CN1134552A - 淋病快速诊断药盒及其生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疾病诊断试剂及其生产工艺,包括药盒试剂的总体配备;淋病双球菌抗原筛选、分离与纯化,免疫***抗体制备和提纯工艺。药盒经临床试用具有较高的特异性和敏感性,通过检测血清,30分钟左右即可作出诊断,且阳性检出率高;药盒生产工艺流程简洁,分离纯化方法温和,对膜蛋白破坏性低,回收得率高,所得***蛋白抗原纯度达电泳级,反应活性较原粗菌液提高500—1000倍,药盒价格仅国际已有产品1/10。
Description
本发明淋病快速诊断药盒及其生产工艺,涉及疾病诊断试剂及其生产工艺。
淋病(Gonor rhea)即淋菌性尿道炎,是由淋病双球菌侵袭男性前尿道,女性尿道或子宫颈等处引起的泌尿生殖***粘膜的炎症性疾病,占所有性传播性疾病(STD)的70-80%。淋病对人类的危害是众所周知的,***主要侵袭粘膜组织,不仅引起尿道炎症,导致尿频、尿痛、脓血尿,炎症***反复发作可出现纤维化,导致尿道、输卵管、输精管狭窄,恶性发展为***、腹膜炎、***、不育症等。当粘膜上皮的***侵入血液时,还可引起播散性感染(DGI),导致淋菌性关节炎、皮肤损害、心内膜炎、心包炎及脑膜炎,严重时可发展为淋菌性败血症。
***感染后,如确诊迅速,越早治疗效果就越好。目前淋病的诊断方法已有多种,如传统的显微镜(涂片)检查和培养法,前者虽快速简便,但特异性和敏感性差,后者确诊性高,但取样困难,且诊断周期长,一般需要48-72小时方能确诊;近年来发展起来的玻片协同凝集法、荧光抗体染色法、乳胶凝集法操作简便,但阳性率低,PCR法敏感度高,但假阳性多,且操作繁琐,需要特定仪器设备。
七十年代初,酶联免疫吸附试验(ENZYME LINKEDIMMUNOSORBENT ASSAY,ELISA)方法建立以来,应用于临床诊断学方面取得了飞速进展,酶联法淋病快速检测法(即ELISA)由于其以血清为标本,可用于检测抗原也可用于检测抗体,且具有采样方使,易于操作,全程检测仅需三十余分钟,是一种具有临床诊断价值的免疫学诊断新方法,尤其适用于医院、海关、防疫、计划生育、性防***和中心血站等大批量、高危人群体检筛选检测。酶联快速检测药盒生产的首要问题是要解决***膜蛋白特异性抗原的大量生产及其分离纯化的工艺问题。该法的诊断药盒,美国ABBOTT公司已有G0NOZYME KIT商品出售,但价格昂贵,并需要配套购置专用的酶标检测仪,且未见***膜蛋白特异性抗原的大量生产及其分离纯化工艺的批露。
本发明的目的在于要提供一种生产成本较低,能大量生产的淋病双球菌快速诊断盒及其生产工艺。
本发明是这样实现的:
1,淋病快速诊断药盒,包括:酶标抗体稀释液,稀释原液,底物液,显色液和终止液,抗原包被板条以及阴、阳性对照标准品,其中:
一,酶标抗体稀释液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50-200mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 700-950ml
酶标抗体(SPA-HRP) 1-2mg(1∶200,1∶2000)
每瓶分装2.0-2.5ml
二,稀释原液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50-250mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01-0.03M,
pH7.0-7.8PBS 700-950ml
每瓶分装2.0-2.5ml;
三,底物液:1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30%H2O2 300-800μl
PM抑菌剂 50-75mg
每瓶分装2.0-2.5ml;
四,显色液:1000ml中含:
四甲基联苯胺(TMB) 200-1500mg
甲酵 750ml
以上摇匀,溶解后加入
纯甘油 250ml
每瓶分装2.0-2.5ml;
五,终止液:1000ml
98%浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
每瓶分装2.0-2.5ml;
六,特异性***膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl);
七,阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准 1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50-200ml
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 680-930ml
正常人血清 20ml
每瓶分装0.5-2.1.0ml;
(二)阳性标准 1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50-200ml
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 680-930ml
兔抗***阳性血清 10-20ml
每瓶分装0.5-1.0ml;
2,本发明的生产工艺包括:
(1)淋病双球菌抗原的筛选、分离和纯化;
(2)免抗***抗体制备和提纯;
(3)高效SPA制备及标记辣根过氧化物酶;
(4)药盒检测反应条件的建立等。其中:
一,***的繁殖与保存
(一),专用培养基的配制:
配方:
每1000ml蒸馏水中含:
(1)蛋白胨 10-18g
(2)酵母浸出粉 5-15g
(3)葡萄糖 1-2g
(4)氯化钠 1-2g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂 12g
(8)脱纤维羊血50-100ml
制法:将(1)-(7)加入上述蒸馏水混匀,在15磅高压下灭菌15分钟,待冷却至54-56℃,加入(8),摇匀,分装至培养皿待用。
(二),将淋病菌划线接种于上述培养基中,置CO2环境37℃培养24-48小时。以5%甲醛生理水浸润培养皿30分钟,用滴管洗脱,收集至0.02M PBS,pH7.4,3000转离心15分钟,重复三次,收集沉淀,保存于质膜匀浆液内,-27℃低温储藏;
(三)***的菌种保存
制备***浓悬液于灭菌脱脂牛奶中,用干冰速冻,迅速移入冷冻干燥机内,迅速抽真空达到升华,保持真空状态4-5小时,到菌液完全抽干,取出,用煤气灯封口,并抽气保证内部干燥,于4℃冰箱保存;
二,特异性膜蛋白抗原的纯化
(1),大量收集***培养菌液,37℃纯培养18-36小时,涂片染色,显微镜检查,证明属革兰氏阴性双球菌;氧化酶阳性,触酶阳性;生化鉴定仅发酵葡萄糖,不发酵麦芽糖、蔗糖和果糖;
(2),在上述培养菌液中加入5%甲醛生理盐水浸泡30分钟左右,用吸管洗涤,将培养皿表面菌落洗脱并收集入离心管;
(3),将(2)所得菌落洗脱液置冷冻离心机,4-10℃,3000转/分离心15分钟,弃上清液,沉淀以PBS洗涤,重复离心洗涤三次,沉淀液保存于匀浆器内待用,储藏于-27℃冰箱;
(4),上述菌液自冰箱内取出,置室温融化,冻融反复三次;
(5),将(4)所述菌液用匀浆器反复匀浆10-15分钟,再用超声波粉碎,65μA粉碎5-10分钟,至镜检无完整细胞壁;
(6),冷冻高速离心,4℃,10,000转/分,离心30分钟,取上清液,弃去沉淀;
(7),冰冻超高速离心,4℃,100,000转/分,离心60-120分钟,取沉淀,弃去上清液;
(8),沉淀用两相法精制,再用两性离子洗涤剂洗脱杂质,4℃搅拌过夜;
(9),冰冻高速离心,4℃,10,000-15,000转/分,转30-60分钟,取上清液,弃去未溶解沉淀;
(10),上清液以0.5μ滤膜过滤,滤液用紫外分光法检测蛋白质浓度;
(11),上Sephadex G-200柱层析,以PBS为洗脱液,280nm检测,收集峰值,即得电泳纯的特异性***膜蛋白抗原,测浓度,冰水浴保存;
(12),以该膜蛋白包被固相酶板或浓缩后免疫家兔,制备抗体;三,免抗***抗体的制备与纯化
(一),免疫血清的制备
(1),药品:
纯化抗原
灭活卡介苗
佐剂
(2),免疫动物:
健康新西兰白兔,雄性,年令六个月以上,体重2千克左右,2-3只。
(3)免疫方法:
a,制备抗原浓度为5mg/ml,与1ml完全佐剂混合(使用注射器法),制成油包水乳剂,乳剂的粘稠度为保证佐剂抗原滴于冷水表面保持完整而不分散;
b,第一次免疫:抗原总量5mg,注射体积2ml,注射部位为四足下数点,每点0.2ml,脊背皮下数点,每点0.2ml;
c,第二次免疫:为第一史疫后7-10天,抗原用量1mg,可用不完全佐剂,途径为脊背皮下多点;
d,第三次免疫:第二次免疫后7-10天,方法同第二次;
e,间隔7天后采血,测定效价;
f,颈动脉放血,无菌手续分离血清,分装,低温冰箱保存待用;
(二),免疫血清的纯化
(1)用常规饱和硫酸铵沉淀法进行粗提纯;
(2)用常规琼脂糖珠免疫吸附亲和层析法,进行精提纯;
四,辣根过氧化物酶标记SPA
采用常规的过碘酸钠法标记SPA纯品;
五,药盒检测反应条件
(一),包被抗原最佳工作浓度为1.0μg。包被时间:4℃24-48小时,或37℃2-4小时;
(二),血清标本稀释最佳浓度为1∶50.反应时间:37℃10分钟;
(三),SPA酶标最佳应用浓度为1∶400-1∶1 200,反应时间:37℃5分钟;
(四),洗涤剂0.01M pH7.4 PBS为最佳,洗涤时间为:第一次浸泡2-3分钟,以后三次可快速洗涤;或每次洗涤浸泡1分钟,连续五次,最后在吸水纸内用力拍干。
本发明药盒由于血清采样方便,且检测速度快,经164例临床检测验证:其敏感性,特异性与国外文献报导相符,用本药盒检测病人抗体1gG,不需特殊仪器(在无酶标仪的实验室可用肉眼判读结果),半小时左右即可获得检测结果,操作简便快速;对感染7天以上的慢性患者有更高的阳性检出率,可以弥补传统涂片、培养法在这一阶段的局限性;抗体测定不需采集分泌物标本,仅需微量血清,因此更适宜于在非一般条件下作人群普查及流行病学调查。
本发明药盒的生产工艺,流程简洁,分离纯化方法较温和,对膜蛋白破坏性不小,膜蛋白回收率高,纯度可达电泳级,反应活性较原粗菌液提高500-1000倍,药盒价格仅为国际已有产品的1/10。
以下附图和实施例将对本发明的技术方案作进一步说明:
图1为本发明的纯特异性***膜蛋白抗原(PI)Sephadex G
-200层析洗脱图谱。
图2为本发明纯特异性***膜蛋白抗原(PI)等SDS-PAGE电
泳图谱。
图3为本发明药盒生产工艺流程图。
图面标号:
1.低分子量蛋白标准,2.纯化PI,3.粗提PI,
4.5.29404菌体裂解物。
实施例1:
1.本药盒试剂包括:
一,酶标抗体稀释液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 50mg
灭菌0.01M,pH7.4 PBS 950ml
酶标抗体(SPA-HRP) 1mg(1∶200,1∶2000)
每瓶分装2.0-2.5ml;
二,稀释原液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 50ml
灭菌0.01-0.03M,
pH7.0-7.8PBS 950ml
每瓶分装2.0-2.5ml;
三,底物液:1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30%H2O2 300μl
PM抑菌剂 50mg
每瓶分装2.0-2.5ml;
四,显色液:1000ml中含:
四甲基联苯胺(TMB) 200mg
甲醇 750ml
以上摇匀,溶解后加入
纯甘油 250ml
每瓶分装2.0-2.5ml;
五,终止液:1000ml
98%浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
每瓶分装2.0-2.5ml;
六,特异性***膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl);
七,阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 50ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 930ml
正常人血清 20ml
每瓶分装0.5-1.0ml;
(二)阳性标准品1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 50ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 940ml
免疫***阳性血清 10ml
每瓶分装0.5-1.0ml;。2,本发明淋病快速诊断药盒生产工艺一,***的繁殖与保存(一)菌种选择、培养分离(1)菌种:A.标准菌种
a.中国药品检定所提供(W1,W11/W111型,菌种编号
29401/29403);
b.捷克流行病学微生物研究所提供,菌种编号:29106/29107
(1993年版中国医学细菌菌种目录)
B.野生菌种选自上海及中国野生分离株,菌种编号:F29/F76
(2)培养分离
将上述菌种划线接种于专用培养基中,置5%CO2环境37℃培养24-48小时。以5%甲醛生理水浸润培养皿30分钟,用滴管洗脱,收集至0.02M PBS,pH7.4,3000转离心15分钟,重复三次,收集沉淀,保存于0.01-0.03M,pH7.0-7.8PBS中,-27℃低温储藏;(二)***的菌种保存
制备***浓悬液于0.2-0.5ml灭菌脱脂牛奶的菌种管内,用干冰速冻,迅速移入冷冻干燥机内,迅速抽真空达到升华,保持真空状态4-5小时,到菌液完全抽干,取出,菌种管用煤气灯封口,同时抽气,保证内部干燥,于4℃冰箱保存;
二,特异性膜蛋白抗原的纯化
(1),取上述***培养粗菌液100mg,划线接种于专用培养基平皿中,置5%CO2环境,37℃纯培养18-36小时,涂片染色,显微镜检查,证明属革兰氏阴性双球菌;氧化酶阳性,触酶阳性;生化鉴定仅发酵葡萄糖,不发酵麦芽糖、蔗糖和果糖;
(2),在上述培养基平皿中加入5%甲醛生理盐水浸泡30分钟左右,用吸管洗涤,将培养皿表面菌落洗脱并收集入离心管;
(3),将(2)所得菌落洗脱液置冷冻离心机,4-10℃,3000转/分离心15分钟,弃上清液,沉淀以PBS洗涤,重复离心洗涤三次,沉淀液保存于试管内待用,储藏于-27℃冰箱;
(4),上述菌沉淀液自冰箱内取出,置室温融化,冻融反复三次;
(5),将(4)所述菌沉淀液用组织匀浆器反复匀浆10-15分钟,再用超声波粉碎,65μA粉碎5-10分钟,至镜检无完整细胞壁;
(6),冷冻高速离心,4℃,10,000转/分,离心30分钟,取上清液,弃去沉淀;
(7),冰冻超高速离心,4℃,100,000转/分,离心60-120分钟,取沉淀,弃去上清液;
(8),沉淀用两相法精制,再用两性离子洗涤剂chaps洗脱杂质,4℃搅拌过夜;
(9),冰冻高速离心,4℃,10,000-15,000转/分,转30-60分钟,取上清液,弃去未溶解沉淀;
(10),上清液以0.5μ滤膜过滤,滤液用紫外分光法检测膜蛋白抗原浓度;
(11),上Sephadex G-200柱层析,以PBS为洗脱液,280nm检测,收集峰值(见图1),即得电泳纯的特异性***膜蛋白抗原(见图2)1-2mg,测浓度,冰水浴保存;
(12),以该膜蛋白包被固相酶板或浓缩后免疫家兔,制备抗体;三,免抗***抗体的制备与纯化
(一),免疫血清的制备
(1),药品:
纯化抗原
灭活卡介苗
佐剂
(2),免疫动物:
健康新西兰白兔,雄性,年令六个月以上,体重2千克左右,2-3只;
(3)免疫方法:
a,制备抗原浓度为5mg/ml,与1ml完全佐剂混合(使用注射器法),制成油包水乳剂,乳剂的粘稠度为保证佐剂抗原滴于冷水表面保持完整而不分散;
b,第一次免疫:抗原总量5mg,注射体积2ml,注射部位为四足下多点,每点0.2ml,脊背皮下多点,每点0.2ml;
c,第二次免疫:为第一史疫后7-10天,抗原用量1mg,可用不完全佐剂,途径为脊背皮下多点;
d,第三次免疫:第二次免疫后7-10天,方法同第二次;
e,间隔7天后采血,测定效价;
f,颈动脉放血,无菌手续分离血清,分装,低温冰箱保存待用;
(二),免疫血清的纯化
(1)用常规饱和硫酸铵沉淀法进行粗提纯;
(2)用常规琼脂糖珠免疫吸附亲和层析法,进行精提纯;
四,辣根过氧化物酶标记SPA
采用常规的过碘酸钠法标记SPA纯品;
五,药盒检测反应条件
(一),包被抗原最佳工作浓度为1.0μg。包被时间:4℃ 24-48小时,或37℃ 2-4小时
(二),血清标本稀释最佳浓度为1∶50.反应时间:37℃ 10分钟;
(三),SPA酶标最佳浓度为1∶400-1∶1200,反应时间:37℃ 5分钟;
(四),洗涤剂0.01M pH7.4PBS为最佳,洗涤时间为:第一次浸泡2-3分钟,以后三次可快速洗涤;或每次洗涤浸泡1分钟,连续五次,最后在吸水纸上用力拍干。
实施例2:
1.本药盒试剂包括:
一,酶标抗体稀释液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 150mg
新鲜小牛血清 200ml
灭菌0.01M,pH7.4 PBS 800ml
酶标抗体(SPA-HRP) 1mg(1∶200,1∶2000)
二,稀释原液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 150mg
新鲜小牛血清 250ml
灭菌0.01-0.03M,
pH7.0-7.8PBS 750ml
三,底物液:1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30%H2O2 600μ1
PM抑菌剂 55mg
四,显色液:1000ml中含:
四甲基联苯胺(TMB) 1000mg
甲醇 750ml
以上摇匀,溶解后加入
纯甘油 250ml
五,终止液:1000ml
98%浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
六,特异性***膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl);
七,阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 100ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 880ml
正常人血清 20ml
(二)阳性标准品1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50ml
新鲜小牛血清 100ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 890ml
免疫***阳性血清 10ml
2,本发明淋病快速诊断药盒生产工艺同实施例1。
实施例3:
1.本药盒试剂包括:
一,酶标抗体稀释液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 100mg
新鲜小牛血清 300ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 700m1
酶标抗体(SPA-HRP) 1mg(1∶200,1∶2000)
二,稀释原液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 125mg
新鲜小牛血清 150ml
灭菌0.01-0.03M,
pH7.0-7.8PBS 850ml
三,底物液: 1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30%H2O2 550μl
PM抑菌剂 65mg
四,显色液:1000ml中含:
四甲基联苯胺(TMB) 1000mg
甲醇 750ml
以上摇匀,溶解后加入
纯甘油 250ml
五,终止液:1000ml
98%浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
六,特异性***膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl);
七,阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准品1000ml中含:
柳硫汞钠盐 150mg
新鲜小牛血清 200ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 680ml
正常人血清 20ml
(二)阳性标准品1000ml中含:
柳硫汞钠盐 100mg
新鲜小牛血清 200ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 780ml
免疫***阳性血清 20ml
2,本发明淋病快速诊断药盒生产工艺同实施例1。
实施例4:
1.本药盒试剂包括:
一,酶标抗体稀释液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 200mg
新鲜小牛血清 150ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 850ml
酶标抗体(SPA-HRP) 2mg(1∶200~1∶2000)
二,稀释原液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 250mg
新鲜小牛血清 300ml
灭菌0.01-0.03M,
pH7.0-7.8PBS 700ml
三,底物液:1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30%H2O2 800μl
PM抑菌剂 75mg
四,显色液:1000ml中含:
四甲基联苯胺(TMB) 1500mg
甲醇 750ml
以上摇匀,溶解后加入
纯甘油 250ml
五,终止液:1000ml
98%浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
六,特异性***膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液)100μl
七,阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准品1000ml中含:
柳硫汞钠盐 200mg
新鲜小牛血清 400ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 580ml
正常人血清 20ml
(二)阳性标准1000ml中含:
柳硫汞钠盐 200mg
新鲜小牛血清 300ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 6480ml
免疫***阳性血清 20ml
2,本发明淋病快速诊断药盒生产工艺同实施例1。
实施施5:
***繁殖专用培养基的配制:
配方:
每1000ml蒸馏水中含:
(1)蛋白胨 13g
(2)酵母浸出粉 8g
(3)葡萄糖 1g
(4)氯化钠 1g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂 12g
(8)脱纤维羊血 80ml
制法:将(1)-(7)加入上述蒸馏水混匀,在15磅高压下灭菌15分钟,待冷却至54-56℃,加入(8),摇匀,分装至培养皿待用。
实施像6:
其中专用培养基的配制:
配方为:
每1000ml蒸馏水中含:
(1)蛋白胨 l0g
(2)酵母浸出粉 5g
(3)葡萄糖 lg
(4)氯化钠 lg
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 lg
(7)琼脂 12g
(8)脱纤维羊血 50ml
配制方法同实施例5。
实施例7:
专用培养基的配制:
配方为:
每1000ml蒸馏水中含:
(1)蛋白胨 15g
(2)酵母浸出粉 10g
(3)葡萄糖 1g
(4)氯化钠 1g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂粉 12g
(8)脱纤维羊血 75ml
配制方法同实施例5。
实施例8:
专用培养基的配制:
配方为:
每1000ml蒸馏水中含:
(1)蛋白胨 18g
(2)酵母浸出粉 15g
(3)葡萄糖 2g
(4)氯化钠 2g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂粉 12g
(8)脱纤维羊血 100ml
配制工艺同实施例5。
Claims (3)
1,一种淋病快速诊断药盒,包括:酶标抗体稀释液,稀释原液,底物液,显色液和终止液,抗原包被板条以及阴、阳性对照标准品,其特征在于:
一,酶标抗体稀释液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50-200mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 700-950ml
酶标抗体(SPA-HRP) 1-2mg(1∶200,1∶2000)
二,稀释原液:1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50-250mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01-0.03M,
pH7.0-7.8PBS 700-950ml
三,底物液:1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30%H2O2 300-800μl
PM抑菌剂 50-75mg
四,显色液:1000ml中含:
四甲基联苯胺(TMB) 200-1500mg
甲醇 750ml
以上摇匀,溶解后加入
纯甘油 250ml
五,终止液:1000ml
98%浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
六,特异性***膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl);
七,阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准品1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50-200mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 680-930ml
正常人血清 10-20ml
(二)阳性标准品1000ml中含:
柳硫汞钠盐 50-200mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M,pH7.4PBS 680-930ml
兔抗淋球阳性血清 10-20ml。
2,一种淋病快速诊断药盒的生产工艺,包括淋病双球菌抗原的筛选、分离和纯化;免抗***抗体制备和提纯;高效价SPA制备及标记辣根过氧化物酶;药盒检测反应条件的建立等,其特征在于:
一,***的繁殖与保存
(1),将淋病菌划线接种于专用培养基中,置5%CO2环境37℃培养24-48小时。
(2)***的菌种保存
制备***浓悬液于灭菌脱脂牛奶中,用干冰速冻,迅速移入液完全抽干,取出,用煤气灯封口,并抽气保证内部干燥,于4℃冰箱保存;
二,特异性膜蛋白抗原的纯化
(1),收集***培养菌液,37℃纯培养18-36小时,涂片染色,显微镜检查,证明属革兰氏阴性双球菌;氧化酶阳性,触酶阳性;生化鉴定仅发酵葡萄糖,不发酵麦芽糖、蔗糖和果糖;
(2),在上述培养菌液中加入5%甲醛生理盐水浸泡30分钟左右,用吸管洗涤,将培养皿表面菌落洗脱并收集入离心管;
(3),将(2)所得菌落洗脱液置冷冻离心机,4-10℃,3000转/分离心15分钟,弃上清液,沉淀以PBS洗涤,重复离心洗涤三次,沉淀液保存于匀浆器内待用,储藏于-27℃冰箱;
(4),上述菌液自冰箱内取出,置室温融化,冻融反复三次。
(5),将(4)所述菌液用匀浆器反复匀浆10-15分钟,再用超声波粉碎,65μA粉碎5-10分钟,至镜检无完整细胞壁;
(6),冷冻高速离心,4℃,10,000转/分,离心30分钟,取上清液,弃去沉淀;
(7),冰冻超高速离心,4℃,100,000转/分,离心60-120分钟,取沉淀,弃去上清液;
(8),沉淀用两相法精制,再用两性离子洗涤剂洗脱杂质,4℃搅拌过夜;
(9),冰冻高速离心,4℃,10,000-15,000转/分,转30-60分钟,取上清液,弃去未溶解沉淀;
(10),上清液以0.5μ滤膜过滤,滤液用紫外分光法检测蛋白质浓度;
(11),上柱Sephadex G-200,以PBS为洗脱液,280nm检测,收集峰值,即为特异性***膜蛋白抗原,测浓度,冰水浴保存;
(12),以该膜蛋白包被固相酶板或浓缩后免疫家兔,制备抗体;
三,免抗***抗体的制备与纯化
(一),免疫血清的制备
(1),药品:
纯化抗原
灭活卡介苗
佐剂
(2),免疫动物:
健康新西兰白兔,雄性,年令六个月以上,体重2千克左右,2-3只;
(3)免疫方法:
a,制备抗原浓度为5mg/ml,与1ml完全佐剂混合(使用注射器法),制成油包水乳剂,乳剂的粘稠度为保证佐剂抗原滴于冷水表面保持完整而不分散;
b,第一次免疫:抗原总量5mg,注射体积2ml,注射部位为四足下数点,每点0.2ml,脊背皮下数点,每点0.2ml;
c,第二次免疫:为第一次疫后7-10天,抗原用量1mg,可用不完全佐剂,途径为脊背皮下多点;
d,第三次免疫:第二次免疫后7-10天,方法同第二次;
e,间隔7天后采血,测定效价;
f,颈动脉放血,无菌手续分离血清,分装,低温冰箱保存待用;
(二),免疫血清的纯化
(1)用常规饱和硫酸铵沉淀法进行粗提纯;
(2)用常规琼脂糖珠免疫吸附亲和层析法,进行精提纯;
四,辣根过氧化物酶标记SPA
采用常规的过碘酸钠法标记SPA纯品;
五,药盒检测反应条件
(一),包被抗原最佳工作浓度为1.0μg/孔。包被时间:4℃24-48小时,或37℃,2-4小时,封闭,以20%小牛血清PBS,37℃,2小时(PBS,pH7.0-7.8,0.01-0.03m);
(二),血清标本稀释最佳浓度为1∶50.反应时间:37℃ 10分钟;
(三),SPA酶标最佳应用浓度为1∶400-1∶1200,反应时间:37℃5分钟;
(四),洗涤剂0.01MpH7.4PBS为最佳,洗涤时间为:第一次浸泡2-3分钟,以后三次可快速洗涤;或每次洗涤浸泡1分钟,连续五次,最后用力拍干;
3.一种***繁殖专用培养基,其特征在于其配方组成为:
每1000ml蒸馏水中含:
(1)蛋白胨 10-18g
(2)酵母浸出粉 5-15g
(3)葡萄糖 1-2g
(4)氯化钠 1-2g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂粉 10-12g
(8)脱纤维羊血 50-100ml
其配制方法为:将(1)-(7)所述各组份加入上述蒸馏水中混匀,在15磅高压下灭菌15分钟,待冷却至54-56℃,加入(8),摇匀,分装至培养皿即得。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 95111738 CN1134552A (zh) | 1995-08-25 | 1995-08-25 | 淋病快速诊断药盒及其生产工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 95111738 CN1134552A (zh) | 1995-08-25 | 1995-08-25 | 淋病快速诊断药盒及其生产工艺 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1134552A true CN1134552A (zh) | 1996-10-30 |
Family
ID=5078992
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 95111738 Pending CN1134552A (zh) | 1995-08-25 | 1995-08-25 | 淋病快速诊断药盒及其生产工艺 |
Country Status (1)
Country | Link |
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CN (1) | CN1134552A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1307422C (zh) * | 2005-01-31 | 2007-03-28 | 上海市血液中心 | 一种质控品稀释液及其形成的质控品 |
CN100385237C (zh) * | 2001-02-01 | 2008-04-30 | 上海新新医学生物工程公司 | 乙肝病毒前s1抗体酶免测定试剂盒及制备方法 |
-
1995
- 1995-08-25 CN CN 95111738 patent/CN1134552A/zh active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN100385237C (zh) * | 2001-02-01 | 2008-04-30 | 上海新新医学生物工程公司 | 乙肝病毒前s1抗体酶免测定试剂盒及制备方法 |
CN1307422C (zh) * | 2005-01-31 | 2007-03-28 | 上海市血液中心 | 一种质控品稀释液及其形成的质控品 |
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