)和(5)相同。其中，步骤(3)低共熔溶剂的摩尔比为1∶2-1∶10。添加低共熔溶剂(DES)的组合处理杨木木屑主要成分分析以及酶解得率见表3。
表3低共熔溶剂(DES)辅助组合处理杨木木屑的主要成分分析及酶解得率
Figure BDA0003177716600000062
表3结果表明，在相同温度下(130℃)，随着DES预处理摩尔比例的增加，组合处理杨木木屑中葡聚糖含量逐渐增加，而酸不溶木质素含量逐渐降低，同时纤维素酶解得率显著提高。
对比例1
一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，即采用低共熔溶剂对水热处理的杨木木屑进行预处理，步骤同实施例2中的步骤(1)、(2)、(3)、(4)和(5)相同。其中，步骤(5)酶水解前不添加乳清蛋白。添加低共熔溶剂(DES)的组合处理杨木木屑主要成分分析以及酶解得率见表4。
表4水热-DES联合处理杨木木屑的主要成分分析及酶解得率
Figure BDA0003177716600000063
表4结果表明，水热-DES联合处理杨木木屑酶水解得率仅为8.56％-11.06％。本对比例的水热-DES联合处理杨木酶水解明显低于实施例2中添加乳清蛋白杨木木屑的酶解得率(68.73％-86.71％)。
对比例2
一种木本原料杨木木屑水热处理方法，即单独采用蒸馏水对杨木木屑进行预处理，不进行DES预处理处理，步骤同实施例1中的步骤(1)、(2)和(5)，不包括步骤(3)和(4)。其中，步骤(2)得到的水热处理杨木木屑的主要成分分析和酶解得率见表5。
表5水热处理杨木木屑主要成分分析及酶解得率
Figure BDA0003177716600000071
表5结果表明，水热处理杨木木屑，其酶解得率仅为8.62％，远低于实施例1中DES组合处理杨木木屑酶解得率(86.71％)。
对比例3
一种木本原料杨木木屑DES处理方法，即单独采用低共熔溶剂对杨木木屑进行预处理，步骤同实施例1中的步骤(3)、(4)和(5)相同，不包括步骤(1)和(2)。其中，步骤(3)DES处理的物料是原始物料。添加低共熔溶剂(DES)处理杨木木屑主要成分分析以及酶解得率见表6。
表6 DES处理杨木木屑的主要成分分析、低聚木糖得率及酶解得率
Figure BDA0003177716600000072
表6结果表明，DES处理杨木木屑酶水解得率为77.08％。本对比例的DES处理杨木酶水解明显低于实施例1中水热-DES联合处理杨木木屑的酶解得率(86.71％)。
实施例3
一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，步骤如下：
(1)称取绝干重为200g杨木木屑，用2000mL蒸馏水，于固液比1∶10(g/mL，下同)，180℃下处理0.5h；水热处理结束后，进行固液分离，分别收集处理液和处理固体残渣；固体残渣经水洗、过滤后待用，记作物料1。
(2)称取绝干重为10g杨木木屑，用100g摩尔比为1∶10的低共熔溶剂，固液比1∶10g/g，130℃下共处理1.5h；处理结束后，物料经水洗及过滤收集待用，记作物料2。
(3)称取绝干重为10g上述水热处理杨木木屑(物料1)，用100g摩尔比为1∶10的低共熔溶剂，固液比1∶10g/g，130℃下共处理1.5h；组合处理结束后，进行固液分离，分别收集处理液和处理固体残渣；物料经水洗及过滤收集待用，记作物料3。
(5)对单独DES预处理和组合处理收集的处理液进行木质素提取，将10倍体积的蒸馏水加入到预处理液中沉淀木质素，然后离心收集，再用10％的乙醇进行反复洗涤，所得木质素经冷冻干燥后，在40℃的真空烘箱中进一步干燥4小时备用，分别记作木质素L1和L2。
(6)取未处理杨木屑，干燥处理后，于球磨机中进行球磨处理，球磨速度为600rpm，有效球磨时间为6h。(7)取上述未处理杨木屑球磨木粉于二氧六环/水(96∶4，v/v)溶剂中进行木质素提取，固液比为1∶10，提取所得木质素为磨木木质素，记作木质素L0。
(8)采用31p核磁共振技术分析上述3种木质素的酚羟基含量，结果如表7所示。
表7杨木木屑和两种预处理杨木木屑中木质素酚羟基含量(mmol/g)
L<sub>0</sub> L<sub>1</sub> L<sub>2</sub>
酚羟基含量(mmol/g) 1.27 2.39 2.77
木质素回收率(％) - 41.27 71.26
表7结果表明，在单独DES处理杨木木屑(物料2)和组合处理杨木屑(物料3)中，其木质素的游离的酚羟基含量由未处理杨木的1.27mmol/g分别增加到2.39mmol/g和2.77mmol/g。单独DES处理以及水热-DES联合处理后，预处理杨木木屑中的木质素的游离酚羟基含量明显升高。说明DES处理和水热-DES联合处理有效水解了木质素中的芳香醚键，从而释放了更多的游离羟基，而组合处理杨木木屑中木质素的酚羟基高于单独DES处理，说明组合预处理过程中，木质素的芳香醚键断的较多。此外，水热-DES联合处理杨木木屑中木质素的回收率(71.26％)明显高于单独DES预处理(41.27％)，这与上述高的木质素脱除率相吻合。
实施例4
一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，步骤如下：
(1)称取绝干重为200g杨木木屑，用2000mL蒸馏水，于固液比1∶10(g/mL，下同)，180℃下处理0.5h。
(2)水热处理结束后，进行固液分离，分别收集处理液和处理固体残渣；固体残渣经水洗、过滤后待用。
(3)称取绝干重为10g上述水热处理杨木木屑，用100g摩尔比为1∶2-1∶10的低共熔溶剂，固液比1∶10g/g，130℃下共处理1.5h。
(4)组合处理结束后，进行固液分离，分别收集处理液和处理固体残渣；固体残渣经水洗、过滤后待用。
(5)分别称取少量组合处理的固体残渣进行冷冻干燥，将干燥后的固体残渣研磨至200目以下进行真空干燥，再通过X射线光电子能谱测定组合处理固体残渣的表面木质素含量，具体分析见表8。
表8水热-DES联合处理杨木木屑的表面木质素含量分析及酶解得率
样品 O/C 表面木质素含量(％) 酶解得率(％)
HP-DES130(1∶2) 0.35 95.62 34.24
HP-DES130(1∶6) 0.45 76.02 42.88
HP-DES130(1∶10) 0.53 60.42 49.86
表8结果表明，在相同温度下(130℃)，随着DES预处理摩尔比例的增加，组合处理杨木木屑中表面木质素含量逐渐降低，酶水解得率逐渐升高。表明物料表面木质素含量越高对纤维素的酶水解抑制作用越强。
对比例4
一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，即采用低共熔溶剂对水热处理的杨木木屑进行预处理，步骤同实施例1。添加不同酶解促进剂不同浓度对组合处理杨木木屑纤维素酶水解结果见图1。
图1结果表明，与实施例2的结果相比，在相同预处理最优条件下(130℃，1∶10)，添加酶解促进剂的水热-DES联合处理杨木屑纤维素酶水解得率明显高于未添加酶解促进剂的酶水解得率(11.06％)。本对比例中添加吐温80(2.5g/L)、和牛血清蛋白(2.5g/L)对物料酶解的作用效果与实施例1中添加乳清蛋白(4.5g/L)的作用相当，而大豆分离蛋白(6.0g/L)的作用效果最差。
对比例5
一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，步骤同实施例1，添加不同酶解促进剂不同酶用量对水热-DES联合处理杨木木屑纤维素酶水解结果见图2。
图2结果表明，与对比例4的结果相比，在相同预处理最优条件下(130℃，1∶10)，添加不同酶解促进剂组合处理杨木屑随着酶用量的增加纤维素酶水解得率不断增加，当酶用量为7.5FPU/g葡聚糖时，物料纤维素酶可以达到完全降解，而不添加酶解促进剂的水热-DES联合处理杨木木屑达到完全降解最少需要40FPU/g葡聚糖。本对比例中添加酶解促进剂可使水热-DES处理杨木木屑纤维素完全降解节省32.5FPU/g葡聚糖。

Claims (10)

1.一种组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，先用水热法处理木本原料，获得含低聚木糖的水溶液和滤渣；接着对滤渣用DES处理，获得富含纤维素的物料和富含木质素的预处理黑液；采用纤维素酶酶解得到的富含纤维素的物料，获得葡萄糖；其中，在纤维素酶酶解时加入酶解促进剂。
2.根据权利要求1所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，所述木本原料为杨木锯木屑。
3.根据权利要求1所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，所述水热预处理的条件为：180℃处理0.5h，木本原料和水溶的固液比为1g∶10mL。
4.根据权利要求1所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，所述DES处理中，DES混合液为摩尔比为1∶2～10的氯化胆碱和乳酸。
5.根据权利要求1所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，所述酶解促进剂为乳清蛋白、吐温80、牛血清蛋白。
6.根据权利要求1所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，所述酶解体系中，纤维素的浓度为20g/L，纤维素酶的用量为2.5-40FPU/g纤维素。
7.根据权利要求1所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，所述酶解体系在45-55℃，pH 4.0-6.0条件下酶解72h。
8.根据权利要求1所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取杨木木屑，按固液比1∶10g/mL加入蒸馏水，于180℃下处理0.5h；结束后，进行固液分离，分别收集处理液和处理固体残渣；固体残渣经水洗、过滤后待用；
(2)取步骤(1)获得的固体残渣，按固液比1∶10g/g加入低共熔溶剂，于130℃下共处理1.5h；处理结束后，物料经水洗及过滤收集；获得富含纤维素的物料和富含木质素的预处理黑液；
(3)取富含纤维素的物料，加入柠檬酸缓冲液、酶解促进剂、纤维素酶，于pH4.0-6.0、45-55℃的恒温摇床中摇动酶解；酶解结束后，分离获得富含葡萄糖的上清液。
9.根据权利要求8所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，先添加牛血清蛋白于150rpm、pH 4.8、50℃的恒温摇床中吸附1h后，再添加纤维素酶酶解。
10.根据权利要求8所述的组合预处理木本原料联产低聚木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，先将将富含纤维素的物料经水洗、过滤，洗去残余的低共熔溶剂、溶出的木质素及糖分，然后进行酶解；酶解体系中纤维素的浓度为20g/L，纤维素酶的用量为2.5-40FPU/g纤维素。
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