CN113423729A - 能够在体内进行糖工程化的重组aav病毒载体的组合物和产生 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种表达载体(例如，AAV载体)，所述表达载体包括对以下进行编码的核酸序列：(1)抗体的重链和/或轻链；以及(2)一个或多个靶向岩藻糖基转移酶‑8(FUT8)的shRNA序列。

Description

能够在体内进行糖工程化的重组AAV病毒载体的组合物和 产生
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年11月6日提交的美国临时专利申请第62/756,233号的权益，所述美国临时专利申请的整个内容通过引用完全并入本文。
通过引用并入电子提交的材料
本申请含有作为本公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名：53652_Seqlisting.txt；大小：26,417字节，创建于：2019年11月6日)，所述申请通过引用以其整体并入。
联邦政府资助的研究的声明
本发明是在由美国国家过敏和传染病研究所(National Institute of Allergyand Infectious Disease)(NIAID)授予的授权号R01 AI098446下由政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开涉及一种物质的新颖组合物以及一种制造能够在体内对蛋白质进行糖工程化的重组AAV病毒载体的方法。
背景技术
人IgG的恒定结构域含有位于天冬酰胺-297处的单个N-连接寡糖。在此位点处在碳水化合物上不存在岩藻糖可能对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性产生巨大影响。已示出相比于岩藻糖基化抗体，非岩藻糖基化抗体可将ADCC活性提高10-100倍。这些发现引起了治疗性抗体领域的极大关注。临床试验中已经存在癌症的几种治疗性抗体的经糖工程化的版本。当前的糖工程化技术不适用于使用如腺相关病毒载体等病毒载体的抗体产生方法。
发明内容
本公开提供了一种在体内对重组腺相关病毒(AAV)载体进行糖工程化的方法。具体地，本公开涉及一种物质的新颖组合物和一种制造能够在体内被糖工程化的重组AAV病毒载体的方法。
本公开提供了一种表达载体，所述表达载体包括对以下进行编码的核酸序列：(1)抗体的重链和/或轻链；以及(2)一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的shRNA序列。
本公开还提供了一种组合物，所述组合物包括：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的表达载体；以及(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的表达载体，其中(a)、(b)或(a)和(b)进一步包括一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的shRNA序列。
本公开进一步提供了一种在体内产生抗体的方法，所述方法包括向受试者递送以下：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的核酸；(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的核酸；以及(c)靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的抑制性RNA。
附图说明
图1：FUT8 KO细胞系的生成.使用靶向FUT8和CAS9/GFP表达质粒的三个gRNA对HEK293T细胞进行转染。用Ab 10-1074表达质粒对从细胞分选中分离出的FUT8 KO克隆中的四个和HEK293T野生型对照进行转染。另外4天之后，收获上清液并进行过滤以去除细胞碎屑。通过蛋白A柱对IgG进行纯化，并且使3μg在4-12％bris-tris凝胶上进行电泳，一式两份。转染之后，用抗IgG-HRP对一个膜进行染色，并且用AAL-HRP凝集素对另一个进行探测，以使α1-6岩藻糖的存在可视化。
图2A-2D：FUT8 shRNA和糖工程化AAV(GE-AAV)构建体的克隆策略.针对在人与恒河猴FUT8之间同源性>99％的FUT8的区选择五个候选shRNA(shRNA 52[TRCN0000035952]、shRNA 53[TRCN0000035953]、shRNA 59[TRCN0000229959]、shRNA 60[TRCN0000229960]和shRNA 61[TRCN0000229961])。图2A)将候选shRNA(大写)与恒河猴FUT8(小写)进行比对，以证明同源性。仅shRNA 61与恒河猴FUT8序列具有一个碱基对差异。图2B)用具有每个候选shRNA的pLKO.1表达载体对HEK293T细胞进行了转染。24小时之后，收获细胞，并且通过实时PCR针对FUT8 mRNA表达对其进行了分析。数据以相比于野生型HEK-293T细胞的敲低百分比呈现。图2C)描绘了GE-AAV敲低构建体的设计的图表。所描绘的poly A是由AAV表达的IgG的poly A尾部。使用了U6、H1和7SK启动子来驱动单独shRNA的表达。在构建体之间调整间隔子大小以最大化敲低，同时维持最大IgG表达。使用多个pol III启动子对构建体进行了设计，每个pol III启动子驱动单独短发夹RNA(s)hRNA。注意间隔子序列的长度。图2D)描绘了将FUT8敲低构建体克隆到AAV载体中的图表。将构建体***poly A尾部下游以及3'ITR上游。
图3A-3B：通过GE-AAV构建体进行的FUT8敲低验证.用含有图2中概述的shRNA构建体的AAV载体质粒的质粒DNA对HEK293T细胞进行了转染。图3A)24小时之后，收获细胞，并且通过实时PCR针对FUT8 mRNA对其进行了分析。数据以相比于野生型HEK-293T细胞的敲低百分比呈现。图3B)用于检测4L6抗体的岩藻糖含量的AAL凝集素蛋白质印记。用表达4L6抗体的具有或不具有FUT8 shRNA构建体的GE-AAV载体对HEK293T野生型对照进行了转染。18小时之后，洗涤细胞并将其转移到无血清培养基中，持续另外3天。吸出培养基并替换为新鲜无血清培养基，以消除在FUT8完全敲低之前产生的IgG。在第7天，收获上清液并进行过滤以去除细胞碎屑。使用蛋白A柱对IgG进行纯化，并且在4-12％bris-tris凝胶上对3μg进行分析，一式两份。转染之后，用抗IgG-HRP对一个膜进行染色，并且用AAL-HRP凝集素对另一个进行探测，以使α1-6岩藻糖的存在可视化。将在泳道2-5中敲低的岩藻糖与在shRNA不存在的情况下产生的4L6抗体(泳道1)进行比较。
图4：shRNA构建体ADCC活性验证.用慢病毒表达构建体2、5和6将HEK293T细胞转导。慢病毒还表达了GFP标签以及可选择嘌呤霉素抗性基因。转导后48小时，将嘌呤霉素添加到细胞培养基中，并且允许选择经阳性转导的细胞。持续另外2周，逐渐增加嘌呤霉素浓度以选择高表达细胞群。将10-1074IgG1表达质粒转染成野生型HEK293T细胞、FUT8敲除细胞系和经慢病毒转导的HEK293T细胞系表达构建体2、5或6。通过蛋白A柱对Ab 10-1074进行纯化并定量。虚线表明对HIV AD8感染的靶细胞的50％RLU(相对光单位)或50％ADCC活性。RLU的损失表明在CD16+NK细胞系存在以及对抗体连续稀释的情况下，病毒感染的细胞在8小时的孵育时间段期间的损失。RLU的损失表示高ADCC活性。由于经纯化的IgG上完全缺乏岩藻糖，因此包含了Ab 10-1074FUT8作为阳性对照。
图5A-5D：缺乏岩藻糖的普通Ab 10-1074Fc变体的ADCC.在HEK293T细胞和FUT8 KO细胞系中产生呈野生型IgG、LS突变体、LALA突变体或LALA突变和LS突变的组合形式的Ab10-1074。通过蛋白A柱对抗体进行了纯化。图5A)将3μg IgG加载到4-12％bis-tris凝胶上，一式两份。对一份进行处理以用于考马斯染色(Coomassie staining)，用AAL凝集素对第二份进行探测，以监测α(1-6)岩藻糖的存在。图5B)SF162 gp140三聚体结合ELISA.开始于1μg/ml的抗体浓度，接着3倍连续稀释，培育10-1074变体以用于对SF162 gp140三聚体进行ELISA测定。高吸光度表明高结合。图5C)AD8与开始于1μg/ml的10-1074IgG1的中和曲线。虚线表明50％RLU(相对光照单位)，这表示对HIV的AD8菌株的50％中和活性。最低RLU表明最高中和。图5D)对10-1074变体的ADCC活性进行了测试。虚线表明对HIV AD8感染的靶细胞的50％RLU(相对光单位)或50％ADCC活性。在人CD16+NK细胞系存在以及对抗体连续稀释的情况下，通过HIV感染的细胞在8小时培育之后的荧光素酶活性对ADCC进行了测量。RLU的损失表明病毒感染的细胞在8小时培育时间段期间的损失，并且代表高ADCC活性。
图6A-6D：缺乏岩藻糖的普通3BNC117 Fc变体的ADCC.在HEK293T细胞和FUT8 KO细胞系中制成了呈野生型IgG、LS突变体、LALA突变体或LALA突变和LS突变的组合形式的Ab3BNC117。通过蛋白A柱对抗体进行了纯化。图6A)将3μg IgG加载到4-12％bis-tris凝胶上，一式两份。对一份凝胶进行处理以用于考马斯染色，转移第二份并且用AAL凝集素进行探测，以监测α(1-6)岩藻糖的存在。图6B)SF162 gp140三聚体结合ELISA.开始于1μg/ml的抗体浓度，接着3倍连续稀释，培育3BNC117变体以用于对SF162 gp140三聚体进行ELISA测定。高吸光度表明高结合。图6C)AD8与起始于1μg/ml的3BNC117 IgG1的中和曲线.虚线表明50％RLU(相对光照单位)，这表示对HIV的AD8菌株的50％中和活性。最低RLU表明最高中和。图6D)对3BNC117变体的ADCC活性进行了测试。虚线表明对HIV AD8感染的靶细胞的50％RLU(相对光单位)或50％ADCC活性。在人CD16+NK细胞系存在以及对抗体连续稀释的情况下，通过HIV感染的细胞在8小时培育之后的荧光素酶活性对ADCC进行了测量。RLU的损失表明病毒感染的细胞在8小时培育时间段期间的损失，并且代表高ADCC活性。
图7A-7D：通过将FUT8去除与Fc突变组合得到的Ab 10-1074和Ab 3BNC117 ADCC增强.在HEK293T细胞和FUT8 KO细胞中产生了Ab 10-1074和Ab 3BNC117。图7A和7B)还用S239突变(S239D/I332F/A330L)制成了抗体。图7C和7D)还在HEK293T和FUT8 KO细胞两者中对每个重链上存在不同突变的不对称抗体进行了测试。测试的变体是W117(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/Y296W的第二重链)、W187(包括包含突变K392D/K409D/S239D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)、W141(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)、W144(包括包含突变K392D/K409D/A330F/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)和W125(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变W125BE356K/D399K/K290Y/Y296W的第二重链)。对于不对称抗体，对每条重链的相等量的质粒进行共转染，从而允许杂交抗体形成。对变体的ADCC活性进行测试。虚线表明对HIV AD8感染的靶细胞的50％RLU(相对光单位)或50％ADCC活性。在人CD16+NK细胞系存在以及对抗体连续稀释的情况下，通过HIV感染的细胞在8小时培育之后的荧光素酶活性对ADCC进行了测量。RLU的损失表明病毒感染的细胞在8小时培育时间段期间的损失，并且代表高ADCC活性。图7A)10-1074IgG1变体ADCC测定.图7B)3BNC117 IgG1变体ADCC测定.图7C)10-1074不对称IgG1变体ADCC测定.图7D)3BNC117不对称IgG1变体ADCC测定.
具体实施方式
本公开涉及一种物质的新颖组合物和一种使用能够在体内进行糖工程化的重组AAV病毒载体制造的方法。
尽管AAV递送的IgG取得了有希望的成功，但对于递送的抗体的优化仍有空间。治疗性抗体通常用于癌症治疗。3-6为了最大化癌症治疗的功效，修改Fc结构并修改IgG的聚糖含量增加了抗体Fc结合和效应子功能。在这些方法中，糖工程化是迄今为止对调节ADCC最有效的方法之一。IgG含有位于asn-297处的单个N连接的寡糖。此asn-297在第一N-乙酰葡糖胺上含有任选α1-6岩藻糖残基。效应子功能的急剧增加与去除asn-297处的α1-6岩藻糖，从而导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的增强相关联，这是抗癌治疗性抗体的关键机制。当制成了呈非岩藻糖基化形式的抗CD20 IgG1(利妥昔单抗(rituximab))时，观察到B细胞耗竭活性增加了100倍并且FcγRIIIA结合的亲和力更高。11需要低得多的抗体浓度来实现相同临床功效。
糖工程化在治疗HIV方面具有巨大潜力。高水平的ADCC与延缓的进展、更好的病毒对照和更低的病毒设置点相关联。16-18糖工程化已在增强抗HIV抗体方面取得成功。当在缺少岩藻糖基化的情况下产生b12时，观察到与野生型b12相比高10倍的病毒抑制。19ADCC也表明在清除再活化的潜伏HIV-1贮库方面是有效的。这些发现表明，糖工程化可以是对HIV的功能性治愈的研究中所追求的重要途径。
本公开提供了用于对在体内产生的抗体进行糖工程化的材料和方法。在一方面，所述材料和方法采用靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)，优选地人FUT8(以及任选地恒河猴FUT8)的抑制性寡核苷酸。岩藻糖基转移酶-8(FUT8)基因对α-(1,6)-岩藻糖转移酶进行编码，这催化了岩藻糖从GDP-岩藻糖转换为N-连接型复杂糖肽。人FUT8的核苷酸序列以SEQID NO:1提供，并且氨基酸序列以SEQ ID NO:2提供。使用一个或多个抑制性寡核苷酸以减少与对抗体进行编码的表达载体相连接的表达(即“敲低”)FUT8，在体内产生具有改变的糖基化模式的导致ADCC活性增强的抗体。
在各个实施例中，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体包括对以下进行编码的核酸序列：(1)抗体的重链和/或轻链；以及(2)一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的抑制性寡核苷酸序列(例如，抑制性RNA序列，如shRNA序列)。在各个方面，所述表达载体对抗体的重链和轻链两者进行编码。在各个方面，所述表达载体对抗体的重链和/或轻链进行编码并且与抑制性寡核苷酸(例如，抑制性RNA，如shRNA)组合在组合物中，任选地组合在靶向FUT8的单独表达载体上。
在某些实施例中，抑制性寡核苷酸是反义寡核苷酸、抑制性RNA(包含siRNA、或RNAi或shRNA)、DNA酶、核酶(任选地锤头状核酶)或适体。在一个实施例中，寡核苷酸与SEQID NO:1的核苷酸序列的至少10个碱基互补。
用于设计抑制性寡核苷酸的特定序列可以是靶标的所表达基因消息内含有的核苷酸的任何连续序列。支配抑制性寡核苷酸序列的靶位点的因素包含寡核苷酸的长度、结合亲和力和靶序列的可及性。可以使用任何合适的方法，包含以下描述的方法，在体外针对序列的抑制性活性的效能对序列进行筛选。通常已知的是，可以使用反义寡核苷酸来靶向RNA的大多数区(5'和3'非翻译区、AUG起始、编码、剪接点和内含子)。可以使用本领域已知的程序和算法来选择适当的靶序列。另外，可以利用被设计成预测指定单链核酸序列的二级结构的程序并且允许选择可能出现在折叠mRNA的暴露的单链区中的那些序列来选择最优序列。用于设计适当的寡核苷酸的方法和组合物可以在例如美国专利第6,251,588号中找到，所述美国专利的内容通过引用以其整体并入本文。
在抑制性RNA中，shRNA在沉默寿命和递送选项方面提供了优势。参见，例如，Hannon等人,《自然(Nature)》,431:371-378(2004)以供审查。已经报道了产生shRNA的被细胞内处理成具有siRNA样性质的短双链体RNA的载体(Brummelkamp等人,《科学(Science)》,296:550-553(2000)；Paddison等人,《基因与发育(Genes Dev.)》,16:948-958(2002))。可以在左手发夹(即5'-反义-环-有义-3')或右手发夹(即5'-有义-环-反义-3')中组织发夹。RNA还可以含有位于有义链或反义链的5'端或3'端处的突出端，这取决于发夹的组织。突出端可以是未经修饰的，或者可以含有：一种或多种特异性或稳定修饰，如2'位置的卤素或O-烷基修饰；或核苷酸间修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯修饰。突出端可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸或核糖核酸和脱氧核糖核酸的组合。
另外，发夹还可以进一步包括位于最靠近5'的核苷酸上的磷酸酯基团。最靠近5'的核苷酸的磷酸化是指存在于5'末端核苷酸的糖部分的5'碳连接的一个或多个磷酸酯基团。优选地，在Dicer处理后在将形成反义链的区的5'端上存在仅一个磷酸酯基团。在一个示例性实施例中，右手发夹可以包含不具有5'磷酸酯基团的5'端(即，有义区的游离5'端)，或者可以具有以防止磷酸化的此方式被修改的有义区的游离最靠近5'的核苷酸的5'碳。这可以通过多种方法实现，包含但不限于添加磷酸化阻断基团(例如，5'-O-烷基)或消除5'-OH功能基团(例如，最靠近5'的核苷酸是5'脱氧核苷酸)。在发夹是左手发夹的情况下，优选地最靠近5'的核苷酸的5'碳位置被磷酸化。
可以通过Dicer对茎长度长于26个碱基对的发夹进行处理，使得一些部分不是所产生的siRNA的促进mRNA降解的一部分。因此，可以包括有义核苷酸的第一区和可以包括反义核苷酸的第二区也可以含有互补的(或至少基本上彼此互补的)，但是与靶mRNA相同或不同或互补或不互补的核苷酸的段。尽管shRNA的茎可以由不包含突出端的互补或部分互补的反义和有义链构成，但shRNA还可以包含以下：(1)分子的位于最终Dicer切削位点远端的部分含有与靶mRNA基本上互补/同源的区；以及(2)茎的位于Dicer切削位点近端的区(即，与环相邻的区)与靶mRNA无关或仅部分相关(例如，互补/同源)。此第二区的核苷酸含量可以基于许多参数来选择，包含但不限于热力学性状或概况。
经修饰的shRNA可以保留经后Dicer处理的双链体中的修饰。在示例性实施例中，在发夹是含有位于分子的3'端上的2-6个核苷酸突出端的右手发夹(例如，5'-S-环-AS-3')的情况下，可以在发夹的5'端处的位置2、位置1和2或位置1、2和3处向核苷酸添加2'-O-甲基修饰。同样，具有此配置的发夹的Dicer处理可以使有义链的5'端保持完整，从而在经后Dicer处理的双链体中保留化学修饰的模式。在此配置中存在3'突出端可能是特别有利的，因为可以通过Dicer，以去除携带2'修饰的核苷酸的方式对含有规定的修饰模式的平端分子进行进一步处理。在存在/保留3'突出端的情况下，携带经有义修饰的核苷酸的所产生的双链体相对于沉默特异性和功能性可能具有高度有利的性状。
shRNA可以包括随机或根据任何合理的设计选择程序选择的序列。例如，合理设计算法在国际专利公开第WO 2004/045543号和美国专利公开第20050255487号中进行了描述，所述专利公开的公开内容通过引用以其整体并入本文。另外，可能期望的是全部或部分地基于平均内部稳定性概况(“AISP”)或区域内部稳定性概况(“RISP”)来选择序列，这可以促进细胞机器的访问或处理。
在本公开的各个方面，使用包括SEQ ID NOs:3-7中的任一个的核酸序列的shRNA。在此方面，本公开提供了一种包括靶向FUT8的一个或多个shRNA核酸序列的表达载体。例如，本公开提供了一种如下表达载体：包括shRNA59的核酸序列(例如，包括SEQ ID NO:10的序列)；包括shRNA59的核酸序列和对shRNA53进行编码的核酸序列(例如，包括SEQ ID NO:8和11的序列)；或包括shRNA59的核酸序列、对shRNA53进行编码的核酸序列和对shRNA52进行编码的核酸序列(例如，包括SEQ ID NO:9、12或13的序列)，所述核酸序列中的每一个任选地与单独启动子可操作地连接。示例性构建体在图2C中展示。
“载体”或“表达载体”是包括用于引入到宿主细胞中的核酸(DNA或RNA)的任何类型的遗传构建体。在各个实施例中，表达载体是病毒载体，即包括全部或部分病毒基因组的病毒颗粒，其可以用作核酸递送媒剂。包括对所关注的基因产物进行编码的一个或多个外源核酸的病毒载体也被称为重组病毒载体。如本领域将理解的，在一些上下文中，术语“病毒载体”(和类似术语)可以用来指代没有病毒衣壳的载体基因组。在本公开的上下文中使用的病毒载体包含，例如，逆转录病毒载体、基于单纯性疱疹病毒(HSV)的载体、基于细小病毒的载体，例如，基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体。这些病毒载体中的任一种可以使用在以下中描述的标准重组DNA技术来制备：例如Sambrook等人,《分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)》,第2版,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.),(1989)；Ausubel等人,《分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》,格林出版协会(Greene Publishing Associates)与约翰威立国际出版公司(John Wiley&Sons),纽约州纽约市(New York,N.Y.),(1994)；Coen D.M,《病毒学中动物病毒的分子遗传学(Molecular Genetics of Animal Viruses in Virology)》,第2版,B.N.Fields(编辑),雷文出版社(Raven Press),纽约(1990)和其中引用的参考文献。
在本文所述的任何实施例中，表达载体任选地是腺相关病毒(AAV)载体。AAV是尚不知道可引起人类疾病的DNA病毒，使其成为理想的基因治疗选择。AAV基因组由两个基因rep和cap构成，两侧是含有用于DNA复制和病毒包装的识别信号的反向末端重复序列(ITR)。但用于施用治疗性核酸的AAV载体的大部分亲本基因组通常缺失，使得仅保留ITR，但这不是必需的。如此，来自AAV载体的治疗因子的经延长的表达可以用于治疗持续性和慢性疾病。AAV载体任选地基于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包含3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型或AAV 11型。AAV的基因组序列，以及ITR、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。参见，例如，国际专利公开第WO 00/28061号、第WO 99/61601号、第WO 98/11244号；以及美国专利第6,156,303号，Srivistava等人(1983)《病毒学杂志(J Virol.)》45:555；Chiorini等人(1998)《病毒学杂志》71:6823；Xiao等人(1999)《病毒学杂志》73:3994；Shade等人(1986)《病毒学杂志》58:921；以及Gao等人(2002)《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》99:11854。
表达载体通常含有可操作地连接的编码序列的转录和翻译所需要的多种核酸序列。例如，表达载体可以包括复制起始点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等。本公开的载体优选地包括与所关注的编码序列(例如，对抗体的重链和/或轻链进行编码的核酸序列)可操作地连接的启动子。“可操作地连接”意味着如启动子等控制序列相对于另一个核酸序列处于正确的位置和朝向，以发挥其对核酸序列的作用(例如，转录的启动)。启动子对于其可操作地连接的核酸序列可以是天然或非天然的，并且对于特定靶细胞类型可以是天然或非天然的，并且在各个方面，启动子可以是构成性启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子(例如，包括Tet开/关元件的启动子***、RU486诱导型启动子或雷帕霉素诱导型启动子)。在各个方面，提供了包括对shRNA进行编码的核酸序列的表达载体，所述核酸序列与Pol III启动子，如III U6、7SK或H1启动子可操作地连接。在某些实施例中，表达载体是pLKO.1。
任选地，对病毒外壳或衣壳(即，颗粒表面)进行修饰以调节病毒嗜性。例如，可以将一种血清型病毒的基因组包装到不同血清型病毒的衣壳中，以例如逃避免疫应答。可替代地(或另外)，可以对衣壳的组分进行修饰，以例如扩增由所产生的载体转导的细胞的类型，避免(全部或部分地)不期望的细胞类型的转导，或提高所期望的细胞类型的转导效率。例如，转导效率通常是通过参考对照(即未经修饰的、匹配的病毒载体)确定的。转导效率的提高可能导致，例如，给定细胞类型的转导率至少约25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％的提高。如果期望，可以对衣壳进行修饰，使得其不能有效地转导非靶组织，如肝或胚细胞(例如，所期望的一种或多种靶组织的转导水平的50％或更低、30％或更低、20％或更低、10％或更低、5％或更低)。
在各个方面，所述表达载体包括对抗体的重链和/或轻链进行编码的核酸序列。在各个方面，所述表达载体对重链和轻链两者进行编码。本公开不依赖于特定抗体或编码核酸序列。任选地，重链包括位于Fc区的增强抗体依赖性细胞毒性的一个或多个突变。例如，在各个方面，重链包括一个或多个选自以下的突变：LS突变(M428L/N434S)、LALA突变(L234A、L235A)、S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)、C6A-74突变(V259I/N315D/N434Y)、HN突变(H433K/N434F)、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/Y296W、K392D/K409D/S239D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330F/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W)、K392D/K409D/A330M/K334V和/或E356K/D399K/K290Y/Y296W。在各个实施例中，使用了对不同重链(即，第一重链和第二重链)进行编码的表达载体，其中所述第一重链和所述第二重链包括不同突变(即，在每个重链上存在不同突变的不对称抗体)。例如，在各个方面，重链包括一个或多个选自以下的变体：W117(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/Y296W的第二重链)、W187(包括包含突变K392D/K409D/S239D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)、W141(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)、W144(包括包含突变K392D/K409D/A330F/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)和W125(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变W125B E356K/D399K/K290Y/Y296W的第二重链)。如实例中所证明的，Fc突变与如本文所述的糖工程化的组合提供了令人惊讶的ADCC活性增强。
本公开提供了一种组合物，所述组合物包括：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的表达载体；以及(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的表达载体，其中(a)、(b)或(a)和(b)进一步包括一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的shRNA序列。可替代地，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的表达载体；(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的表达载体；以及(c)包括一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的shRNA序列的表达载体(例如，本文所述和图2C中所展示的表达载体)。在各个方面，表达载体是腺相关病毒(AAV)载体。任选地，抗体重链包括位于Fc区中的增强抗体依赖性细胞毒性的一个或多个突变，如LS突变(M428L/N434S)、LALA突变(L234A、L235A)、S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)、C6A-74突变(V259I/N315D/N434Y)、HN突变(H433K/N434F)、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/Y296W、K392D/K409D/S239D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330F/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W)、K392D/K409D/A330M/K334V和/或E356K/D399K/K290Y/Y296W。在各个实施例中，使用了对不同重链(即，第一重链和第二重链)进行编码的表达载体，其中所述第一重链和所述第二重链包括位于每个重链上的不同突变(即，在每个重链上存在不同突变的不对称抗体)。在各个方面，第一或第二重链上的突变可以互换。例如，在各个方面，重链包括一个或多个选自以下的变体：W117(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/Y296W的第二重链)、W187(包括包含突变K392D/K409D/S239D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)、W141(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)、W144(包括包含突变K392D/K409D/A330F/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)和W125(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变W125B E356K/D399K/K290Y/Y296W的第二重链)。
本公开进一步提供了一种在体内产生抗体的方法，所述方法包括向受试者递送表达载体，所述表达载体包括对以下进行编码的核酸序列：(1)抗体的重链和/或轻链；以及(2)一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的抑制性寡核苷酸序列(例如，抑制性RNA序列，如shRNA序列)。在各个方面，所述表达载体对抗体的重链和轻链两者进行编码。
另外，本公开提供了一种在体内产生抗体的方法，所述方法包括向受试者递送组合物，所述组合物包括：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的表达载体；以及(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的表达载体，其中(a)、(b)或(a)和(b)进一步包括一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的抑制性寡核苷酸(例如，shRNA序列)。可替代地，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的表达载体；(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的表达载体；以及(c)包括一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的抑制性寡核苷酸(例如，shRNA序列)(例如，本文所述和图2C中所展示的表达载体)。
在各个方面，本公开提供了一种在体内产生抗体的方法，所述方法包括向受试者递送以下：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的核酸；(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的核酸；以及(c)靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的抑制性寡核苷酸。(a)、(b)和(c)中的核酸任选地独立地存在于相同或不同表达载体(即，(a)和(b)可以位于相同的载体上；(a)和(c)可以位于相同载体上；(b)和(c)可以位于相同载体上；(a)、(b)和(c)可以各自位于不同的体上等)。在各个实施例中，表达载体是AAV载体。进一步地，如上所述，一个或多个重链任选地包括位于Fc区中的增强抗体依赖性细胞毒性的一个或多个突变，如LS突变(M428L/N434S)、LALA突变(L234A、L235A)和/或S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)、C6A-74突变(V259I/N315D/N434Y)、HN突变(H433K/N434F)、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/Y296W、K392D/K409D/S239D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330F/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W)、K392D/K409D/A330M/K334V和/或E356K/D399K/K290Y/Y296W。在各个实施例中，使用了对不同重链进行编码的表达载体，在所述表达载体中存在第一重链和第二重链，所述第一重链和所述第二重链包括位于每个重链上的不同突变(即，在抗体的每个重链上存在不同突变的不对称抗体)。例如，在各个方面，重链包括一个或多个选自以下的变体：W117(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/Y296W的第二重链)、W187(包括包含突变K392D/K409D/S239D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)、W141(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)、W144(包括包含突变K392D/K409D/A330F/K334V的第一重链和包含突变E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W的第二重链)和W125(包括包含突变K392D/K409D/A330M/K334V的第一重链和包含突变W125B E356K/D399K/K290Y/Y296W的第二重链)。进一步地，抑制性寡核苷酸任选地是shRNA，如包括SEQ ID NO:3-7中的人一个的核酸序列的shRNA。在此方面上，所述方法任选地包括施用包括选自SEQ ID NO:3-7的不同序列的多个shRNA，所述不同序列可以存在于相同或不同表达载体上。
“受试者”可以是任何哺乳动物，如人。设想的哺乳动物受试者包含但不限于：具有农业重要性的动物，如牛、马和猪动物；用作家养宠物的动物，包含犬科和猫科；以及通常用于研究的动物，包含啮齿动物和灵长类动物。
在各个方面，表达载体在包括生理学上可接受的(即，药理学上可接受的)载体、缓冲液、赋形剂或稀释剂的组合物(例如，药物组合物)中提供。可以使用在本公开的上下文内的任何合适的生理学上可接受的(例如，药学上可接受的)载体，并且此类载体是本领域众所周知的。载体的选择将部分地通过要施用组合物的特定位点和用于施用组合物的特定方法来确定。组合物还可以包括促进将表达载体摄取到宿主细胞中的药剂。合适的组合物调配物包含水性和非水性溶液、可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂的等渗无菌溶液和使调配物与血液等渗的溶质以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。组合物可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶，并且可以在立即使用之前仅需要添加无菌液体载体，例如水的冷冻干燥(冻干)条件下储存。一方面，包括本文所述的表达载体中的任何一种或多种的组合物，连同提供关于所述组合物的用途的说明书的包装材料一起放置在容器内。通常，此类说明包含描述试剂浓度的有形表达，以及在某些实施例中，重组组合物可能需要的赋形剂成分或稀释剂(例如，水、盐水或PBS)的相对量。
一种或多种表达载体(例如，一种或多种病毒颗粒)以足以产生经糖工程化的抗体的量并且在足以产生经糖工程化的抗体的位置处施用，并且在各种实施例中，为受试者提供一些改善或益处。根据情况，将包括一种或多种表达载体的组合物施用或滴入到体腔中、直接施用到靶组织和/或引入到循环中。例如，在各种情况下，将期望的是通过静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下方式递送包括表达载体的组合物。
针对特定受试者的特定施用方案将部分地取决于所施用的载体的量、施用途径以及任何副作用的原因和程度。根据本公开的施用于受试者(例如，哺乳动物，如人)的量应该足以在合理的时间框架内产生期望的抗体。基因组当量滴度的病毒颗粒的示例性剂量为104-1015个转导单位(例如，107-1012个转导单位)或至少约105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个或1015个转导单位或更多个(例如，至少约107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个或1014个转导单位，如约1010个或1012个转导单位)。
如本文所述，设计并测试了靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的shRNA——负责IgG上的在asn-297处的岩藻糖基化的糖基转移酶。通过实时PCR展示出充分敲低的shRNA克隆被克隆到用于递送HIV特异性广泛中和抗体的同一AAV载体上。对通过经糖工程化的AAV(GE-AAV)载体生成的抗体进行了纯化并且针对岩藻糖含量、中和、三聚体结合和ADCC进行了分析。
总结：1)AAV载体可以被工程化，以有效表达shRNA；2)优选的(但不是必须的)是75b.p.或更大的间隔子长度来有效表达包含的所有shRNA；3)通过GE-AAV构建体产生的抗体仅具有低水平的可检测的α1-6岩藻糖；4)尽管中和或三聚体结合中未观察到差异，但是通过GE-AAV构建体产生的抗体的ADCC活性高10-100倍，这取决于所测试的抗体；5)可以与其它形式的糖工程化和Fc突变组合，以进一步增强ADCC；并且6)将在慢性感染有SHIV-AD8的猕猴体内对治疗作用进行测试。
虽然已经展示了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其进行各种修改和改变，如在下文中所附权利要求中所定义的。
本公开的另外的方面和细节将根据以下实例而变得显而易见，所述实例旨在是说明性而非限制性的。
实例
一般方法
gRNA生成.针对FUT8(基因ID：2530)生成导向RNA(gRNA)(圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruz Biotechnology))。使用GeCKO v2人类文库确定了靶序列。使用了FUT8的三个gRNA，以靶向DNA的两个链，以确保完全敲除(KO)了所关注的基因。gRNA被克隆到具有GFP标签的表达载体中，以允许进行单细胞GFP分选。
FUT8 CRISPR/Cas9 KO gRNA：
1：ACGCGTACTCTTCCTATAGC(SEQ ID NO:14)
2：ATTGATCAGGGGCCAGCTAT(SEQ ID NO:15)
3：TACTACCTCAGTCAGACAGA(SEQ ID NO:16)
细胞系生成.使用JetPrime转染试剂(Polyplus-Transfection公司)用人FUT8的三个gRNA对HEK293T细胞(ATCC)进行了转染。在转染后24小时，使用Zeiss Axio ObserverA1显微镜通过GFP荧光显微镜检查对细胞进行了检查，以对下游流式细胞分析和细胞分选所需的足够表达水平进行计量。显微镜检查之后，收获细胞，在PBS中对其进行洗涤，并且将其重悬于具有1mM EDTA的DMEM中以防止细胞聚集物形成。在具有自动细胞沉积单元(ACDU)的5激光17色BD FACS SORP Aria-IIu上分选细胞。将前20％的GFP表达细胞单独分选到96孔板中。使用了FSC-W×FSC-A以及SSC-W×SSC-A来降低电子对的速率。分选后四小时，检查细胞以确保所有孔仅含有一个细胞。从进一步处理中排除了含有电子对的任何孔。一旦克隆在6孔板中达到汇合，则将细胞裂解在RIPA缓冲液(生命技术公司(Life Technologies))中并用于蛋白质印迹分析。
用于确认FUT8 CRISPR敲除的蛋白质印记.选择了四个FUT8 KO克隆以用于进一步筛选。使用JetPrime转染试剂(Polyplus-Transfection公司)用10-1074单克隆抗体表达质粒对HEK293T野生型对照和四个FUT8 KO克隆进行了转染。18小时后，将细胞用BIO-MPM-1无血清培养基(Biological Industries公司)洗涤并转移到BIO-MPM-1无血清培养基中。另外4天之后，收获上清液，并且通过45μm aPES过滤器(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))进行过滤，以去除细胞碎屑。使用HiTrap蛋白A柱(通用电气医疗公司(GEHealthcare))对IgG进行了纯化，并且使3μg在4-12％bris-tris凝胶(生命技术公司)上进行电泳，一式两份。将野生型HEK293T细胞中产生的10-1074抗体加载在第一泳道中作为对照。使用iBlot干式蛋白转印***(生命技术公司)将蛋白质转移到PVDF膜。转染之后，使用iBind蛋白印记***(生命技术公司)用抗-人-IgG-HRP(SouthernBiotech公司)对一个膜进行探测，并且用AAL-HRP凝集素(BioWorld公司)对另一个印记进行探测，以使α1-6岩藻糖的存在可视化。使用SuperSignal Pico底物(赛默飞世尔科技公司)和在ImageQuant LAS4000微型发光图像分析仪(通用电气医疗公司)上捕获的图像来开发膜。
FUT8 shRNA设计.对在人与恒河猴FUT8之间具有非常相同的同源性的人FUT8的区选择五个候选shRNA。将候选shRNA与恒河猴FUT8进行比对，以证明使用连续克隆2-6-1的同源性。将候选shRNA克隆到pLKO.1表达载体中以允许进行转染实验。
FUT8实时PCR.用pLKO.1表达载体对野生型HEK293T细胞进行转染，其中每个候选shRNA、GE-AAV载体质粒和GFP表达载体在指示时使用JetPrime转染试剂(Polyplus转染)。24小时会后，收获细胞并用PBS洗涤。使用TaqMan基因表达测定HS00189535_m1(生命技术公司)和Cells-to-CT 1-Step TaqMan试剂盒(生命技术公司)根据制造商指定的方案通过实时PCR对FUT8 shRNA表达进行了分析。数据以相比于野生型HEK-293T细胞的敲低百分比呈现。
GE-AAV克隆.使用含有F2A肽和Furin肽的双顺反子表达盒将4L6和10-1074抗体的编码序列克隆到如先前描述的单链AAV(ssAAV)载体中(Fuchs等人,《公共科学图书馆：综合(PLoS ONE)》,11(6):e0158009(2016))。通过Genscript对所有抗体序列进行了密码子优化和合成。
将shRNA构建体构建为包含靶向FUT8的各个区的一个、两个或三个shRNA，以及在单独Pol III启动子的控制下的所有shRNA。使用了Pol III U6、7SK和H1启动子。使用了最强启动子来驱动shRNA的表达，所述表达通过实时PCR展现出最高水平的敲低。将shRNA构建体克隆到含有4L6和10-1074抗体序列的ssAAV载体中。将shRNA构建体***poly A尾部的下游和3'ITR的上游。通过如本文所述是实时PCR测试所有GE-AAV载体的敲低水平。
用于确认FUT8敲低的凝集素蛋白质印记.使用JetPrime转染试剂(Polyplus-Transfection)将表达4L6抗体和FUT8 shRNA敲低构建体的GE-AAV载体瞬时转染到HEK293T细胞中。18小时后，洗涤细胞并且用BIO-MPM-1无血清培养基(Biological Industries公司)替换培养基。另外4天之后，收获上清液，并且通过45μm aPES过滤器(赛默飞世尔科技公司)进行过滤，以去除细胞碎屑。使用HiTrap蛋白A柱(通用电气医疗公司)对IgG进行了纯化，并且使3μg在4-12％bris-tris凝胶(生命技术公司)上进行电泳，一式两份。将野生型HEK293T细胞中产生的4L6抗体加载在第一泳道中作为对照。使用iBlot干式蛋白转印***(生命技术公司)将蛋白质转移到PVDF膜。转染之后，使用iBind蛋白印记***(生命技术公司)用抗-人-IgG-HRP(SouthernBiotech公司)对一个膜进行探测，并且用AAL-HRP凝集素(BioWorld公司)对另一个印记进行探测，以使α1-6岩藻糖的存在可视化。使用RIPA缓冲液(生命技术公司)阻断、探测并洗涤凝集素印迹。使用SuperSignal Pico底物(赛默飞世尔科技公司)和在ImageQuant LAS 4000微型发光图像分析仪(通用电气医疗公司)上捕获的图像来开发膜。
shRNA敲低细胞系.将shRNA构建体2、5和6克隆到pGFP-C-shLenti慢病毒载体中。根据制造商指定的方案，使用Lenti-vpak包装试剂盒(Origene公司)包装慢病毒。在转导前一天以细胞在转导当天将达到约70％汇合的密度将HEK293T细胞铺板在6孔板中。将1ml收获的病毒上清液与HEK293T细胞一起培育48小时，然后添加1μg/ml嘌呤霉素(生命技术公司)。在第一周之后将嘌呤霉素剂量逐步升高到2μg/ml，并且在第2周之后逐步升高到4μg/ml，以选择经良好转导的细胞。针对相比于HEK293T野生型对照细胞的GFP表达，通过流式细胞术对shRNA构建体表达进行监测。
gp140 ELISA.通过ELISA对10-1074和3BNC117变体结合SF162 gp140三聚体(NIHAIDS Reagent Program公司)的能力进行了测试。在4℃下在PBS中用重组SF162 gp140对高结合ELISA板涂覆过夜。使用PBS-Tween20(西格玛奥德里奇有限公司(Sigma-Aldrich))对板进行洗涤，并且随后用含5％脱脂乳粉的PBS(伯乐公司(Bio-Rad))进行阻断。在封闭缓冲液中以1:3对10-1074和3BNC117变体进行连续稀释并且添加到测试板。在37℃下培育1小时之后，再次对板进行洗涤，并且然后添加经HRP缀合的山羊抗人IgG H+L(SouthernBiotech公司)以用于检测。在37℃下在1小时之后停止反应并将板洗涤10次。随后，添加TMB底物和终止溶液(SouthernBiotech公司)，并在微板阅读仪(珀金埃尔默仪器有限公司(PerkinElmer))中测量450nm下的吸光度。
病毒中和测定.在如先前描述的TZM-bl细胞中执行对HIV-1AD8的中和测定(Alpert等人,《病毒学期刊(Journal of virology)》,86,12039-12052(2012))，每孔使用2ng HIV-1p24。在中和测定前一天，将每孔5,000个TZM-bl细胞铺板在平底96孔细胞结合板中。在与TZM-bl记者细胞组合之前将抗体稀释液和病毒在37℃下培育1小时。3天后使用BriteLitePlus荧光素酶底物(珀金埃尔默仪器有限公司)测量了TZM-bl细胞中的荧光素酶活性。计算了中和50％病毒感染所需的抗体滴度。
ADCC测定.通过先前确立的测定测量ADCC活性，以对NK细胞对表达如先前描述的荧光素酶的病毒感染的靶细胞的活性(Alpert等人,《病毒学期刊》,86,12039-12052(2012))进行量化，下面概述了对其的轻微修改。使用200ng p24 HIV-1AD8在圆底12×75mm管中通过脊髓接种(spinoculation)执行感染。在25℃下以1,200×g对病毒和靶细胞进行离心，持续2小时。
在圆底96孔板中执行ADCC测定，其中每个孔含有最终体积为200μl的104个靶细胞和105效应细胞。在添加到测定板之前将效应细胞立即与经洗涤的靶细胞组合。一式三份执行抗体的四倍连续稀释。一旦将靶标、效应子和经连续稀释的抗体组合，就在37℃下培育测定板，持续8小时。培育8小时之后，将板旋转减慢并从顶部去除100μl培养基。将100μlBriteLite Plus(珀金埃尔默仪器有限公司)添加到每个孔中并通过移液混合。将150μl混合物转移到白色96孔板中。使用Wallac Victor板阅读器(珀金埃尔默仪器有限公司)读取荧光素酶活性。
AAV产生.如先前描述的执行rAAV的产生(Mueller等人,《微生物学方法(Protoc.Microbiol.)》,第14章(2012)单元14D.1)。用rAAV载体质粒和两个辅助质粒对HEK-293细胞进行转染，以允许产生感染性AAV颗粒。在收获经转染的细胞和细胞培养上清液之后，通过三个连续CsCl离心步骤对rAAV进行纯化。通过实时PCR对载体基因组数量进行评估，并且通过电子显微镜检查和经银染色的SDS-PAGE验证制剂的纯度。
AAV体外转导.在转导前1天，将HEK293T细胞接种在6孔细胞结合板(康宁公司(Corning))中的R10培养基中。在AAV转导的当天，细胞达到了约50-70％的汇合，并且用每细胞共计2×104个rAAV颗粒对其进行转染。在有或没有靶向FUT8的shRNA的情况下，用表达3BNC117抗体的AAV对细胞进行转导。在转导到新鲜R10之后24小时更换细胞培养基。另外3天之后，再次将培养基更换为BIO-MPM-1无血清培养基(Biological Industries公司)。每24小时收获500μl上清液，并且用新鲜无血清培养基替换，持续另外4天。通过在16,000RCF和4℃下离心10分钟来澄清上清液。依照如先前描述的标准通过蛋白A/抗恒河猴IgG ELISA使用经纯化的恒河猴IgG对细胞培养上清液中的分泌的3BNC117 IgG1的浓度进行测量(Fuchs等人,《公共科学图书馆：综合》,11(6):e0158009(2016))。通过如本文所述的凝集素蛋白质印迹对相等量的3BNC117抗体的α1-6岩藻糖进行了分析。
实例1：FUT8糖基化缺陷细胞系的生成和验证
将对靶向人FUT8基因的导向RNA(gRNA)进行编码的DNA序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标签的表达载体中。用均靶向FUT8的三个gRNA表达载体对HEK293T细胞进行瞬时转染。在转染后24小时，通过GFP荧光显微镜检查对细胞进行了检查，以对下游流式细胞分析和细胞分选所需的足够表达水平进行计量。使用具有96孔板适配器的FACS Aria II细胞分选仪收集并分选细胞。使用了对前向散射宽度(FSC-W)×前向散射面积(FSC-A)以及侧向散射宽度(SSC-W)×侧向散射面积(SSC-A)的紧密门控来降低电子对的频率(图1A)。对前20％GFP表达内的细胞进行单独分选，从而使96孔板的每孔的单独细胞沉积。分选后五小时，通过共聚焦显微镜检查对孔进行检查以确保孔未收纳多于1个细胞。在确认靶基因的所有拷贝都被破坏之前，允许细胞生长到汇合。
对四个HEK293T-FUT8敲除克隆(FUT8 KO)对人IgG进行岩藻糖基化的能力进行了分析。将对人抗HIV mAb 10-1074进行编码的表达载体瞬时转染到FUT8 KO克隆以及HEK293T亲本细胞系中。转染后五天，使用蛋白A柱对分泌的10-1074进行了亲和纯化。通过蛋白印迹使用IgG探针对经纯化的抗体进行分析，以确保将相等量的蛋白质加载到每个泳道中，并且通过凝集素蛋白印迹使用AAL-HRP凝集素对其进行分析，以检测存在于IgG中α的1-6岩藻糖(图1B)。已知AAL凝集素与可以仅通过FUT8而被添加到生长的N聚糖链的α1-6岩藻糖特异性结合。因此，缺乏α1-6岩藻糖将表明缺乏FUT8酶活性。
尽管在每个泳道中加载了相等量的IgG，但是未检测到在四个FUT8 KO细胞系中产生的IgG上α存在1-6岩藻糖(图1B)。
实例2：FUT8 shRNA设计和选择
由于人与和恒河猴岩藻糖基转移酶8基因(FUT8)之间具有高度相似性，因此设计了五个能够靶向人和恒河猴FUT8两者的shRNA。通过选择可以靶向人和恒河猴FUT8两者的shRNA，可以将GE-AAV载体用于人细胞系的体外工作并且用于恒河猴动物实验。将候选人shRNA与恒河猴FUT8进行比对，以证明同源性(图2A)。仅shRNA 61相比于恒河猴FUT8序列具有一个碱基对差异。
在U6启动子的控制下，将候选shRNA克隆到pLKO.1表达载体中。将表达载体瞬时转染到HEK293T细胞中，并且转染之后24小时通过实时PCR测量FUT8 mRNA的水平。尽管所有克隆都展现出高水平的敲低，但shRNA 52、53和59介导了最高水平的敲低(图2B)。所有三个克隆都展现出大于60％的敲低，其中克隆59达到了接近80％的最高敲低。选择这三个shRNA以用于开发GE-AAV载体。
实例3：GE-AAV载体的设计和开发
由于ssAAV载体的包装限制，将GE-AAV构建体设计成不超过1000个碱基对。测试了具有不同间隔子长度和数量的shRNA的构建体(图2C)。将所有shRNA设计成具有独立PolIII启动子。使用了U6、H1和7SK启动子来驱动单独shRNA的表达。小心使用最强启动子来驱动展现出最高水平FUT8敲低的shRNA。在ssAAV载体中，在IgG poly A尾部下游和3'ITR上游，使用现有SalI限制性位点并筛选最终构造中的正确朝向来克隆shRNA构建体(图2D)。
间隔子长度被视为用于构建体设计的可优化变量。发现构建体#1和#2的早期版本由于IgG poly A尾部的末尾与U6启动子的开头之间的短间隔子而减少抗体产生。一旦此间隔子长度增加，就将表达恢复到正常水平。类似地，在单独shRNA和下一个Pol III启动子的起点紧密接近的情况下，观察到FUT8敲低减少。对间隔子长度进行了优化以允许在不抑制IgG表达的情况下最大FUT8敲低。约75个碱基对(bp)的间隔子长度是优选的，但不是必需的。这里呈现的五个构建体是此优化的结果。
通过rt-PCR进行的GE-AAV载体的验证.将对4L6 IgG和各个FUT8 shRNA构建体进行编码的AAV质粒DNA瞬时转染到HEK293T细胞中。24小时之后，收获细胞并在PBS中洗涤。对经转染的细胞执行实PCR以测量人FUT8 mRNA的水平。计算了相比于未经转染的HEK293T对照细胞中存在的FUT8 mRNA水平的敲除百分比。构建体5、6和7(SEQ ID NO:11-13)表现出大约80％的相对敲低(图3A)。令人惊讶的是，构建体5虽然仅含有一个shRNA，但表现出与含有靶向FUT8的三个不同shRNA的构建体7相似的敲低水平。
如先前所提及的，shRNA克隆之间的间隔子长度可能影响单独shRNA的表达水平。尽管构建体1(SEQ ID NO:8)和构建体6(SEQ ID NO:11)含有完全相同的shRNA和启动子，但在敲低方面存在22％的差异。这两个克隆之间的唯一区别在于shRNA 59与7SK启动子之间的间隔子长度更大。类似地，构建体2和构建体7也含有相同的shRNA和启动子，但构建体7仅由于每个shRNA与下游启动子之间的大间隔子序列而表现出5％的敲低增强。
通过凝集素蛋白印迹进行的GE-AAV载体的验证.将对4L6 IgG和各个FUT8 shRNA构建体进行编码的AAV质粒DNA瞬时转染到HEK293T细胞中。18小时之后，用R10完全培养基替换培养基。另外3天之后，洗涤细胞并且用无血清培养基替换培养基。培养基更换后4天，收获并过滤上清液。对存在于上清液中的4L6 IgG进行纯化，并且使3μg经纯化的4L6 IgG在4-12％bris-tris凝胶上以双份凝胶进行电泳。将在野生型HEK293T细胞中产生的4L6抗体加载在每个凝胶的第一泳道中作为对照。转移后，用抗恒河猴-IgG-HRP对一个膜进行探测，并且用AAL-HRP凝集素对另一个膜进行探测，以使α1-6岩藻糖的存在可视化(图3B)。
尽管IgG探针表明每泳道加载了相等量的4L6抗体，但当用AAL凝集素进行探测时，每构建体都观察到不同量的α1-6岩藻糖。如所预期的，构建体5、6和7介导了最低水平的α1-6岩藻糖。这与实时PCR中观察到的敲低一致，并且最可能是由于与构建体1和2相比间隔子长度增加。由构建体6和7生成的4L6抗体上存在的α1-6岩藻糖的水平几乎通过蛋白质印迹检测不到。这些数据表明，敲低水平将足以在体内对细胞进行糖工程化，并且对于大多数分泌的抗体足以使α1-6岩藻糖缺乏。
实例4：GE-AAV稳定细胞系生成
在根据图3B的实验中，观察到FUT8敲低需要大约4天的构建体表达，然后才能达到足够的敲低水平以产生具有低水平的α1-6岩藻糖的抗体。然而，在体内，在肌肉内注射AAV之后，肌细胞将连续地表达IgG并且不确定地表达shRNA构建体。由于肌肉内注射AAV之后肌细胞的高转导速率以及此转导的长期性，对此情景进行建模以用于进行体外研究。由于每个构建体中的各种shRNA，选择了构建体2、5和6来制造稳定的细胞系。由于AAV包装问题，选择了构建体2而不是构建体7。由于构建体7处于包装极限，敲除的有限改进不足以解决AAV包装中的潜在困难。
将shRNA构建体克隆到具有嘌呤霉素抗性可选择标志物和GFP标签的慢病毒载体中。将HEK293T细胞与这些慢病毒一起培育48小时，然后添加1ug/ml嘌呤霉素。在第一周之后将嘌呤霉素剂量逐步升高到2μg/ml，并且在第2周之后逐步升高到4μg/ml，以选择经良好转导的细胞。针对GFP表达，通过流式细胞术对shRNA构建体表达进行监测(图4A)。在所有构建体中观察到高水平的GFP，这表明shRNA构建体表达高。
实例5：通过FUT8敲低稳定细胞系表达的Ab 10-1074的ADCC
用10-1074IgG的表达载体对HEK293T细胞、FUT8 KO细胞系和FUT8敲低稳定细胞系进行瞬时转染。5天之后，使用蛋白A柱从上清液中纯化IgG。通过先前确立的测定测量ADCC活性，以对NK细胞对表达如先前描述的荧光素酶的HIV-1NL4-3 AD8感染的靶细胞的活性进行定量。20将效应细胞与感染的靶细胞组合，然后添加4倍连续稀释的经纯化的抗体。测量了ADCC活性作为荧光素酶活性的损失。虚线表明对HIV AD8感染的靶细胞的50％RLU(相对光单位)或50％ADCC活性。
如所预测的，观察到当在FUT8 KO细胞系中生成Ab 10-1074时，与野生型相比，ADCC活性增强了>10倍(图4B)。有趣的是，在所有三个FUT8敲低稳定细胞系中产生的Ab 10-1074也显示出ADCC活性增强了约10倍，ADCC活性比在FUT8 KO细胞系中观察到的略低。ADCC活性与图3B中在经纯化的4L6 IgG上观察到的最少量岩藻糖一致。这些数据表明，用在体内对抑制性RNA进行编码的表达载体转导的肌细胞生成的抗体应展现相似的ADCC活性增强。
实例6：Fc突变与糖工程化的组合
增加抗体效应功能(如ADCC)的另一种常见方法是通过增加对Fc受体的亲和力的Fc突变。然而，关于将Fc突变与糖工程化组合的影响知之甚少。为了确定将两种方法组合以用于基于AAV载体递送抗HIV抗体是否有任何附加价值，还探索了常见的Fc突变。测试的前两个Fc突变是LS(M428L/N434S)21突变和LALA(L234A,L235A)22突变。LS突变尽管对ADCC没有影响，但已知可增加与新生Fc受体的结合，并且因此增加了血清半衰期21。此突变普遍用于AAV递送的抗体。第二Fc突变LALA已知可通过中断与FcγRIIIA的结合来消除所有ADCC活性。22还以组合方式测试了这些突变体，并且将其标注为LALA-LS(L234A/L235A/M428L/N434S)。
在HEK293T细胞和FUT8 KO细胞中产生了Ab 10-1074和Ab 3BNC117两者以及其相应的Fc突变体。对抗体进行纯化，并且将3μg经纯化的IgG在两份4-12％bris-tris凝胶上进行电泳。分别将在野生型HEK293T细胞中产生的Ab 10-1074或Ab 3BNC117 IgG加载在每个凝胶的第一泳道中，作为对照。将一个膜染色为考马斯以使总蛋白可视化，并且将另一个膜转移到PVDF膜并用AAL-HRP凝集素进行探测以使α1-6岩藻糖的存在可视化(图5A和6A)。尽管每泳道加载了相等量的抗体，但在FUT8 KO细胞中产生的Ab 10-1074和Ab 3BNC117两者均缺少α1-6岩藻糖。
接下来，使用SF162 gp140三聚体结合ELISA对抗体结合gp140的能力进行了分析。起始于1μg/ml的抗体浓度，然后进行3倍连续稀释，用结合SF162 gp140三聚体的1μg/ml板对Ab 10-1074和Ab 3BNC117变体进行连续培育。高吸光度表明高结合。如所预期的，糖工程化和Fc突变对gp140结合没有任何影响(图5B和6B)。同样重要的是要注意，比较不同抗体时测定的一致性表明IgG的蛋白质定量几乎没有变化。这表明在ADCC活性中观察到的任何差异确实是由于抗体修饰而不是样品与样品的可变性。
为了确定糖工程化与Fc受体突变的组合是否对中和能力有任何影响，用Ab 10-1074和Ab 3BNC117变体执行了中和测定(图5C和6C)。用HIV-1NL4-3 AD8执行了中和测定。抗体浓度开始于1μg/ml，然后是2倍连续稀释。虚线表明50％RLU(相对光照单位)，这表示对AD8的50％中和活性。最低RLU表明最高中和。如所预期的，糖工程化或Fc受体突变单独地或以组合方式都不会影响Ab 10-1074和Ab 3BNC117中和AD8的能力。
还测试了Ab 10-0174和Ab 3BNC117变体的ADCC活性(图5C和6C)。通过先前确立的测定测量ADCC活性，以对NK细胞对表达如先前描述的荧光素酶的病毒感染的靶细胞的活性进行定量。20将效应细胞与感染的靶细胞组合，然后添加4倍连续稀释的经纯化的抗体。虚线表示对HIV AD8感染的靶细胞的50％RLU(相对光单位)或50％ADCC活性。RLU的损失表明病毒感染的细胞在8小时培育时间段期间的损失，并且代表高ADCC活性。
与用4L6观察到的一致、10-1074和3BNC117抗体两者展示出当产生于FUT8 KO细胞系中时，与野生型HEK293T细胞相比，ADCC增强了>10倍(图5C和6C)。如所预期的，即使与FUT8 KO组合，LS突变也不会影响ADCC活性。最有趣的是LALA突变。已知LALA突变会消除ADCC活性。这可以在10-1074-LALA和3BNC117-LALA两者中观察到。即使在最高抗体浓度下，LALA突变体的ADCC活性也几乎不存在。然而，当10-1074-LALA和3BNC117-LALA IgG产生于FUT8 KO细胞中时，ADCC活性的水平增强到大于野生型10-1074和3BNC117的水平。当LALA突变体IgG缺少α1-6岩藻糖时，两种抗体都表现出约5倍的ADCC活性增强(图5C和6C)。
实例7：Fc突变与糖工程化的组合可以增强ADCC活性
由于观察到LALA突变体IgG的ADCC活性不仅可以通过去除α1-6岩藻糖恢复还可以增强，因此检查了去除α1-6岩藻糖对与其它Fc突变相关联的ADCC水平的影响。对于这些试验，利用了S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)。23在HEK293T和FUT8 KO细胞中克隆并产生了Ab 10-1074-S239和Ab 3BNC117-S239两者。根据经纯化的IgG确定了ADCC活性(图7A和7B)。单独地，FUT8 KO和S239突变两者都将ADCC活性增强了约10倍。然而，当组合时，10-1074 FUT8 S239和3BNC117 FUT8 S239显示出对ADCC活性的累加作用，与野生型抗体相比，增强了40-60倍。
还测试了不对称Fc突变，其中一个重链具有与第二个不同的突变组。突变体W117、W125、W141、W144和W187突变体均产生于FUT8 KO细胞系中。与野生型10-1074和3BNC117以及产生于FUT8 KO细胞中的10-1074和3BNC117相比，除了10-1074 W187之外，所有测试的突变体都显示出增强的ADCC活性(图7C和7D)。与野生型IgG相比，这些增强的范围高于ADCC的20-80倍。这些数据表明，如不对称Fc突变等Fc突变和新策略可以与经糖工程化的AAV载体组合，以极大地增强ADCC活性。
参考文献
1 Fuchs,S.P.等人,“AAV递送的抗体在中和活性不存在下介导对SIVmac239挑战的显著保护作用(AAV-Delivered Antibody Mediates Significant Protective Effectsagainst SIVmac239 Challenge in the Absence of Neutralizing Activity)”《公共图书馆：病原体(PLoS pathogens)》11,e1005090,doi:10.1371/journal.ppat.1005090(2015)。
2 Martinez-Navio,J.M.等人,“抗HIV单克隆抗体的腺相关病毒递送可以驱动长期病毒抑制(Adeno-Associated Virus Delivery of Anti-HIV Monoclonal AntibodiesCan Drive Long-Term Virologic Suppression)”《免疫(Immunity)》50,567-575.e565,doi:10.1016/j.immuni.2019.02.005(2019)。
3 Ayyar,B.V.、Arora,S.和O'Kennedy,R.,“癌症疗法中抗体的成熟(Coming-of-Age of Antibodies in Cancer Therapeutics)”,《药理科学趋势(Trends inPharmacological Sciences)》37,1009-1028,doi:10.1016/j.tips.2016.09.005(2016)。
4 Pescovitz,M.D.,“利妥昔单抗——抗cd20单克隆抗体：作用的历史和机制(Rituximab,an anti-cd20 monoclonal antibody:history and mechanism ofaction.)”,《美国移植杂志：美国移植学会和美国移植外科学会的官方杂志(Americanjournal of transplantation:official journal of the American Society ofTransplantation and the American Society of Transplant Surgeons)》,6,859-866,doi:10.1111/j.1600-6143.2006.01288.x(2006)。
5 Scott,A.M.、Allison,J.P.和Wolchok,J.D.,“癌症疗法中的单克隆抗体(Monoclonal antibodies in cancer therapy)”,《癌症免疫(Cancer immunity)》12,14(2012)。
6 Nielsen,D.L.、Andersson,M.和Kamby,C.,“乳腺癌的HER2靶向疗法，单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂(HER2-targeted therapy in breast cancer.Monoclonalantibodies and tyrosine kinase inhibitors)”,《癌症治疗评论(Cancer treatmentreviews)》35,121-136,doi:10.1016/j.ctrv.2008.09.003(2009)。
7 Thomann,M.等人,“IgG1的体外糖工程化以及其对Fc受体结合和ADCC活性的作用(In vitro glycoengineering of IgG1 and its effect on Fc receptor bindingand ADCC activity)”《公共科学图书馆：综合》10,e0134949,doi:10.1371/journal.pone.0134949(2015)。
8 Yamane-Ohnuki,N.和Satoh,M.,“利用受控的岩藻糖基化产生治疗性抗体(Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation)”,《Mabs》1,230-236(2009)。
9 Peipp,M.等人,“抗体岩藻糖基化不同地影响通过NK和PMN效应细胞介导的细胞毒性(Antibody fucosylation differentially impacts cytotoxicity mediated by NKand PMN effector cells)”,《血液(Blood)》112:2390-2399,doi:10.1182/blood-2008-03-144600(2008)。
10 Iannello,A.和Ahmad,A.“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性在治疗性抗癌单克隆抗体的功效中的作用(Role of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity inthe efficacy of therapeutic anti-cancer monoclonal antibodies)”,《癌症转移评论(Cancer metastasis reviews)》24,487-499,doi:10.1007/s10555-005-6192-2(2005)。
11 Iida,S.等人,“人血液中的非岩藻糖基化治疗性抗体的增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功效的两种机制(Two mechanisms of the enhanced antibody-dependentcellular cytotoxicity(ADCC)efficacy of non-fucosylated therapeutic antibodiesin human blood)”,《BMC Cancer》9,58,doi:10.1186/1471-2407-9-58(2009)。
12 Pereira,N.A.、Chan,K.F.、Lin,P.C.和Song,Z.,“治疗性抗体中的“少即是多”：具有增强的抗体依赖性细胞毒性的非岩藻糖基化抗癌抗体(The"less-is-more"intherapeutic antibodies:Afucosylated anti-cancer antibodies with enhancedantibody-dependent cellular cytotoxicity)”,《MAbs》10,693-711,doi:10.1080/19420862.2018.1466767(2018)。
13 Goede,V.等人,“患有CLL患者的奥滨尤妥珠单抗加瘤可宁以及共存条件(Obinutuzumab plus chlorambucil in patients with CLL and coexistingconditions)”,《新英格兰医药杂志(The New England Journal of Medicine)》370,1101-1110,doi:10.1056/NEJMoa1313984(2014)。
14 Duvic,M.等人,“莫加莫珠单抗——去岩藻糖基化的抗CCR4抗体在先前经治疗的患有皮肤T细胞淋巴瘤的患者体内的1/2期研究(Phase 1/2study of mogamulizumab,adefucosylated anti-CCR4 antibody,in previously treated patients withcutaneous T-cell lymphoma)”,《血液(Blood)》125:1883-1889,doi:10.1182/blood-2014-09-600924(2015)。
15 FitzGerald,J.M.等人,“贝那丽珠单抗——抗白介素-5受体α单克隆抗体作为对患有重度不受控的嗜酸性哮喘(CALIMA)的患者的附加治疗：随机、双盲、安慰剂受控的3期试验(Benralizumab,an anti-interleukin-5receptor alpha monoclonal antibody,as add-on treatment for patients with severe,uncontrolled,eosinophilic asthma(CALIMA):a randomised,double-blind,placebo-controlled phase 3trial)”,《柳叶刀(Lancet)》(英国伦敦(London,England))388,2128-2141，doi:10.1016/s0140-6736(16)31322-8(2016)。
16 Wren,L.H.等人,“与HIV感染的缓慢进展相关联的特异性抗体依赖细胞毒性应答(Specific antibody-dependent cellular cytotoxicity responses associatedwith slow progression of HIV infection)”,《免疫学(Immunology)》138:116-123,doi:10.1111/imm.12016(2013)。
17 Baum,L.L.等人,“HIV-1gp120特异性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性与疾病进展的速率相关(HIV-1gp120-specific antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity correlates with rate of disease progression)”,《免疫学杂志(Journal of immunology)》(马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Md.)：1950)157,2168-2173(1996)。
18 Lambotte,O.等人,“HIV-1精英控制者体内的异构中和抗体和抗体依赖性细胞毒性应答(Heterogeneous neutralizing antibody and antibody-dependent cellcytotoxicity responses in HIV-1elite controllers)”《艾滋病(AIDS)》(英国伦敦)23,897-906,doi:10.1097/QAD.0b013e328329f97d(2009)。
19 Moldt,B.等人,“抗HIV-1单克隆抗体b12的非岩藻糖基化变体在体外具有增强的FcγRIIIa介导的抗病毒活性，但没有改进对恒河猴的粘膜SHIV挑战的保护(Anonfucosylated variant of the anti-HIV-1monoclonal antibody b12 has enhancedFcgammaRIIIa-mediated antiviral activity in vitro but does not improveprotection against mucosal SHIV challenge in macaques)”《病毒学杂志》,86,6189-6196,doi:10.1128/JVI.00491-12(2012)。
20 Alpert,M.D.等人,“针对HIV-1或SIV感染的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的新颖测定揭示了与通过中和与结合测定测量的抗体的不完整重叠(A novelassay for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against HIV-1-or SIV-infected cells reveals incomplete overlap with antibodies measured byneutralization and binding assays)”《病毒学杂志》86，12039-12052,doi:10.1128/jvi.01650-12(2012)。
21 Zalevsky,J.等人,“增强的抗体半衰期提高体内活性(Enhanced antibodyhalf-life improves in vivo activity)”《自然生物技术(Nature biotechnology)》28,157-159,doi:10.1038/nbt.1601(2010)。
22 Xu,D.等人,“五个人源化OKT3效应功能变体抗体的体外表征(In vitrocharacterization of five humanized OKT3 effector function variantantibodies)”《细胞与分子免疫学(Cellular immunology)》200,16-26，doi:10.1006/cimm.2000.1617(2000)。
23 Lazar,G.A.等人,“具有增强的效应子功能的经工程化的抗体Fc变体(Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function)”《美国国家科学院院刊》103,4005-4010,doi:10.1073/pnas.0508123103(2006)。
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Claims (23)

1.一种表达载体，其包括对以下进行编码的核酸序列：(1)抗体的重链和/或轻链；以及(2)一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的shRNA序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述表达载体对抗体的所述重链和所述轻链两者进行编码。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其中所述表达载体是腺相关病毒(AAV)载体。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的表达载体，其中所述重链包括位于Fc区中的增强抗体依赖性细胞毒性的一个或多个突变。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其中突变是LS突变(M428L/N434S)、LALA突变(L234A、L235A)、S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)、C6A-74突变(V259I/N315D/N434Y)、HN突变(H433K/N434F)、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/Y296W、K392D/K409D/S239D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330F/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V或E356K/D399K/K290Y/Y296W。
6.一种组合物，其包括：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的表达载体；以及(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的表达载体，其中(a)、(b)或(a)和(b)进一步包括一个或多个靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的shRNA序列。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述表达载体是腺相关病毒(AAV)载体。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的组合物，其中所述重链包括位于Fc区中的增强抗体依赖性细胞毒性的一个或多个突变。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中一个或多个突变是LS突变(M428L/N434S)、LALA突变(L234A、L235A)、S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)、C6A-74突变(V259I/N315D/N434Y)、HN突变(H433K/N434F)、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/Y296W、K392D/K409D/S239D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330F/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V或E356K/D399K/K290Y/Y296W。
10.一种在体内产生抗体的方法，所述方法包括向受试者递送根据权利要求1到3中任一项所述的表达载体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述表达载体的所述重链包括位于所述Fc区中的增强抗体依赖性细胞毒性的一个或多个突变。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述Fc区中的所述一个或多个突变是LS突变(M428L/N434S)、LALA突变(L234A、L235A)、S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)、C6A-74突变(V259I/N315D/N434Y)、HN突变(H433K/N434F)、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/Y296W、K392D/K409D/S239D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330F/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W)、K392D/K409D/A330M/K334V或E356K/D399K/K290Y/Y296W。
13.一种在体内产生抗体的方法，所述方法包括向受试者递送根据权利要求6或7所述的组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述重链包括位于Fc区中的增强抗体依赖性细胞毒性的一个或多个突变。
15.根据权利要求14所述的方法，其中一个或多个突变是LS突变(M428L/N434S)、LALA突变(L234A、L235A)、S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)、C6A-74突变(V259I/N315D/N434Y)、HN突变(H433K/N434F)、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/Y296W、K392D/K409D/S239D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330F/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W)、K392D/K409D/A330M/K334V或E356K/D399K/K290Y/Y296W。
16.一种在体内产生抗体的方法，所述方法包括向受试者递送以下：(a)包括对抗体的重链进行编码的核酸序列的核酸；(b)包括对抗体的轻链进行编码的核酸序列的核酸；以及(c)靶向岩藻糖基转移酶-8(FUT8)的抑制性RNA。
17.根据权利要求16所述的方法，其中(a)、(b)和(c)独立地存在于相同或不同表达载体上。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述表达载体是AAV载体。
19.根据权利要求16到18中任一项所述的方法，其中所述重链包括位于Fc区中的增强抗体依赖性细胞毒性的一个或多个突变。
20.根据权利要求19所述的方法，其中一个或多个突变是LS突变(M428L/N434S)、LALA突变(L234A、L235A)、S239(DFL)突变(S239D/I332F/A330L)、C6A-74突变(V259I/N315D/N434Y)、HN突变(H433K/N434F)、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/Y296W、K392D/K409D/S239D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330M/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W、K392D/K409D/A330F/K334V、E356K/D399K/L234Y/K290Y/Y296W)、K392D/K409D/A330M/K334V或E356K/D399K/K290Y/Y296W。
21.根据权利要求16到20中任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA是shRNA。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述shRNA包括SEQ ID NO:3-7中的任一个的核酸序列。
23.根据权利要求21所述的方法，其包括向所述受试者递送包括多个具有SEQ ID NO:3-7中的两个或更多个的shRNA的组合物。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008077547A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Shrna-mediated inhibition of expression of alpha-1. 6-fucosyltransferase
US20170313765A1 (en) * 2014-10-29 2017-11-02 Novartis Ag Direct expression of antibodies
CN108136007A (zh) * 2015-08-31 2018-06-08 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗犬癌症的嵌合aav-抗vegf

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120047586A9 (en) * 2007-10-24 2012-02-23 Otsuka Chemical Co., Ltd Polypeptide having enhanced effector function
US20140099666A1 (en) * 2009-07-06 2014-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing production of a biological product
CN118271441A (zh) * 2013-05-30 2024-07-02 基尼克萨制药有限公司 制瘤素m受体抗原结合蛋白
KR101583457B1 (ko) * 2015-05-18 2016-01-08 한국생명공학연구원 다중 당단백질의 발현량 및 당질변이의 측정을 통한 간암의 예측방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008077547A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Shrna-mediated inhibition of expression of alpha-1. 6-fucosyltransferase
US20170313765A1 (en) * 2014-10-29 2017-11-02 Novartis Ag Direct expression of antibodies
CN108136007A (zh) * 2015-08-31 2018-06-08 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗犬癌症的嵌合aav-抗vegf

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIN ALLEN等: "Adeno‑associated virus gene deliveryof broadly neutralizing antibodies as preventionand therapy against HIV‑1", 《RETROVIROLOGY》, pages 12 *

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