CN113444158B

CN113444158B - B-型细胞周期蛋白Cbc1及其编码基因在新生隐球菌致病性中的重要作用

Info

Publication number: CN113444158B
Application number: CN202010227474.5A
Authority: CN
Inventors: 王琳淇; 田秀云; 柯维鑫
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2040-03-27
Also published as: CN113444158A

Abstract

本发明涉及B‑型细胞周期蛋白Cbc1及其编码蛋白在新生隐球菌致病性中的重要作用。本发明提供了一种隐球菌致病蛋白，所述隐球菌致病蛋白为细胞周期蛋白Cbc1。还提供了细胞周期蛋白Cbc1在制备药物中的用途，所述药物能够治疗隐球菌引发的疾病。细胞周期蛋白Cbc1表达量下降能够导致致病菌的致病性下降，从而可以将该蛋白作为药物靶点，应用于新药物的研发中，治疗隐球菌引发的疾病。

Description

B-型细胞周期蛋白Cbc1及其编码基因在新生隐球菌致病性中的重要作用

技术领域

本发明涉及生物技术和医药领域，具体涉及一种B-型细胞周期蛋白Cbc1及其编码蛋白在新生隐球菌的致病性中的重要作用。

背景技术

新生隐球菌是担子菌门最为重要的人类病原真菌，是导致免疫缺陷人群死亡的重要真菌病原菌之一，每年可导致超过60万人死亡。新生隐球菌通常通过呼吸***进入宿主肺部，经由血液扩散至不同脏器，并可最终穿过血脑屏障进入脑部引发脑膜炎。该菌引发的脑膜炎致死/致残率较高，即便在欧美等诊疗发达的国家和地区其感染致死率仍超过20％。此外，新生隐球菌在我国的感染相对独特，有感染免疫健全人群的倾向，且在一些地区已成为感染性脑炎的主要病原体，对我国的公共健康安全构成了更严峻的挑战。

当前针对新生隐球菌的治疗药物主要三类抗真菌药物，它们分别是两性霉素B、制霉菌素等多烯类、伏立康唑和伊曲康唑等***类和卡泊芬净、5-氟胞嘧啶等核苷类药物。然而这些不同类型药物的选择性和毒性使得这些药物的使用受到一定的限制。例如：***类药物具有广谱、高效、毒副作用较轻和较易通过血脑屏障的优点，但唑类药物压力下，新生隐球菌易发生点突变，使得药物作用靶点和药物转运体等发生改变，导致临床上耐药性菌株的产生。为发挥药物最大作用同时减少毒副作用，2010年美国感染病学会提出对于中枢神经***感染新生隐球菌或重度患者，推荐使用两性霉素B脱氧胆酸盐和5-氟胞嘧啶联合治疗至少四周后，再用氟康唑进行继续治疗；仅肺部感染的轻、中度患者可仅使用氟康唑进行治疗。尽管联合用药使得药物对人体的毒副作用降低，但长期使用仍给真菌带来极高的选择压力，导致临床上高毒和耐药菌株的不断涌现，使得这些药物治疗面临着挑战。

针对新生隐球菌的诊断和治疗还需要进一步发掘和改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。本发明通过挖掘与新生隐球菌致病相关的细胞周期蛋白，提供更多的针对隐球菌治疗的靶点，从而可以应用于隐球菌引发的疾病的治疗中。

细胞从一次***完成开始到下一次***结束，经历一个细胞周期。细胞周期包含DNA合成前期(G1期)，DNA合成器(S期)，DNA合成后期(G2期)与***期(M期)。在此过程中，细胞经S期将染色体进行倍化，经M期将染色体均分后进入两个子代细胞。在一个完整的细胞周期里，细胞周期蛋白及其相应的蛋白质激酶共同作用，推动和协调细胞周期的顺利进行。细胞周期是包含真菌在内的不同生物体控制自身生长和发育分化的重要基础过程，而对于人类致病真菌而言，其致病性又往往与其发育分化直接相关，所以细胞周期往往与其致病性紧密相关。

目前针对新生隐球菌细胞周期蛋白对其致病性影响的研究很少，已发现的细胞周期蛋白在新生隐球菌致病性中发挥的作用不足，未有能够使得新生隐球菌致病性完全丧失的细胞周期蛋白的报道。在众多的细胞周期蛋白成员中，找到与新生隐球菌致病性相关的细胞周期蛋白，发掘细胞周期蛋白在新生隐球菌致病性中的重要作用，能够为新生隐球菌的治疗提供更多有效的药物靶点。

本发明以新生隐球菌的细胞周期蛋白为研究对象，通过对一个已知的在新生隐球菌各个发育阶段中均起到重要作用的RNA结合蛋白Pum1(其缺失可导致新生隐球菌致病性的明显下降)所调控的元件进行分析，从众多细胞周期蛋白中找到其中表达上调明显的CBC1编码产物，对其编码基因进行缺失和回补，发现其缺失突变体致病性完全丧失，说明CBC1基因及其编码的蛋白对于新生隐球菌的致病性是必需的，可将该蛋白及其编码基因作为新的靶点开发隐球菌病的治疗药物。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，细胞周期蛋白Cbc1在制备药物中的用途，所述药物能够治疗隐球菌引发的疾病。细胞周期蛋白Cbc1缺失或者表达量下调，能够使得隐球菌的致病性降低或者完全丧失。以细胞周期蛋白Cbc1作为靶点，可以获得对于隐球菌有抑制作用的药物，所获得的药物能够治疗隐球菌导致的疾病。所提到的隐球菌引起的疾病包括但不限于肺炎、脑膜炎、器官感染等多种疾病。

根据本发明的实施例，以上所述细胞周期蛋白Cbc1在制备药物中的用途可以进一步包括如下技术特征：

根据本发明的实施例，所述细胞周期蛋白Cbc1为所述药物的作用靶点。药物能够以细胞周期蛋白Cbc1作为作用靶点，通过下调细胞周期蛋白Cbc1的表达，使得隐球菌的致病性降低，从而可以用于治疗隐球菌所引起的疾病。

根据本发明的实施例，所述药物能够使得所述细胞周期蛋白Cbc1的蛋白表达量降低。

根据本发明的实施例，所述隐球菌为新生隐球菌。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种隐球菌致病蛋白，所述隐球菌致病蛋白为细胞周期蛋白Cbc1。

根据本发明的实施例，以上所述的隐球菌致病蛋白可以进一步包括如下技术特征：

根据本发明的实施例，所述细胞周期蛋白Cbc1包括下列至少之一：a)具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，经过一个或几个氨基酸取代、缺失和/或添加。

根据本发明的实施例，所述细胞周期蛋白Cbc1的编码序列选自下列至少之一：c)具有SEQ ID NO:1所示的核酸序列；d)与SEQ ID NO:1所示的核酸序列相比，具有80％以上同源性；e)在严格条件下与c)或d)所示的核酸序列杂交。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括下列核酸至少之一：1)具有SEQ ID NO:1所示的核酸序列；2)与SEQ ID NO:1所示的核酸序列相比，具有80％以上同源性；3)在严格条件下与1)或2)所示的核酸序列杂交。可用的载体包括但不限于质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体等。所提到的表达载体上还可以进一步包含有操作元件，所述操作元件与所述核酸可操作性连接。操作元件包括但不限于启动CBC1基因转录的启动子，终止CBC1基因转录的终止子以及增强子序列。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞具有本发明第三方面所述的表达载体。所提到的重组细胞可以以单个细胞的方式存在，也可以存在于多细胞生物中，例如酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌等中。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗隐球菌引发的疾病，所述方法包括：将候选药物施用于本发明第四方面所述的重组细胞，筛选使得所述重组细胞的细胞周期蛋白Cbc1的表达量降低的药物，作为用于治疗隐球菌引发疾病的药物。

在本方明的第六方面，本发明提供了一种细胞周期蛋白Cbc1作为药物靶点在筛选药物中的应用，所述药物用于治疗隐球菌引发的疾病。

根据本发明的实施例，以上所述细胞周期蛋白Cbc1作为药物靶点在筛选药物中的应用可以进一步包括如下技术特征：

根据本发明的实施例，所述药物能够使得隐球菌在37摄氏度条件下生长受到抑制。

根据本发明的实施例，所述药物能够使得隐球菌毒力因子荚膜多糖和/或黑色素的表达量降低。根据本发明的实施例，所述药物使得隐球菌毒力因子荚膜多糖的表达量相较于野生型菌株降低至10％以下，例如降低至8％以下，降低至7％以下，降低至6％以下，5％以下，4％以下。根据本发明的实施例，所述药物使得隐球菌毒力因子黑色素的表达量相较于野生型菌株降低至10％以下，例如降低至9％以下，降低至8％以下，降低至7％以下，6％以下，5％以下。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明的实施例提供的Cbc1 C端含Cyclin结构域的示意图。

图2为根据本发明的实施例提供的CBC1基因的缺失导致新生隐球菌呈现G2阻滞。

图3为根据本发明的实施例提供的CBC1基因缺失对于新生隐球菌在不同温度条件下的生长的影响结果图。

图4为根据本发明的实施例提供的CBC1基因缺失对于新生隐球菌毒力因子荚膜多糖的影响结果图。

图5为根据本发明的实施例提供的CBC1基因缺失对于新生隐球菌毒力因子黑色素的影响结果图。

图6是根据本发明的实施例提供的CBC1基因缺失新生隐球菌对于小鼠的影响结果图，其中图6A为不同处理组小鼠的存活率结果，图6B为不同处理组小鼠的体重变化结果。

图7是根据本发明的实施例提供的CBC1基因缺失新生隐球菌对于小鼠的影响结果图，其中图7A为小鼠肺部隐球菌载量结果，图7B为小鼠脑部隐球菌载量结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文中，隐球菌是一种病原菌，能够导致疾病。隐球菌所引起的疾病通常称为隐球菌病，是由隐球菌引起的肺部或者播散性感染性疾病，主要引起肺炎和脑膜炎，也会引起皮肤、骨骼或者内脏器官等的感染。作为隐球菌中的一个重要的致病菌，新生隐球菌可以在土壤、鸟粪、尤其是鸽粪中等大量存在，也存在于人体的体表、口腔及粪便中，引起人和动物的隐球菌病。应用本发明的细胞周期蛋白Cbc1作为药物靶点，可以获得对于隐球菌病治疗有效的药物，应用于药物生产以及隐球菌病的治疗中。

本发明分析了一个缺失后明显影响新生隐球菌致病性的在新生隐球菌各个发育阶段中均起到重要作用的RNA结合蛋白Pum1所调控的元件，发现了一个受Pum1上调表达非常明显的细胞周期蛋白Cbc1(由基因CNAG_02095编码)，在其C端含有一个保守的cyclindomain。为此，在新生隐球菌野生型菌株的基础上，构建了细胞周期蛋白Cbc1编码基因CBC1的缺失突变株，并在缺失突变株的基础上构建了回补菌株(即在缺失菌株中又导入了CBC1基因)。然后对这些菌株的致病性等进行了研究。

首先对野生型菌株与缺失突变株及回补菌株的细胞染色体进行了定量的流式细胞荧光检测，发现相对于野生型，缺失突变株呈现了G2期的阻滞；而回补菌株则与野生型相似，并未发现明显的细胞周期变化。进一步对它们在人体温度即37℃条件下的生长能力和毒力因子(荚膜多糖和黑色素)的产生进行了测试，结果发现缺失突变株在37℃条件下的生长相对野生型而言极度受阻(例如，将含有约1200个缺失突变株细胞的液滴滴至培养基表面时，只能看到极其微弱的生长，而相同条件下野生型菌株生长成为正常的菌苔)，毒力因子荚膜多糖和黑色素的产生也明显减弱(例如，分别降低至约为野生型菌株的4.8％和6.0％)，表明缺失突变株毒力的下降，回补菌株同样表现出与野生型相似的表型。最后，为确定该基因的缺失在实际感染过程中的功能，以C57 BL/6小鼠为模型进行了野生型和缺失突变株的鼻息感染，在感染剂量为1x10⁵cell时，感染野生型菌株的小鼠在感染后23天内全部死亡。而感染CBC1缺失突变株的小鼠在感染后60天仍然正常，且体重持续增加。以上结果表明，细胞周期蛋白Cbc1在新生隐球菌的致病性方面起到非常关键的作用。

本文中，细胞周期蛋白Cbc1在本领域也通常称为B-型细胞周期蛋白Cbc1。

为此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种隐球菌致病蛋白，所述隐球菌致病蛋白为细胞周期蛋白Cbc1。该蛋白的缺失可以使得新生隐球菌完全丧失对小鼠的致病性。所提供的隐球菌致病蛋白选自下列至少之一：a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，经过一个或几个氨基酸取代、缺失和/或添加。

根据本发明的实施例，所提供的一个或几个氨基酸取代、缺失和/或添加为不超过8个氨基酸的取代、缺失和/或添加，优选不超过5个氨基酸的取代、缺失和/或添加，不超过4个氨基酸的取代、缺失和/或添加，不超过3个氨基酸的取代、缺失和/或添加，更优选不超过2个氨基酸的取代、缺失和/或添加，不超过1个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

所提到的细胞周期蛋白Cbc1可以直接人工合成，即可以直接借助化学反应获得相应的氨基酸序列；也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。为了在体外获得细胞周期蛋白Cbc1，可以在上述细胞周期蛋白Cbc1的羧基末端和/或氨基末端连接上标签序列。根据本发明的实施例，所用到的标签序列可以如下表1所示：

表1标签序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

根据本发明的实施例，细胞周期蛋白Cbc1的编码序列选自下列至少之一：c)具有SEQ ID NO:1所示的核酸序列；d)与SEQ ID NO:1所示的核酸序列相比，具有75％以上同源性。根据本发明的实施例，所述编码序列优选为与SEQ ID NO:1所示的核酸序列相比，具有80％以上同源性，优选具有85％以上同源性，具有90％以上同源性，更优选具有95％以上同源性，具有98％以上同源性，具有99％以上同源性。所提到的同源性序列可以是由于编码氨基酸的密码子的简并性带来的，也可以是氨基酸的取代、缺失和/或添加等带来的。

CBC1基因的缺失可使得人生隐球菌在人体温度条件下的生长极度受阻，毒力因子荚膜多糖和黑色素的产生大大下降，致病性完全丧失，可作为潜在的靶点，开发新型的治疗方法与药物。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

通过研究新生隐球菌重要RNA结合蛋白Pum1所调控的细胞周期蛋白，发现细胞周期蛋白Cbc1为受Pum1上调最明显的，鉴于PUM1缺失后新生隐球菌的致病性明显下降，且此时CBC1基因转录水平极低，推测该细胞周期蛋白Cbc1与致病性紧密相关。并对细胞周期蛋白Cbc1与隐球菌致病相关性进行了研究。

1、CBC1基因的核苷酸序列和细胞周期蛋白Cbc1的氨基酸序列

CBC1(在新生隐球菌Cryptococcus neoformans var.grubii中的基因号为CNAG_02095)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:1为cDNA序列，5’-3’)如下：

atggctt cccgaaaccc cgtcgtcacc cgccgagctg ctactcgttc tcgaaatgacgagaacgccg ctcctcaacc gtcagtacga accaagccct caatctccca cctcggccct gcttccaaggctgcggttgt caatgcctct gtagtcgctg gcaagaagcc tgtcgctgtc aaggctggcg ccaagaggacagctttggga ggcgtggttg ttaacggtaa ggaagatact gaagccgcga agaagccttt gaaggcgaatggcaagactg tcaccgaggc tagacagcct cttgcgtccc gacaaaacaa tgctcagccc acacgaccgattgccgccat ccctcaccga tccaaagcgg ctcctgccaa cgtctatgct cctgtagagg ctcctactaagcttactgtc gacgacgata tgcagatgga gatcgatact cgacgatctc agcccgtctc cagcgctgccggcttcgcga ctgtcgatga ggagcttctc gatgacgaat ccgaagagga tgacgtggaa gaggaggatgaagaagattg gctgaggatg tctgaagagg agatggtgaa ggcgcaagag caactggacg tcgtgcaggcgactttcaaa gatgatgttg acatgtttga caccactatg gttgccgagt acgcggacga gattttcgagcacatggagc gacttgagga gactgttatg cctaaccctc gctacatgga cttccagact gagattgaatggaccatgag gacaacactt attgattggc ttcttcaagt gcatcttcgt taccacatgc tccccgagactctttggatc gctgtcaaca ttgttgaccg attcctttcc accagagtgg tctcccttgt caagcttcaacttgttggtg tcaccgccat gttcatcgct gccaagtatg aagagatcct cgctccttct gttgaggagtttgtctacat gactgaaaat gggtacacca aggatgagat ccttaaggga gaaaggatta tccttcaaaccctcgatttc accatttcat cctactgttc cccgtactca tgggtcaggc gaatttctaa ggccgacgattacgacgttc aaactcgaac attgagcaaa ttcttgatgg aggtcaccct tttggaccac aggttcctcaggtgtaagcc tagcatgatc gctgccatcg ggatgtatct tgccaggaag atgttgggcg gcgactggaatgacgctttt atctactact ccaactttac tgaatctcaa ctcatcactg gcgcatctct tttgtgcgagcgacttattg agcctgactt tgagtccgtg tacgtttaca agaagtacgc caacaagaag tttttgcgagcgtctacctt tgcgcgagat tgggctttga ccaacgccgc caactcatca tga

其编码的细胞周期蛋白为Cbc1，Cbc1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:2(479个氨基酸残基组成)如下：

MASRNPVVTRRAATRSRNDENAAPQPSVRTKPSISHLGPASKAAVVNASVVAGKKPVAVKAGAKRTALGGVVVNGKEDTEAAKKPLKANGKTVTEARQPLASRQNNAQPTRPIAAIPHRSKAAPANVYAPVEAPTKLTVDDDMQMEIDTRRSQPVSSAAGFATVDEELLDDESEEDDVEEEDEEDWLRMSEEEMVKAQEQLDVVQATFKDDVDMFDTTMVAEYADEIFEHMERLEETVMPNPRYMDFQTEIEWTMRTTLIDWLLQVHLRYHMLPETLWIAVNIVDRFLSTRVVSLVKLQLVGVTAMFIAAKYEEILAPSVEEFVYMTENGYTKDEILKGERIILQTLDFTISSYCSPYSWVRRISKADDYDVQTRTLSKFLMEVTLLDHRFLRCKPSMIAAIGMYLARKMLGGDWNDAFIYYSNFTESQLITGASLLCERLIEPDFESVYVYKKYANKKFLRASTFARDWALTNAANSS

2、序列分析

将CBC1基因上游和下游序列各延伸2000bp作为参考序列，用Snapgene Viewer4.1.6软件将转录组的reads定位到参考序列上，分析得出CBC1基因从起始密码子到终止密码子全长为1747bp(如下述SEQ ID NO:3所示)，包含5个大小分别为88，55，52，61，51bp的内含子。

atggcttcccgagtaagtatctgcgacccactttatccatcttcacgacatatgcaaacatcacattatgaaggcccaggctcactcttatcttgcacagaaccccgtcgtcacccgccgagctgctactcgttctcgaaatgacgagaacgccgctcctcaaccgtcagtacgaaccaagccctcaatctcccacctcggccctgcttccaaggctgcggttgtcaatgcctctgtagtcgctggcaagaagcctgtcgctgtcaaggctggcgccaagaggacagctttgggaggcgtggttgttaacggtaaggaagatactgaagccgcgaagaagccttgtaagtttgtcgatcagtcaacgtacctttgtttggtattgactttccgcgctagtgaaggcgaatggcaagactgtcaccgaggctagacagcctcttgcgtcccgacaaaacaatgctcagcccacacgaccgattgccgccatccctcaccgatccaaagcggctcctgccaacgtctatgctcctgtagaggctcctactaagcttactgtcgacgacgatatgcagatggagatcgatactcgacgatctcagcccgtctccagcgctgccggcttcgcgactgtcgatgaggagcttctcgatgacgaatccgaagaggatgacgtggaagaggaggatgaagaagattggctgaggatgtctgaagaggagatggtgaaggcgcaagagcaactggacgtcgtgcaggcgactttcaaagatgatgttgacatgtttgacaccactatggttgccgagtacgcggacgagattttcgagcacatggagcgacttgaggagactgttatgcctaaccctcgctacatggacttccagactgagattgaatggtaagcgtcaaaatctctatcaatcaaacaacatccactgaattatttttaggaccatgaggacaacacttattgattggcttcttcaagtgcatcttcgttaccacatgctccccgagactctttggatcgctgtcaacattgttgaccgattcctttccaccagagtggtctcccttgtcaagcttcaacttgttggtgtcaccgccatgttcatcgctgccaagtatgaagagatcctcgctccttctgttgaggagtttgtctacatgactgaaaatgggtacaccaaggatgagatccttaagggagaaaggattatccttcaaaccctcgatttcaccatttcatcctactgttccccgtactcatgggtcaggcgaatttctaaggccgacgattacgacgttcaaactcgaacattgagcaaattcttgatggaggtcacccttttggaccacaggttcctcaggtgtaagcctagcatgatcgctgccatcgggatgtatcttgccaggaagatgttgggcggcgactgggtaagctggtttaacacagatatgttgcccttgatgcactaacctgaccgttctacctcagaatgacgcttttatctactactccaactttactgaatctcaactcatcactggcgcatctcttttgtgcgagcgacttattgagcctgactttgagtccgtgtacgtttacaagaagtacgccaacaagaagtttttgcgagcgtctacctttgcgcgagattgggctttgaccaacgccgccaactcgtaagtggcttctgttcatcttccattatgtgggctaaccttgggctgtagatcatga(SEQ ID NO:3)。

用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和ExPASY(https://www.expasy.org/)细胞周期蛋白Cbc1的氨基酸序列进行分析。

结果显示，细胞周期蛋白Cbc1为一个C端具有保守Cyclin结构域(Cyclin domain)的蛋白，如图1所示，分子量为54048.41Da，等电点为5.07。

3、CBC1基因缺失

本技术采用TRACE的方法进行CBC1基因的缺失，具体操作如下：

将CBC1基因上游和下游序列各延伸2000bp作为参考序列，分别设计引物Left F,Left R,Right F,Right R(上游片段反向引物Left R与下游片段的正向引物Right F各携带约20bp匹配抗性片段的序列以方便之后的overlap-PCR)扩增CBC1基因上游和下游各1-1.5kb的片段用作基因缺失同源重组的同源片段(上下游片段分别定义为left片段和right片段)。

其中所用到的引物如下：

CBC1-Left-F:AGGTCTTTACCTGCGATGACCT(SEQ ID NO:4)

CBC1-Left R:CTGGCCGTCGTTTTACGGCTAACCTTGGGCTGTAGATC(SEQ ID NO:5)

CBC1-Right F:GTCATAGCTGTTTCCTGAGTGGGTCGCAGATACTTACTCG(SEQ ID NO:6)

CBC1-Right R:TAGCGGTAGGACGTTCAGGTCA(SEQ ID NO:7)。

将该两条片段与抗性片段NEO(neomycin)一起作为模板进行overlap-PCR。然后以该overlap-PCR产物为模板，通过TRACE***对CBC1基因进行缺失(参考文献Yumeng Fanand Xiaorong Lin.2018.Multiple Applications of a Transient CRISPR-Cas9Coupled with Electroporation(TRACE)System in the Cryptococcus neoformansSpecies Complex.Genetics.2018Apr；208(4):1357–1372.中记载的方法)。得到的CBC1缺失菌株以cbc1Δ表示。

所用到的引物如下所示：

CBC1-sgRNA-F:ACTTCTTGCCAGCGACTACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQ IDNO:8)

CBC1-sgRNA-R:CTGTAGTCGCTGGCAAGAAGTAACAGTATACCCTGCCGGTG(SEQ ID NO:9)。

4、CBC1缺失突变体回补菌株的构建

通过PCR扩增CBC1基因的启动子区域与编码区域，经NotI和PacI双酶切，连接至同样酶切的载体pXL1，得到回补载体。将回补载体经NotI线性化后电转进入cbc1Δ，构建得到的回补菌株以cbc1Δ+CBC1表示。

用于扩增回补片段的引物：

CBC1-F:ATAAGAATGCGGCCGCGTCGGGAGGTATAACAAACGAGA(SEQ ID NO:10)

CBC1-R:GGCGGTTAATTAACAATAGTCGTGGCATAAGAACAGC(SEQ ID NO:11)。

5、Cbc1作为细胞周期蛋白功能的验证

在一个完整的细胞周期里，细胞周期蛋白及其相应的蛋白质激酶共同作用，推动和协调细胞周期的顺利进行，在此过程中，细胞经S期将染色体倍化，M期后将染色体均分至两个子代细胞中，完成一个循环。当细胞周期蛋白功能改变或缺失时，细胞周期无法正常进行，可通过流式细胞荧光的方式检测细胞染色体的组成变化，从而分析或验证该细胞周期蛋白在正常细胞周期功能中的作用。

对新生隐球菌野生型、cbc1Δ与cbc1Δ+CBC1的流式细胞检测发现cbc1Δ呈现明显的G2阻滞，且回补株的结果与野生型相似，验证了Cbc1作为细胞周期蛋白的功能，如图2所示。

实施例2

实施例2研究了CBC1基因缺失对于新生隐球菌在不同温度下的生长的影响。

将野生型菌株，cbc1Δ及cbc1Δ+CBC1进行浓度梯度稀释后分别在30℃与37℃条件下培养，发现在30℃条件下三者的生长无差异，而cbc1Δ在人体温度条件下的生长则明显受到抑制，如图3所示。

实验结果表明：CBC1基因的缺失使得新生隐球菌在人体温度(37℃)条件下的生长严重受阻。该结果表明：CBC1基因缺失，能够使得新生隐球菌在体内温度条件下的生长受到抑制。

实施例3

实施例3研究了CBC1基因的缺失对于新生隐球菌的毒力因子荚膜多糖的影响。

将野生型菌株，cbc1Δ及cbc1Δ+CBC1在DME培养基中5％CO₂条件下培养后，于墨汁中观察，发现相对于野生型和回补菌株，cbc1Δ的荚膜多糖层明显变薄(如图4所示)，意味着CBC1基因缺失能够使得新生隐球菌的毒力因子荚膜多糖的产量大大降低。

实施例4

黑色素可帮助新生隐球菌抵抗机体炎症细胞释放的氧化剂对菌体的破坏，是其重要的毒力因子之一。实施例4研究了CBC1基因的缺失对于新生隐球菌的毒力因子黑色素的影响。

利用DME培养基分别培养野生型菌株，cbc1Δ及cbc1Δ+CBC1，然后分别在培养基中加入黑色素合成底物L-DOPA。结果发现：野生型菌株可产生大量的黑色素，使得整个菌落呈现黑色；而cbc1Δ产生黑色素的能力大大减弱，回补菌株产生黑色素的能力与野生型类似(如图5所示)。实验结果表明，CBC1基因的缺失大大影响了新生隐球菌毒力因子黑色素的产生。

综合实施例2，3，4，人体温度条件是病原菌在宿主内生存需要克服的重要屏障，而毒力因子荚膜多糖与黑色素的产生是新生隐球菌致病能力的重要组成，cbc1Δ在这三方面的缺陷表明Cbc1在新生隐球菌的致病性方面起到非常重要的作用。

实施例5 CBC1基因缺失导致新生隐球菌对C57 BL/6小鼠毒力完全丧失

将新生隐球菌野生型菌株与cbc1Δ分别以1x 10⁵细胞/只的剂量感染6-7周龄的C57BL/6小鼠。

实验结果发现：感染野生型新生隐球菌的小鼠在23天时全部死亡，而至60天实验结束时，感染cbc1Δ的小鼠无一例体重下降或死亡，而是呈现了正常的体重增加，如图6A和图6B所示。

与此结果一致的是，对于新生隐球菌感染1天和14天后的小鼠分别进行肺部和脑部新生隐球菌计数，感染cbc1Δ的小鼠肺部和脑部隐球菌载量均明显低于感染野生型菌株的新生隐球菌载量，如图7A和图7B所示，其中图7B中ND代表未检出。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> B-型细胞周期蛋白Cbc1及其编码基因在新生隐球菌致病性中的重要作用

<130> PIDC3202270

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CBC1 基因的核苷酸序列

<400> 1

atggcttccc gaaaccccgt cgtcacccgc cgagctgcta ctcgttctcg aaatgacgag 60

aacgccgctc ctcaaccgtc agtacgaacc aagccctcaa tctcccacct cggccctgct 120

tccaaggctg cggttgtcaa tgcctctgta gtcgctggca agaagcctgt cgctgtcaag 180

gctggcgcca agaggacagc tttgggaggc gtggttgtta acggtaagga agatactgaa 240

gccgcgaaga agcctttgaa ggcgaatggc aagactgtca ccgaggctag acagcctctt 300

gcgtcccgac aaaacaatgc tcagcccaca cgaccgattg ccgccatccc tcaccgatcc 360

aaagcggctc ctgccaacgt ctatgctcct gtagaggctc ctactaagct tactgtcgac 420

gacgatatgc agatggagat cgatactcga cgatctcagc ccgtctccag cgctgccggc 480

ttcgcgactg tcgatgagga gcttctcgat gacgaatccg aagaggatga cgtggaagag 540

gaggatgaag aagattggct gaggatgtct gaagaggaga tggtgaaggc gcaagagcaa 600

ctggacgtcg tgcaggcgac tttcaaagat gatgttgaca tgtttgacac cactatggtt 660

gccgagtacg cggacgagat tttcgagcac atggagcgac ttgaggagac tgttatgcct 720

aaccctcgct acatggactt ccagactgag attgaatgga ccatgaggac aacacttatt 780

gattggcttc ttcaagtgca tcttcgttac cacatgctcc ccgagactct ttggatcgct 840

gtcaacattg ttgaccgatt cctttccacc agagtggtct cccttgtcaa gcttcaactt 900

gttggtgtca ccgccatgtt catcgctgcc aagtatgaag agatcctcgc tccttctgtt 960

gaggagtttg tctacatgac tgaaaatggg tacaccaagg atgagatcct taagggagaa 1020

aggattatcc ttcaaaccct cgatttcacc atttcatcct actgttcccc gtactcatgg 1080

gtcaggcgaa tttctaaggc cgacgattac gacgttcaaa ctcgaacatt gagcaaattc 1140

ttgatggagg tcaccctttt ggaccacagg ttcctcaggt gtaagcctag catgatcgct 1200

gccatcggga tgtatcttgc caggaagatg ttgggcggcg actggaatga cgcttttatc 1260

tactactcca actttactga atctcaactc atcactggcg catctctttt gtgcgagcga 1320

cttattgagc ctgactttga gtccgtgtac gtttacaaga agtacgccaa caagaagttt 1380

ttgcgagcgt ctacctttgc gcgagattgg gctttgacca acgccgccaa ctcatcatga 1440

<210> 2

<211> 479

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 细胞周期蛋白Cbc1

<400> 2

Met Ala Ser Arg Asn Pro Val Val Thr Arg Arg Ala Ala Thr Arg Ser

1 5 10 15

Arg Asn Asp Glu Asn Ala Ala Pro Gln Pro Ser Val Arg Thr Lys Pro

20 25 30

Ser Ile Ser His Leu Gly Pro Ala Ser Lys Ala Ala Val Val Asn Ala

35 40 45

Ser Val Val Ala Gly Lys Lys Pro Val Ala Val Lys Ala Gly Ala Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Leu Gly Gly Val Val Val Asn Gly Lys Glu Asp Thr Glu

65 70 75 80

Ala Ala Lys Lys Pro Leu Lys Ala Asn Gly Lys Thr Val Thr Glu Ala

85 90 95

Arg Gln Pro Leu Ala Ser Arg Gln Asn Asn Ala Gln Pro Thr Arg Pro

100 105 110

Ile Ala Ala Ile Pro His Arg Ser Lys Ala Ala Pro Ala Asn Val Tyr

115 120 125

Ala Pro Val Glu Ala Pro Thr Lys Leu Thr Val Asp Asp Asp Met Gln

130 135 140

Met Glu Ile Asp Thr Arg Arg Ser Gln Pro Val Ser Ser Ala Ala Gly

145 150 155 160

Phe Ala Thr Val Asp Glu Glu Leu Leu Asp Asp Glu Ser Glu Glu Asp

165 170 175

Asp Val Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Trp Leu Arg Met Ser Glu Glu

180 185 190

Glu Met Val Lys Ala Gln Glu Gln Leu Asp Val Val Gln Ala Thr Phe

195 200 205

Lys Asp Asp Val Asp Met Phe Asp Thr Thr Met Val Ala Glu Tyr Ala

210 215 220

Asp Glu Ile Phe Glu His Met Glu Arg Leu Glu Glu Thr Val Met Pro

225 230 235 240

Asn Pro Arg Tyr Met Asp Phe Gln Thr Glu Ile Glu Trp Thr Met Arg

245 250 255

Thr Thr Leu Ile Asp Trp Leu Leu Gln Val His Leu Arg Tyr His Met

260 265 270

Leu Pro Glu Thr Leu Trp Ile Ala Val Asn Ile Val Asp Arg Phe Leu

275 280 285

Ser Thr Arg Val Val Ser Leu Val Lys Leu Gln Leu Val Gly Val Thr

290 295 300

Ala Met Phe Ile Ala Ala Lys Tyr Glu Glu Ile Leu Ala Pro Ser Val

305 310 315 320

Glu Glu Phe Val Tyr Met Thr Glu Asn Gly Tyr Thr Lys Asp Glu Ile

325 330 335

Leu Lys Gly Glu Arg Ile Ile Leu Gln Thr Leu Asp Phe Thr Ile Ser

340 345 350

Ser Tyr Cys Ser Pro Tyr Ser Trp Val Arg Arg Ile Ser Lys Ala Asp

355 360 365

Asp Tyr Asp Val Gln Thr Arg Thr Leu Ser Lys Phe Leu Met Glu Val

370 375 380

Thr Leu Leu Asp His Arg Phe Leu Arg Cys Lys Pro Ser Met Ile Ala

385 390 395 400

Ala Ile Gly Met Tyr Leu Ala Arg Lys Met Leu Gly Gly Asp Trp Asn

405 410 415

Asp Ala Phe Ile Tyr Tyr Ser Asn Phe Thr Glu Ser Gln Leu Ile Thr

420 425 430

Gly Ala Ser Leu Leu Cys Glu Arg Leu Ile Glu Pro Asp Phe Glu Ser

435 440 445

Val Tyr Val Tyr Lys Lys Tyr Ala Asn Lys Lys Phe Leu Arg Ala Ser

450 455 460

Thr Phe Ala Arg Asp Trp Ala Leu Thr Asn Ala Ala Asn Ser Ser

465 470 475

<210> 3

<211> 1747

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CBC1基因

<400> 3

atggcttccc gagtaagtat ctgcgaccca ctttatccat cttcacgaca tatgcaaaca 60

tcacattatg aaggcccagg ctcactctta tcttgcacag aaccccgtcg tcacccgccg 120

agctgctact cgttctcgaa atgacgagaa cgccgctcct caaccgtcag tacgaaccaa 180

gccctcaatc tcccacctcg gccctgcttc caaggctgcg gttgtcaatg cctctgtagt 240

cgctggcaag aagcctgtcg ctgtcaaggc tggcgccaag aggacagctt tgggaggcgt 300

ggttgttaac ggtaaggaag atactgaagc cgcgaagaag ccttgtaagt ttgtcgatca 360

gtcaacgtac ctttgtttgg tattgacttt ccgcgctagt gaaggcgaat ggcaagactg 420

tcaccgaggc tagacagcct cttgcgtccc gacaaaacaa tgctcagccc acacgaccga 480

ttgccgccat ccctcaccga tccaaagcgg ctcctgccaa cgtctatgct cctgtagagg 540

ctcctactaa gcttactgtc gacgacgata tgcagatgga gatcgatact cgacgatctc 600

agcccgtctc cagcgctgcc ggcttcgcga ctgtcgatga ggagcttctc gatgacgaat 660

ccgaagagga tgacgtggaa gaggaggatg aagaagattg gctgaggatg tctgaagagg 720

agatggtgaa ggcgcaagag caactggacg tcgtgcaggc gactttcaaa gatgatgttg 780

acatgtttga caccactatg gttgccgagt acgcggacga gattttcgag cacatggagc 840

gacttgagga gactgttatg cctaaccctc gctacatgga cttccagact gagattgaat 900

ggtaagcgtc aaaatctcta tcaatcaaac aacatccact gaattatttt taggaccatg 960

aggacaacac ttattgattg gcttcttcaa gtgcatcttc gttaccacat gctccccgag 1020

actctttgga tcgctgtcaa cattgttgac cgattccttt ccaccagagt ggtctccctt 1080

gtcaagcttc aacttgttgg tgtcaccgcc atgttcatcg ctgccaagta tgaagagatc 1140

ctcgctcctt ctgttgagga gtttgtctac atgactgaaa atgggtacac caaggatgag 1200

atccttaagg gagaaaggat tatccttcaa accctcgatt tcaccatttc atcctactgt 1260

tccccgtact catgggtcag gcgaatttct aaggccgacg attacgacgt tcaaactcga 1320

acattgagca aattcttgat ggaggtcacc cttttggacc acaggttcct caggtgtaag 1380

cctagcatga tcgctgccat cgggatgtat cttgccagga agatgttggg cggcgactgg 1440

gtaagctggt ttaacacaga tatgttgccc ttgatgcact aacctgaccg ttctacctca 1500

gaatgacgct tttatctact actccaactt tactgaatct caactcatca ctggcgcatc 1560

tcttttgtgc gagcgactta ttgagcctga ctttgagtcc gtgtacgttt acaagaagta 1620

cgccaacaag aagtttttgc gagcgtctac ctttgcgcga gattgggctt tgaccaacgc 1680

cgccaactcg taagtggctt ctgttcatct tccattatgt gggctaacct tgggctgtag 1740

atcatga 1747

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

aggtctttac ctgcgatgac ct 22

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

ctggccgtcg ttttacggct aaccttgggc tgtagatc 38

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

gtcatagctg tttcctgagt gggtcgcaga tacttactcg 40

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 7

tagcggtagg acgttcaggt ca 22

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

acttcttgcc agcgactaca ggttttagag ctagaaatag caagtt 46

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 9

ctgtagtcgc tggcaagaag taacagtata ccctgccggt g 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 10

ataagaatgc ggccgcgtcg ggaggtataa caaacgaga 39

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 11

ggcggttaat taacaatagt cgtggcataa gaacagc 37

Claims

1.细胞周期蛋白Cbc1在制备药物中的用途，所述药物能够治疗新生隐球菌引发的疾病，

所述细胞周期蛋白Cbc1如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

所述细胞周期蛋白Cbc1为所述药物的作用靶点；

所述药物能够使得所述细胞周期蛋白Cbc1的蛋白表达量降低。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细胞周期蛋白Cbc1的编码序列为SEQID NO:1所示的核酸序列。

3.一种筛选药物的方法，其特征在于，所述药物用于治疗新生隐球菌引发的疾病，所述方法包括：

将候选药物施用于重组细胞，所述重组细胞能够用来治疗隐球菌引发的疾病，所述重组细胞具有表达载体，所述表达载体包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

筛选使得所述重组细胞的细胞周期蛋白Cbc1的表达量降低的药物，作为用于治疗新生隐球菌引发疾病的药物。