CN113405877A - 一种生物分子提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物分子提取方法，包括如下步骤：S1、向稀释组件中加入样本和稀释液；在缓冲组件中加入缓冲液；S2、第一次离心处理，样本和稀释液进入第一过滤组件过滤处理；S3、停止第一次离心；进行第二次离心；S4、停止第二次离心；进行第三次离心，混合液的其他物质进入滤液收集组件；S5、停止第三次离心，向第一洗脱组件和第二洗脱组件中加入第一洗脱液和第二洗脱液；S6、进行第四次离心；在进行加速第五次离心；S7、停止第五次离心，进行第六次离心；S8、从洗脱液收集组件中提取外泌体。该生物分子提取方法，只需加入样本和配套试剂，盘片配套仪器自动完成样本的稀释、混合、过滤膜、滤液的收集和洗脱液的收集，无需专业的操作人员。

Description

一种生物分子提取方法

技术领域

本发明涉及医疗器械对外泌体提取方法领域，具体为一种生物分子提取方法。

背景技术

目前，离心式微流控芯片常应用于POCT领域，无需专业技术人员操作就能方便快捷的输出检测结果。其特点在于将储液池、检测池和阀等微流控结构集成到圆盘状芯片上，以离心力驱动微流体的流动，从而实现对样品的检测分析。离心式微流控芯片能够完成样本的前处理、混匀、精确的体积定量和检测等操作。近年来离心式微流控芯片以其集成化、多平行检测、高通量、低成本、自动化、等优点获得了快速发展，已广泛应用于生化检测、免疫分析、核酸检测、生物分子富集和食品安全等领域。

细胞外囊泡是蛋白质、mRNA、miRNA和脂质运输来完成细胞间通讯通路的重要媒介，根据它们的大小和发生分为三类，包括外泌体、微泡和凋亡小体。其中，外泌体是直径大约为40-100nm的包装囊泡，由多种细胞分泌，内含有特定的蛋白质、脂质、细胞因子或遗传物质。来源于不同的组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，而且还包含其行使功能的关键分子。近年来，随着外泌体研究的不断深入，它的应用已经涉及肿瘤治疗领域、医学基础和免疫领域、寄生虫领域；临床研究上已涉及心血管***、内分泌代谢***等。

现有技术中，商品化的外泌体提取试剂盒需要大型冷冻离心机，并且操作步骤多，耗时长，需要专业实验人员进行手工操作，并且操作过程中容易出错，导致提取的外泌体量不足、外泌体纯度不够等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种芯片集成多种微阀和滤膜，解决人样本中外泌体的生物分子提取操作复杂、提取外泌体量不足，提取的外泌体纯度不够等问题的生物分子提取方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种生物分子提取方法，包括如下步骤：

S1、向稀释组件中加入样本和稀释液；在缓冲组件中加入缓冲液；

S2、第一次离心处理，样本和稀释液进入第一过滤组件过滤处理；并进入缓冲组件，与缓冲液混合形成混合液；

S3、停止第一次离心；进行第二次离心，混合液进入第二过滤组件；混合液的分泌体富集在所述第二过滤组件内部，其他物质进入分液组件；

S4、停止第二次离心；进行第三次离心，混合液的其他物质进入滤液收集组件；

S5、停止第三次离心，向第一洗脱组件中加入第一洗脱液，向第二洗脱组件中加入第二洗脱液；

S6、进行第四次离心；第一洗脱液进入第二过滤组件，第二洗脱液仍然留在第二洗脱组件中；在进行加速第五次离心，第一洗脱液通过第二过滤组件进入分液组件；

S7、停止第五次离心，进行第六次离心，第二洗脱液进入第二过滤组件进一步进入分液组件，第一洗脱液和第二洗脱液均进入洗脱液收集组件；

S8、从洗脱液收集组件中提取外泌体。

所述稀释组件出口端连接第一过滤组件，所述第一过滤组件的出口端连接缓冲组件，所述缓冲组件的出口端连接分液组件，所述分液组件的还连接所述第二洗脱组件的出口端，所述分液组件的出口端分别连接滤液收集组件和洗脱液收集组件；

所述稀释组件、第一过滤组件、第二过滤组件、缓冲组件、第一洗脱组件、第二洗脱组件、分液组件和滤液收集组件和洗脱液收集组件均为环槽结构。

在一种优选的实施方式中，所述稀释组件包括：添加和存储稀释液的第一储液槽；添加和存储样本的样本槽，所述第一储液槽和样本槽的出口端连接第一过滤组件。

在一种优选的实施方式中，所述第一储液槽和样本槽均为环形结构，且相邻设置；在所述第一储液槽和样本槽相互靠近位置开设出口，并与所述第一过滤组件连接。

在一种优选的实施方式中，样本槽上端设置有样本加液孔

在一种优选的实施方式中，所述第一过滤组件包括：第一滤膜槽，所述第一滤膜槽一端与所述稀释组件导通连接，所述第一滤膜槽另一端开设有通孔与所述缓冲组件连接，在所述通孔靠近第一滤膜槽的端部设置有去杂滤膜。

在一种优选的实施方式中，所述通孔靠近第一滤膜槽端部的侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为30-150°。

在一种优选的实施方式中，所述通孔靠近第一滤膜槽端部的侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为120°。

在一种优选的实施方式中，所述去杂滤膜的孔径为0.22-0.03微米的超滤膜。

在一种优选的实施方式中，所述通孔的直径为0.5-3mm。

在一种优选的实施方式中，所述缓冲组件包括：混合槽、储存缓冲液的第二储液槽；所述混合槽的入口端导通连接所述第一过滤组件的出口端，所述第二储液槽的出口端连接所述混合槽。

在一种优选的实施方式中，所述混合槽的深度为1-5mm。

在一种优选的实施方式中，所述第二过滤组件包括：第二滤膜槽；所述第二滤膜槽的入口端通过第一虹吸流道连接缓冲组件的出口端，所述第二滤膜槽的出口端连接分液组件；

在一种优选的实施方式中，所述滤膜槽的出口端设置有生物分子过滤膜。

在一种优选的实施方式中，所述第二滤膜槽的出口端侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为30-150°。

在一种优选的实施方式中，所述第二滤膜槽的出口端侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为120°。

在一种优选的实施方式中，所述第一虹吸流道的宽度为0.1-0.5mm，第一虹吸流道的深度为0.1-0.5mm。

在一种优选的实施方式中，所述第一洗脱组件包括：第三储液槽，所述第三储液槽的出口端连接第二滤膜槽。

在一种优选的实施方式中，所述第二洗脱组件包括：第四储液槽、过渡槽；所述第四储液槽与过渡槽之间通过毛细阀导通连接，所述过渡槽的出口端通过第四虹吸流道与所述第二滤膜槽导通连接。

在一种优选的实施方式中，第三储液槽的深度为3-5mm，出口流道的宽度为3-5mm，出口流道的深度与第三储液槽深度相同；

在一种优选的实施方式中，所述毛细阀的宽度为0.1-0.2mm，深度为0.1-0.2mm，长度为2-5mm。

在一种优选的实施方式中，所述分液组件包括：分液槽，所述分液槽的入口端连接第二过滤组件的出口端，所述分液槽的两端分别通过第二虹吸流道和第三虹吸流道连接滤液收集组件和洗脱液收集组件。

在一种优选的实施方式中，所述第二过滤组件出口端的孔径为直径为0.5-3mm。

在一种优选的实施方式中，所述第二虹吸流道的亲水指数小于第三虹吸流道。

在一种优选的实施方式中，所述滤液收集组件包括：滤液收集槽、滤液收集池，所述滤液收集槽的入口端连接第二虹吸流道，所述滤液收集槽的溢流口连接滤液收集池。

在一种优选的实施方式中，所述滤液收集槽为废液定量结构，所述废液定量结构的定量大小为100-300μl的废液。

在一种优选的实施方式中，所述洗脱液收集组件包括：提取槽，所述提取槽一端第四虹吸流道连接，所述提取槽一端开设有取液孔。

在一种优选的实施方式中，所述稀释组件、第一过滤组件、第二过滤组件、缓冲组件、第一洗脱组件、第二洗脱组件、分液组件、滤液收集组件和洗脱液收集组件分别中心对称设置有两个。

在一种优选的实施方式中，所述步骤S1为：样本槽内加入人样本，第一储液槽内加入稀释液，第二储液槽内加入缓冲液；

所述步骤S2为：进行芯片第一次离心，样本与稀释液一同进入第一滤膜槽，缓冲液进入混合槽，离心一定时间后，样本与稀释液通过第一滤膜槽内的去杂滤膜，并与混合槽内缓冲液混合；

所述步骤S3为：停止第一次离心后，混合液充满第一虹吸流道；进行第二次离心，混合液进入第二滤膜槽，离心一定时间后，混合液通过第二滤膜槽内的生物分子过滤膜，进入分液槽；混合液中的外泌体富集在生物分子过滤膜上；

所述步骤S4为：停止第二次离心后，混合液优先填充满第二虹吸流道，在第三虹吸流道未填充满时，进行第三次离心，混合液进入滤液收集槽内的废液定量结构，多余的混合液进入废液溢流池；

所述步骤S5为：向芯片第三储液槽内加入第一洗脱液，第四储液槽内加入第二洗脱液；

所述步骤S6为：进行第四次离心，即低速离心，第一洗脱液进入第二滤膜槽，第二洗脱液扔在停留在第四储液槽内；进行第五次离心，即高速离心，第一洗脱液通过生物分子过滤膜进入分液池，第二洗脱液突破毛细阀门进入过渡槽；

所述步骤S7为：停止第五次离心后，进入过渡槽的第二洗脱液填充满第四虹吸流道；进行第六次离心，第二洗脱液进入第二滤膜槽并穿生物分子过滤膜进入分液槽，第一洗脱液和第二洗脱液一同进入提取槽；

所述步骤S8为：通过提取槽将含有外泌体的提取液从芯片中取出。

本发明的生物分子提取方法，具有如下有益效果：

该生物分子提取方法，稀释组件出口端连接第一过滤组件，第一过滤组件的出口端连接缓冲组件，缓冲组件的出口端连接分液组件，分液组件的还连接所述第二洗脱组件的出口端，分液组件的出口端分别连接滤液收集组件和洗脱液收集组件；稀释组件、第一过滤组件、第二过滤组件、缓冲组件、第一洗脱组件、第二洗脱组件、分液组件和滤液收集组件和洗脱液收集组件均为环槽结构。

解决了现有技术中商品化的外泌体提取试剂盒需要大型冷冻离心机，并且操作步骤多，耗时长，需要专业实验人员进行手工操作，并且操作过程中容易出错，导致提取的外泌体量不足、外泌体纯度不够等问题。

该生物分子提取方法，只需加入样本(可以是全血、血浆、尿液等)和配套试剂(外泌体生物分子提取所用的试剂)盘片配套仪器自动完成样本的稀释、混合、过滤膜、滤液的收集和洗脱液的收集，无需专业的操作人员。例如：血浆的前处理、外泌体生物分子的富集、外泌体生物分子洗脱，无需专业的操作人员。盘片上已集成样本过滤的超滤膜和外泌体生物分子富集滤膜，并且滤膜和试剂使用量为传统滤器和离心柱的1/10，成本低，提取效率高。提取外泌体生物分子所用样本为传统方法的1/5，可减少病人采血量。样本中的细胞碎片及杂质已与外泌体生物分子提取液分离，提取的外泌体生物分子纯度高。可同时进行2个样本的外泌体生物分子提取。整体外泌体生物分子提取所需时间段，15分钟内即可完成单个或多个样本外泌体生物分子的提取。目前还没有使用离心式微流控芯片技术用于人血样本的外泌体生物分子提取。其中生物分子包括所有用滤膜富集的循环肿瘤细胞、外泌体、特别蛋白等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的立体图；

图2为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片流道结构的结构示意图；

图3为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片内置滤膜剖面图；

图4为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片废液和提取液分液原理图；

图5为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片上加入血样样本、稀释液和缓冲液示意图；

图6为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片第一次离心，样本稀释后过去杂滤膜并与缓冲液在芯片混合槽内混合示意图；

图7为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片第二次离心，混合液过生物分子过滤膜后进入分液槽示意图；

图8为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片第三次离心混合液进入滤液收集槽，并填充满滤液收集槽内定量结构示意图；

图9为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片上加入第一洗脱液和第二洗脱液时的示意图；

图10为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片第四次离心，低转速下第一洗脱液进入第二滤膜槽与生物分子过滤膜孵育，第二洗脱液无法突破毛细阀示意图；

图11为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片第四次离心，高转速下第一洗脱液穿过生物分子过滤膜进入分液槽，第二洗脱液突破毛细阀进入过渡槽的示意图；

图12为根据本公开一种实施方式的生物分子提取方法的芯片第五次离心洗脱液穿过生物分子过滤膜与第一洗脱液一起进入提取槽示意图。

【主要组件符号说明】

1、稀释组件；11、第一储液槽；12、样本槽；121、样本加液孔；

2、第一过滤组件；21、第一滤膜槽；22、通孔；23、去杂滤膜；

3、缓冲组件；31、混合槽；32、第二储液槽；

4、第二过滤组件；41、第二滤膜槽；42、第一虹吸流道；

5、分液组件；51、分液槽；52、第二虹吸流道；53、第三虹吸流道；

6、第一洗脱组件；61、第三储液槽；

7、第二洗脱组件；71、第四储液槽；72、过渡槽；73、毛细阀；74、第四虹吸流道；

8、滤液收集组件；81、滤液收集槽；82、滤液收集池；

9、洗脱液收集组件；91、提取槽；92、取液孔。

具体实施方式

下面结合附图及本发明的实施例对本发明的生物分子提取方法作进一步详细的说明。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

如图1-图12所示，该生物分子提取方法，包括如下步骤：

S1、向稀释组件1中加入样本和稀释液；在缓冲组件3中加入缓冲液；

S2、第一次离心处理，样本和稀释液进入第一过滤组件2过滤处理；并进入缓冲组件3，与缓冲液混合形成混合液；

S3、停止第一次离心；进行第二次离心，混合液进入第二过滤组件4；混合液的分泌体富集在所述第二过滤组件4内部，其他物质进入分液组件5；

S4、停止第二次离心；进行第三次离心，混合液的其他物质进入滤液收集组件8；

S5、停止第三次离心，向第一洗脱组件6中加入第一洗脱液，向第二洗脱组件7中加入第二洗脱液；

S6、进行第四次离心；第一洗脱液进入第二过滤组件4，第二洗脱液仍然留在第二洗脱组件7中；在进行加速第五次离心，第一洗脱液通过第二过滤组件4进入分液组件5；

S7、停止第五次离心，进行第六次离心，第二洗脱液进入第二过滤组件4进一步进入分液组件5，第一洗脱液和第二洗脱液均进入洗脱液收集组件9；

S8、从洗脱液收集组件9中提取外泌体。

所述稀释组件1出口端连接第一过滤组件2，所述第一过滤组件2的出口端连接缓冲组件3，所述缓冲组件3的出口端连接分液组件5，所述分液组件5的还连接所述第二洗脱组件7的出口端，所述分液组件5的出口端分别连接滤液收集组件8和洗脱液收集组件9；

所述稀释组件1、第一过滤组件2、第二过滤组件4、缓冲组件3、第一洗脱组件6、第二洗脱组件7、分液组件5和滤液收集组件8和洗脱液收集组件9均为环槽结构。

在一种实施例中：

稀释组件1包括：添加和存储稀释液的第一储液槽11；添加和存储样本的样本槽12，所述第一储液槽11和样本槽12的出口端连接第一过滤组件2。

所述第一储液槽11和样本槽12均为环形结构，且相邻设置；在所述第一储液槽11和样本槽12相互靠近位置开设出口，并与所述第一过滤组件2连接。

样本槽12上端设置有样本加液孔121

所述第一过滤组件2包括：第一滤膜槽21，所述第一滤膜槽21一端与所述稀释组件1导通连接，所述第一滤膜槽21另一端开设有通孔22与所述缓冲组件3连接，在所述通孔22靠近第一滤膜槽21的端部设置有去杂滤膜23。

所述通孔22靠近第一滤膜槽21端部的侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为30-150°。

所述通孔22靠近第一滤膜槽21端部的侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为120°。

所述去杂滤膜23的孔径为0.22-0.03微米的超滤膜。

所述通孔22的直径为0.5-3mm。

在一种实施例中：

缓冲组件3包括：混合槽31、储存缓冲液的第二储液槽32；所述混合槽31的入口端导通连接所述第一过滤组件2的出口端，所述第二储液槽32的出口端连接所述混合槽31。

所述混合槽31的深度为1-5mm。

所述第二过滤组件4包括：第二滤膜槽41；所述第二滤膜槽41的入口端通过第一虹吸流道42连接缓冲组件3的出口端，所述第二滤膜槽41的出口端连接分液组件5；

所述滤膜槽的出口端设置有生物分子过滤膜。

所述第二滤膜槽41的出口端侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为30-150°。

所述第二滤膜槽41的出口端侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为120°。

所述第一虹吸流道42的宽度为0.1-0.5mm，第一虹吸流道42的深度为0.1-0.5mm。

所述第一洗脱组件6包括：第三储液槽61，所述第三储液槽61的出口端连接第二滤膜槽41。

所述第二洗脱组件7包括：第四储液槽71、过渡槽72；所述第四储液槽71与过渡槽72之间通过毛细阀73导通连接，所述过渡槽72的出口端通过第四虹吸流道74与所述第二滤膜槽41导通连接。

第三储液槽61的深度为3-5mm，出口流道的宽度为3-5mm，出口流道的深度与第三储液槽61深度相同；

所述毛细阀73的宽度为0.1-0.2mm，深度为0.1-0.2mm，长度为2-5mm。

在一种实施例中：

所述分液组件5包括：分液槽51，所述分液槽51的入口端连接第二过滤组件4的出口端，所述分液槽51的两端分别通过第二虹吸流道52和第三虹吸流道53连接滤液收集组件8和洗脱液收集组件9。

所述第二过滤组件4出口端的孔径为直径为0.5-3mm。

所述第二虹吸流道52的亲水指数小于第三虹吸流道53。

所述滤液收集组件8包括：滤液收集槽81、滤液收集池82，所述滤液收集槽81的入口端连接第二虹吸流道52，所述滤液收集槽81的溢流口连接滤液收集池82。

所述滤液收集槽81为废液定量结构，所述废液定量结构的定量大小为100-300μl的废液。

所述洗脱液收集组件9包括：提取槽91，所述提取槽91一端第四虹吸流道74连接，所述提取槽91一端开设有取液孔92。

在一种实施例中：

所述稀释组件1、第一过滤组件2、第二过滤组件4、缓冲组件3、第一洗脱组件6、第二洗脱组件7、分液组件5、滤液收集组件8和洗脱液收集组件9分别中心对称设置有两个。

在一种优选的实施例中，所述步骤S1为：样本槽12内加入人样本，第一储液槽11内加入稀释液，第二储液槽32内加入缓冲液；

所述步骤S2为：进行芯片第一次离心，样本与稀释液一同进入第一滤膜槽21，缓冲液进入混合槽31，离心一定时间后，样本与稀释液通过第一滤膜槽21内的去杂滤膜23，并与混合槽31内缓冲液混合；

所述步骤S3为：停止第一次离心后，混合液充满第一虹吸流道42；进行第二次离心，混合液进入第二滤膜槽41，离心一定时间后，混合液通过第二滤膜槽41内的生物分子过滤膜，进入分液槽51；混合液中的外泌体富集在生物分子过滤膜上；

所述步骤S4为：停止第二次离心后，混合液优先填充满第二虹吸流道52，在第三虹吸流道53未填充满时，进行第三次离心，混合液进入滤液收集槽81内的废液定量结构，多余的混合液进入废液溢流池；

所述步骤S5为：向芯片第三储液槽61内加入第一洗脱液，第四储液槽71内加入第二洗脱液；

所述步骤S6为：进行第四次离心，即低速离心，第一洗脱液进入第二滤膜槽41，第二洗脱液扔在停留在第四储液槽71内；进行第五次离心，即高速离心，第一洗脱液通过生物分子过滤膜进入分液池，第二洗脱液突破毛细阀73门进入过渡槽72；

所述步骤S7为：停止第五次离心后，进入过渡槽72的第二洗脱液填充满第四虹吸流道74；进行第六次离心，第二洗脱液进入第二滤膜槽41并穿生物分子过滤膜进入分液槽51，第一洗脱液和第二洗脱液一同进入提取槽91；

所述步骤S8为：通过提取槽91将含有外泌体的提取液从芯片中取出。

图1是立体结构示意图，芯片总体结构分为上、下两层，芯片上层设置各种槽结构、加液孔、取液孔92、各种流道和气孔，芯片下层为聚酯薄膜。芯片上层带流道面向下与芯片下层紧密键合，芯片可容纳多个检测单元，可同时进行多个样本的外泌体提取，图中举例了2个检测单元，可同时进行2个样本的外泌体提取。当然亦可以是3个、4个、5个等设计。

图2是芯片上层单个单元平面结构图。包括有：样本槽12、第一储液槽11、第二储液槽32、第三储液槽61、第四储液槽71、过渡槽72、第一滤膜槽21、第二滤膜槽41、混合槽31、分液槽51、滤液收集槽81、提取槽91、第一虹吸流道42、第二虹吸流道52、第三虹吸流道53、第四虹吸流道74、毛细阀73、样本加液孔121和取液孔92。其中各虹吸流道需要做表面亲水处理，特别的第二虹吸流道52的亲水指数小于第三虹吸流道53。

图3是芯片内置滤膜剖面图，以去杂滤膜23为例，去杂滤膜23通过超声焊接、激光焊接或胶粘法键合在第一滤膜槽21侧壁面。第一滤膜槽21侧壁面与底面的夹角90°-150°，图示中优选为120°。第一滤膜槽21与混合槽31之间通过贯穿侧壁面的通孔22连接，通孔22直径0.5-3mm，优选为2mm。

图4是芯片废液和提取液分液原理图。芯片分液结构包括：第二滤膜槽41、分液槽51、第二虹吸流道52、第三虹吸流道53、滤液收集槽81、提取槽91。其中滤液收集槽81内包含：废液定量结构和废液溢流池。当混合液(样本+稀释液+缓冲液)通过第二滤膜槽41中的生物分子过滤膜进入分液槽51成为废液时，由于第二虹吸流道52的亲水指数小于第三虹吸流道53，废液会优先填充满第二虹吸流道52，而第三虹吸流道53由于亲水性相对较差，在短时间见内无法填充满。再次离心后，废液会经过第二虹吸流道52进入滤液收集槽81，并且填充满滤液收集槽81内的废液定量结构，多余的废液则进入废液溢流池。

使用洗脱液对生物分子过滤膜上富集的外泌体进行洗脱时，洗脱液通过生物分子过滤膜进入分液槽51成为提取液，由于第二虹吸流道52出口处连接的滤液收集槽81内的废液定量结构内已充满液体，导致第二虹吸流道52内的空气柱无法排出，因此第二虹吸流道52无法打开，成为常闭阀。而当提取液填充满第二虹吸流道52时，再次离心提取液则会经过第三虹吸流道53进入提取槽91，至此芯片上分液结构完成废液和提取液的分离至两个不同槽。

具体的，采用以下步骤进行样本的外泌体进行提取：

如图5所示，向芯片的样本槽12内加入100μl样本，第一储液槽11内加入100μL稀释液，第二储液槽32内加入200μL缓冲液。

如图6所示，进行芯片第一次离心，转速7000rpm，离心5min，样本和稀释液在第一滤膜槽21内混合，并通过去杂滤膜23进入混合槽31。稀释后的样本通过去杂滤膜23后，样本内的杂质和杂蛋白被过滤，并与缓冲液在混合槽31内混合。

如图7所示，当混合液(样本+稀释液+缓冲液)充满第一虹吸流道42后，再次离心，3400rpm，离心1min。混合液穿过生物分子过滤膜进入分液槽51成为废液，混合液中的外泌体已富集在生物分子过滤膜上。

如图8所示，由于芯片分液结构的作用(具体原理已在图4详细说明)，再次离心，3400rpm，离心1min，废液进入滤液收集槽81内，并填充满滤液收集槽81内的废液定量结构，多余的废液则进入废液溢流池。

如图9所示，芯片上第三储液槽61内加入第一洗脱液，第四储液槽71内加入第二洗脱液，准备对富集在生物分子过滤膜上的外泌体进行洗脱。

如图10所示，芯片进行低转速离心，300rpm，离心1min。由于第三储液槽61出口处不设阀，洗脱液在低转速下进入第二滤膜槽41，但无法穿过生物分子过滤膜，使第一洗脱液与生物分子过滤膜上的外泌体充分接触一段时间，起到孵育的作用。而第四储液槽71出口处设置毛细阀73，毛细阀73宽度0.1-0.3mm，深度0.1-0.3mm，优选宽度0.2mm，深度0.1mm，在低转速下洗脱液2无法突破毛细阀73，仍然停留在第四储液内。

如图11所示，芯片在低转速离心1min后，转速立即升至3400rpm，离心1min。第一洗脱液将生物分子过滤膜上的外泌体大部分洗脱下来后穿过生物分子过滤膜进入分液池成为提取液，第二洗脱液突破毛细阀73进入过渡槽72，停止离心后，第一洗脱液填充满第三虹吸流道53，第二洗脱液填充满第四虹吸流道74。

如图12所示，芯片进行高速离心，8800rpm，离心1min，第二洗脱液穿过生物分子过滤膜，将生物分子过滤膜上剩余的外泌体洗脱下来，由于第三虹吸流道53已经打通，第一洗脱液与第二洗脱液会一起进入提取槽91，通过提取槽91上端的取液孔92，可将带有外泌体的提取液吸出盘片，用于后续分析检测。

本发明的离心式微流控芯片，盘片使用时只需操作人员加入对应的样本和试剂，盘片将自动完成：

1.样本的前处理，包括样本的稀释，稀释样本过超滤膜，去除细胞碎片和杂质、过滤后的样本与缓冲液混合；

2.外泌体富集，包括将外泌体富集在滤膜上，样本中的废液穿过滤膜；

3.外泌体洗脱，包括洗脱液与滤膜孵育，充分洗脱滤膜上的外泌体以及多次洗脱确保将滤膜上的外泌体全部洗脱下来，并且洗脱液不与废液接触，确保提取的外泌体纯度高。

整个外泌体的提取过程包括：样本的前处理、外泌体富集、外泌体洗脱，15Min内即可完成，并且无需大型的冷冻离心设备，无需专业的实验人员进行手工操作，整个提取流程高度自动化，重复性好。

商品化的外泌体提取试剂盒需要大型冷冻离心机，并且操作步骤多，耗时长，需要专业实验人员进行手工操作，并且操作过程中容易出错，导致提取的外泌体量不足、外泌体纯度不够等问题。

为了克服人血浆中外泌体的提取操作复杂、提取外泌体量不足，提取的外泌体纯度不够等问题，本发明提供了一种外泌体提取离心式微流控芯片，芯片集成多种微阀和滤膜，整个提取过程15Min内即可完成，并且无需大型的冷冻离心设备，无需专业的实验人员进行手工操作，整个提取流程高度自动化，重复性好。

上述实施例以提取外泌体为例对本发明做了说明，本发明的离心式微流控芯片也可用于其他生物分子的提取，包括所有用滤膜富集的循环肿瘤细胞、外泌体、特别蛋白等。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (27)

1.一种生物分子提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、向稀释组件(1)中加入样本和稀释液；在缓冲组件(3)中加入缓冲液；

S2、第一次离心处理，样本和稀释液进入第一过滤组件(2)过滤处理；并进入缓冲组件(3)，与缓冲液混合形成混合液；

S3、停止第一次离心；进行第二次离心，混合液进入第二过滤组件(4)；混合液的分泌体富集在所述第二过滤组件(4)内部，其他物质进入分液组件(5)；

S4、停止第二次离心；进行第三次离心，混合液的其他物质进入滤液收集组件(8)；

S5、停止第三次离心，向第一洗脱组件(6)中加入第一洗脱液，向第二洗脱组件(7)中加入第二洗脱液；

S6、进行第四次离心；第一洗脱液进入第二过滤组件(4)，第二洗脱液仍然留在第二洗脱组件(7)中；在进行加速第五次离心，第一洗脱液通过第二过滤组件(4)进入分液组件(5)；

S7、停止第五次离心，进行第六次离心，第二洗脱液进入第二过滤组件(4)进一步进入分液组件(5)，第一洗脱液和第二洗脱液均进入洗脱液收集组件(9)；

S8、从洗脱液收集组件(9)中提取外泌体。

2.根据权利要求1所述的生物分子提取方法，其特征在于，

所述稀释组件(1)出口端连接第一过滤组件(2)，所述第一过滤组件(2)的出口端连接缓冲组件(3)，所述缓冲组件(3)的出口端连接分液组件(5)，所述分液组件(5)的还连接所述第二洗脱组件(7)的出口端，所述分液组件(5)的出口端分别连接滤液收集组件(8)和洗脱液收集组件(9)；

所述稀释组件(1)、第一过滤组件(2)、第二过滤组件(4)、缓冲组件(3)、第一洗脱组件(6)、第二洗脱组件(7)、分液组件(5)和滤液收集组件(8)和洗脱液收集组件(9)均为环槽结构。

3.根据权利要求2所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述稀释组件(1)包括：添加和存储稀释液的第一储液槽(11)；添加和存储样本的样本槽(12)，所述第一储液槽(11)和样本槽(12)的出口端连接第一过滤组件(2)。

4.根据权利要求3所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第一储液槽(11)和样本槽(12)均为环形结构，且相邻设置；在所述第一储液槽(11)和样本槽(12)相互靠近位置开设出口，并与所述第一过滤组件(2)连接。

5.根据权利要求4所述的生物分子提取方法生物分子提取方法，其特征在于，样本槽(12)上端设置有样本加液孔(121)。

6.根据权利要求4所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第一过滤组件(2)包括：第一滤膜槽(21)，所述第一滤膜槽(21)一端与所述稀释组件(1)导通连接，所述第一滤膜槽(21)另一端开设有通孔(22)与所述缓冲组件(3)连接，在所述通孔(22)靠近第一滤膜槽(21)的端部设置有去杂滤膜(23)。

7.根据权利要求6所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述通孔(22)靠近第一滤膜槽(21)端部的侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为30-150°。

8.根据权利要求7所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述通孔(22)靠近第一滤膜槽(21)端部的侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为120°。

9.根据权利要求7所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述去杂滤膜(23)的孔径为0.22-0.03微米的超滤膜。

10.根据权利要求6所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述通孔(22)的直径为0.5-3mm。

11.根据权利要求6所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述缓冲组件(3)包括：混合槽(31)、储存缓冲液的第二储液槽(32)；所述混合槽(31)的入口端导通连接所述第一过滤组件(2)的出口端，所述第二储液槽(32)的出口端连接所述混合槽(31)。

12.根据权利要求11所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述混合槽(31)的深度为1-5mm。

13.根据权利要求11所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第二过滤组件(4)包括：第二滤膜槽(41)；所述第二滤膜槽(41)的入口端通过第一虹吸流道连接缓冲组件(3)的出口端，所述第二滤膜槽(41)的出口端连接分液组件(5)；

所述滤膜槽的出口端设置有生物分子过滤膜。

14.根据权利要求13所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第二滤膜槽(41)的出口端侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为30-150°。

15.根据权利要求14所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第二滤膜槽(41)的出口端侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为120°。

16.根据权利要求13-15任意一项所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第一虹吸流道的宽度为0.1-0.5mm，第一虹吸流道的深度为0.1-0.5mm。

17.根据权利要求13-16任意一项所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第一洗脱组件(6)包括：第三储液槽(61)，所述第三储液槽(61)的出口端连接第二滤膜槽(41)。

18.根据权利要求17所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第二洗脱组件(7)包括：第四储液槽(71)、过渡槽(72)；所述第四储液槽(71)与过渡槽(72)之间通过毛细阀(73)导通连接，所述过渡槽(72)的出口端通过第四虹吸流道(74)与所述第二滤膜槽(41)导通连接。

19.根据权利要求18所述的生物分子提取方法，其特征在于，第三储液槽(61)的深度为3-5mm，出口流道的宽度为3-5mm，出口流道的深度与第三储液槽(61)深度相同；

所述毛细阀(73)的宽度为0.1-0.2mm，深度为0.1-0.2mm，长度为2-5mm。

20.根据权利要求11所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述分液组件(5)包括：分液槽(51)，所述分液槽(51)的入口端连接第二过滤组件(4)的出口端，所述分液槽(51)的两端分别通过第二虹吸流道(52)和第三虹吸流道(53)连接滤液收集组件(8)和洗脱液收集组件(9)。

21.根据权利要求20所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第二过滤组件(4)出口端的孔径为直径为0.5-3mm。

22.根据权利要求20所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述第二虹吸流道(52)的亲水指数小于第三虹吸流道(53)。

23.根据权利要求20-22任意一项所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述滤液收集组件(8)包括：滤液收集槽(81)、滤液收集池(82)，所述滤液收集槽(81)的入口端连接第二虹吸流道(52)，所述滤液收集槽(81)的溢流口连接滤液收集池(82)。

24.根据权利要求23所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述滤液收集槽(81)为废液定量结构，所述废液定量结构的定量大小为100-300μl的废液。

25.根据权利要求20-22任意一项所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述洗脱液收集组件(9)包括：提取槽(91)，所述提取槽(91)一端第四虹吸流道(74)连接，所述提取槽(91)一端开设有取液孔(92)。

26.根据权利要求20所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述稀释组件(1)、第一过滤组件(2)、第二过滤组件(4)、缓冲组件(3)、第一洗脱组件(6)、第二洗脱组件(7)、分液组件(5)、滤液收集组件(8)和洗脱液收集组件(9)分别中心对称设置有两个。

27.根据权利要求26所述的生物分子提取方法，其特征在于，所述步骤S1为：样本槽(12)内加入人样本，第一储液槽(11)内加入稀释液，第二储液槽(32)内加入缓冲液；

所述步骤S2为：进行芯片第一次离心，样本与稀释液一同进入第一滤膜槽(21)，缓冲液进入混合槽(31)，离心一定时间后，样本与稀释液通过第一滤膜槽(21)内的去杂滤膜(23)，并与混合槽(31)内缓冲液混合；

所述步骤S3为：停止第一次离心后，混合液充满第一虹吸流道；进行第二次离心，混合液进入第二滤膜槽(41)，离心一定时间后，混合液通过第二滤膜槽(41)内的生物分子过滤膜，进入分液槽(51)；混合液中的外泌体富集在生物分子过滤膜上；

所述步骤S4为：停止第二次离心后，混合液优先填充满第二虹吸流道(52)，在第三虹吸流道(53)未填充满时，进行第三次离心，混合液进入滤液收集槽(81)内的废液定量结构，多余的混合液进入废液溢流池；

所述步骤S5为：向芯片第三储液槽(61)内加入第一洗脱液，第四储液槽(71)内加入第二洗脱液；

所述步骤S6为：进行第四次离心，即低速离心，第一洗脱液进入第二滤膜槽(41)，第二洗脱液扔在停留在第四储液槽(71)内；进行第五次离心，即高速离心，第一洗脱液通过生物分子过滤膜进入分液池，第二洗脱液突破毛细阀(73)门进入过渡槽(72)；

所述步骤S7为：停止第五次离心后，进入过渡槽(72)的第二洗脱液填充满第四虹吸流道(74)；进行第六次离心，第二洗脱液进入第二滤膜槽(41)并穿生物分子过滤膜进入分液槽(51)，第一洗脱液和第二洗脱液一同进入提取槽(91)；

所述步骤S8为：通过提取槽(91)将含有外泌体的提取液从芯片中取出。

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