CN113466090A - 一种基于差分去噪的表面等离激元成像*** - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，包括：旋转照明***、管镜、分束镜、油浸显微物镜、金膜基底、高精度位移平台、成像光路；表面等离激元具有局域场增强以及对环境折射率变化敏感的特性，可以用于对微小颗粒进行成像。首先，利用旋转照明***实现入射光对物体进行旋转照明，消除入射光与散射光产生的干涉条纹，获得没有干涉条纹的以及尺寸较小的像。在此基础上利用差分去噪方法，快速移动高精度位移平台，实现对图像背景噪声的去除，提高成像的信噪比。该成像***利用差分去噪的方法极大的提高了表面等离激元显微成像的信噪比，可以对直径低至22nm的纳米颗粒进行高对比度成像，并具有10nm的粒径分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及高信噪比的表面光学显微成像领域，特别涉及一种基于差分去噪的表面等离激元成像。
背景技术
单个纳米颗粒粒径的光学检测方法已广泛用于生物物理研究，并且正在扩展到包括国家安全，环境监测和早期诊断在内的应用当中。这项技术为探究生物和光子材料的基本特性提供了重要手段，并彻底改变了我们对纳米尺度上发生的生物物理现象的理解。具有较小直径的纳米颗粒往往比较大的纳米颗粒对人体健康危害更大，因为它们可以深入肺部，然后可能诱发肺癌，呼吸***疾病甚至器官功能障碍。因此，我们更应该着眼于对超细颗粒的检测，特别是直径小于100nm的纳米颗粒。
光学表面波是局域在于物体表面近场区域的一种电磁模式，如存在于金属与电介质分界面的表面等离激元(Surface Plasmon polaritons,SPPs)就是一种常见的光学表面波。当电磁波入射到金属(通常为贵金属，如金或者银)与电介质分界面时，金属表面的自由电子发生集体振荡，电磁波与金属表面自由电子耦合而形成的一种沿着金属表面传播的近场电磁波；在满足波矢匹配(动量守恒)的条件下，入射电磁场的能量被有效地转变为金属表面自由电子的集体振动能，这时就形成的一种所谓的表面等离激元。SPPs具有亚波长、近场局域与表面增强、环境敏感等特性，基于这些优良特性SPPs经常被应用于显微成像当中。但是，在使用表面等离激元显微成像***对直径低于100nm的小颗粒物进行成像检测时具有很大局限性：由于沿金属表面传播的SPPs与散射光发生干涉，产生的干涉条纹极大的影响成像的空间分辨率；同时，对于直径低于50nm的颗粒物，其散射信号强度非常微弱，很容易被淹没在背景噪声当中。这些问题制约了表面等离激元成像***对小粒径颗粒的成像与检测，因此亟待解决。
发明内容
本发明的目的是为了克服传统表面等离激元显微成像***信噪比低的问题，提出了一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，该***可以对直径低至22nm的纳米颗粒进行高信噪比成像，并具有10nm的粒径分辨率。与此同时，所需基底易于制备，成像过程无损伤，适用于各类生化标本，使得该显微成像方法具有广泛的应用价值。
本发明实现上述目的的技术方案如下：
一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，该成像***包括：旋转照明***、管镜、分束镜、油浸显微物镜、金膜基底、高精度位移平台和成像光路；其中，一束经过准直透镜准直之后的激光，通过旋转照明***的调制变为任意方向的线偏振光，并出射；出射光束经过管镜和分束镜后，聚焦至油浸显微物镜的后焦面；聚焦的光束经过油浸显微物镜后以平行光形式照射金膜基底；经过旋转照明***的调制，平行光束可以以表面等离激元的激发角度以及TM偏振方向入射至金膜基底，从而在金膜-空气界面激发表面等离激元；沿着界面传播的表面等离激元照射位于金膜基底上的样品时，会与样品的散射光干涉产生干涉条纹；通过旋转照明***对光束出射角度的调制，使光束在后焦面上的聚焦光斑沿着有固定半径的圆环轨迹进行旋转，从而实现光束在样品平面的旋转照明；与此同时，将托载金膜基底的高精度位移平台沿着水平方向以固定步长移动，并且每移动一个步长后进行停留，样品也随之移动与停留；从金膜基底泄漏的散射光经过油浸显微物镜收集，透射过分束镜后，以平行光形式进入成像光路，在样品每次停留的间隙成像光路曝光成像，得到一系列样品的图像；将这一系列图像中相邻两张图像的灰度值相减，消除***中缺陷带来的噪声，例如光斑不均匀、光学元件表面的污染物等引入的噪声，得到相应的一系列差分图像；在差分图像中，以样品的像为中心提取400*400像素大小的区域，得到提取图像；将全部提取图像的灰度值叠加求平均，消除***中随时间变化的噪声，例如光斑强度随时间波动引入的噪声，得到最终处理后的图像。通过后期差分去噪算法的处理，图像的噪声被消除，表面等离激元成像***的信噪比得到大幅提升。
其中，所述的旋转照明***由反射振镜、反射振镜、起偏器和半波片构成。通过两个反射振镜的调制，可以改变光束的出射角度，最终实现光束以表面等离激元激发角为径向角入射至金膜基底，同时光束沿着方位角方向旋转。起偏器用于使光束变为线偏光，转动半波片可以改变偏振光的偏振方向，直到偏振方向相对于金膜基底为TM模式对应的偏振方向，从而实现表面等离激元的激发。
其中，所述的油浸显微物镜具有两个作用，首先用于将聚焦光转变为平行光照射至金膜基底，并在基底上激发表面等离激元；然后，用于收集从金膜泄漏下来的散射光。
其中，所述的金膜基底由底层盖玻片、中层3nm钛和上层45nm金构成。底层盖玻片用于在激发表面等离激元时提供波矢匹配，中层3nm钛作为粘附层，使上层金膜不脱落，上层的金膜用来激发表面等离激元。
其中，所述的高精度位移平台可以进行纳米级的高精度位移，并且在到位后给探测器发送触发信号，使探测器开始曝光。
其中，所述的成像光路包含检偏器、成像管镜和探测器。将检偏器透振方向与起偏器透振方向正交，可以阻挡大部分反射光，抑制背景噪声。成像管镜将散射光聚焦至探测器芯片，实现成像。探测器受来自高精度位移平台的触发信号控制，进行曝光拍照。
本发明技术方案的原理为：
在显微成像过程中，轻微移动基底并不会改变成像的背景噪声分布，因此可以通过将移动基底前后拍得的两张图片作差来去除背景噪声。由于采取作差的方式，每次移动的步长必须大于样品沿着移动方向的最大长度，这样才能保证作差后两张图片中样品的像不会因为有交叠部分而被消去。然而传统的表面等离激元显微成像***由于干涉条纹的存在，使得粒径小于100nm的样品的像变大至几十微米。为了缩小样品的像的尺寸，采取旋转照明***，在一个曝光时间内照明光束沿着方位角方向高速旋转一周以上，不同方位角入射得到的干涉条纹朝向不同，这样各个朝向的干涉条纹在探测器上叠加平均，实现干涉条纹的消除，样品像的尺寸降至几百纳米，从而使得高精度位移平台可以以较小的步长进行平移。为了消除照明光强度分布随时间变化带来的噪声，拍摄了一列连续的图像作差分，并将差分后的图像做平均，以消除这类噪声，使得成像的信噪比得到大幅提升。
本发明和现在有成像技术相比的优势为：
该发明使得成像***具有极高的高信噪比：可以对粒径低至22nm的聚苯乙烯小球清晰成像，而传统表面等离激元显微镜的极限是对粒径为50-100nm的聚苯乙烯小球成像。
附图说明
图1为本发明一种基于差分去噪的表面等离激元成像***的结构示意图；
图2为差分去噪方法的流程图；
图3为直径分别为22nm、31nm、41nm、51nm、61nm、81nm的聚苯乙烯小球的透射电镜图和表面等离激元成像图，其中，图3a为不同直径聚苯乙烯小球的透射电镜图，scalebar长度为50纳米；图3b为利用该***获不同直径聚苯乙烯小球的表面等离激元成像图，scalebar长度为1微米；图3c为沿着3b中虚线画出的强度截面。
附图标记含义为：1为旋转照明***；2为管镜；3为分束镜；4为油浸显微物镜；5为金膜基底；6为高精度位移平台；7为成像光路；8为第一振镜；9为第二振镜；10为起偏器；11为半波片；12为检偏器；13为成像管镜；14为探测器。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细描述。
参照图1-2所示的一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，包括：旋转照明***1、管镜2、分束镜3、油浸显微物镜4、金膜基底5、高精度位移平台6、成像光路7、第一振镜8、第二振镜9、起偏器10、半波片11、检偏器12、成像管镜13、探测器14。
所述的旋转照明***1由第一振镜8、第二振镜9、起偏器10和半波片11构成。通过两个反射振镜的调制，可以改变光束的出射角度，最终实现光束以表面等离激元激发角为径向角入射至金膜基底5，同时光束沿着方位角方向旋转。起偏器10用于使光束变为线偏光，转动半波片11可以改变偏振光的偏振方向，直到偏振方向相对于金膜基底5为TM模式对应的偏振方向，从而实现表面等离激元的激发。
所述的成像光路7包含检偏器12、成像管镜13和探测器14。将检偏器12透振方向与起偏器10透振方向正交，可以阻挡大部分反射光，抑制背景噪声。成像管镜13将散射光聚焦至探测器14芯片，实现成像。探测器14受来自高精度位移平台6的触发信号控制，进行曝光拍照。
所述的油浸显微物镜4具有两个作用，首先用于将聚焦光转变为平行光照射至金膜基底5，并在基底上激发表面等离激元；然后，用于收集从金膜泄漏下来的散射光。
所述的金膜基底5由底层盖玻片、中层3nm钛和上层45nm金构成。底层盖玻片用于在激发表面等离激元时提供波矢匹配，中层3nm钛作为粘附层，使上层金膜不脱落，上层的金膜用来激发表面等离激元。
所述的高精度位移平台6可以进行纳米级的高精度位移，并且在到位后给探测器14发送触发信号，使探测器开始曝光。
一束经过准直透镜准直之后的激光，依次通过旋转照明***1中的第一振镜8、第二振镜9、起偏器10和半波片11的调制变为任意方向的线偏振光，并以特定的角度出射；出射光束经过管镜2和分束镜3后，聚焦至油浸显微物镜4的后焦面；聚焦的光束经过油浸显微物镜4后以平行光形式照射金膜基底5；通过控制第一振镜8和第二振镜9的角度，使得平行光束以固定的方位角以及表面等离激元激发角为径向角入射至金膜基底5，实现了传统表面等离激元成像***对样品的单向照明功能，见图2A；使平行光束沿着方位角方向旋转并且径向角为表面等离激元激发角入射至金膜基底5，实现对样品的旋转照明，见图2B；通过操控高精度位移平台6，使得金膜基底5与置于其上的样品沿着水平方向以固定步长移动，每移动一个步长会进行停顿，此时探测器14进行曝光拍照，拍得一系列样品图像，见图2C；将这一系列图片中，相邻两张图片前后相减，得到相应的差分图片，见图2D；利用电脑程序，将差分图片中以样品为中心周围400*400像素区域提取出来，得到提取图，见图2E；最后将所有提取图进行灰度值叠加再除以提取图数量，得到最终图像，见图2F。通过对比图2A和2F可以看出，该***相比于传统的表面等离激元成像***具有更高的信噪比。
参照图3所示，A图为直径分别是22nm、31nm、41nm、51nm、61nm、81nm的聚苯乙烯小球的透射电镜图像；B图为相应小球经过基于差分去噪的表面等离激元成像***成像得到的图像，表明该***可以对直径低至22nm的低折射率颗粒进行成像，并具有10nm的直径分辨率；C图为B图中虚线位置的强度截面，表明通过该***成像可以获得极高的信噪比。
本发明未详细阐述的部分属于本领域公知技术。以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，其特征在于：该成像***包括：旋转照明***(1)、管镜(2)、分束镜(3)、油浸显微物镜(4)、金膜基底(5)、高精度位移平台(6)和成像光路(7)；其中，
一束经过准直透镜准直之后的激光，通过旋转照明***(1)的调制变为任意方向的线偏振光，并出射；出射光束经过管镜(2)和分束镜(3)后，聚焦至油浸显微物镜(4)的后焦面；聚焦的光束经过油浸显微物镜(4)后以平行光形式照射金膜基底(5)；经过旋转照明***(1)的调制，平行光束可以以表面等离激元的激发角度以及TM偏振方向入射至金膜基底(5)，从而在金膜-空气界面激发表面等离激元；沿着界面传播的表面等离激元照射位于金膜基底(5)上的样品时，会与样品的散射光干涉产生干涉条纹；通过旋转照明***(1)对光束出射角度的调制，使光束在后焦面上的聚焦光斑沿着有固定半径的圆环轨迹进行旋转，从而实现光束在样品平面的旋转照明；与此同时，将托载金膜基底(5)的高精度位移平台(6)沿着水平方向以固定步长移动，并且每移动一个步长后进行停留，样品也随之移动与停留；从金膜基底(5)泄漏的散射光经过油浸显微物镜(4)收集，透射过分束镜(3)后，以平行光形式进入成像光路(7)，在样品每次停留的间隙成像光路曝光成像，得到一系列样品的图像；将这一系列图像中相邻两张图像的灰度值相减，消除***中缺陷带来的噪声，得到相应的一系列差分图像；在差分图像中，以样品的像为中心提取400*400像素大小的区域，得到提取图像；将全部提取图像的灰度值叠加求平均，消除***中随时间变化的噪声，得到最终处理后的图像。
2.根据权利要求1所述的一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，其特征在于，所述的旋转照明***(1)由第一振镜(8)、第二振镜(9)、起偏器(10)和半波片(11)构成；通过两个反射振镜的调制，可以改变光束的出射角度，最终实现光束以表面等离激元激发角为径向角入射至金膜基底(5)，同时光束沿着方位角方向旋转；起偏器(10)用于使光束变为线偏光，转动半波片(11)可以改变偏振光的偏振方向，直到偏振方向相对于金膜基底(5)为TM模式对应的偏振方向，从而实现表面等离激元的激发。
3.根据权利要求1所述的一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，其特征在于，所述的油浸显微物镜(4)具有两个作用，首先用于将聚焦光转变为平行光照射至金膜基底(5)，并在基底上激发表面等离激元；然后，用于收集从金膜泄漏下来的散射光。
4.根据权利要求1所述的一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，其特征在于，所述的金膜基底(5)由底层盖玻片、中层3nm钛和上层45nm金构成；底层盖玻片用于在激发表面等离激元时提供波矢匹配，中层3nm钛作为粘附层，使上层金膜不脱落，上层的金膜用来激发表面等离激元。
5.根据权利要求1所述的一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，其特征在于，所述的高精度位移平台(6)可以进行纳米级的高精度位移，并且在到位后给探测器(14)发送触发信号，使探测器开始曝光。
6.根据权利要求1所述的一种基于差分去噪的表面等离激元成像***，其特征在于，所述的成像光路(7)包含检偏器(12)、成像管镜(13)和探测器(14)；将检偏器(12)透振方向与起偏器(10)透振方向正交；成像管镜(13)将散射光聚焦至探测器(14)芯片，实现成像；探测器(14)受来自高精度位移平台(6)的触发信号控制，进行曝光拍照。
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| CN107238575A (zh) * | 2017-06-08 | 2017-10-10 | 深圳大学 | 一种基于完美涡旋光激发spr的光声显微*** |
| CN109239020A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-18 | 中国科学技术大学 | 一种基于旋转照明的表面波成像*** |
| CN109932162A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-06-25 | 南京理工大学 | 一种基于白光配准的腔模参数检测方法与装置 |
-
2021
- 2021-06-28 CN CN202110719599.4A patent/CN113466090A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| CN116481983A (zh) * | 2023-04-26 | 2023-07-25 | 之江实验室 | 一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置及方法 |
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