CN113444661B - 一株新鞘氨醇杆菌及其在废水除磷中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株新鞘氨醇杆菌以及其废水除磷中的应用。该菌株为新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21177。本发明还提供上述新鞘氨醇杆菌SJB007在脱除污水中磷的应用。包括如下步骤：(1)菌种培养：保藏菌株新鞘氨醇杆菌SJB007接种于种子培养基中，30℃、160rpm条件下培养24小时，离心，得菌体，菌体用无菌水洗涤后制成OD600为0.50～0.60的菌悬液；(2)发酵除磷：将步骤(1)制备的菌悬液以2％的比例接种于含磷污水中，pH为4～8、15‑35℃条件下发酵以脱除磷。本发明提供的高效聚磷菌株新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007，在适宜条件下，污水中磷浓度为10‑30mg/L时，去除率均超过97％，具有较高的去除率。

Description

一株新鞘氨醇杆菌及其在废水除磷中的应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株新鞘氨醇杆菌以及其废水除磷中的应用。
背景技术
水环境富营养化导致藻类过度生长是引起水质恶化的主要问题之一，磷是导致水体富营养化的重要因子，其污染源主要为生活、工业和农业废水，因此废水处理的主要目的之一就是去除废水中的磷。
传统的物理化学除磷工艺效率低、技术复杂、易造成二次污染，而生物除磷法具有成本低、工作量小、效率高且适用范围广等特点，是目前污水除磷的主要方法。在生物除磷中，起主要作用是一类在厌氧/好氧或厌氧/缺氧交替运行下导致厌氧释磷、好氧或缺氧超量吸磷的微生物——聚磷菌(Phosphorus Accumulating Organisms)，该类微生物体内含磷量超过一般细菌体的数倍，目前的研究认为聚磷菌分为好氧聚磷菌和反硝化聚磷菌两类，报道的生物除磷菌株主要包括假单胞菌属(朱卫强，陈舒，张培玉.2株反硝化聚磷菌的筛选及其影响因素.环境工程学报，2016，10(4):3295-3302)、肠杆菌属、葡萄球菌属、副球菌属和泛菌属(张立成，李艳美，袁雅姝，等.5株聚磷菌的筛选与亚硝化反硝化除磷特性研究.工业水处理，2012，32(4):33-35)、不动杆菌属(Acevedo B，
Figure BDA0003123893060000011
C，Corona J E，etal.The metabolic versatility of PAOs as an opportunity to obtain a highly P-enriched stream for further P-recovery.Chemical Engineering Journal，2015，270:459-467)、气单胞菌属、假单胞菌属、链球菌属、莫拉氏菌属和微球菌属(魏儒平，闫诚，杨欣妍，等.强化生物除磷***的功能微生物研究进展.生物技术通报，2017,33(10):1-8)中的菌株，但这些菌株大多存在对自然环境耐受性差、不易繁殖培养、活性易衰退等弊端，在实际使用中活菌数量不高，大部分菌株在实际工艺中不能表现出良好的除磷功效，除磷效果有待于进一步提高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一株高效聚磷的新鞘氨醇杆菌，该菌株为采用常规分离方法从采自浙江省温州市温州大学校园生活污水的活性污泥中分离获得，经16SrDNA序列测定并将测序结果通过GeneBank Blast进行比对分析，与新鞘氨醇菌Novosphingobium sp.BH-4(MG855668.1)的同源性为99％，确定属于Novosphingobiumsp.，编为Novosphingobium sp.SJB007。
本发明提供的一株高效聚磷的新鞘氨醇杆菌，该菌株为新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.21177。
本发明还提供上述新鞘氨醇杆菌SJB007在脱除污水中磷的应用。
所述的新鞘氨醇杆菌SJB007用于去除污水中磷的方法，包括如下步骤：
(1)菌种培养：保藏菌株新鞘氨醇杆菌SJB007接种于种子培养基中，30℃、160rpm条件下培养24小时，离心，得菌体，菌体用无菌水洗涤后制成OD600为0.50～0.60的菌悬液；
(2)发酵除磷：将步骤(1)制备的菌悬液以2％的比例接种于含磷污水中，pH为4～8、15-35℃条件下发酵以脱除磷。
其中步骤(1)中的种子培养基组成为：酵母粉1.0g、NaCl 1.0g、KH2PO4 0.3g、K2HPO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g和葡萄糖1.0g，蒸馏水定容至1000mL，1mol/L NaOH水溶液和/或1mol/L HCl调pH为7.0。
优选地，步骤(2)中去除含磷污水的培养温度为25-30℃，以NaOH或HCl调pH为5-8。
优选地，步骤(2)中，将步骤(1)所得菌悬液接种于含磷污水中在转速160-200r/min下培养以除磷。
本发明能够达到以下技术效果：
1、本发明提供的高效聚磷菌株新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007为国内首次报道。
2、本发明提供的高效聚磷菌株新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007去除含磷污水的磷的适宜温度为15～35℃，有比较广的温度适应范围。
3、本发明提供的高效聚磷菌株新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007，在适宜条件下，污水中磷浓度为10-30mg/L时，去除率均超过97％，具有较高的去除率。
4、本发明提供的高效聚磷菌株新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007，适应性广，好氧条件下除磷效果好，在实际废水的磷去除中具有很大的应用潜力。
附图说明
图1是新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007的菌落。
图2是采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株SJB007与相关种的16S rDNA序列***发育树。
菌株保藏
本发明的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.21177，保藏起始日期为2020年11月13日。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供一株高效聚磷的新鞘氨醇杆菌，该菌株为采用常规分离方法从采自浙江省温州市温州大学校园生活污水的活性污泥中分离获得，经16SrDNA序列测定并将测序结果通过GeneBank Blast进行比对分析，与新鞘氨醇菌Novosphingobium sp.BH-4(MG855668.1)的同源性为99％，确定属于Novosphingobium sp.，编为Novosphingobiumsp.SJB007。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所用的菌种培养基如下：
富集培养基和种子培养基：酵母粉1.0g、NaCl 1.0g、KH2PO4 0.3g、K2HPO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g和葡萄糖1.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。
分离培养基：酵母粉1.0g、NaCl 1.0g、KH2PO4 0.3g、K2HPO4 0.25g、MgSO4·7H2O0.2g，葡萄糖1.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。
多聚磷酸盐颗粒染色培养基：Na3C6H5O7·2H2O 4.0g、NaCl 0.5g、(NH4)2SO4 2.5g、CaCl2 0.25g、MgSO4·7H2O 0.25g、Na2HPO4 12.8g、KH2PO4 3g、麦芽糖0.01g和甲苯胺蓝O0.025g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。
聚磷培养基：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g、KCl 0.3g、NaCl 0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O 0.03g、CaCO3 5g和KH2PO4 0.0439g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。
实施例1新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007的分离与鉴定
一、菌株的分离筛选
样品为取自浙江省温州市温州大学校园生活污水的活性污泥，采用常规分离法，将一定量活性污泥按10％添加至装有100mL富集培养基的250mL的锥形瓶内，30℃、160rpm下振荡培养一周。然后将经适当稀释的菌液涂布于分离培养基，于30℃下培养48小时，挑取单菌落转接新的分离培养基进行划线纯化，直至经镜检为纯培养物。转接后4℃下保藏。
分别将保藏菌株接种于种子培养基于30℃、150r/min下培养(250mL锥形瓶装培养基100mL)培养24小时。然后接种于
在96孔板上分别加180μL多聚磷酸盐颗粒染色培养基和20μL菌液，对照组添加等量的无菌水。30℃下培养48h，若供试菌株内形成聚磷酸盐颗粒，则甲苯胺蓝会进入菌体与之反应着色，孔内甲苯胺蓝浓度降低，颜色随之变浅，且褪色越明显表明菌株聚磷能力越强。根据颜色变化，选取能够使甲苯胺蓝褪色最为显著的聚磷菌株命名为SJB007，并进一步纯化，其菌落形态见图1。由图1可见，菌落呈圆形，边缘整齐，黄色不透明，表面光滑湿润呈粘稠状，中间凸起。
二、菌株的分子鉴定
将目的菌株在斜面培养基上培养24小时，提取基因组DNA，利用PCR技术扩增该菌株的16S rDNA，所用引物，正向引物(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')，反向引物(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')；
PCR反应体系组成如下表：
Figure BDA0003123893060000041
Figure BDA0003123893060000051
PCR条件如下表所示：
Figure BDA0003123893060000052
取PCR产物5μL进行1％琼脂糖电泳(150V、100mA、20min)电泳观察，扩增片段长度约1.5kb为合格。用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对检测合格的PCR产物进行纯化，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测得16S rDNA序列与GeneBank数据库中的16S rDNA进行同源性比对，结果见图2，发现与新鞘氨醇菌Novosphingobium sp.BH-4(GenBank accession No.MG855668.1)的同源性最高，为99％，确定该菌株为Novosphingobium sp.，编为Novosphingobium sp.SJB007。
实施例2新鞘氨醇菌Novosphingobium sp.SJB007除磷特性
取保藏菌株接种于装有100mL种子培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养24h，在5000r/min离心10min后用无菌水洗涤2次，再用无菌水配制成菌悬液(OD600＝0.5-0.6)；然后按2％体积比转接于装有100mL聚磷培养基的250mL锥形瓶中，在一定温度、转速下培养24h，然后在14000r/min下离心10min，收集上清液，采用GB 11893-1989规定的钼锑抗分光光度法测定磷浓度。采用以下公式计算磷脱除率：
Figure BDA0003123893060000053
本发明以上述方法，主要研究pH、温度、摇床转速和磷浓度对新鞘氨醇菌Novosphingobium sp.SJB007除磷的影响。
1、pH的选择
配置磷浓度为10mg/L的聚磷培养基，pH值分别调至4、5、6、7、8、9、10，并接种2％(体积比)的种子液，于30℃、160rpm下培养24h，然后在14000r/min下离心10min，收集上清液，测定磷浓度，结果见下表。由表中可见，菌株SJB007在pH值4-8范围内对污水中磷的脱除效果好，脱除率均超过97％。
pH 4 5 6 7 8 9 10
磷脱除率(％) 97.713 98.140 98.980 99.827 98.140 62.117 3.636
2、培养温度的选择
配置磷浓度为10mg/L的聚磷培养基，pH值调整为7，接种2％(体积比)的种子液，分别于15、20、25、30、35℃温度条件下，160rpm培养24h，然后在14000r/min下离心10min，收集上清液，测定磷浓度，结果见下表。由表中可见，菌株SJB007在15-35℃范围内对污水中磷的脱除效果好，脱除率均超过97％。
温度(℃) 15 20 25 30 35
磷脱除率(％) 98.983 97.713 99.407 98.983 98.133
3、摇床转速的选择
配置磷浓度为10mg/L的聚磷培养基，pH值调整为7，接种2％(体积比)的种子液，分别于80、120、160、200rpm，30℃条件下，培养24h，然后在14000r/min下离心10min，收集上清液，测定磷浓度，结果见下表。由表中可见，菌株SJB007在80-200r/min的转速范围内对污水中磷的脱除效果好，脱除率均超过97％。
摇床转速(r/min) 80 120 160 200
磷脱除率(％) 97.713 97.713 98.983 98.133
4、污水中磷浓度试验
配制不同磷浓度的聚磷培养基，磷浓度分别为10、20、30、40、50、60、70mg/L，然后将聚磷培养基pH调至7，并接种2％(体积比)种子液，于160rpm，30℃条件下，培养24h，然后在14000r/min下离心10min，收集上清液，测定磷浓度，结果见下表。由表中可见，菌株SJB007在10-30mg/L的磷浓度范围内对污水中磷的脱除效果好，脱除率均超过97％。
Figure BDA0003123893060000071
实施例3新鞘氨醇菌Novosphingobium sp.SJB007除经厌氧处理后的猪场废水磷的效果
依实施例2法制得新鞘氨醇菌Novosphingobium sp.SJB007菌悬液，按2％体积比分别转接于装有200mL经厌氧处理后的猪场废水，在25℃、160r/min下培养，以不接入菌悬液的原废水在相同条件下培养为对照。培养24h，然后在14000r/min下离心10min，收集上清液，测定磷浓度。经厌氧处理后的猪场废水磷浓度为3.12mg/L，经新鞘氨醇菌Novosphingobium sp.SJB007培养处理后，废水中磷浓度降为1.57，脱除率为49.68％；对照组磷浓度为2.91mg/L，磷浓度下降率为6.73％。菌株新鞘氨醇菌Novosphingobiumsp.SJB007具有实际含磷废水脱除的应用潜力。
序列表
<110> 温州大学
<120> 一株新鞘氨醇杆菌及其在废水除磷中的应用
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)
<400> 1
ggctcagaac gaacgctggc ggcatgccta acacatgcaa gtcgaacgag atcttcggat 60
ctagtggcgc acgggtgcgt aacgcgtggg aatctgccct tgggttcgga ataacagtga 120
gaaattactg ctaataccgg atgatgtctt cggaccaaag atttatcgcc cagggatgag 180
cccgcgtagg attaggtagt tggtggggta atggcctacc aagccgacga tccttagctg 240
gtctgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300
agcagtgggg aatattggac aatgggcgca agctgatcca gcaatgccgc gtgagtgatg 360
aaggctttag ggttgtaaag ctcttttacc agggatgata atgacagtac ctggagaata 420
agctccgggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggagcta gcgttgttcg 480
gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggcg gttactcaag tcagaggtga aagcccgggg 540
ctcaaccccg gaactgcctt tgaaactagg tgactagaat cttggagagg tcagtggaat 600
tccgagtgta gaggtgaaat tcgtagatat tcggaagaac accagtggcg aaggcgactg 660
actggacaag tattgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 720
tggtagtcca cgccgtaaac gatgataact agctgtccgg gtacttggta cttgggtggc 780
gcagctaacg cattaagtta tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg 840
aattgacggg ggcctgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga 900
accttaccag cgtttgacat gccggtcgcg gatttgggag accatttcct tcagttcggc 960
tggaccgtgc acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1020
gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgtcctta gttgccagca tttagttggg cactctaagg 1080
aaactgccgg tgataagccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca tggcccttac 1140
acgctgggct acacacgtgc tacaatggcg gtgacagtgg gcagcaagca ggcgactgca 1200
agctaatctc caaaagccgt ctcagttcgg attgttctct gcaactcgag agcatgaagg 1260
cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttccca ggccttgtac 1320
acaccgcccg tcacaccatg ggagttggat tcactcgaag gcgttgagct aacccgcaag 1380
ggaggcaggc gaccacagtg ggtttagcga ctgggtgaag tcga 1424

Claims (4)

1.一株新鞘氨醇杆菌，其特征在于，该菌株为新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)SJB007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.21177，保藏日期2020年11月13日。
2.权利要求1所述新鞘氨醇杆菌的应用，其特征在于，将新鞘氨醇杆菌SJB007接种于含磷污水中培养以除去磷。
3.根据权利要求2所述新鞘氨醇杆菌的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种培养：保藏菌株新鞘氨醇杆菌SJB007接种于种子培养基中，30℃、160rpm条件下培养24小时，离心，得菌体，菌体用无菌水洗涤后制成OD600为0.50～0.60的菌悬液；
(2)发酵除磷：将步骤(1)制备的菌悬液以2％的比例接种于含磷污水中，pH为4～8、15-35℃条件下发酵以脱除磷。
4.根据权利要求3所述新鞘氨醇杆菌的应用，其特征在于，所述的种子培养基组成为：酵母粉1.0g、NaCl 1.0g、KH2PO4 0.3g、K2HPO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g和葡萄糖1.0g，蒸馏水定容至1000mL，1mol/L NaOH水溶液和/或1mol/L HCl调pH为7.0。
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