CN113466191B - 一种用于检测细胞结构功能的共聚焦显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测细胞结构功能的共聚焦显微成像方法，属于细胞结构功能检测领域，本发明利用共聚焦显微镜对铺展在一定刚度基底上细胞的牵引力、细胞膜局部形变以及对细胞内蛋白定性的同时观测，可用于研究细胞在处于不同外界刺激下细胞膜局部形变和牵引力以及细胞内蛋白位置变化的实时动态规律，大大缩短了检测时间和成本。
Description
方法领域
本发明涉及细胞结构功能检测领域，具体涉及一种用于检测细胞结构功能的共聚焦显微成像方法。
背景方法
众所周知，细胞作为生物体结构和功能的基本单位，是生命活动的基本单位，在生物体的生长和发育过程中发挥着关键的作用。活细胞通过改变其外在形态结构与内部稳态来面对外界刺激从而存活下来。细胞膜主要是由蛋白质、脂类、糖类构成，与能量代谢、肿瘤发生、物质交换、细胞识别高度相关，具有重要的生物学功能。因此，通过实时监测外界刺激条件下细胞膜形态结构与细胞内蛋白质位置的实时动态变化可以有助于预测生物体对外在刺激的响应，具有重要的生理学和病理学研究意义。
目前用于细胞力学研究测量的方法大致可以分为四类：单细胞加载实验方法、流变学加载实验方法、基底应变加载方法和原子力显微镜方法。由于这些方法需要向细胞施加力因而会损害细胞，不利于测量或获取细胞的动态力学性质，同时缺乏合适的研究方法去同时检测细胞黏附过程中或者外界刺激下细胞膜局部形变和细胞牵引力变化以及对细胞内蛋白质动态变化的方法手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够通过检测细胞黏附过程中或者外界刺激下细胞膜局部形变和细胞牵引力变化以及对细胞内蛋白质动态变化而检测细胞结构功能的共聚焦显微成像方法。
本发明的方法方案是：一种用于检测细胞结构功能的共聚焦显微成像方法，具体包括如下步骤，
(1)制备混有橙色荧光小球的聚丙烯酰胺凝胶基底，对基底表面进行黏附性处理；
(2)将细胞消化后接种在步骤(1)中所做的基底上，加入培养基过夜培养细胞，第二天拍照；
(3)共聚焦显微镜使用20倍镜以每层0.3微米的间距扫描20层，通过552nm激发波长观测基底荧光小球的运动位移；同时以638nm激光激发，发射波长为630-650nm检测细胞条纹的变化；
(4)根据细胞干涉条纹的物理特征值，检测细胞膜内局部张力、离面位移；通过观察干涉条纹的波长测定细胞牵引力的大小，通过条纹产生的规则程度量化细胞内力信号相关蛋白的位置变化；
进一步的技术方案，步骤(4)中根据荧光小球处干涉条纹的亮斑值和暗斑值测定细胞膜离面位移h(x,y)，具体计算方式如下：
其中，δ为相移量，n为细胞培养液的折射系数，λ为光波波长，d是细胞膜的厚度；I(x,y)为荧光分子经过光学***后的光强，Imax+Imin为干涉条纹的亮斑值，Imax-Imin为干涉条纹的暗斑值；
进一步的技术方案，步骤(4)中根据光波波长确定细胞膜内局部张力，具体计算方式如下：细胞膜内局部张力为σ，张力阈值为σ*，细胞膜内分子与基底表面相互作用势为V,
K是载波条纹的空间频率，λ为光波波长，
V”为细胞膜内分子与基底表面相互作用势的二阶倒数。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种基于共聚焦显微镜检测细胞内蛋白定性和细胞膜局部形变以及细胞牵引力变化的方法，解决了传统方法中细胞膜局部形变、细胞牵引力以及对细胞内蛋白定性不能同时检测的问题，从而实现了对铺展在一定刚度基底上细胞的牵引力、细胞膜局部形变以及对细胞内蛋白定性的同时观测，可用于研究细胞在处于不同外界刺激下细胞膜局部形变和牵引力以及细胞内蛋白位置变化的实时动态规律，大大缩短了检测时间和成本。
附图说明
图1为本发明的技术原理图。
具体实施方式
下面通过非限制性实施例，进一步阐述本发明，理解本发明。
现有技术表明，细胞的力学性能与细胞的外部形态结构和内部功能直接相关，细胞膜形变和其张力被认为是细胞进程的主要调控因子，参与了包括细胞***、迁移、吞噬、极化、代谢等众多生理学功能。为了很好地完成这些生理过程，细胞膜需要不断地进行变形。在这些生理学过程中，由于细胞受到不同的机械刺激，使得作用到膜内离子通道、表面受体蛋白的构型变化，进而引起细胞内的蛋白级联反应。
基于上述细胞结构功能与细胞力学性能的紧密联系，本发明提供了一种利用共聚焦显微镜同时对细胞内蛋白定性和细胞膜局部形变以及细胞牵引力变化检测的方法来检测细胞的结构功能。
一种用于检测细胞结构功能的共聚焦显微成像方法，具体包括如下步骤，
(1)制备混有橙色荧光小球的聚丙烯酰胺凝胶基底，对基底表面进行黏附性处理；
(2)将细胞消化后接种在步骤(1)中所做的基底上，加入培养基过夜培养细胞，第二天拍照；
(3)共聚焦显微镜使用20倍镜以每层0.3微米的间距扫描20层，通过552nm激发波长观测基底荧光小球的运动位移；同时以638nm激光激发，发射波长为630-650nm检测细胞条纹的变化；
(4)根据细胞干涉条纹的物理特征值，检测细胞膜内局部张力、离面位移；通过观察干涉条纹的波长测定细胞牵引力的大小，通过条纹产生的规则程度量化细胞内力信号相关蛋白的位置变化；
细胞膜离面位移测定如下：
对于黏附在二维平面的细胞，其反射干涉对比成像的光路图1所示；由于相邻介质具有不同折射率，两束入射光路I1和I2分别在基底的上表面和细胞膜的内层表面形成反射。这两束光路的光程差就产生了干涉现象；相应的干涉条纹与细胞膜的离面位移(细胞膜距离基底上表面的高度)一一对应。
离面位移h(x,y)与对应光强之间的关系如下：
其中，δ为相移量，n为细胞培养液的折射系数，λ为光波波长，d是细胞膜的厚度；I(x,y)为荧光分子经过光学***后的光强，Imax+Imin为干涉条纹的亮斑值，Imax-Imin为干涉条纹的暗斑值。
细胞膜张力测定如下：
对于黏附在二维基质上的细胞，细胞膜内局部张力为σ，张力阈值为σ*，细胞膜内分子与基底表面相互作用势为V，则张力阈值σ*与膜的刚度以及膜与基底作用势V满足如下关系：
K是载波条纹的空间频率，λ为光波波长，
V”为细胞膜内分子与基底表面相互作用势的二阶倒数。
干涉条纹间距对应着细胞膜波动的面内波长ξ，以上理论表明，当膜内张力σ较小时，膜波动的面内波长ξ并不发生变化，而是一个恒定的值。当膜内张力σ超过阈值σ*后，面内波长ξ正比于膜内应力。
细胞牵引力测定：
黏附细胞和基底之间的作用力是相互的，细胞黏附在软凝胶基底上，其在迁移铺展过程中会受到一定的牵引力。在细胞伪足区域，干涉条纹的波长与牵引力的大小表现出高度相关性，因此可通过观察干涉条纹的波长去测定细胞牵引力的大小。
细胞内蛋白定性:
当细胞受到外界机械信号刺激时，会激活细胞内力学信号的传导，引起细胞内蛋白质信号通路的级联反应，进而造成细胞面内波动产生的干涉条纹的变化，可以通过判断条纹产生的规则程度去量化细胞内力信号相关蛋白的位置变化。
Claims (1)
1.一种用于检测细胞结构功能的共聚焦显微成像方法，其特征在于，具体包括如下步骤，
（1）制备混有橙色荧光小球的聚丙烯酰胺凝胶基底，对基底表面进行黏附性处理；
（2）将细胞消化后接种在步骤（1）中所做的基底上，加入培养基过夜培养细胞，第二天拍照；
（3）共聚焦显微镜使用20倍镜以每层0.3微米的间距扫描20层，通过552nm激发波长观测基底荧光小球的运动位移；同时以638nm激光激发，发射波长为630-650nm检测细胞条纹的变化；由于相邻介质具有不同折射率，两束入射光路分别在基底的上表面和细胞膜的内层表面形成反射；这两束光路的光程差就产生了干涉现象；
（4）根据细胞干涉条纹的物理特征值，检测细胞膜内局部张力、离面位移；通过观察干涉条纹的间距测定细胞牵引力的大小，通过条纹产生的规则程度量化细胞内力信号相关蛋白的位置变化；
其中，步骤（4）中根据荧光小球处干涉条纹的亮斑值和暗斑值测定细胞膜离面位移，具体计算方式如下：
，
，
其中，δ为相移量，n为细胞培养液的折射系数，λ为光波波长，d是细胞膜的厚度；为荧光分子经过光学***后的光强，/>为干涉条纹的亮斑值，/>为干涉条纹的暗斑值；
步骤（4）中根据光波波长确定细胞膜内局部张力，具体计算方式如下：细胞膜内局部张力为σ，张力阈值为σ*，细胞膜内分子与基底表面相互作用势为V,
，
，
ζ是细胞膜波动的面内波长，干涉条纹的间距对应着细胞膜波动的面内波长ζ，
K是载波条纹的空间频率，，λ为光波波长，
为细胞膜内分子与基底表面相互作用势的二阶导数。
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