CN113403242B - 突变的米曲霉菌株 - Google Patents

突变的米曲霉菌株 Download PDF

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Abstract

本发明涉及突变的米曲霉菌株。具体地，本发明涉及突变的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，其相对于未突变的菌株，内源酶，例如淀粉酶和/或外源蛋白，如食品用脂肪酶，优选选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶的生产能力提高。本发明还涉及所述菌株的各种用途。

Description

突变的米曲霉菌株
技术领域
本发明涉及微生物领域，更具体涉及突变的米曲霉菌株和采用该菌株得到的重组菌株、生物催化剂等，以及用该菌株生产外源蛋白的方法。
背景技术
米曲霉 (Aspergillus oryzae) 是发酵工业常用的菌株，为好气真菌，属曲霉属，半知菌亚门。米曲霉生产酱油、豆面酱、清酒等许多发酵食品的历史可追溯到1000多年以前, 被美国食品与药品管理局（FDA）列为GRAS( Generally Regards As Safe) 级别并得到了世界卫生组织的认可（ MachidaM. Progress ofAspergillus oryzae genomics.AdvAppl Microbio,l 2002, 51: 81，106），是丝状真菌中应用非常普遍的种属，广泛应用于食品酿造行业、工业酶制剂行业。
米曲霉是一种能产复合酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、植酸酶等的菌株，且米曲霉还具有高效的蛋白分泌表达能力。米曲霉表达外源蛋白具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰***接近高等真核细胞等特点，且表达的外源蛋白具有天然活性。另外，米曲霉还能进行各种翻译后加工，如糖基化修饰蛋白酶切割和二硫键的形成等（Meyer V. Genetic engineering of filamentous fungi-progress, obstacle andfuture trends. Biotechnol Adv, 2008, 26(2):177-185）。因而，利用米曲霉作为表达菌株来表达同源和异源蛋白日益受到重视。
在工业生产过程中，米曲霉表达异源蛋白相较于同源蛋白时，表达水平较低（张建军，蔡容华，***，等. 提高蛋白质在米曲霉中表达量的策略. 中国生物工程杂志，2009，29(1) : 111-115）。通常可以采取构建自身蛋白酶缺陷株、使用强启动子、融合表达等策略增强外源蛋白在米曲霉中的表达。但蛋白酶缺陷菌株一般会影响菌株的生长速度，不利于工业生产，而融合表达在食品用酶生产过程中可能存在法规风险，所以使用强启动子的策略一般较为常用。
另外合适的筛选标记是表达***重要的组成部分。米曲霉中的营养缺陷型筛选标记目前使用最多的是硝酸盐还原酶营养缺陷型( niaD - ) 转化***和乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型( pyrG - ) 转化***（于潇淳，马世良. 米曲霉外源表达***研究进展.中国生物工程杂志，2016，36(9) : 94-100）。但是由于米曲霉的菌丝是多核有隔的而绝大部分分生孢子也是多核的，所以使得诱变或基因改造的效率大打折扣，增加了转化***的建立难度（Jun-ichi MARUYAMA., Visualization of Nuclei in Aspergillus oryzaewith EGFP and Analysis of the Number of Nuclei in Each Conidium byFACS.Biosci.Biotechnol.Biochem,65(7),1504-1510,2001）。
在我国，应用于食品中的酶制剂必须符合中华人民共和国国家标准GB2760-食品国家标准\食品添加剂使用标准。其中符合法规的常用的异源表达食品用脂肪酶：米黑根霉（Rhizomucor miehei）、棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）来源的脂肪酶均只能由米曲霉来进行异源表达，体现了米曲霉表达***在食品用酶生产的重要性。但根据现有文献，由米曲霉来进行异源表达食品用脂肪酶，其表达量往往非常低，例如：王斌在米曲霉营养缺陷型宿主菌 (Aspergillus oryzae niaD300 , niaD- )中表达米黑根霉（Rhizomucor miehei）来源的脂肪酶RML，取培养7天的培养液上清，采用碱滴定法测定其酶活只有2.5 U/mL（王斌，潘力，郭勇. 丝状真菌米曲霉外源基因表达***的构建. 华南理工大学学报，2009，37(6) : 84-90），因而，无法满足行业需求。
因此，本领域仍然需要能够高效表达各种蛋白，尤其是食品用脂肪酶的米曲霉菌株。
发明内容
本发明以米曲霉CICC2012为出发菌株，构建了乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型( pyrG - )菌株，并通过ARTP诱变提高了其蛋白表达能力，使之成为有效的异源表达宿主，其可以高效异源表达各种蛋白，尤其是食品用脂肪酶。
具体地，本发明涉及以下方面。
一方面，本发明涉及突变的米曲霉 (Aspergillus oryzae)菌株，其相对于未突变的菌株，内源酶，例如淀粉酶和/或外源蛋白，如食品用脂肪酶，如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶的生产能力提高。在本发明中，术语“内源酶”指的是突变的米曲霉 (Aspergillus oryzae)菌株自身表达的酶，例如，包括但不限于突变的米曲霉 (Aspergillus oryzae)菌株自身表达的淀粉酶。
在一个具体实施方案中，本发明的突变的米曲霉菌株具有CGMCC No.18825的保藏号。
本发明的新的米曲霉菌株能够高效表达异源蛋白。本发明的米曲霉菌株是乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型菌株，内源的淀粉酶表达量较出发菌株可以提高40%以上，例如40%-100%，特别是40%-60%，尤其是45%-55%。在异源表达RML时，比出发菌株的蛋白表达水平的提高了50%-100%，特别是50%-80%，尤其是55%-70%。此外，在表达TLL和FOL时，蛋白表达水平比出发菌株CICC2012相比，提高了40%以上，特别是40-50%。因此，该菌株具有显而易见的高效表达异源蛋白的实用性。
另一方面，本发明涉及重组米曲霉菌株，其通过在上述突变的米曲霉菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得。在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶，例如食品用脂肪酶，如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶。
另一方面，本发明涉及生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入上述突变的米曲霉菌株，并且培养所述菌株以产生目标蛋白。或者，包括培养上述重组米曲霉菌株以产生目标蛋白。在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶，例如食品用脂肪酶，如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶。
另一方面，本发明涉及生物催化剂，其包含上述突变的米曲霉菌株，其中引入了编码外源酶，例如食品用脂肪酶，例如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶的基因。
另一方面，本发明涉及上文所述菌株生产的外源蛋白。所述外源蛋白是酶，例如食品用脂肪酶，例如选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶的食品用脂肪酶。
本发明还涉及重组微生物细胞，其中引入了源自上述突变的米曲霉菌株的菌内成分。在获得本发明的菌株后，可以通过常规技术分离其菌内成分，并且将所述成分引入其它微生物。引入所述成分的重组微生物细胞具有本发明所述菌株的优良性能。在本发明中，术语“菌内成分”指的是指生物体所有遗传物质的总和，具体而言，包括但不限于：编码DNA和非编码DNA、线粒体DNA。
具体地，本发明的突变米曲霉菌株能够用于表达外源蛋白。在获得了本发明的突变米曲霉后，可以将常用的表达载体引入其中，用于表达外源蛋白。例如，表达载体中可以包含启动子和终止子，在启动子和终止子之间具有多克隆位点，可以***编码外源蛋白的基因。启动子中可以包含一个或多个拷贝的增强子。许多商业载体都可以用于本发明的突变米曲霉菌株中进行外源蛋白的表达。
在表达非米曲霉来源的外源蛋白时，某些物种的密码子可能在米曲霉中是稀有的密码子。因此，在引入表达载体时，可以先对编码外源蛋白的基因进行适合本发明的米曲霉的密码子优化，从而增加表达量。
本发明的米曲霉可以表达多种外源蛋白，包括食品用酶，如食品用脂肪酶、药用蛋白、来自植物、动物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白以及可用于研究晶体结构的蛋白等。本发明的表达外源酶组分的米曲霉还可以以全细胞作为生物催化剂。
附图说明
图1是本发明构建的RML基因表达载体示意图。
图2是本发明的菌株BC4与出发菌株CICC2012以及菌株PyrG L4表达的内源淀粉酶的酶活对比图。
图3是本发明的菌株BC4与出发菌株CICC2012以及菌株PyrG L4表达的内源淀粉酶的蛋白电泳图。
图4是本发明的菌株BC4与出发菌株CICC2012以及菌株PyrG L4表达的米黑根毛霉脂肪酶RML的酶活对比图。
图5是本发明的菌株BC4与出发菌株CICC2012以及菌株PyrG L4表达的RML的蛋白电泳图。
图6是500L发酵罐中本发明的菌株BC4与出发菌株CICC2012以及菌株PyrG L4表达的淀粉酶的酶活对比图。
图7是500L发酵罐中本发明的菌株BC4与出发菌株CICC2012以及菌株PyrG L4表达的米黑根毛霉脂肪酶RML的酶活对比图。
具体实施方式
本发明的初始菌株米曲霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（简称CICC），菌株保藏号CICC2012。初始菌株先通过在肌醇平板上，富集生长单核孢子后，再经过紫外诱变，最后通过在筛选平板上添加5-氟乳清酸和尿嘧啶来进行筛选，获得了乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型菌株PyrG L4。再利用ARTP诱变的方式，筛选到了一株菌株BC4，其在500L发酵罐上的淀粉酶活性达到12264U/mL, 与出发菌株CICC2012和PyrG L4相比，淀粉酶表达量提高了52.2% 和51.4%。在本发明中，术语“ARTP”是常压室温等离子体（Atmosphericand Room Temperature Plasma）的简称，具体指，能够在大气压下产生温度在25-40 °C之间的、具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）浓度的等离子体射流。术语“ARTP诱变”，即利用常压室温等离子体技术进行菌株诱变，具体而言，采用氦气为工作气体的常压室温等离子体源中含有多种化学活性粒子成分，如OH、氮分子二正***、氮分子一负***、激发态氦原子、氢原子和氧原子等。ARTP富含的活性能量粒子对菌株/植株/细胞等的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。SOS修复强度，和DNA受损伤的程度有很大关联。
尝试在米曲霉菌株BC4中使用添加了12个拷贝增强子序列的烯醇化酶启动子异源表达食品用米黑根毛霉脂肪酶RML，结果发现在500L发酵罐上BC4表达的RML脂肪酶酶活达到6488U/mL, 与出发菌株CICC2012和PyrG L4相比，提高了68.1% 和58.0%。相比现有技术，例如：王斌在米曲霉营养缺陷型宿主菌 (Aspergillus oryzae niaD300 , niaD- )中表达米黑根霉（Rhizomucor miehei）来源的脂肪酶RML，其酶活只有2.5 U/mL（王斌，潘力，郭勇.丝状真菌米曲霉外源基因表达***的构建. 华南理工大学学报，2009，37(6) : 84-90），本发明由米曲霉来进行异源表达食品用脂肪酶RML的优势非常明显。
发明人也进行了棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶TLL和尖孢镰刀菌（ Fusarium oxysporum）脂肪酶FOL在米曲霉菌株BC4中的表达，均可以进行高效表达， 结果显示，使用BC4表达获得的TLL和FOL时，蛋白表达水平比出发菌株CICC2012相比，提高了45.6% 和40.5%，从而证明其作为食品用脂肪酶表达***具有明显的优势。而且，发明人还发现，使用米曲霉BC4表达的目的酶，例如RML、TLL和FOL等，在具体应用时具有明显的应用价值，例如：
1、可以使用米曲霉BC4表达获得的RML和TLL进行固定化，获得的固定化RML酶制剂和固定化TLL酶制剂。当使用固定化RML酶制剂和固定化TLL酶制剂来进行OPO的生产时，在满足GB30604-2015，OPO产品中二位棕榈酸含量要大于52%，1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量（以C52计）要高于40% 的要求下，固定化RML的使用批次不少于40次，固定化TLL的使用批次不少于60次，明显优于使用商品酶Novozym® 40086获得的固定化酶的使用批次，米曲霉BC4表达的RML和TLL应用于OPO的生产，既能满足生产指标要求，又能重复多批次的使用，大大降低了生产成本，具有明显的经济价值。
2、使用米曲霉BC4表达获得的FOL对毛油进行酶法脱胶，其脱胶效果显著，具体而言，可以通过一步脱胶，将油脂含磷量降至10ppm以下，从而后续直接进行物理精炼，省去化学精炼段，节省精炼工序和炼耗，降低了生产成本，也做到了环境友好。
实施例1：乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型米曲霉菌株的获得
参考专利CN201310288060.3，将米曲霉CICC2012菌种孢子接种涂布至添加了0.04%肌醇的MM固体培养基（1%葡萄糖，0.15% KH2PO4，0.6% NaNO3，0.05% KCl，0.05%MgSO4，2%琼脂粉）上， 28℃，静置培养5天，获得富集的单核米曲霉孢子。用孢子洗液（0.9%NaCl，0.05%吐温80）洗脱新鲜的米曲霉CICC2012孢子，通过Miracloth（Calbiochem，Cat#475885）过滤制备成孢子悬液，用无菌水洗涤菌体2次并调整至1×107 个/mL。取2mL孢子悬浮液均匀分散在培养皿表层，置于超净工作台紫外灯下照射90s，取100μL涂布于添加了0.3% 尿嘧啶(Uracil)和1mg/mL 5-氟乳清酸(5-FOA)的MM固体培养基上，28℃，避光培养（全过程在红光下操作，防止回复突变）7天。将上一步在MM固体培养基上长出来的单菌落，转接到MM固体培养基、MM-Uracil固体培养基上，挑取只能在MM-Uracil固体培养基上生长的菌株，从而获得乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型米曲霉PyrG L4菌株。通过对米曲霉PyrG L4菌株的pyrG基因测序发现，其第34个核苷酸由C变成了T，对应的氨基酸变化是由精氨酸（CGC）变成了半胱氨酸(TGC)，从而导致pyrG基因失活。
实施例2：RML表达载体的构建
外源的米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶（RML）基因序列如下。
核酸序列：
gtgccaatcaagagacaatcaaacagcacggtggatagtctgccacccctcatcccctctcgaacctcggcaccttcatcatcaccaagcacaaccgaccctgaagctccagccatgagtcgcaatggaccgctgccctcggatgtagagactaaatatggcatggctttgaatgctacttcctatccggattctgtggtccaagcaatgagcattgatggtggtatccgcgctgcgacctcgcaagaaatcaatgaattgacttattacactacactatctgccaactcgtactgccgcactgtcattcctggagctacctgggactgtatccactgtgatgcaacggaggatctcaagattatcaagacttggagcacgctcatctatgatacaaatgcaatggttgcacgtggtgacagcgaaaaaactatctatatcgttttccgaggttcgagctctatccgcaactggattgctgatctcacctttgtgccagtttcatatcctccggtcagtggtacaaaagtacacaagggattcctggacagttacggggaagttcaaaacgagcttgttgctactgttcttgatcaattcaagcaatatccaagctacaaggttgctgttacaggtcactcactcggtggtgctactgcgttgctttgcgccctgggtctctatcaacgagaagaaggactctcatccagcaacttgttcctttacactcaaggtcaaccacgggtaggcgaccctgcctttgccaactacgttgttagcaccggcattccttacaggcgcacggtcaatgaacgagatatcgttcctcatcttccacctgctgcttttggttttctccacgctggcgaggagtattggattactgacaatagcccagagactgttcaggtctgcacaagcgatctggaaacctctgattgctctaacagcattgttcccttcacaagtgttcttgaccatctctcgtactttggtatcaacacaggcctctgtacttaa (SEQ ID NO:1)。
氨基酸序列：
VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAMSIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALDLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCT(SEQ ID NO:2)。
具体操作参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)的方法，构建RML基因表达载体pAOP-Eno-E，如图1所示，过程如下：
用 SphI 和 HindIII 酶切位点将从生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成获得的RML基因（SEQ ID NO:1，带米曲霉α-淀粉酶信号肽（NCBI序列号：XM_001821384.2，1-63bp序列））***到以米曲霉烯醇化酶启动子（NCBI序列号：D63941.1，215-734bp；含12拷贝增强子序列( gtcgtgtcgggcatttatcgggggatggaccaatcagcgtagg，SEQ ID NO:3)）和黑曲霉糖化酶终止子（NCBI序列号：AF214480.1，其中终止子序列部分）的表达框中，将整个表达框以 BglII和 XhoI ***到克隆载体 pSP72 的多克隆位点，最后将米曲霉来源的PyrG表达基因（NCBI序列号：AB017705.1）以XhoI酶切位点***到载体上，从而构建好RML基因表达载体pAOP-Eno-E。
实施例3：米曲霉PyrG L4回补实验
用孢子洗液（0.9%NaCl，0.05%吐温80）洗脱新鲜的米曲霉PyrG L4孢子，通过Miracloth过滤制备成孢子悬液，并调整至1×107 个/mL。接种1mL 孢子悬液至菌丝培养基（2%胰蛋白胨，1%酵母抽提物，2%葡萄糖，0.3%尿嘧啶）中，于28℃，180rpm，培养 40小时，用灭菌Miracloth 过滤收集长出的菌丝。
收集的菌丝用灭菌的渗透压稳定剂（0.6 M MgSO4，10mM NaH2PO4，pH=5.8）冲洗三次，压干。菌丝转移至100mL三角瓶中。每 0.8g 菌丝重悬在 20mL 的酶解液（用渗透压稳定剂配制1%裂解酶，1%纤维素酶，0.1%蜗牛酶的酶解液，用 0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌）中，于30℃，90 rpm，酶解60-90min。酶解好的原生质体混合液用 Miracloth 过滤，收集滤液，4℃，1000g 离心 10min，用 5mL 预冷的1.0mol/L 山梨醇溶液重悬原生质体沉淀，于800g，4℃ 离心10min，弃上清。再用预冷的 STC溶液（1.0 M山梨醇，50mM CaCl2，50mM Tris-HCl，pH=7.5）将原生质体调整至1 ×107 个/mL，冰浴待用。
向 200μL 原生质体悬液中，加入10μL浓度为1μg/μL的RML表达载体 pAOP-Eno-E，再添加 50μL PTC溶液（40% PEG4000，50mM CaCl2，50mM Tris-HCl，pH=7.5），混匀后冰浴30min。加入 0.2mL PTC 溶液，混匀后再加入 0.8mL PTC 溶液，混匀，室温保持 30min。
将上述混合液铺于再生培养基（1%葡萄糖，0.6%NaNO3，0.15% KH2PO4，0.05% KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4，1M蔗糖，2%琼脂粉）上， 28℃，培养7天，待菌落长出。
将在平板上长出的菌落，转接至 PDA- Rhodamine B 筛选培养基上，28℃，培养3-6 天。
PDA- Rhodamine B 筛选培养基制备方法如下：
-- PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g 水1000mL，pH 值自然；
-- 橄榄油乳化液：以 1:3 体积比加入橄榄油与 4% 的聚乙烯醇（PVA）溶液并混合，用高速匀浆机 8000rpm 匀浆 15min，间歇 5min 后再搅拌 3min；
PDA培养基和橄榄油乳化液分别 115℃，高压灭菌15min；待冷却至 60℃ 左右，按9:1 加入 PDA 培养基和橄榄油乳化液，再加入1/100体积的过滤灭菌的 0.1% 罗丹明B（Rhodamine B）溶液，混匀后立即倒平板。
转化发现米曲霉PyrG L4可以很好的实现pyrG基因回补实验，且转化子在PDA-Rhodamine B 筛选培养基表现出脂肪酶活性，进一步证明成功的建立了以乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶营养缺陷型米曲霉菌株PyrG L4为宿主的米曲霉表达***。
实施例4：米曲霉PyrG L4 ARTP诱变实验
用孢子洗液（0.9%NaCl，0.05%吐温80）洗脱新鲜的米曲霉PyrG L4孢子，通过Miracloth过滤制备成孢子悬液，并调整至2×107 个/mL。将孢子悬液与10%甘油 1:1混合后，取10μL混合液至铁片上用ARTP仪器（无锡源清天木生物科技有限公司，仪器型号：ARTP-M）处理100s，仪器参数设置：射频功率量程120W、氦气量10 SLM（99.999% 的高纯氦气）、照射距离 2mm）。
处理结束后，将小铁片取下放入已装有1mL 无菌水的离心管中，后用枪头反复吸取，使铁片上的菌体洗下来，再稀释到合适浓度后再涂布在添加了尿嘧啶的淀粉酶筛选平板（PDA培养基添加了1%可溶性淀粉和0.3%尿嘧啶）上，放置在30℃培养箱中培养3d，挑选水解圈较大的菌落。
实施例5：淀粉酶高产菌株的筛选
将实施例4中挑选出来的淀粉酶水解圈较大的菌落接种至24孔板中，孔板中添加了3mL发酵培养基（4%玉米浆干粉，3.5%玉米糊精，0.15%磷酸二氢钾，0.6%十二水磷酸氢二钠，0.05%七水硫酸镁，0.3%尿嘧啶）180rpm，28℃，8天，进行初筛。
再将初筛获得的较好的淀粉酶酶活较高的菌株进行摇瓶发酵进行复筛，复筛发酵培养基同初筛，装液量为50mL/250mL三角摇瓶，150rpm，28℃，8天。
淀粉酶测定方法：
取洁净无菌离心管（2mL或1.5mL），依次加入浓度为200uL的淀粉底物（吸取20mL可溶性淀粉（20g/L）于试管中，加入磷酸缓冲液（称取45.23g十二水磷酸氢二钠和8.07g一水柠檬酸，用水溶解并定容至于1000mL，pH值6.0）5mL，摇匀）和100uL适当稀释的酶液，上下颠倒充分混合淀粉底物及酶液，并迅速放入60℃水浴锅中进行时长为10min酶促反应。反应结束后立即向每管加入450uL DNS（称取10g 3,5-二硝基水杨酸于水中，溶解后加入20gNaOH、200g酒石酸钠，加水定容至500mL，加热溶解后加2 g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠，加热溶解，冷却，用水定容至1000mL，储于棕色瓶中，1周后使用）并充分混匀以迅速终止反应，沸水浴10min 后转移入冰水浴中快速冷却。取洁净的酶标板依次加入190uL蒸馏水，混匀后用酶标仪测定540nm下每管反应液的吸光值。
淀粉酶活性（U）单位的定义：在上述特定的测定方式下，单位时间（min）催化可溶性淀粉水解并生产还原糖，其还原力相当于1umol葡萄糖所需的酶的量。
酶活力的计算公式
酶活力（U/mL）=
其中：
n：稀释倍数；
ODt：实验组在540nm处的吸光值；
ODc：对照组在540nm处的吸光值；
1000：单位换算倍数；
0.106：葡萄糖标准曲线的斜率；
10：60℃下的反应时间
最终结果见图2淀粉酶酶活图和图3蛋白电泳图。筛选获得了淀粉酶高产菌株BC4，其淀粉酶活性达到6415U/mL, 与出发菌株CICC2012和PyrG L4相比，淀粉酶表达量分别提高了40.4% 和45.1%。
将菌株BC4于2019年10月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号 CGMCC No.18825，分类命名为米曲霉 (Aspergillus oryzae) 。
实施例6：淀粉酶高产菌株BC4的表达能力的考察
米曲霉BC4的转化操作同实施例3，将RML表达载体 pAOP-Eno-E转化入菌株中。
将实施例3中的米曲霉PyrG L4转化子作为对照，另外将pAOP-Eno-E转化入米曲霉CICC2012中，由于米曲霉CICC2012无法使用pyrG为筛选标记，所以使用p3SR2 （(BCCM/LMBP: Accession number：2363)，含乙酰胺酶（amdS）基因），来进行转化筛选。再生培养基需要去除硝酸钠，另外需要补加15mM的乙酰胺和20mM的氯化铯。
三种转化子每种都挑取40个转化子进行摇瓶发酵，发酵培养基（4%玉米浆干粉，3.5%玉米糊精，0.15%磷酸二氢钾，0.6%十二水磷酸氢二钠，0.05%七水硫酸镁）150rpm，28℃，8天，并测定RML脂肪酶活性。
RML脂肪酶活性测定法如下：橄榄油滴定法脂肪酶测定法
（1）0.05M NaOH的配制：先用无CO2水配制5M的NaOH储液；再准确稀释50倍后，称取100℃烘干至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.38g，溶于80mL无CO2水中，标定出其准确浓度，再推算出储液浓度；0.05M NaOH的NaOH溶液以无CO2水用储液现用现配；
（2）PVA-橄榄油乳化液底物的配制:将橄榄油100mL, 300mL 4% PVA1750(聚乙烯醇)混合，加热熔化，用超声波乳化，功率300W，超声3s，间歇4s，99次，循环2次;
（3）取4mL乳化液底物、2mL 0.2M pH8.0的Tris-HCl缓冲液和3 mL无菌水加入到100ml三角瓶中，置于恒温水浴摇床40℃，150rpm温育5min;
（4）取1mL适当稀释的酶液加入到底物和缓冲液中，40℃，150rpm反应15min后加入10mL无水乙醇终止反应;
（5）滴加2滴酚酞作指示剂，用0.05M NaOH滴定酶解产生的脂肪酸，至反应液变粉红色停止;
空白操作与上述一致，只是当底物和缓冲液水浴15min，用无水乙醇终止反应后，再添加1mL适当稀释的酶液。
（6）酶活定义及计算公式
脂肪酶酶活力单位定义为：每分钟催化底物释放出1μmol脂肪酸的酶量为1个脂肪酶活力单位（U）。
酶活计算公式：
酶活力（U/mL）=
式中： V：滴定样液所消耗的NaOH溶液体积 (ml)
V0：滴定空白样所消耗的NaOH溶液体积 (ml)
t：反应时间 (min)
n：酶液体积 (ml)
M：滴定用的NaOH溶液的浓度 (mmol/L)
酶活测定结果如图4所示。结果显示，BC4表达的RML脂肪酶酶活达到5560U/mL, 比出发菌株CICC2012和PyrG L4相比，提高了66.9% 和60.6%。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：使用0.22μm滤膜过滤处理上清液，将等量上清液使用Milipore 10KDa超滤浓缩罐浓缩到相同体积后，取相同体积的浓缩酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。电泳结果如图5所示。蛋白电泳图的结果显示，BC4转化子的RML蛋白条带浓度明显高于对照。
BC4菌株蛋白表达水平提高的具体原因推测可能是其细胞内的转录、翻译或分泌效率提高导致的，而在RML表达时可以将其利用，进而也就提高了异源表达RML的水平。
实施例7： BC4及BC4-RML菌株500L发酵罐实验
500L 发酵罐培养基为各营养成份浓度按总体积300L配制，包括最初定容体积245L，消罐冷凝水25L左右，0小时(0h)加糊精溶液30L。
基础培养基：5610g玉米浆干粉，207g磷酸二氢钾，994g十二水磷酸氢二钠，41.53七水硫酸镁, 定容245L（发酵PyrG L4 和BC4需要补加0.3%尿嘧啶）；流加培养基与基础培养基一致，定容38L;
消泡剂：10%乳化硅油, 200g/2000mL;
糊精溶液：配制浓度为200g/L，共配制 150L, 共需要30kg。
各发酵参数：发酵温度 28℃、通气0.6vvm、消泡剂按需添加、转速135-280rpm在发酵过程中根据实际情况再做进行调整，流加培养基及糊精溶液从24h时开始流加，发酵约184h。
具体500L发酵罐获得的淀粉酶及RML脂肪酶的活性见图6和图7。
图6的结果显示淀粉酶高产菌株BC4在500L发酵罐上的淀粉酶活性达到12264U/mL, 与出发菌株CICC2012和PyrG L4相比，淀粉酶表达量提高了52.2% 和51.4%。
图7的结果显示，在500L发酵罐上BC4表达的RML脂肪酶酶活达到6488U/mL, 比出发菌株CICC2012和PyrG L4相比，提高了68.1% 和58.0%。
实施例8：在米曲霉菌株BC4表达TLL和FOL
表达TLL和FOL的表达载体构建过程同实施例2，TLL（NCBI序列号：AF054513.1和FOL（NCBI序列号：EF613329.1的基因序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成。
米曲霉BC4的转化操作同实施例3，将TLL和FOL表达载体转化入菌株中。
两种转化子每种都挑取40个转化子进行摇瓶发酵，发酵培养基（4%玉米浆干粉，3.5%玉米糊精，0.15%磷酸二氢钾，0.6%十二水磷酸氢二钠，0.05%七水硫酸镁）150rpm，28℃，8天，并测定脂肪酶活性。
结果显示，BC4表达的TLL和FOL，蛋白表达水平比出发菌株CICC2012相比，提高了45.6% 和40.5%。
实施例9：在米曲霉菌株BC4表达的RML和TLL应用于1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）的生产
将大孔吸附树脂 D101 (购自河北沧州宝恩化工有限公司)，置于去离子水中浸泡约12h 去杂，然后用 95%乙醇浸泡过夜去除有机杂质和其它不溶物，用去离子水冲洗至无醇味，置于去离子水中备用。
称取处理好的D101树脂40g于250ml三角瓶中，加入40mL 蛋白浓度20g/L，pH5的RML或TLL酶液，在25°C摇床中 150rpm 振荡 2h，然后将树脂取出放入干燥的培养皿中，放入冷冻干燥机内进行干燥，分别获得固定化RML和固定化TLL，并以诺维信的RML商品酶Novozym® 40086作为对照（固定化获得的酶记为固定化40086）。
根据GB30604-2015，OPO产品中二位棕榈酸含量要大于52%，1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量（以C52计）要高于40%。
将800g棕榈油硬脂精（IV6）和200g高油酸葵花籽油混合，加热至105℃，在真空下搅拌30min进行脱水。加入1g甲醇钠，在105℃真空搅拌反应30min，加入20g柠檬酸水溶液（15%重量比），搅拌20min终止反应。用热水对反应物进行反复洗涤，脱皂。加热到105℃，真空搅拌30min进行脱水干燥，得到酯交换油脂。
取500g上述酯交换油脂和1000g油酸混合，固定化酶添加量6%，60℃，250rpm气浴反应6h。取出产物重新放入新的底物进行重复反应（考察酶的可重复使用次数）。
将取出的产物通过分子蒸馏除去游离脂肪酸，将脱酸后的油脂在真空下加热到105℃，加入油脂重量1.5%的活性白土，保持真空搅拌30min，过滤得到驼色的油脂。对脱色后的油脂通入氮气（充当搅拌以及脱臭介质），真空度大约为10-20mBar，在240℃下保持1h进行脱臭得到精炼OPO产物，测定其二位棕榈酸占所有棕榈酸含量和1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量（以C52计）。
多次重复实验结果显示，在满足GB30604-2015，OPO产品中二位棕榈酸含量要大于52%，1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量（以C52计）要高于40% 的要求下，固定化RML的使用批次不少于40次，而固定化TLL的使用批次不少于60次，而固定化40086的使用批次在多数情况下未达到20次，从而证明米曲霉BC4表达的RML和TLL应用于OPO的生产，既能满足生产指标要求，又能重复多批次的使用，大大降低了生产成本，具有明显的经济价值。
实施例10：在米曲霉菌株BC4表达的FOL应用于大豆油酶法脱胶
称取30g大豆毛油，升温至55℃；添加一水合柠檬酸水溶液，添加量为0.065%（以无水柠檬酸重计，w/w），10000rpm剪切1.5min（第一次剪切）；温度55℃，搅拌反应1h；添加NaOH水溶液，添加量为无水柠檬酸的1.5倍摩尔比（以NaOH重计），10000rpm剪切30s（第二次剪切）；添加用水稀释的FOL酶液，水添加量为2.5%，FOL酶（成品浓度为10g/L）添加量为50ppm，10000rpm剪切1.5min（第三次剪切）；温度55℃，搅拌反应4h；升温至85℃,反应8min；10000g，离心10min，取出上清液，即为脱胶油，检测脱胶油的含磷量，判断脱胶效果。
毛豆油1 毛豆油2
毛油起始含磷量(ppm) 703.21 806.67
FOL脱胶后含磷量(ppm) 5.21 6.26
结果显示使用米曲霉BC4表达的FOL酶法脱胶，毛油可以实现一步脱胶将含磷量降至10ppm以下，从而后续直接进行物理精炼，省去化学精炼段，节省精炼工序和炼耗，降低了生产成本，也做到了环境友好。
序列表
<110> 丰益(上海）生物技术研发中心有限公司
<120> 突变的米曲霉菌株
<130> CPCH1963261N
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶
<400> 1
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggatgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggt ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt ttcatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa acctctgatt gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagtg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 2
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶
<400> 2
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro
1 5 10 15
Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr
20 25 30
Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp
35 40 45
Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn
85 90 95
Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His
100 105 110
Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu
115 120 125
Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr
130 135 140
Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala
145 150 155 160
Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys
165 170 175
Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu
180 185 190
Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val
195 200 205
Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala
210 215 220
Leu Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn
245 250 255
Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg
260 265 270
Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala
275 280 285
Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val
290 295 300
Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro
305 310 315 320
Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly
325 330 335
Leu Cys
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 增强子
<400> 3
gtcgtgtcgg gcatttatcg ggggatggac caatcagcgt agg 43

Claims (4)

1.突变的米曲霉菌株，其保藏号为CGMCC No.18825。
2.重组米曲霉菌株，其通过在权利要求1的菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得，其中所述外源蛋白选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶。
3.生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入权利要求1的菌株，并且培养所述菌株以产生目标蛋白，或者培养权利要求2的重组米曲霉菌株以产生目标蛋白，其中所述目标蛋白选自米黑根毛霉脂肪酶、棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和尖孢镰刀菌脂肪酶。
4.生物催化剂，其包含权利要求1的突变的米曲霉菌株或权利要求2的重组米曲霉菌株。
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丝状真菌米曲霉外源基因表达***的构建;王斌等;华南理工大学学报(自然科学版);第37卷(第6期);第84页摘要 *
米曲霉基因工程技术的进展;张智敏;庄淼;金锋杰;;生物技术通报(09);全文 *

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