CN113476464A

CN113476464A - 一种糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用

Info

Publication number: CN113476464A
Application number: CN202110861165.8A
Authority: CN
Inventors: 王煜丹; 赵京浩; 程桂广; 袁明龙
Original assignee: Yunnan Minzu University
Current assignee: Yunnan Minzu University
Priority date: 2021-07-29
Filing date: 2021-07-29
Publication date: 2021-10-08

Abstract

本发明公开了一种糖苷类化合物的新用途，即其在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用，属于医药技术领域；本发明从天然植物红香树的叶子中采用超声辅助提取方法，经硅胶柱层析法分离纯化获得本发明糖苷类化合物；细胞凋亡实验及小鼠动物实验结果显示该化合物能降低APAP造成的肝损伤的程度，改善肝组织病变和肝细胞损伤，对APAP诱导的炎症损伤有明显的预防和治疗作用，减少氧化应激和过度炎症造成的机体和细胞损伤，细胞毒性评价结果显示，在100μg/mL以下对细胞存活率无明显影响，该化合物在低浓度时不会对生物机体及细胞健康造成危害，本发明为传统天然植物红香树提供了新的药用途径。

Description

一种糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)被认为是临床上治疗剂量下最常见的解热镇痛药，但许多治疗感冒的复方制剂中都含有APAP，这导致公众在购买感冒药治疗疾病时不知不觉地过度使用APAP，药物过量很容易引发肝损伤，如果肝损伤得不到及时合理的控制，就会导致肝纤维化、肝硬化，甚至肝功能衰竭等严重疾病。据调查，目前APAP仍是临床药物性肝损伤的主要来源。通常APAP给药后，大部分APAP将被代谢成无毒的葡萄糖醛酸加合物，并被肝脏Ⅱ相代谢酶硫酸化，然后通过尿液和粪便***。一小部分APAP(约5-15%)还被细胞色素P450酶代谢成活性代谢物N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI)，NAPQI可与肝细胞内的谷胱甘肽(GSH)结合而转化为无毒产物。虽然在正常情况下，肝细胞内还原型GSH可以中和NAPQI，但过量的APAP会产生过多的NAPQI，导致细胞内和线粒体GSH储备的耗竭，导致活性氧(ROS)的过量产生，从而导致氧化应激和线粒体功能障碍，导致肝细胞坏死和凋亡。

现在临床上常用的预防或治疗APAP肝损伤的可行方法是给药N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)或维生素C。但是，其治疗效果不尽人意，NAC可通过直接与GSH结合或增加GSH的合成来提高NAPQI的中和能力，从而降低APAP的肝毒性。但是，NAC治疗过程中所引发的副作用明显，对胃肠道、中枢神经***和呼吸道都有刺激，易出现恶心、呕吐，头晕，支气管痉挛、咯血等不良反应。

天然植物中常见的抗氧化剂有黄酮、木脂素等。特别是含有多酚羟基的黄酮类化合物，在体内可通过抗脂质过氧化、清除活性自由基和作用于酶而发挥抗氧化活性，实验和临床实践证明，黄酮类化合物具有较强的保肝作用。临床上用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化和多种中毒性肝损伤。

目前尚未见本发明糖苷类化合物在药源性肝损伤保护中的应用报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种来源于红香树（Annesleafragrans Wall.）的糖苷类化合物的新用途，即结构式如下式所示的糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的用途：

；

本发明预防或/和治疗肝损伤药物是以糖苷类化合物为活性成分，用于制备治疗肝损伤药物，还可以加入一种或多种药物制剂上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等；或者与其他活性成分复配发挥协同预治肝损伤的作用；可以制成药剂学上适宜的使用剂型，例如胶囊、丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。

本发明所述糖苷类化合物Confusoside是以红香树树叶为原料，通过自然干燥粉碎，采用超声辅助提取的方法制得乙醇提取物，定量分析其含量达111.84±9.53mg/g乙醇提取物，将乙醇提取物经硅胶柱分离纯化得到的糖苷类化合物Confusoside。

本发明致力于该糖苷类化合物Confusoside对APAP造成的药源性肝损伤的预防和缓解作用的实验研究，经过对小鼠灌胃给药糖苷类化合物Confusoside后，腹腔注射APAP测试，可见肝损伤症状得到明显改善。

细胞毒性实验结果表明，人肝癌细胞（HepG2细胞）单次给药12.5、25、50、100和200μg/mL Confusoside，100μg/mL内未见细胞存活率降低；对小鼠20mg/kg、60mg/kgConfusoside给药，未见小鼠有包括抽搐、震颤、腹泻、嗜睡、呼吸困难和昏迷等行为；Confusoside在低浓度时不会对生物机体及细胞健康造成危害。

本发明对糖苷类化合物Confusoside预防和缓解APAP造成的肝损伤进行了研究，证实了Confusoside可以降低APAP造成的肝损伤的程度，改善肝组织病变和肝细胞损伤，降低脏器指数及评价肝损伤的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）指标，可以促进抗氧化、抑制炎症反应抑制细胞凋亡，减少氧化应激和过度炎症造成的机体和细胞损伤，因此可作为一种新的预防和治疗药源性肝损伤的药品开发。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明为传统天然植物红香树提供了新的药用途径；

2、本发明糖苷类化合物Confusoside在较低浓度时不会对生物体和细胞造成明显损伤，可显著降低肝损伤，安全性高；

3、本发明糖苷类化合物制备工艺简单，化合物在天然植物中含量丰富，适于工业化生产和市场推广应用。

附图说明

图1为不同浓度Confusoside化合物给药HepG2细胞毒性实验的细胞存活率结果；

图2为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的Control组（正常对照组）结果；

图3为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的APAP组（APAP给药）结果；

图4为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的NAC+APAP组（对乙酰半胱氨酸（NAC，100μg/mL）与APAP（50μg/mL）联合给药）结果；

图5为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的Cf-L+APAP组（低浓度Confusoside（50μg/mL）与APAP联合给药（50μg/mL））结果；

图6为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，通过AV/PI和流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡的Cf-H+APAP组（高浓度Confusoside（100μg/mL）与APAP（50μg/mL）联合给药）结果；

图7为不同浓度Confusoside抑制APAP诱导的细胞凋亡，不同组HepG2细胞的凋亡率统计结果；图中NC为对照组，NAC为NAC+APAP组，Cf-L为Cf-L+APAP组，Cf-H为Cf-H+APAP组；

图2-7中数据以平均数±平均标准差(SEM)表示(每组5个)，^# p<0.01 表示与Control组相比；^* p<0.05 ，^** p<0.01 表示与APAP组相比；

图8为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠肝脏形态学观察、H&E染色组织病理学观察结果示意图；

图9为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠实验中肝脏脏器指数结果；

图10为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠实验中生化指标ALT结果；

图11为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠实验中生化指标AST结果；

图12为不同浓度Confusoside对APAP肝损伤小鼠实验中生化指标LDH结果；

图8-12中数据以SEM表示(每组6个)。^# p<0.0 1 表示与 C组相比；^* p<0.05 ，^** p<0.01 表示与M组相比；C：正常对照组，M：APAP（400mg/kg）给药，Y：NAC（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf-L：低浓度Confusoside（20mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf：高浓度Confusoside（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药；

图13为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤实验中GSH含量结果；

图14为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤实验中超氧化物歧化酶（SOD）含量结果；

图15为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤实验中过氧化氢酶（CAT）含量结果；

图16为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤实验中丙二醛（MDA）含量结果；

图13-16中数据以SEM表示(每组6个)。^# p<0.0 1 表示与 C组相比；^* p<0.05 ，^** p<0.01 表示与M组相比；C：正常对照组，M：APAP（400mg/kg）给药，Y：NAC（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf-L：低浓度Confusoside（20mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf：高浓度Confusoside（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药；

图17为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子TNF-α含量结果；

图18为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子IL-1β含量结果；

图19为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子IL-6含量结果；

图20为不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤实验中NO含量结果；

图17-20中数据以SEM表示(每组6个)，^# p<0.0 1 表示与 C组相比；^* p<0.05 ，^** p<0.01 表示与M组相比；C：正常对照组，M：APAP（400mg/kg）给药，Y：NAC（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf-L：低浓度Confusoside（20mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药，Cf：高浓度Confusoside（60mg/kg）与APAP（400mg/kg）联合给药。

具体实施方式

下面结合实验数据和附图来进一步的阐述本发明。这些实验的事例仅用于说明本发明，不用于限制本发明的应用范围。在阅读了本发明的记载以后，本领域的科技人员对其等效的各种改动、修改和修饰，都属于本发明权利要求所限定的范围，实施例中使用的试剂，如无特殊说明，均为常规市售产品或按常规方法配制的试剂，实施例中方法如无特殊说明，均为常规实验方法。

实施例1：糖苷类化合物Confusoside的分离纯化

1）将从中国云南省临沧市永德县采集的红香树树叶自然干燥并粉碎；

2）按料液比g:mL为1:10的比例，将红香树叶粉末样品与用80% 乙醇水溶液混合后超声提取30min，过滤得提取液，滤渣重复提取3次后合并提取液，4000rpm下离心10min后取上清液，使用旋转蒸发仪进行减压蒸发浓缩，得浸膏状红香树叶提取物；

3）提取物浸膏进行预冻后经冷冻浓缩干燥机进行低温冻干，得到红香树叶乙醇提取物，置于样品干燥器内保存；

4）称取红香树叶乙醇提取物使用硅胶柱分离纯化，CHCl₃-MeOH（体积比30:1）洗脱，收集洗脱液，浓缩后80%甲醇水溶解，结晶，即得到化合物Confusoside；

5）利用核磁共振（NMR）对化合物结构进行鉴定，鉴定结果如下：

Confusoside : 黄色无定型粉末；1H (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.50 (1H, s,OH-2′), 9.16 (1H, s, OH-4), 7.05 (2H, d, J = 8.3 Hz, H-2/H-6), 6.66 (2H, d, J= 8.3 Hz, H-3/H-5), 6.55 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-3′), 6.58 (1H, dd, J = 1.8,8.9 Hz, H-5′), 7.90 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-6′). ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ:130.9 (s, C-1), 129.2 (d, C-2/C-6), 115.0 (d, C-3/C-5), 155.5 (s, C-4), 114.4(s, C-1′), 163.3 (s, C-2′), 103.4 (d, C-3′), 163.5 (s, C-4′), 108.3 (d, C-5′), 132.6 (d, C-6′), 40.0 (t, C-α), 28.9 (t, C-β), 99.6 (d, C-1″), 73.1 (d,C-2″), 76.4 (d, C-3″), 69.5 (d, C-4″), 77.1 (d, C-5″), 60.5 (t, C-6″), 204.4(s, CO). HRESIMS （m/z）419.1363 [M - H]^- (calcd. for C₂₁H₂₃O₉, 419.1348)；

。

实施例2：糖苷类化合物Confusoside的细胞毒性实验

使用人肝癌细胞（HepG2）通过MTT法测细胞活率来对化合物Confusoside进行细胞毒性评价，开展糖苷类化合物Confusoside对HepG2细胞的存活率的研究，具体方法如下：

从液氮罐中取出冻存的HepG2细胞，对细胞进行复苏后培养三代，进行MTT实验；HepG2细胞以3×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，孵育24h，孵育结束后对实验进行分组；空白组（NC）：200μL完全培养基处理HepG2细胞24h；样品组：分别选用浓度12.5、25、50、100、200μg/mL的Confusoside溶液200μL处理HepG2细胞24h。处理结束后，用0.5mg/mL的MTT溶液（150μL/孔）与细胞孵育4h，然后用150μL二甲基亚砜（DMSO）溶解，用SpectraMax M5微板仪在570nm处记录每孔的吸光度，并通过以下公式计算得到细胞存活率：

结果如图1所示，随着糖苷类化合物Confusoside浓度的增加，细胞存活率呈现剂量依赖性降低，且在浓度为200μg/mL时细胞活率低于90％，这说明Confusoside在200μg/mL时会抑制HepG2细胞的增殖，表现出一定的毒性作用，而Confusoside在100μg/mL以下浓度时不存在明显细胞毒性。

实施例3：糖苷类化合物Confusoside对乙酰氨基酚诱导的细胞凋亡的保护作用

用Annexin V-FITC (AV)/PI凋亡试剂盒检测化合物Confusoside对APAP诱导HepG2细胞凋亡的影响。

HepG2细胞在12孔板（细胞数量1.5×10⁵个/孔）中预孵育12h，待细胞接近长满孔板时，对细胞进行给药，Control组：1mL DMEM完全培养液处理细胞；APAP组：1mL DMEM完全培养液处理细胞；NAC+APAP组：1mL 100μg/mL NAC处理细胞；Cf-L+APAP组：1mL 50μg/mLConfusoside处理细胞；Cf-H+APAP组：1mL 100μg/mL Confusoside处理细胞；24h后，弃去之前培养液，对细胞再进行给药处理，Control组：1mL DMEM完全培养液处理细胞，其余组别用1mL 50mM APAP处理细胞24h；处理结束后，将细胞收集于1.5mL离心管中，用冷的PBS洗涤3次细胞，加入100μL的结合缓冲液、5μL的Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）在室温下避光孵育10min，结束后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

结果如图2-7所示，通过流式细胞仪对细胞凋亡情况的检测，与Control组相比，APAP处理后显著诱导了细胞的凋亡（p<0.01），但是与APAP组相比较，3个给药组均显著抑制了APAP诱导的细胞凋亡（p<0.01），并且Confusoside样品组以剂量依赖的方式显著抑制。

实施例4：糖苷类化合物化合物Confusoside对APAP诱导的小鼠肝损伤的预防和治疗作用

1、实验方法

选取雄性昆明种小鼠30只，体重20~25g，所有小鼠在正式实验前适应性饲养7d，饲养环境为室温24±1℃，相对湿度50±10%，每12h进行一次明暗交替。用实验室标准饲料和双蒸水喂养小鼠。饲养适应实验环境7d后，将小鼠随机分为5组，每组6只：C组(对照组)、M组(APAP模型组)、Y组(NAC组)、Cf-L组(Confusoside低剂量组)、Cf-H组(Confusoside高剂量组)。对小鼠正常饲养，并分别对不同组别小鼠连续7d每天一次灌胃给药，每次灌药剂量0.2mL；

C组：蒸馏水；

M组：APAP（400mg/kg）给药；

Y组：60mg/kg（药物/鼠体重）NAC（N-乙酰-L-半胱氨酸）与APAP（400 mg/kg）联合给药；

Cf-L组：20mg/kg（药物/鼠体重）Confusoside与APAP（400mg/kg）联合给药；

Cf-H组：60mg/kg（药物/鼠体重）Confusoside与APAP（400mg/kg）联合给药；

连续给药7d后，小鼠禁食一夜，第8天早上，将APAP溶解于PBS中，采取腹腔注射的方法，对C组小鼠注射一定体积的PBS，对M组、Y组、Cf-L组、Cf-H组小鼠，注射溶有APAP的PBS（400mg/kg ，APAP/鼠体重）。

6h之后，对小鼠进行眼球取血，并实施安乐死；对小鼠进行解剖，观察、收集肝组织，用于分析。

观察肝脏的形态学变化、拍照，称每只小鼠的肝组织重量，计算肝脏脏器指数，随机将每组2份肝组织制作H&E染色切片。取小鼠血液，使用离心机1800×g、4℃离心10min，采集血浆；用相应试剂盒检测ALT、AST、LDH、NO、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)等生化指标。

取剩余小鼠肝组织与0.9%氯化钠溶液混合，超声细胞破碎机匀浆；组织匀浆在10000rpm和4℃下离心10min，收集上清液并储存在-80℃以备进一步使用；制备肝组织匀浆进行MDA、CAT、SOD、GSH等生化指标的测定。

观察H&E染色切片，对小鼠肝脏进行组织病理学评价。

2、结果

（1）不同浓度化合物Confusoside对APAP给药小鼠肝损伤的预防和治疗情况

由图8可知，C组正常小鼠肝脏呈红色，包膜光滑、有光泽、有弹性。反之，观察小鼠肝脏的形态学变化。M组肝脏颜色加深，出现灰黄色点状坏死，肝表面暗淡，质地硬化，个别肝脏可见明显的斑片状充血。与M组相比，Y组、Cf-L组和Cf-H组小鼠肝损伤明显改善，肝组织形态接近C组。

病理组织学评价与形态学观察结果一致。C组肝小叶结构清晰，肝细胞无坏死变性，无炎性细胞浸润，细胞核大而清晰，中心静脉周围肝索呈放射性排列，肝窦正常；M组小鼠肝小叶中心静脉周围均有不同程度的肝细胞变性坏死，坏死表现为凝固性、核固缩或溶解，并伴有中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞浸润。细胞索形态正常，中间带可见细胞空泡变性；与M组相比，Y组、Cf-L组和Cf-H组肝小叶结构更加完整，肝索排列趋于整齐，肝细胞形态明显改善，中心静脉附近的炎性浸润和变性坏死细胞明显减少；表明对过量APAP诱导的肝损伤有明显的改善作用。

由图9-12可知，直观评价肝损伤情况的肝脏脏器指数以及生化指标AST、ALT、LDH，与C组相比，M组水平均有显著增加（p<0.01）；与M组相比，Y组和Cf-L、Cf-H组指标水平均有明显下降；Cf-H组与Y组水平接近，与Cf-L组相比效果更加明显。

以上结果表明化合物Confusoside对APAP诱导的肝损伤有明显的预防和治疗作用。

（2）不同浓度化合物Confusoside减轻APAP给药小鼠氧化应激损伤情况

从图13-16可知，与C组相比，M组大鼠肝组织中SOD、CAT活性显著降低(p<0.01)，GSH含量也显著降低(p<0.01)；与M组相比，Y组、Cf-L组、Cf-H组SOD、CAT、GSH活性均升高，其中Cf-H组升高最为明显，接近Y组(p<0.01)，说明Cf能有效治疗APAP所致的肝组织氧化损伤，且剂量与作用呈正相关；此外，M组MDA水平显著升高(p<0.01)。与C组比较，提示肝组织存在脂质过氧化；Cf-L组与M组比较，Cf-L组降低MDA水平(p<0.05)，Cf-H组作用更明显，接近Y组(p<0.01)；CAT、SOD、GSH和MDA的活性是评价生物体内氧化应激情况的重要指标，由以上结果表明Confusoside对APAP诱导的氧化应激损伤有明显的预防和治疗作用。

（3）不同浓度Confusoside减轻APAP给药小鼠炎症损伤情况

由图17-20可知，与C组比较，M组大鼠肝组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量明显升高(p<0.01)。与M组比较，Y组、Cf-L组、Cf-H组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量均低于M组，Cf-L组TNF-α含量下降，但变化不明显，Cf-H组显著降低(p<0.01)，与M组比较，Y组、Cf-L组、Cf-H组均有显著降低p<0.01)，Cf-L组与M组比较差异无显著性(p>0.05)。同样，Y组和Cf-H组IL-1β含量明显低于M组(p<0.01)，Cf-L组IL-6含量明显低于M组(p<0.0 5)，而Cf-H组与Y组接近(p<0.01)。Cf组NO含量明显低于M组(p<0.01)，Cf-L组和Cf-H组NO含量均显著低于M组(p<0.01)，Cf-L组和Cf-H组NO含量均显著低于M组(p<0.01)，Cf-L组和Cf-H组NO含量明显低于M组(p<0.01)。TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的活性是评价生物内炎症水平的关键性指标，因此，以上结果表明Confusoside对APAP诱导的炎症损伤有明显的预防和治疗作用。

Claims

1.结构式如下式所示的糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用：

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