CN113402608B - 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品安全技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用。本发明所述杂交瘤细胞株为抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的杂交瘤细胞株skTnT‑2E8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年3月12日，保藏编号为CCTCCNO:C202158。采用本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为IgG2a亚型，效价能达到1:4.1×105，亲和力常数Ka＝5.14×106L/mol。为特异性的检测猪骨骼肌肌钙蛋白T提供了依据。

Description

一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用
技术领域
本发明涉及食品安全技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用。
背景技术
目前，国内外许多实验室都使用分子生物学技术手段检测肉制品中的源性成分，DNA检测方法手段多样，主要为核酸探针杂交、DNA指纹分析、PCR特异扩增、PCR-RFLP等。这些方法具有一定的灵敏度，但同时也存在着成本高、对检测对象要求高、工作量大、不能现场检测等缺点，尤其是对于熟肉制品检测有很大不确定性，因为这很大程度上依赖于熟肉制品的处理过程，生产过程的多样性导致了基因物质的不同水平的降解。再者，该方法只能检测动物DNA的可能来源，必须时刻防止交叉污染，乳汁、血液、脂肪都有可能是DNA的来源。因此，需要其他的辅助方法来进行相互印证。免疫学方法具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便等特点，适于大批量样品筛选。然而在进行免疫学分析时，制备得到一种特异性高，亲和力好的单克隆抗体显得尤为重要。然而现有技术中并未见具有亲和力高、效价好的抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体用于对猪骨骼肌肌钙蛋白T的免疫学分析中的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性高，亲和力好的单克隆抗体用于对猪骨骼肌肌钙蛋白T的免疫学分析中。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的杂交瘤细胞株skTnT-2E8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年3月12日，保藏编号为CCTCCNO:C202158。
本发明还提供了所述的杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：取经过免疫抗原免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按细胞个数比为4～6:1的比例进行PEG融合，筛选得到杂交瘤细胞株。
作为优选，所述免疫抗原为猪骨骼肌肌钙蛋白T抗原。
作为优选，所述小鼠为6～8周龄的雌性Balb/c小鼠。
本发明还提供了所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
作为优选，所述抗体的亚型为IgG2a。
本发明还提供了所述的单克隆抗体在制备检测猪骨骼肌肌钙蛋白T产品方面的应用。
作为优选，所述产品为酶联免疫试剂盒或胶体金层析试纸条。
本发明提供了一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的效价高、亲和力高，特异性好，为特异、灵敏的免疫测定猪骨骼肌肌钙蛋白T提供了实验依据。
附图说明
图1为抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体效价检测图。
图2为抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体亚型测定图。
图3为抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体特异性检测图。
保藏说明
抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的杂交瘤细胞株skTnT-2E8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年3月12日，保藏编号为CCTCCNO:C202158。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的制备
对新鲜猪腿肉进行处理得到免疫抗原。用得到的免疫抗原免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，按表1的免疫方式进行免疫。免疫完成后断尾取血测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠进行融合。摘取融合小鼠眼球，放血，将血清作为阳性对照，脱颈处死后无菌条件下取出脾脏，制备脾细胞，与SP2/0细胞按5:1的比例进行PEG融合，将融合后的细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。次日检查有无污染，第7天换用HT培养基，继续培养2d，用间接ELISA进行阳性孔筛选，尽量挑选出强阳性、单个克隆、细胞状态好的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，同时进行扩大培养、冻存，直至建立单一分泌抗体的单克隆细胞株。之后采用小鼠体内诱生腹水的方法，大量制备获得猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体。
表1免疫方式
免疫时间 免疫次数 免疫部位 免疫剂量 备注
0 第一次免疫 颈背部注射 40μg/只
2周 第二次免疫 颈背部注射 40μg/只
4周 第三次免疫 颈背部注射 40μg/只 测定效价
6周 加强免疫 颈背部注射 20μg/只
实施例2猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体效价测定
采用间接ELISA法测定猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的效价。具体方法为：包被：用碳酸盐缓冲液稀释包被抗原至浓度为2μg/mL，将其按100μL/孔的量包被于96孔酶标板，4℃过夜。洗涤：包被板恢复至室温，倾去包被液，每孔加洗液300μL，每次静置l min，洗涤3次，最后一次拍干。封闭：每孔加200μL含10％小牛血清的洗液，37℃封闭1h；倾去封闭液，洗涤3次，拍干。加一抗：每孔加入一定稀释倍数的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体100μL，以每孔100μL的PBS溶液作为空白对照孔，每孔100μL的阴性血清作为阴性对照，37℃放置45min；倒掉液体，洗涤3次，拍干；所述一定稀释倍数的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体为以1:2000倍开始进行倍比稀释的单克隆抗体。加酶标二抗：每孔加入100μL的l:10000倍稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；倾去液体，洗涤3次，拍干。显色：每孔加底物显色液100μL，37℃避光反应15min。终止：每孔加入50μL终止液，终止反应。检测：测定波长为450nm处的吸光度值(A450nm)。
结果判定：(A样品孔-A空白对照)/(A阴性对照-A空白对照)≧2.1，且阴性对照的A450nm小于0.2时，此时抗体的稀释倍数即为抗体效价。结果见图1。
经检测，抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体浓度为1mg/ml时的效价达1：4.1×105。
实施例2猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体亚型测定
采用购自Sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒对实施例1制备得到的单克隆抗体进行亚型测定。结果见图2。
结果显示：猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体与不同亚类的二抗显色有明显差异，其中与IgG2a二抗的A450 nm值最高，与IgG3的二抗显色微弱，而与IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA二抗几乎不显色。说明猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体亚型为IgG2a。
实施例3猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体亲和力测定
采用非竞争ELISA法测定实施例1得到的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的亲和常数(Ka)。具体步骤如下：包被：用碳酸盐缓冲液稀释包被抗原至浓度为1、0.5、0.25、0.125μg/mL，将其按100μL/孔的量加入到96孔酶标板中，4℃过夜进行包被；倾去包被液，洗涤3次，拍干。封闭：每孔加200μL含10％小牛血清的洗液，37℃1h；倾去封闭液，洗涤3次，拍干。加单抗：按100μL/孔的量加入一定稀释倍数的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体，37℃反应45min后倾去液体，洗涤3次，拍干；所述一定稀释倍数的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体为以100μg/mL开始倍比稀释的单克隆抗体。加酶标二抗：每孔加入100uL的l:10000倍稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；倾去液体，洗涤3次，拍干。显色：每孔加底物显色液100μL，37℃避光反应15min。终止：每孔加入50μL终止液，终止反应。检测：测定波长为450nm处的吸光度值(A450nm)。
亲和力Ka的计算公式为：
Ka＝(n-1)/2(nAb’-Ab)
式中：Ab为抗原浓度为a时，产生半数吸光度值的抗体浓度；Ab’为抗原浓度为b时，产生半数吸光度值的抗体浓度；n为a和b之间的稀释倍数。
经测定猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体亲和常数Ka＝5.14×106L/mol。
实施例4猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体特异性测定
采用间接竞争ELISA法，测定实施例1制备得到的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的特异性。具体步骤如下：包被：用碳酸盐缓冲液包被牛、羊、鸡、鸭、猪骨骼肌肌钙蛋白抗原，包被浓度为2μg/mL，包被量为100μL/孔，4℃过夜；倾去包被液，洗涤3次，拍干。封闭：每孔加200μL含10％小牛血清的洗液，37℃1h；倾去封闭液，洗涤3次，拍干。加一抗：按100μL/孔的量加入一定稀释倍数的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体，37℃放置45min；倾去液体，洗涤3次，拍干；以每孔加入100μL/孔的PBS作为空白对照，以阴性血清作为阴性对照；所述一定稀释倍数的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体为以1:2000倍开始倍比稀释的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体。加酶标二抗：每孔加入100μL的l:10000倍稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；倾去液体，洗涤3次，拍干。显色：每孔加底物显色液100μL，37℃避光反应15min。终止：每孔加入50μL终止液，终止反应。检测：测定波长为450nm处的吸光度值(A450nm)。
结果判定：(A样品孔-A空白对照)/(A阴性对照-A空白对照)≧2.1，且阴性对照的A450nm小于0.2时，此时抗体的稀释倍数即为抗体效价。结果见图3。
经检测猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体与猪骨骼肌肌钙蛋白抗原效价为1:40万，而与鸡、鸭骨骼肌肌钙蛋白效价低于1:10万，与牛、羊骨骼肌肌钙蛋白的效价更低，分别为1:6千，1:2万。说明本发明得到的猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的特异性好。
由以上实施例可知，本发明提供了一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的效价高、亲和力高，特异性好，为特异、灵敏的免疫测定猪骨骼肌肌钙蛋白T提供了实验依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为抗猪骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的杂交瘤细胞株skTnT-2E8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年3月12日，保藏编号为CCTCC NO:C202158。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测猪骨骼肌肌钙蛋白T产品方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为酶联免疫试剂盒或胶体金层析试纸条。
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