CN113466110A - 细胞电生理信号分立式原位长时测量记录***与方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种细胞电生理信号分立式原位长时测量记录***，包括平面微电极阵列传感器、电信号感测装置、电信号调理装置、上位机和信号传输线。该***可自动化电穿孔细胞，并进行胞内外电生理信号记录。通过分离感测装置和后续部分，减少发热并降低噪声，感测装置可长期置于培养箱内原位记录信号，从而实现了细胞所处环境条件的控制，保证了细胞的长期活性。本发明还提供了一种细胞电生理信号分立式原位长时测量记录方法，在***各部件连接后将平面微电极阵列传感器与电信号感测装置一同放入培养箱中进行测试记录，可使实验人员可以远程查看细胞状况，监测与控制***工作状态，实现对细胞电生理信号安全稳定又方便的长期记录。

Description

细胞电生理信号分立式原位长时测量记录***与方法

技术领域

本发明涉及一种自动化的细胞电生理信号测量与记录装置，尤其涉及一种分立式的原位长时间持续测量并记录细胞电生理信号的***。

背景技术

生物电活动作为机体许多生理活动的基础，可通过测量与记录其发出的电生理信号对其进行研究。目前，基于微电极阵列的记录装置，能够非侵入式地长时记录到电生理信号。但在实际应用场景中，细胞常常需要被移出培养箱并长时间放置在记录装置上，然而细胞对温度、二氧化碳浓度等因素敏感，若长时间处于不适宜的环境中，细胞容易活性下降甚至死亡，从而影响实验。

发明内容

本发明针对现有***在实际中无法长时间稳定记录细胞电生理信号的问题，开发了一种细胞电生理信号分立式原位长时测量记录***，采用将感测电路与后续部分前后分离，同时减少发热并降低噪声的方法，使感测装置能够长期置于培养箱中，从而控制细胞所处环境的条件稳定不变，实现对细胞电生理信号的自动化长时测量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种细胞电生理信号的分立式长时测量记录***，包括平面微电极阵列传感器、电信号感测装置、电信号调理装置、上位机和信号传输线。

其中，所述平面微电极阵列传感器包括基底、位于基底上的细胞培养腔、形成于基底上的微电极阵列和参考电极，所述微电极阵列包括多个工作电极，且位于所述细胞培养腔内；

所述电信号感测装置包括多路传感器电信号感测电路、电穿孔模块和置于多路传感器电信号感测电路、电穿孔模块外侧的金属屏蔽盒。

所述电信号调理装置包括多路电信号调理电路、数据采集卡、电源模块和置于多路电信号调理电路、信号采集卡、电源模块外侧的金属屏蔽盒。每路传感器电信号感测电路均由RC隔直流电路、一级同相放大电路组成且每路传感器电信号感测电路与微电极一一对应连接，用于初级放大微电极输出的电信号。

每路电信号调理电路与传感器电信号感测电路通过信号传输线一一对应连接，用于二次放大传感器电信号感测电路输出的电信号，直至放大到数据采集卡的采集范围之内。信号调理电路的输出端与数据采集卡输入端相连，数据采集卡的输出端与上位机相连。

电穿孔模块的输入端通过信号传输线与数据采集卡的模拟输出端相连，输出端与微电极阵列相连，用于接收数据采集卡产生的电穿孔控制信号，产生电穿孔信号并传输至微电极阵列并最终作用于细胞。

电源模块外接12V直流电，用于对传感器信号感测电路提供±3V直流电，对信号调理电路提供±5V直流电。

所述上位机用于控制电穿孔信号输出、显示和记录平面微电极阵列传感器测试得到的数据。

进一步地，每路电信号调理电路由一阶RC高通滤波器、二阶RC低通滤波器、一级放大电路依次连接组成。

进一步地，所述电信号感测装置的金属屏蔽盒上还设有多个排气孔。

进一步地，所述微电极阵列中工作电极呈中心对称分布，工作电极的尺寸为20×20μm²。

进一步地，所述工作电极由一层钛和一层金组成。

具体地，所述微电极阵列由以下步骤制得：

(1)光刻获得工作电极的电极图案：以20×20mm²的玻璃作为绝缘基底，采用光刻技术制备尺寸为20×20μm²的工作电极。

(2)镀电极：在步骤(1)获得的图案化的玻璃基底上磁控溅射一层钛和一层金，去除电极排布图案外的钛和金得到导电的金属电极。

进一步地，所述平面微电极阵列传感器上设置有与工作电极一一对应连接的排针，所述电信号感测装置上设置有与传感器电信号感测电路输入端一一对应连接的插孔，所述平面微电极阵列传感器和所述电信号感测装置通过排针和插孔连接。

基于相同的发明思路，本发明还提出了一种细胞电生理信号的分立式长时测量记录方法，包括以下步骤：

(1)将细胞培养在细胞培养腔中，各部件连接后将平面微电极阵列传感器与电信号感测装置一同放入培养箱中。

(2)开启电源模块，利用上位机设置和控制电穿孔信号输出，并实时显示和记录平面微电极阵列传感器测试得到的数据。

优选地，所述传感器电信号感测电路的RC隔直流电路由3.3nF电容和阻值为50MΩ的电阻构成。RC隔直流电路的输出端与放大电路相连，放大电路的输出端通过多根长的并排信号屏蔽线与电信号调理电路相连。电源地和信号地分别隔离连接，最后在一点相接，此点同时与外置的金属屏蔽盒连接。

所述金属屏蔽盒正上方中央设有一翻盖，翻盖两侧设有多个用以透气的孔洞，翻盖依靠磁力与屏蔽盒紧吸关闭。

所述电信号调理电路由滤波电路和一级同相放大电路组成，滤波电路由一阶RC高通无源滤波和二阶RC低通有源滤波构成，滤波器的输出端与放大电路相连，放大电路的输出端与信号采集卡相连，信号采集卡的信号输出端与上位机的输入端相连，信号采集卡的模拟输出模块通过一根长的信号屏蔽线与电穿孔模块输入端相连。

本发明的有益效果是，通过分离感测装置和后续部分并减小***的发热和噪声，使细胞能够在整个培养和实验期间均置于培养箱内，从而控制细胞所处的环境条件恒定不变，避免细胞受环境影响，从而大大减小环境因素对实验的影响，使实验结果更加精确，同时也实现了对细胞电生理信号更准确的、随时随地的、长期的测量与记录。

附图说明

图1是金平面微电极阵列传感器示意图；

图2是传感器电信号感测电路模块图；

图3是电信号调理电路模块图；

图4是电信号感测装置示意图；

图5是电信号调理装置示意图；

图6是传感器电信号感测电路原理图；

图7是电信号调理电路原理图；

图8是金平面微电极阵列的分立式长时测量记录***框图；

图9是上位机软件主界面；

图10是细胞胞外电生理信号的采集结果图；

图中，工作电极1、导电银浆2、细胞培养腔3、悬垂式参考电极4、PCB板5、排针6、玻璃基底7、平面微电极阵列传感器8、传感器电信号感测电路9、接地点10、传感器信号感测电路输出端11、信号调理电路输入端12、信号调理电路13、信号调理电路输出端14、带有透气孔的金属屏蔽盒15、传感器信号感测电路模块16、电穿孔模块17、电源模块输入端18、数据采集卡19、插孔20、数据采集卡输入端21、信号调理电路模块22、长方体翻盖23、通气孔24、电源模块25、金属屏蔽盒26。

具体实施方式

下面详细介绍所使用的细胞电生理信号的检测原理。

细胞的电生理信号可以反映细胞的生命活动，当细胞膜上的离子通道对钠离子、钾离子和钙离子开放时，所引起的动作电位会通过细胞膜传导至胞外，所形成的胞外场电位信号被工作电极1记录。如果通过工作电极1对细胞施加电刺激，细胞膜的通透性将发生改变，产生微小纳米裂缝，此时胞内电信号，即动作电位，可直接传导至工作电极1并被记录，经过高阻抗低噪声放大器放大和滤波后，被信号采集卡采集并送入上位机中分析、显示和存储。

如需长时间放置于培养箱中，记录装置需同时考虑噪声和发热问题，因此将装置设为分立式，置于培养箱中的感测装置只做初级放大，通过减少运放数量和工作电流来减少发热；再添加一金属屏蔽壳15并使用屏蔽线传输信号以减小噪声。

下面结合实例和附图进一步说明本发明的作用，能更好的表现本发明的目的和效果。

如图8所示，本发明的细胞电生理信号分立式原位长时测量记录***，包括平面微电极阵列传感器、如图4所示的电信号感测装置，如图5所示的电信号调理装置、上位机和信号传输线，本实施例中采用可屏蔽噪声的信号屏蔽线，其中，电信号感测装置和电信号调理装置为分立结构，通过信号屏蔽线连接，在测试时，平面微电极阵列传感器和电信号感测装置置于培养箱中，电信号调理装置置于培养箱外。

其中，平面微电极阵列传感器为金平面微电极阵列传感器8，如图1所示，金平面微电极阵列传感器8包括PCB板5、工作电极1和参考电极4，图中所示参考电极4为垂悬式结构，但不限于此；本实施例中，工作电极1的尺寸为20×20μm²，玻璃基底7的尺寸为20×20mm²；参考电极4的高度大约1-2cm。工作电极1与传感器电信号感测电路9的输入端相连。玻璃基底7的边缘布有连接端，工作电极1和PCB板5通过连接端上的导电银浆2固定与连接。玻璃基底7上、工作电极1外侧固定一筒体作为细胞培养腔3。参考电极4依靠腔体3上的盖子固定在细胞上方，一端螺旋式垂入细胞培养液中，一端接地。

作为优选，金平面微电极阵列传感器8上工作电极1为多个，所述多个工作电极1呈中心对称分布，便于与圆筒形的细胞培养腔3粘结。图1中为32个工作电极1与1个参考电极4的金平面微电极阵列传感器8的结构示意图。

工作电极1优选为由一层钛和一层金组成，这种平面结构的电极与在其表面上的细胞的细胞膜耦合效果较好，同时加工工艺较简单，有利于批量制作。

具体地，本实施方式中采用磁控溅射的方法制备金平面微电极阵列。首先采用光刻技术，在玻璃基底7上旋涂一层SU-8负性光刻胶，紫外光通过掩膜板照射到其表面进行曝光，在显影液中浸泡除去曝光部分的光刻胶后，即得到图案化的玻璃基底7。然后对显影之后的玻璃基底7进行磁控溅射10nm的钛，再磁控溅射100nm的金，再采用丙酮溶解剩余的光刻胶，可以得到导电的通路。接着再次采用光刻技术，在上有导电通路的玻璃基底7上再次旋涂一层SU-8负性光刻胶，再次曝光并显影，只暴露出电极部分，最终得到金平面微电极阵列结构。

将金平面微电极阵列朝上，侧面用导电银浆2将连接端部分与PCB板5依次连接固定，然后在电极的上方用未固化的PDMS粘接细胞培养腔3(直径约为1.4cm)，在80℃的条件下放置2小时使PDMS固化，最后焊接上排针6。参考电极4则将钛丝伸过细胞培养腔3的盖子，一端旋成螺旋状并调整至合适的高度，另一端焊接在排针6上，最后用热熔胶枪将钛丝在盖子上固定并密封。

所述电信号感测装置如图4所示，由传感器信号感测电路模块16、电穿孔模块17和带有透气孔的金属屏蔽盒15组成，传感器信号感测电路模块16包含16路传感器信号感测电路9、接地点10和传感器信号感测电路输出端11。

单路传感器信号感测电路9由RC隔直流电路、一级放大电路依次连接组成，如图6所示，所述RC隔直流电路包括一个设于工作电极输出端和一级放大电路输入端之间的电容C9、一端与电容C9的末端相连的电阻R2，电阻R2的另一端与地相连。一级放大电路包括一运放U1A、设于运放反相输入端和输出端之间的电阻R3、与电阻并联的电容C10、一端与运放反相输入端相连的电阻R4、一端与运放正相输入端相连的电阻R1，电阻R4的另一端与地相连，电阻R1的另一端与RC隔直流电路的输出端相连。运放U1A的输出端即为传感器信号感测电路的输出端11，与信号屏蔽线相连。电容C10作为反馈电容，其作用是通过相位补偿防止运放产生自激振荡。同一路传感器信号感测电路的另一通道与前面描述的电路相同。信号感测电路的电源地和信号地分别隔离连接，最后在接地点10相接，此点同时与金属屏蔽盒15连接。

带有透气孔的金属屏蔽盒15为长方体，尺寸略大于传感器信号感测电路模块16，正上方中央有一通过活页连接固定的长方体翻盖23，翻盖23两侧设有多排通气孔24，可供细胞与外界进行气体交换使用。

电穿孔模块17的输出端与工作电极1相连，产生电穿孔信号并传输至微电极阵列。

所述电信号调理装置如图5所示，由信号调理电路模块22，信号采集卡19和金属屏蔽盒26组成，信号调理电路模块22包含16路信号调理电路13、电源模块25、信号调理电路模块输入端12、信号调理电路模块输出端14、电源模块输入端18。

单路信号调理电路13由一阶RC高通滤波器、二阶RC低通滤波器、一级放大电路依次连接组成，如图7所示，所述一阶RC高通滤波器包括一个设于信号屏蔽线输出端即信号调理电路输入端12与二阶RC低通滤波器之间的电容C18、一端与电容C18的末端相连的电阻R10，电阻R10的另一端与地相连；所述二阶RC低通滤波器包括一个运放U2A、两个设于一阶RC高通滤波器的输出端与运放U2A的同相输入端之间的依次串联的电阻R7和R8、一个与运放U2A的输出端相连的电容C17、一个与运放U2A的同相输入端相连的电容C19，电容C17的另一端与电阻R7和R8的连接节点相连，电容C19的另一端与地相连，运放U2A的反相输入端与其输出端短接；所述一级放大电路包括一运放U3A、设于运放U3A反相输入端和输出端之间的电阻R11、与电阻并联的反馈电容C20、一端与运放U3A反相输入端相连的电阻R12、一端与运放U3A正相输入端相连的电阻R9，电阻R12的另一端与地相连，电阻R9的另一端与二阶RC低通滤波器的输出端相连，运放U3A的输出端即为信号调理电路输出端14，与信号采集卡的输入端21相连。同一路信号调理电路的另一通道与前面描述的电路相同。

电源模块输入端18外接12V直流电，为减少电路发热，通过DC/DC转换芯片降压后对传感器信号感测电路9提供±3V直流电，对信号调理电路13提供±5V直流电。

信号调理电路模块22和置于其下方的信号采集卡19均固定于金属屏蔽盒26的内部，金属屏蔽盒26上设有数据接口和电源接口。

将上述电路相关的电子元器件分别焊接在传感器信号感测电路模块16和信号调理电路模块22上，板上共有16路相同的传感器信号感测电路9和信号调理电路13，且每路电路均采用双运放而具有双通道，则共有32通道的传感器信号感测电路和信号调理电路，与图1中32个工作电极1相对应。电源模块输入端18接外部12V直流电，传感器信号感测电路的输出端11与传感器信号调理电路输入端12相连，信号调理电路输出端14与数据采集卡输入端21相连，数据采集卡19的输出端与上位机的输入端相连，数据采集卡19的模拟输出模块与电穿孔模块17的输入端相连。

上位机用于控制电穿孔信号输出、显示和记录金平面微电极阵列传感器8测试得到的数据。

作为优选，工作电极1和参考电极4与传感器信号感测电路9通过排针与插孔结构相连，金平面微电极阵列传感器8上设置有排针6，传感器信号感测电路模块16上设置有相对应的插孔20，排针6与相对应的工作电极1相连，插孔20与传感器信号感测电路9相连，同样地，参考电极与传感器信号感测电路模块的接地点10通过排针和插孔相连。

如图8所示，本发明的工作过程如下：将金平面微电极阵列一侧朝上，将金平面微电极阵列传感器8的排针6***到对应的排针插槽20中，在其上培养细胞，将信号屏蔽线一端接入传感器信号感测电路输出端11，一端接入信号调理电路输入端12，将电源线一端接入传感器信号感测电路供电端，一端接入信号调理电路模块电源输出端，将电穿孔信号传输线一端接入电穿孔电路模块17的控制端，一端接入信号采集卡19的模拟输出模块，开启电源模块25，装置开始工作，点击上位机中的按钮开始采集，工作电极1可以记录到细胞培养腔3中细胞的胞外电信号，输入电穿孔脉冲的参数，点击输出，PC机将控制数据采集卡19通知电穿孔电路模块17输出电穿孔脉冲信号，细胞培养腔3中的细胞受到电刺激，使其细胞膜通透性改变，此时工作电极1可以记录到细胞的胞内电信号。细胞电生理信号通过连接的排针6传输到传感器电信号感测电路9的输入端，通过同相比例放大器进行初步放大后再送往电信号调理装置，由于电信号感测装置内的器件数量和工作电流均较小，电信号感测装置发热量很小，培养箱可以维持细胞所处的环境条件稳定，且金属屏蔽盒可有效降低噪声干扰。细胞电生理信号再从电信号感测装置通过信号屏蔽线传输至电信号调理电路13进行滤波并再次放大，由于电信号调理装置置于培养箱外，与细胞热隔离，其散热良好且对细胞影响小。再次放大后的信号随后被传输至数据采集卡19进行采集，最后传输到上位机进行分析、显示和存储。

优选地，如图9所示，细胞电生理信号分立式原位长时测量记录***的上位机工作流程如下：打开程序进入界面，输入电穿孔条件参数并选择是否记录数据，确认后点击开启采集，上位机将根据当前***时间或电穿孔条件参数在当前目录下新建并命名TDMS记录文件，待信号稳定后，点击发生脉冲按钮，上位机立即通知数据采集卡19发出脉冲电压信号，并同时通知数据采集卡采集数据，上位机一个线程会将采集到的数据送入缓冲队列，另一线程将缓冲队列的数据按照先入先出的规则提取出来经过放大倍数还原后发送给波形图表进行显示和TDMS文件进行记录，这种使用同步队列采集和显示数据有效地避免了处理数据时不能同时采集数据导致数据丢失的情况。当实验结束时，用户可点击停止按钮，这时按钮会转换为停止，表示当前为停止状态。

下面给出本发明的应用案例。

金平面微电极阵列的细胞电生理信号分立式原位长时测量记录***主要用于细胞电生理信号的检测。在实验中，首先将细胞培养在细胞培养腔3中，将金平面微电极阵列传感器8***到插槽20中，使用信号屏蔽线将如图4所示的信号感测装置和如图5所示的信号调理装置相连，使用USB集线器将数据采集卡19和上位机相连，打开电源模块25开关，打开上位机软件，进入主界面如图9所示，点击运行，等待大约1秒后数据将显示在波形图表如图10所示，图10中包含32通道数据的胞外信号。待数据稳定显示后，输入电穿孔条件，再选择记录方式即开始记录，记录文件以穿孔条件命名。记录到一定量的胞外信号数据后，点击发生脉冲按钮，上位机立即控制数据采集卡19发出脉冲信号，在合适的穿孔条件下就可记录胞内电信号。途中实验人员可以离开实验室，由于细胞被置于培养箱中，***可以在不影响细胞活性的情况下二十四小时不间断地对信号进行记录。在***工作过程中，实验人员可以远程查看细胞的状况并监控***的工作状态。待实验完成后，点击结束停止程序，记录文件存放于上位机中，可通过软件对其进行后续处理。

本发明采用导电金属平面电极阵列，研制了一种细胞电生理信号的分立式原位长时测量记录***，通过分离感测装置和后续部分并减小***的发热和噪声，使细胞能够在整个培养和实验期间均置于培养箱内，从而控制细胞所处的环境条件恒定不变，减小环境因素对实验的影响，使实验结果更加精确，也实现对细胞电生理信号更准确的、随时随地的、长期的测量与记录。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种细胞电生理信号的分立式长时测量记录***，其特征在于，包括平面微电极阵列传感器、电信号感测装置、电信号调理装置、上位机和信号传输线。

其中，所述平面微电极阵列传感器包括基底、位于基底上的细胞培养腔、形成于基底上的微电极阵列和参考电极，所述微电极阵列包括多个工作电极，且位于所述细胞培养腔内；

所述电信号感测装置包括多路传感器电信号感测电路、电穿孔模块和置于多路传感器电信号感测电路、电穿孔模块外侧的金属屏蔽盒。

所述电信号调理装置包括多路电信号调理电路、数据采集卡、电源模块和置于多路电信号调理电路、信号采集卡、电源模块外侧的金属屏蔽盒。每路传感器电信号感测电路均由RC隔直流电路、一级同相放大电路组成且每路传感器电信号感测电路与微电极一一对应连接，用于初级放大微电极输出的电信号。

每路电信号调理电路与传感器电信号感测电路通过信号传输线一一对应连接，用于二次放大传感器电信号感测电路输出的电信号。信号调理电路的输出端与数据采集卡输入端相连，数据采集卡的输出端与上位机相连。

电穿孔模块的输入端通过信号传输线与数据采集卡的模拟输出端相连，输出端与微电极阵列相连，用于接收数据采集卡产生的电穿孔控制信号，产生电穿孔信号并传输至微电极阵列。

电源模块外接12V直流电，用于对传感器信号感测电路提供±3V直流电，对信号调理电路提供±5V直流电。

所述上位机用于控制电穿孔信号输出、显示和记录平面微电极阵列传感器测试得到的数据。

2.根据权利要求1所述的分立式长时测量记录***，其特征在于，每路电信号调理电路由一阶RC高通滤波器、二阶RC低通滤波器、一级放大电路依次连接组成。

3.根据权利要求1所述的分立式长时测量记录***，其特征在于，所述电信号感测装置的金属屏蔽盒上还设有多个排气孔。

4.根据权利要求1所述的分立式长时测量记录***，其特征在于，所述微电极阵列中工作电极呈中心对称分布，工作电极的尺寸为20×20μm²。

5.根据权利要求1所述的分立式长时测量记录***，其特征在于，所述工作电极由一层钛和一层金组成。

6.根据权利要求1所述的分立式长时测量记录***，其特征在于，所述平面微电极阵列传感器上设置有与工作电极一一对应连接的排针，所述电信号感测装置上设置有与传感器电信号感测电路输入端一一对应连接的插孔，所述平面微电极阵列传感器和所述电信号感测装置通过排针和插孔连接。

7.一种基于权利要求1-6任一项所述***的细胞电生理信号的分立式长时测量记录方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将细胞培养在细胞培养腔中，各部件连接后将平面微电极阵列传感器与电信号感测装置一同放入培养箱中。

(2)开启电源模块，利用上位机设置和控制电穿孔信号输出，并实时显示和记录平面微电极阵列传感器测试得到的数据。

Images