CN113402733A - 复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于创伤敷料制备技术领域，具体涉及一种复合水凝胶及其制备方法和应用。该复合水凝胶包括蚕丝蛋白溶液、银纳米颗粒、芦荟胶，具体制备方法为：将蚕丝蛋白溶液、Ag+溶液、芦荟胶进行混合得混合液；然后将所述混合溶液进行光化学反应得复合水凝胶。本发明提供的复合水凝胶通过组织学观察创伤，能明显得促进新生血管的生成以及在组织学分析中，复合水凝胶诱导产生了较弱的免疫反应并增强了新生血管的形成；生化结果表明，水凝胶可以上调TGF‑β、EGF、VEGF的表达水平，将作为一种十分具有发展前景的伤口敷料来解决未来的临床问题。

Description

复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于创伤敷料制备技术领域，具体涉及一种复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，由表皮和真皮组成，具有复杂的神经和血管网络分布。因此，皮肤的损伤会为患者造成生理上不适和功能性问题的困扰。皮肤在保护人体免受外界机械损伤中发挥着至关重要的作用。皮肤是抵御外界环境的第一道屏障，因此，皮肤的损伤会导致严重的生理和功能紊乱。伤口愈合是一个动态的过程，包括止血、免疫、增殖和重塑四个环节。人体皮肤具有一定的自我愈合能力，然而漫长的修复过程中会不可避免地提高慢性炎症的风险。创伤局部的慢性炎症反应会阻碍成纤维细胞的迁移和ECM的形成，最终减缓伤口愈合的进程。自体皮肤移植被认为是治疗外伤性皮肤缺损最有效的方法。然而，在临床实践中供皮区伤口的护理和康复仍然存在一定的难度。目前，解决该问题的金标准还是采用创伤敷料进行治疗居多。皮肤缺损是一个十分棘手的临床问题，错误的治疗可能导致不可逆的损害。理想的伤口多功能敷料必须具备如下条件：良好的生物相容性、能够完全阻隔外界环境、为伤口愈合提供一个相对湿润的环境，透气性，易分离且不会导致二次损伤。参照上述标准，已有多种生物敷料得以开发。天然材料、合成材料以及两者复合材料是目前主要应用的三种类别。近年来，天然生物材料在科学研究中受到越来越广泛的关注。因此，构建一种具有优良生物活性的伤口敷料是至关重要的。
在众多基于天然生物材料构建的敷料中，蚕丝蛋白(silk fibroin，SF)因其能够通调控某些信号通路的表达进而促进创伤愈合而受到广泛关注，是一种十分具有开发前景的天然生物材料。然而，蚕丝蛋白的抗菌性仍有待提高，其生物学性能也可进一步加强，才能制备出理想的伤口多功能敷料。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种复合水凝胶，该复合水凝胶是基于蚕丝蛋白的一种可用于创伤敷料的凝胶。蚕丝蛋白具有能够通调控某些信号通路的表达进而促进创伤愈合，而银纳米颗粒是一种具有出众性能的天然抗菌剂，芦荟胶是一种从天然草本植物芦荟中提取的产品，具有显著的抗氧化、抗菌、抗炎、抗溃疡等生物活性，现在没有资料报道，蚕丝蛋白在银纳米颗粒、芦荟胶的作用下通过一定的工艺条件得到一种基于蚕丝蛋白的复合水凝胶，作为敷料可以有效治愈创伤，本发明创造性的将蚕丝蛋白、银纳米颗粒、芦荟胶进行结合，制备成一种用于创伤敷料的复合水凝胶。与以往的伤口敷料相比，本发明使用了两种抗菌剂来提高伤口的抗菌性能，从组织学和生化角度评价其促愈合作用。
具体地，蚕丝蛋白是一种从蚕茧中分离的天然生物材料，包括十八种氨基酸，其中丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的占比最高。这些氨基酸有序地通过二硫键排列形成了1：1的比率重链和轻链的结构。大量的氨基酸排列不仅提供了大量的结合位点，同时也保证其结构的稳定性。蚕丝蛋白是一种十分具有应用前景的生物材料，由于其良好的生物相容性、弱的免疫原性、无生物毒性、无致癌性、机械稳定性、可控的降解速率以及高效益的性质已被应用于组织工程领域(如：人造韧带，人造血管等)与其他生物医学领域。蚕丝蛋白内含的多肽序列Arg-Gly-Asp(RGD)能支持多种细胞如表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等的增殖、迁移及分化。蚕丝蛋白有多种应用形式：泡沫、水凝胶、静电纺丝微毡、膜和支架等。在众多应用形式中，水凝胶是伤口敷料最合适的选择。由蚕丝蛋白形成的水凝胶能够在无外源性粘合剂的前提下与皮肤紧密贴合。蚕丝蛋白可在伤愈合的不同时期通过调节各种细胞的增殖、迁移和分化促进伤口愈合，然而，其生物学性能仍可通过引入其他生物活性物质实现显著性改进。
银纳米颗粒是一种具有出众性能的天然抗菌剂，具有广谱抗菌性且无任何耐药性，能在短时间内杀灭有害细菌，具有很强的渗透性，能通过毛孔迅速深入皮下，对常见细菌、真菌以及耐药性细菌有很强的杀伤效果。除了其良好的抗菌性外，银纳米颗粒还能改善伤口周围微环境，有效地加快细胞生长，减少疤痕的形成。银纳米颗粒包被的丝基生物材料能有效地抵抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。此外，SF水凝胶与人体皮肤之间紧密地贴合能保证蚕丝蛋白负载的纳米颗粒能从角质层渗入内层。
芦荟胶是一种从天然草本植物芦荟中提取的产品，其最早的应用记录可追溯到古罗马时期乃至更早。芦荟胶由单宁、皂苷、黄酮类化合物、类固醇和葡甘露聚糖组成，它们通过激活皮肤巨噬细胞和影响成纤维细胞生长因子来刺激成纤维细胞的增殖和迁移，具有很好的伤口愈合潜力。此外，芦荟胶具有显著的抗氧化、抗菌、抗炎、抗溃疡等生物活性。在芦荟胶中葡萄糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸表现出极强的伤口愈合和抗炎活性，其中的微量元素和蒽醌化合物可以分解毒素和消除炎症。其他类似于SF的氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸赋予AV作为外用敷料在皮肤内氨基酸更新过程中的应用潜力。
所述复合水凝胶包括蚕丝蛋白溶液、银纳米颗粒、芦荟胶。
优选地，所述蚕丝蛋白溶液中蚕丝蛋白的分子量＜3500MW。
更进一步地，本发明还提供一种前述复合水凝胶的制备方法，该制备方法是通过光化学反应在高浓度SF存在下原位将Ag+还原成Ag NPs，使得Ag NPs均匀镶嵌在SF表面，而且水凝胶疏松多孔的结构促进了细胞黏附以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的形成。而且该制备方法简单易行，可实现规模化生产。
所述制备方法包括以下步骤：(1)将所述蚕丝蛋白制备成蚕丝蛋白溶液；(2)然后将Ag+、芦荟胶进行混合得混合液；(3)将所述混合溶液进行光化学反应。
优选地，所述蚕丝蛋白的分子量＜3500MW。
优选地，混合溶液中，所述蚕丝蛋白的浓度为4-6wt％，所述Ag+的浓度为0.4-0.6mg/ml，所述芦荟胶的浓度1-9mg/ml。优选为1-3mg/ml，更优选为3mg/ml。
优选地，混合溶液中，所述蚕丝蛋白的浓度为5wt％，所述Ag+的浓度为0.5mg/ml，所述芦荟胶的浓度1-3mg/ml。
优选地，混合溶液中，所述蚕丝蛋白的浓度为5wt％，所述Ag+的浓度为0.5mg/ml，所述芦荟胶的浓度3mg/ml。
优选地，所述蚕丝蛋白溶液、银纳米颗粒、芦荟胶的质量比或体积比为250：2-2.5：5-15。
在某些具体实施例中，复合凝胶的制备方法为将20—30mg的AgNO3与50－150mg的芦荟胶冻干粉加入到50ml，4-6wt％的蚕丝蛋白溶液中充分混合后进行光照。
优选地，先将Ag+与蚕丝蛋白溶液进行混合搅拌，然后加入芦荟胶进行混合搅拌。
优选地，所述Ag+为AgNO3。
优选地，所述光化学反应为：在40W的白炽光下持续光照，所述光照时间≥24h；或于光化学反应仪或光化学反应釜中，选择汞灯、氙灯或金卤灯作为反应光源，设定光照功率为35-45W，反应温度为20－30℃，持续光照≥24h。
具体地，所述蚕丝蛋白的制备方法为本领域技术人员常规的制备方法，比如溴化锂(LiBr)制备，氯化钙-无水乙醇-去离子水溶液(CaCl2-C2H5OH-ddH20)制备方法。
在某些具体实施例中，所述蚕丝蛋白的制备方法为：将蚕茧剪成小块后在0.02MNa2CO3溶液中煮沸60min，除去表面丝胶成分；去离子水冲洗干净后在60℃下干燥；将蚕丝溶解在9.3M LiBr中水浴四小时至蚕丝彻底溶解；将溶解后的溶液在透析袋(截留分子量3500MW)中透析72h获得纯净的蚕丝蛋白溶液；离心15min后过滤除去沉淀。
本发明目的在于还提供一种前述的复合水凝胶的应用。所述复合水凝胶提高了蚕丝蛋白的抗菌性和生物性能，可以很好的用做创伤敷料。
进一步，所述复合水凝胶可以直接用作创伤愈合敷料；也可以作为活性性，然后添加一些增效的辅料制备成创伤愈合敷料；或添加一些外层制备成创口贴之类的医护用品。
具体地，此处指的创伤可以是不同途径对皮肤造成的损伤，比如摔伤，烧伤，刀伤。该复合水凝胶在组织学中，可以诱导产生较弱的免疫反应并增强了新生血管的形成；生化结果表明，可以上调TGF-β、EGF、VEGF的表达水平从而加快创伤的愈合。
因此，进一步地，所述复合水凝胶还可以直接作为血管生成促进剂或直接作为TGF-β、EGF、VEGF中一种或多种细胞因子表达促进剂；或者所述复合水凝胶作为活性剂，添加一些辅料制备血管生成促进剂或制备TGF-β、EGF、VEGF中一种或多种细胞因子表达促进剂。
或制备血管生成促进剂或TGF-β、EGF、VEGF表达促进剂中的应用。
本发明目的在于还提供一种提高蚕丝蛋白抗菌性能/生物性能的方法，该方法是通过向蚕丝蛋白溶液添加具有抗菌性能的银纳米颗粒和具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗溃疡等生物活性的芦荟胶创造性的结合形成一种复合水凝胶从而提高蚕丝蛋白的抗菌性能/生物性能。该复合水凝胶中银纳米颗粒与芦荟胶发挥协同作用对蚕丝蛋白的抗菌性能有所提高。
具体，所述生物性能为本领域技术人员的常规技术名词，包括但不限于细胞毒性、血液相容性，生物相容性，本发明主要提高了其细胞毒性及生物相容性。
所述方法包括以下步骤：(1)将所述蚕丝蛋白制备成蚕丝蛋白溶液；(2)然后将Ag+、芦荟胶进行混合得混合液；(3)将所述混合溶液进行光化学反应。
优选地，所述蚕丝蛋白的分子量＜3500MW。
优选地，混合溶液中，所述蚕丝蛋白的浓度为4-6wt％，所述Ag+的浓度为0.4-0.6mg/ml，所述芦荟胶的浓度1-9mg/ml。优选为1-3mg/ml，更优选为3mg/ml。
优选地，混合溶液中，所述蚕丝蛋白的浓度为5wt％，所述Ag+的浓度为0.5mg/ml，所述芦荟胶的浓度1-3mg/ml。
优选地，混合溶液中，所述蚕丝蛋白的浓度为5wt％，所述Ag+的浓度为0.5mg/ml，所述芦荟胶的浓度3mg/ml。
优选地，所述蚕丝蛋白溶液、银纳米颗粒、芦荟胶的质量比或体积比为250：2-2.5：5-15。
在某些具体实施例中，复合凝胶的制备方法为将20-30mg的AgNO3与50-150mg的芦荟胶冻干粉加入到50ml，4—6wt％的蚕丝蛋白溶液中充分混合后进行光照。
优选地，先将Ag+与蚕丝蛋白溶液进行混合搅拌，然后加入芦荟胶进行混合搅拌。
优选地，所述Ag+为AgNO3。
优选地，所述光化学反应为：使用白炽光进行光化学反应；更优选地，在40W的白炽灯下持续光照，所述光照时间≥24h；或于光化学反应仪或光化学反应釜中，选择汞灯、氙灯或金卤灯作为反应光源，设定光照功率为35-45W，反应温度为20－30℃，持续光照≥24h
具体地，所述蚕丝蛋白的制备方法为本领域技术人员常规的制备方法，比如溴化锂(LiBr)制备，氯化钙-无水乙醇-去离子水溶液(CaCl2-C2H5OH-ddH20)制备方法。
在某些具体实施例中，所述蚕丝蛋白的制备方法为：将蚕茧剪成小块后在0.02MNa2CO3溶液中煮沸60min，除去表面丝胶成分；去离子水冲洗干净后在60℃下干燥；将蚕丝溶解在9.3M LiBr中水浴四小时至蚕丝彻底溶解；将溶解后的溶液在透析袋(截留分子量3500MW)中透析72h获得纯净的蚕丝蛋白溶液；离心15min后过滤除去沉淀。
本发明有益效果在于
本发明提供的复合水凝胶作为创伤敷料对创伤模型动物表现出了良好的愈合效果，在14天的时候，创伤就较对照组有明显的治疗效果。
本发明提供的复合水凝胶通过模型动物不同器官的组织学观察结果也表明具有可靠的生物安全性，比如良好的细胞毒性、良好的细胞增殖、迁移能力等。
本发明提供的复合水凝胶通过组织学观察创伤，能明显得促进新生血管的生成以及在组织学分析中，复合水凝胶诱导产生了较弱的免疫反应并增强了新生血管的形成；生化结果表明，水凝胶可以上调TGF-β、EGF、VEGF的表达水平，将作为一种十分具有发展前景的伤口敷料来解决未来的临床问题。
附图说明
图1为Ag-AV-SF水凝胶的构建过程示意图。
图2为水凝胶在创伤动物模型中的应用示意图。
图3为基于蚕丝蛋白水凝胶的表征图。
图4为芦荟胶促进细胞增殖的能力。
图5为SF水凝胶与Ag-AV-SF水凝胶的FTIR结果。
图6为四种水凝胶的热失重分析结果。
图7为Ag-AV-SF水凝胶中银元素的释放速率。
图8为粘附性能评价模型及组织粘附情况。
图9为猪皮黏附后1h和24h的冷冻切片及其荧光成像。
图10为Ag-AV-SF水凝胶的体内扩散的荧光表征。
图11为不同水凝胶的抗菌环直径示意图。
图12为抗菌环直径大小的统计学分析图。
图13为CCK-8实验情况图。
图14为细胞增殖的荧光表征图像。
图15为划痕实验情况图。
图16为细胞间隔的平均减少量。
图17为伤口愈合状态的动物活体图像。
图18为14天及28天时伤口愈合率统计图。
图19为HE染色、CD31及CD68的免疫组织化学染色情况。
图20为组织在14天时的masson染色。
图21为血管数量统计。
图22为CD31的阳性结果数量。
图23为CD68的阳性结果数量。
图24为第七天时TGF-β的相对表达量。
图25为28天时VEGF的相对表达量。
图26为28天时EGF的相对表达量。
图27为不同器官(心、大脑、脾脏、肺、睾丸、肾脏)的HE染色结果。
图3中，a-d为蚕丝蛋白溶液及持续光照24h后的形态改变；e为还原银纳米颗粒的扫描电子显微镜图像；f为Ag-AV-SF复合水凝胶的内部疏松多孔结构；g为Ag-AV-SF复合水凝胶混合红色素后注射形成的重庆医科大学首字母：Chong Qing Medical University(CQMU)；h-f为Ag-AV-SF水凝胶的元素EDX能谱。
图20中，4X(scale bar:500μm)and 10X(scale bar:200μm)
图1-图27中，有涉及“*”“**”“***”的，*为P<0.05,**为P<0.01,***为P<0.001。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，Ag-AV-SF水凝胶的构建过程如图1所示。
本发明实施例中，水凝胶在创伤动物模型中的应用过程如图2所示。
本发明实施例中，通过光化学反应制备了复合生物水凝胶，采用银纳米粒子和芦荟修饰的SF水凝胶(Ag-AV-SF水凝胶)加速伤口的全层愈合。
本发明实施例中，采用SEM、EDX、FTIR、TGA和ICP-MC对其理化性质进行了表征和研究。
本发明实施例中，使用CCK-8、划痕试验和荧光染色验证其生物活性。
本发明实施例中，在体内进行创面愈合实验，用复合水凝胶治疗创伤模型大鼠，并对CD31、CD68进行HE染色和免疫组化染色以及血清中细胞因子(TGF-β、EGF、VEGF)的表达水平，分析其对创伤模型大鼠的治疗效果。
本发明实施例中，考虑到水凝胶在应用时的生物安全性，对其进行了体内扩散试验和不同器官的HE染色。
实施例1蚕丝蛋白水凝胶的制备
蚕茧剪成小块后在0.02M Na2CO3溶液中煮沸60min，除去表面丝胶成分。去离子水冲洗干净后在60℃下干燥。将蚕丝溶解在9.3M LiBr中水浴四小时至蚕丝彻底溶解。将溶解后的溶液在透析袋(截留分子量3500MW)中透析72h获得纯净的蚕丝蛋白溶液。离心15min后过滤除去沉淀。最后将蚕丝蛋白溶液浓度调整至5wt％。Ag-SF，AV-SF，Ag-AV-SF三种凝胶分别通过将AgNO3、AV以及两者的混合体系溶解在蚕丝蛋白溶液中。确保最安全的生物毒性以及Ag(Ⅰ)完全还原为Ag(0)，将AgNO3浓度设定为0.5mg/ml。
其中Ag-AV-SF的制备为：将25mg的AgNO3与150mg的芦荟胶冻干粉加入到50ml，5wt％的蚕丝蛋白溶液中充分混合后得预凝胶溶液，将预凝胶溶液转移至培养皿中，在40W的白炽灯下持续光照24h以获得最后的水凝胶。
Ag-SF、AV-SF、SF水凝胶的制备参照上述方法。
水凝胶形成过程中情况如图3中的a、b、c、d所示，预水凝胶溶液(a-b)由透明澄清溶液成功转化为粘稠的深黄色水凝胶(c-d)，经光照后，水凝胶附着在样品瓶底部。
通过扫描电子显微镜观察(SU8010，Hitachi，Ltd.Tokyo，Japan)由蚕丝蛋白原位还原所制备的银纳米颗粒，以及在冷冻干燥后观察水凝胶的空间结构，情况如图3中的e所示，所制备的Ag NPs均匀地分散在蛋白质上，证明了在复合体系中Ag NPs是通过SF原位还原而获得的。
为验证SF溶液成功还原银纳米粒子，对Ag-AV-SF混合溶液进行了SEM表征，情况如图3中的f所示，Ag-AV-SF水凝胶的SEM结果显示，水凝胶内部结构疏松多孔。
随后，将水凝胶与红色素混合后，将重庆医科大学(CQMU)的首字母首字母绘制在透明玻璃上，以展示该水凝胶具有良好的可塑性，情况如图3中的g所示。
Ag-AV-SF水凝胶的EDX光谱特征峰表明，结果如图3中h部分所示，SF成功地发挥了其还原作用，形成了Ag NPs。
元素图分析情况如图3中的i部分所示，分散良好的氮(蓝色)、银(绿色)和碳(浅黄色)证实了Ag NPs镶嵌在SF表面，这表明最终的Ag NPs是在高浓度SF存在下原位还原得到的。
实施例2芦荟胶最适浓度的筛选
将L929细胞种植在96孔板中。以不同浓度芦荟胶溶液作为刺激因素，作用24h后加入CCK-8试剂，37℃孵育2h，检测吸光度值选择芦荟胶的最适浓度。
结果如图4所示，芦荟胶浓度在1mg/ml-9mg/ml，最佳为3mg/ml。
实施例3水凝胶物理学性能研究
(1)傅里叶变换红外光谱
通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)(Thermo Fisher Scientific-CN，USA)在4000cm-1—400cm-1研究凝胶复合体系中官能团的结合情况，不同水凝胶内部官能团结合的变化情况如图5所示：C-N拉伸(1451.88cm-1)转变为新形成的C-N键(1017.68cm-1)；Ag-AV-SF体系中C-O键(3339.11cm-1)，C＝O键(1634.70cm-1，1249.80cm-1)以及N-H拉伸(1543.73cm-1)的作用强度明显高于SF水凝胶。在碱性环境下，由酪氨酸产生的α-氨基氮和α-羧基氧通过配位键与银离子形成配合物，形成了拉伸振动现象。
(2)热失重分析
通过热失重分析仪(SDT650，TA，USA)检测四种复合凝胶从室温升温至500℃过程中的相对重量变化情况，测试了SF、AV-SF、Ag-SF和Ag-AV-SF四种水凝胶的热稳定性，情况如图6所示，当温度从室温升至500℃后，Ag-AV-SF水凝胶的相对质量仍然高于其他水凝胶，并在整个加热过程中保持这一趋势。TGA结果表明，Ag-AV-SF水凝胶具有良好的热稳定性，表明其在保存和实际应用条件下能保持结构的完整性。
(3)银离子释放速率
在不同时间点收集样品，通过电感耦合等离子体源质谱仪(Agilent7900，USA)检测样品中银元素的含量，并通过公式计算。
Figure BDA0003080750110000081
(M1：银元素的总含量；D：检测时间点)
Ag+的释放速率如图7所示，PBS透析7d后(p H＝7.4)，Ag NPs的释放质量达到60.256％；释放率约为10％/天。此外，连续7个检测点的Ag含量呈线性关系(R2＝0.9628)，表明银纳米颗粒在整个释放过程中是连续且均匀的。在体内实验中，水凝胶敷料每3天重复注射一次，因此在创面释放的银纳米颗粒可以有效抑制细菌生长，提高生物活性。
实施例4组织粘合性测试
采用图8中所示的模型(a)评价Ag-AV-SF水凝胶的粘附性能，将Ag-AV-SF水凝胶与FITC混合后涂敷于一块洁净的猪皮表面，取另一块相同大小的猪皮覆盖在其表面。分别在第1h和24h进行冷冻切片，并在荧光显微镜下观察。将Ag-AV-SF水凝胶涂敷于一块洁净的猪皮表面，取另一块相同大小的猪皮覆盖在其表面，使两者紧密结合，一端悬挂于橡皮筋上，另一端于重物相接，重物最大重量作为评估粘合程度的指标。悬挂15g重物后两块猪皮仍然能紧密地贴合在一起(如图8中的b)，这表明水凝胶有良好的的组织粘附性，可用于后续的动物活体实验。
在两片猪皮之间注射FITC标记的水凝胶1小时和24小时后，拍摄猪皮冷冻切片的荧光图像，结果如图9所示，可以清楚地看到，1个小时后(图9中c、d)和24小时后(图9中e、f)水凝胶仍然牢固地附着在每个猪皮的表面，这表明采用上述方法制备的水凝胶对皮肤创面具有良好的粘附性能。此外，水凝胶的溶胀性使其有效地扩张并覆盖病变区域。这些结果表明，该复合水凝胶可用于伤口，并与周围组织紧密粘附，同时保护伤口组织不受外界环境的影响。
实施例5体内荧光扩散实验
麻醉大鼠后，剃除大鼠背部表面毛发，取一片0.5×0.5cm2皮肤。将FITC标记的Ag-AV-SF水凝胶涂抹在伤口上进行扩散荧光表征。0、4、12、24h后，用多功能激光扫描***记录扩散情况，情况如图10所示，水凝胶没有扩散到全身，而是相对固定在伤口部位。
实施例6抗菌性实验
以革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌为模型菌。采用改进的K-B法评价了不同水凝胶的抗菌活性。将100μl的菌悬液接种在琼脂板上，分为4个平行的控制区:SF区、Ag-SF区、AV-SF区和Ag-AV-SF区。将四种水凝胶涂在相应的区域，水凝胶的直径控制在6mm。37℃孵育24h后测定抗菌环直径，评价抗菌能力。
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抗菌环检测结果如图11所示，统计分析结果如图12所示(其中b为大肠杆菌，c为金黄色葡萄球菌)。Ag-AV-SF水凝胶对大肠杆菌(13.92±0.94mm)和金黄色葡萄球菌(10.623±0.61mm)的抑菌环直径最大，释放的活性成分最多，表明Ag-AV-SF水凝胶的抑菌性能优于其他组，也证实了AV和Ag NPs提高了SF的抗菌性能。
实施例7L929细胞的细胞毒性实验
实验中细胞均培养于含1％P/S溶液和10％胎牛血清的DMEM中(37℃，5％CO2)。采用CCK-8法检测不同水凝胶的细胞毒性。L929细胞接种后，在96孔板上培养(5000/孔)。L929细胞采用四种类型的预凝胶溶液(10μl/孔)刺激24h后，加入CCK-8溶液(10μl/孔)在37℃下孵育2h。通过分光光度计测量450nm处吸光度值用于评估其细胞毒性，结果如图13所示，Ag-AV-SF水凝胶处理组的细胞增殖水平显著高于其他平行实验组，该生物学特性有利于创面细胞在恢复过程中增殖，有效减少创面。
实施例8水凝胶的体外细胞增殖
L929细胞在6孔板上培养24小时后，将原始培养基丢弃，用新鲜培养基取代，并与含有SF、Ag-SF、AV-SF或Ag-AV-SF预水凝胶溶液的培养基再培养24小时。FITC标记的鬼笔环肽用于显示细胞骨架的形态，DAPI用于显示细胞核的位置。
结果如图14所示，对L929细胞进行荧光染色以评估水凝胶对细胞增殖的促进作用。加入水凝胶24h后，Ag-AV-SF水凝胶处理组的细胞核(蓝)和细胞骨架(绿)的荧光强度表现出了最高水平，表明Ag-AV-SF水凝胶具有良好的促进细胞增殖作用。
实施例9细胞迁移实验
L929细胞在上述相同的环境中培养。将L929细胞接种到6孔板上，并培养至细胞完全覆盖。用尺子在培养皿中划出一个约150μm的缺口；用PBS洗涤细胞2次，加入不含血清的DMEM培养基，加入50μl不同的预凝胶溶液，在培养箱中培养细胞。24h后，用显微镜观察划痕初期和后期细胞迁移情况。通过划痕实验对其促进细胞迁移能力进行研究。
情况如图15和图16所示，Ag-AV-SF水凝胶处理组的划痕宽度相较于其他实验组减少最多(97.01±18.96μm)，L929细胞之间相对距离的减少表明银纳米颗粒和芦荟的结合具有促进细胞迁移的协同。
实施例10伤口愈合实验
45只大鼠(成年雄性SD大鼠，由重庆医科大学实验动物中心提供)随机分为5组(n＝9)。使用麻醉机(RWD Life Science，Shenzhen，China)用异氟烷麻醉后，剃除背部表面毛发，从背部取1.0×1.0cm2的皮肤；然后用碘伏和酒精清洗避免感染，然后用不同的水凝胶覆盖伤口。对照组只给予碘仿和酒精治疗。大鼠在相同条件下单独饲养，以防止咬伤和交叉感染。各种水凝胶敷料每3天更换一次，直到28天。在第7、14、21和28天，拍摄伤口的照片。
伤口愈合情况如图17和图18所示，分别在第0、7、14、28天记录伤口状况。在第7天，伤口面积没有明显减少，因为愈合的早期阶段主要与炎症反应有关。第14天，Ag-AV-SF混合水凝胶处理组的愈合面积较其他各组减少较多，说明Ag-AV-SF水凝胶在创面修复中期具有良好的抗菌性能。第28天，Ag-AV-SF混合水凝胶处理创面范围接近完全闭合(98.08％±1.89％)，高于空白对照组(88.94％±7.60％)、SF水凝胶处理组(92.20％±5.80％)、AV-SF水凝胶处理组(92.15％±4.65％)，Ag-SF水凝胶处理组(93.36％±0.93％)(图S2)。结果表明，Ag-AV-SF水凝胶在早期炎症反应阶段和之后的组织修复、再生和重塑阶段均有良好促进效果。也可以看出，Ag-AV-SF水凝胶处理组在第28天毛发生长最快，说明该水凝胶具有促进毛发再生的潜力。
实施例11组织学分析
在第7、14、28天采集组织样本和周围0.5cm健康皮肤。术后不同时间点取创面组织进行组织学评价，以评价其体内愈合促进作用。之后分别采用HE染色，CD31和CD68免疫组织化学染色以及Masson染色，对其新血管形成和水凝胶在修复和再生过程中对局部免疫反应的影响以及胶原沉积情况进行分析。
为了进一步分析组织愈合情况，对动物创伤组织进行HE染色和免疫组化CD31和CD68以证明其对伤口愈合的促进效应。
伤口组织HE染色如图19所示，在14天时的masson染色如图20所示，可以观察伤口部位的血管数量和皮肤组织结构。如图21所示，Ag-AV-SF水凝胶处理组(28.7±2.5)的血管数量显著高于对照组(5.6±1.1)、SF水凝胶-(11.3±3.5)、Ag-SF水凝胶(12.6±2.8)和AV-SF水凝胶处理组(20.7±0.6)。
第7天组织样本的CD31免疫组化结果反映了创面部位的血供网络的重建(图19)。使用Ag-AV-SF水凝胶处理的新生血管密度(31.3±3)(如图22所示)高于其他组，这可能是由于轻度免疫应答引起的反应性血管再生。
第7天组织样本的CD68免疫组化反映了巨噬细胞的位置及数量(图19)，用于评估组织再生过程中的免疫反应。Ag-AV-SF水凝胶处理组的免疫细胞密度最低(4.7±0.6)(如图23所示)，说明水凝胶能在一定程度上降低免疫反应强度。
此外，在愈合的早期阶段，对局部伤口的适度免疫反应可诱导反应性新生血管，促进血管网的恢复和损伤代谢产物的清除，加速伤口愈合。
实施例12细胞因子检测
收集静脉血并分离血清通过ELISA试剂盒进行细胞因子检测(TGF-β，VEGF，EGF)，进一步研究水凝胶在改善创面愈合过程中的机制。
为了研究不同水凝胶对细胞增殖和分化的影响，本实施例测定了TGF-β在第7天的相对表达量。结果如图24所示。可见，Ag-AV-SF水凝胶处理组的表达水平高于其他组(P<0.05)。
在第28天血清样本中检测EGF和VEGF的相对表达水平，进一步分析伤口愈合过程重塑阶段表皮再生和血管重塑情况。如图25所示，Ag-AV-SF处理组血管生成效果最强(P<0.05)。
然而，AV-SF处理组也表现出了相对较高的血管重建能力，这表明复合水凝胶中最有效的成分是芦荟。此外，这种高表达也有利于表皮组织的营养转运。VEGF的结果也与之前的HE染色结果相吻合，从生物化学角度阐述了Ag-AV-SF水凝胶有利于血管网络的重建。
EGF检测结果与VEGF检测结果一致，结果如图26所示，Ag-AV-SF水凝胶处理组相对表达量显著高于其他试验组(P<0.001)，说明Ag-AV-SF水凝胶具有最强的表皮再生潜力。
实施例13体内生物安全性评估
在第28天时收集动物不同器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、睾丸以及脑组织)并进行HE染色观察是否出现病理学变化。情况如图27所示，其结果表明在实验组与对照组的器官结构完整，无明显的病理学变化，尤其是由于银纳米颗粒的沉积。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.复合水凝胶，其特征在于，包括蚕丝蛋白、银纳米颗粒、芦荟胶。
2.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述蚕丝蛋白的分子量＜3500MW。
3.权利要求1或2所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将所述蚕丝蛋白制备成蚕丝蛋白溶液；(2)然后将Ag+、芦荟胶进行混合得混合液；(3)将所述混合溶液进行光化学反应。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中，所述蚕丝蛋白的浓度为4-6wt％，所述Ag+溶液为0.4-0.6mg/ml，所述芦荟胶的浓度为1mg/ml-9mg/ml。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述蚕丝蛋白溶液、Ag+、芦荟胶的质量比为250：2-2.5：5-15。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述Ag+为AgNO3。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述光化学反应为：在35-45W的白炽光下持续光照，所述光照时间≥24h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述光化学反应为：或于光化学反应仪或光化学反应釜中，选择汞灯、氙灯或金卤灯作为反应光源，设定光照功率为35-45W，反应温度为20-30℃，持续光照≥24h。
9.权利要求1-2任一所述的复合水凝胶在作为或制备以下制剂中一种或多种的应用，所述制剂为创伤愈合敷料、血管生成促进剂、TGF-β表达促进剂、EGF表达促进剂、VEGF表达促进剂。
10.一种提高蚕丝蛋白抗菌性/生物性能的方法，其特征在于，使用权利要求3-5任一所述的制备方法将蚕丝蛋白制备成蚕丝蛋白复合水凝胶。
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