CN113388532A

CN113388532A - 一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN113388532A
Application number: CN202110667266.1A
Authority: CN
Inventors: 王玮; 魏东芝; 陈雨蒙; 沈涛
Original assignee: Cangzhou Xiasheng Enzyme Biotechnology Co ltd; Ningxia Sunson Industry Group Co ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: Cangzhou Xiasheng Enzyme Biotechnology Co ltd; Ningxia Sunson Industry Group Co ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2041-06-16
Also published as: CN113388532B

Abstract

本发明公开了一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用，属于生物技术领域，该重组里氏木霉利用同源重组技术将里氏木霉菌株大量分泌表达的蛋白质编码序列替换成天冬酰胺酶蛋白质编码序列，提高天冬酰胺酶的表达量和产品纯度，敲除里氏木霉自身的(半)纤维素酶可提高天冬酰胺酶的产品纯度，敲除里氏木霉自身的蛋白酶可提高天冬酰胺酶的产品稳定性。该重组里氏木霉在天冬酰胺酶表达过程中，通过合适的信号肽的引导作用将天冬酰胺酶蛋白质分泌到胞外，所产的天冬酰胺酶产量高、纯度高、稳定性高，胞外蛋白酶活力低，能有效生产来源于里氏木霉及其他微生物的天冬酰胺酶基因，所生产的天冬酰胺酶，可以应用于食品相关行业。

Description

一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用。

背景技术

里氏木霉(Trichoderma reesei或Hypocrea jecorina)是一种嗜温腐生性的丝状真菌。最初所分离到的菌株经鉴定为里氏木霉QM6a。从原始菌株QM6a出发，又经过一系列诱变育种，筛选出了一些纤维素酶高产菌株，如Rut-C30。

里氏木霉被广泛应用是因为具有自然分泌大量的内源蛋白质到胞外的能力，而内源性纤维素酶经发酵其产量高达100g/L。里氏木霉因多样的翻译后修饰也让其成为表达同源和异源蛋白质的常用宿主。里氏木霉产出的纤维素酶和半纤维素酶广泛被应用于各行业，如cbh1，cbh2，egl1，egl2，xyn1，xyn2和xyn3等。纤维素酶和半纤维素酶的启动子，具有诱导型和高表达量的特征，部分启动子，如cbh1和cbh2启动子，已被成功用于表达异源蛋白质。但是，里氏木霉在表达异源蛋白质的过程中，内源蛋白质同时也在表达，并且内源蛋白质的表达量远远大过异源蛋白质。因此，里氏木霉粗酶液中除了异源蛋白质还混有大量的内源蛋白质；应用这些粗酶进行食品加工时，混在里面的大量的里氏木霉内源蛋白质会严重影响食品的品质。这些限制了里氏木霉中异源蛋白质表达在食品行业的应用。因此需要基因工程改造，提高异源蛋白质在粗酶液中的纯度。

发明内容

为解决目前里氏木霉中表达异源蛋白质纯度低的问题，本发明的目的是提供一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用，该重组里氏木霉可用于高纯度天冬酰胺酶的生产，所生产的天冬酰胺酶可直接应用于食品加工过程中减少丙烯酰胺的生成。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉，所述重组里氏木霉异源表达核苷酸序列如SEQ ID No.1～4任一所示的天冬酰胺酶；所述重组里氏木霉为将里氏木霉中原始的纤维素酶CBH1、CBH2、EGL2、EGL3和木聚糖酶XYN2、XYN3的基因替换为所述天冬酰胺酶的基因，并敲除里氏木霉中的所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶的基因。

所述的天冬酰胺酶是指来源于真核生物的天冬酰胺酶，包括丝状真菌的天冬酰胺酶，更优的是极端嗜热菌Thermococcus kodakarensis、黑曲霉和米曲霉来源的天冬酰胺酶。

所述的重组里氏木霉出发菌株是里氏木霉种，较优的是Trichoderma reeseiQM6a、QM 9123、QM9414、QM 9136、NG14、NRRL 3653、NRRL 3652、NRRL 11236、Sa28、DB746、ME-446、4065MG4或4065MG5，更优的是Trichoderma reesei Rut-C30、RL-P37或PC-3-7。

本发明还提供一组用于构建上述的重组里氏木霉的质粒，包括重组表达质粒和敲除质粒，所述重组表达质粒依次包含所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的启动子序列、所述天冬酰胺酶编码的基因序列、基于Cre-loxP介导的可回收的抗性筛选标记和所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的终止子序列；所述敲除质粒依次包含所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶基因的上游同源臂序列、基于Cre-loxP介导的可回收的抗性筛选标记和所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶基因的下游同源臂序列。

进一步地，所述所需替换的纤维素酶或木聚糖酶包括纤维素酶CBH1、CBH2、EGL2、EGL3和木聚糖酶XYN2、XYN3；所述所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶采用EGL1、XYN1、BGL1、PEP1、SLP1、GAP1、TRE81070、TRE120998和TRE123234所编码的酶敲除。

本发明还提供一种上述的重组里氏木霉的构建方法，包括以下步骤：

S1.构建上述的重组表达质粒；

S2.将所述重组表达质粒转化至里氏木霉中；

S3.构建上述的敲除质粒；

S4.将所述敲除质粒转化至所述里氏木霉中，筛选得到所述的重组里氏木霉。

进一步地，步骤S4中，先筛选出同时含有所述重组表达质粒和敲除质粒的里氏木霉，再筛选出基因组中成功发生同源重组的转化子，再通过标记回收技术，筛选得到无抗性标记的转化子。

优选的转化里氏木霉的方案，包括原生质体转化、电转化和根癌农杆菌接合转移。较优的是根癌农杆菌接合转移，通过根癌农杆菌转化子与里氏木霉孢子接合，再筛选出基因组中已经整合有异源蛋白质基因的转化子，即可获得能表达并分泌天冬酰胺酶的重组里氏木霉基因工程菌。

本发明还提供一种上述的重组里氏木霉或上述的质粒在天冬酰胺酶生产中的应用。

本发明还提供一种天冬酰胺酶的生产方法，包括以下步骤：

S1.利用上述的重组里氏木霉或上述的质粒生产天冬酰胺酶；

S2.从S1的体系中分离得到天冬酰胺酶。

进一步地，在步骤S1中，生产天冬酰胺酶的方法包括：将所述重组里氏木霉接种于发酵培养基中，接种量1％～20％，20～37℃，培养2～12天。

上述发酵培养基中包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水；其中碳源包括：葡萄糖、蔗糖、乳糖、纤维素、槐糖、木糖、木聚糖、糖蜜、秸秆、木质纤维素或玉米浆中的至少一种；所述氮源包括：无机物铵盐、硝酸盐和含氮有机物中的至少一种。

本发明还提供一种上述的生产方法生产得到的天冬酰胺酶在面制食品加工中的应用。

进一步地，上述的生产方法生产得到的天冬酰胺酶在面制食品烘焙、烧烤、蒸煮、煎炒或油炸中的应用。

烘焙、烧烤、蒸煮、煎炒、油炸等方式加工食品过程中，食品原料中的天冬酰胺会和葡萄糖反应，生成一种致癌物——丙烯酰胺。在食品加工过程中加入天冬酰胺酶，将天冬酰胺水解成天冬氨酸，会显著减少丙烯酰胺的形成。

在面制食品行业中，将天冬酰胺酶粉末按照0-300ppm加入到面粉中，依据常规方案制作面包、蛋糕等点心。利用液相法检测面包中的丙烯酰胺的含量。优选的浓度为50-300ppm，丙烯酰胺含量减少23％-43％。

在典型的炸块茎类食品工业生产中，将液体天冬酰胺酶加入到热烫后的磷酸盐溶液中，热烫过的块茎类食品，在约45℃-75℃的温度下被浸渍到包含天冬酰胺酶的磷酸盐溶液中，孵育1-10min；再进行后续油炸操作。优选的天冬酰胺酶浓度为50U/mL；优选的孵育时间1-3min；丙烯酰胺含量减少30％-46％。

本发明公开了以下技术效果：

本发明所述的重组里氏木霉利用同源重组技术将里氏木霉菌株大量分泌表达的蛋白质(纤维素酶CBH1、CBH2、EGL2、EGL3和木聚糖酶XYN2、XYN3)编码序列替换成天冬酰胺酶蛋白质编码序列，提高天冬酰胺酶的表达量和产品纯度，敲除里氏木霉自身的(半)纤维素酶EGL1、XYN1和BGL1提高天冬酰胺酶的产品纯度；分别敲除里氏木霉自身的蛋白酶PEP1、SLP1、GAP1、TRE81070、TRE120998或TRE123234，发现敲除PEP1可以显著提高天冬酰胺酶的产品稳定性。该重组里氏木霉在天冬酰胺酶表达过程中，通过合适的信号肽的引导作用将天冬酰胺酶蛋白质分泌到胞外，所产的天冬酰胺酶产量高、纯度高、稳定性高，胞外蛋白酶活力低，能有效生产来源于里氏木霉及其他微生物的天冬酰胺酶基因，所生产的天冬酰胺酶，可以应用于食品相关行业。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为重组里氏木霉的构建，其中，A.重组表达质粒，B.敲除质粒；

图2为实施例2粗酶液的电泳图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中，培养基及试剂的配方如下：

(1)Luria Bertani(LB)培养基配方：酵母粉：5g，蛋白质胨：10g，氯化钠：10g，自来水定容到1L，自然pH。

(2)PDA培养基配方：马铃薯：200g，葡萄糖：20g，琼脂：20g，自来水定容到1L，自然pH。

(3)MD培养基的配方：碳源：20g，酵母粉：0.3g，蛋白质胨：1g，Urea：0.3g，(NH4)₂SO₄：1.4g，KH₂PO₄：2.0g，CaCl₂：0.34g，MgSO₄·7H₂O：0.3g，Mandels微量元素液：1mL。

(4)Mandels微量元素液(1000×)的配方：FeSO₄·7H₂O：5g，CoCl·6H₂O：2g，ZnSO₄·7H₂O：1.4g，MnSO₄·H₂O：1.6g，纯净水定容至1L。

(5)接合转移用的培养基：

a.1M MES：21.32g MES，加水定容到100mL，pH5.3(5M KOH调节)，过膜除菌。

b.5M KOH：7.013g KOH粉末定容到25mL。

c.2M乙酰丁香酮(AS)：称0.01962g使用DMSO溶解并定容至0.5mL，过膜除菌。

e.MM salts(1L)：NaCl：0.375g，(NH₄)₂SO₄：1.250g，K₂HPO₄：5.125g，KH₂PO₄：3.625g，CaCl₂·2H₂O：0.165g，MgSO₄·7H₂O：1.250g，FeSO₄·7H₂O：0.0062g。

f.IM(Induction Medium)液体：80mL MM salts，0.36g葡萄糖，1.26g甘油，加水定容至192mL，分装8瓶，每瓶24mL，接种时每瓶加1mL的1M MES和25μL的2M乙酰丁香酮。

g.Induction Medium Plates固体：160mL MM salts，0.36g葡萄糖，2.52g甘油，加水定容至384mL，分装4瓶，每瓶96mL，每瓶加入1.5g琼脂，115℃，20min灭菌。倒平板前每瓶加入4mL的1M MES和100μL的2M乙酰丁香酮。

在本发明实施例中所用的里氏木霉是Trichoderma reesei Rut-C30(ATCC56765)。此方案对其他里氏木霉菌株同样也适用。

质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司，胶回收试剂盒购自MAGEN公司，无缝克隆试剂盒选用全式金公司，DNA限制性内切酶与连接酶需用NEB公司。也可选用其他公司的同类产品代替。

实施例1构建菌株

一、异源蛋白质基因替换相应纤维素酶、木聚糖酶基因的表达载体的构建

本发明构建载体的骨架来源于本实验构建的LML2.1，含有Cre-loxP元件，可实现筛选标记的重复使用(Scientific Reports.2016,6:20761)。公众可以从申请人处获得，仅可将其用于重复本发明实验用。

首先，PCR分别扩增里氏木霉纤维素酶CBH1，CBH2，EGL2，EGL3和木聚糖酶XYN2，XYN3编码基因的起始密码子ATG上游600～1000bp(启动子)和终止密码子TAA(或TAG、TGA)下游约600～1000bp长度的DNA序列(终止子)。所用引物的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.5～40所示：

CBH1表达质粒构建引物：

SEQ ID No.5：ATTACGAATTCTTAATTAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGC；

SEQ ID No.6：CATGATGCGCAGTCCGCGGT；

SEQ ID No.7：GGACTGCGCATCATGCCTCTCAAGCCGATTCTCC；

SEQ ID No.8：CATTATACGAAGTTATTCTAGACTACGCATCCGTGCCCAGAG；

SEQ ID No.9：ACTAGTGAGCTCATTTAGCTCCGTGGCGAAAGCCT；

SEQ ID No.10：AGTGCCAAGCTTATTTCATCGTAACCGAGAATCCAGAGCTG；

CBH2表达质粒构建引物：

SEQ ID No.11：ATTACGAATTCTTAATTACGAGAATGGTGAGGACTGAGATAA；

SEQ ID No.12：CATGGTGCAATACACAGAGGGT；

SEQ ID No.13：GTGTATTGCACCATGCCTCTCAAGCCGATTCTCC；

SEQ ID No.14：CATTATACGAAGTTATTCTAGACTACGCATCCGTGCCCAGAG；

SEQ ID No.15：ACTAGTGAGCTCATTTGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAA；

SEQ ID No.16：AGTGCCAAGCTTATTTATGCGATGCGGCTCAAGACTTC；

EGL2表达质粒构建引物：

SEQ ID No.17：ATTACGAATTCTTAATTAACGCAAGTGCCTGAGTGAAGAT；

SEQ ID No.18：CATTGTCGATGACGGGGAGATATTAT；

SEQ ID No.19：CCGTCATCGACAATGCCTCTCAAGCCGATTCTCC；

SEQ ID No.20：CATTATACGAAGTTATTCTAGACTACGCATCCGTGCCCAGAG；

SEQ ID No.21：ACTAGTGAGCTCATTTCACTCTGAGCTGAATGCAGAAGC；

SEQ ID No.22：AGTGCCAAGCTTATTTCACCAAGGCAACTCGTCCAG；

EGL3表达质粒构建引物：

SEQ ID No.23：ATTACGAATTCTTAATTAAGTGAGGAGATTGTGGCTACGA；

SEQ ID No.24：CATTGCGACGCTATGCTTGTG；

SEQ ID No.25：CATAGCGTCGCAATGCCTCTCAAGCCGATTCTCC；

SEQ ID No.26：CATTATACGAAGTTATTCTAGACTACGCATCCGTGCCCAGAG；

SEQ ID No.27：ACTAGTGAGCTCATTTAACCTGGAAACGTGAGATGTG；

SEQ ID No.28：AGTGCCAAGCTTATTTCCGAGTCCTGAGAGTTGTAGT；

XYN2表达质粒构建引物：

SEQ ID No.29：ATTACGAATTCTTAATTAATTGTGATGCTGCTGCTGATG；

SEQ ID No.30：CATGTTGATGTCTTCTTGCTTCAG；

SEQ ID No.31：GAAGACATCAACATGCCTCTCAAGCCGATTCTCC；

SEQ ID No.32：CATTATACGAAGTTATTCTAGACTACGCATCCGTGCCCAGAG；

SEQ ID No.33：ACTAGTGAGCTCATTTAGGGGGCTCTTCTTTTGTGAT；

SEQ ID No.34：AGTGCCAAGCTTATTTCACGACGACAACACCTGGAT；

XYN3表达质粒构建引物：

SEQ ID No.35：ATTACGAATTCTTAATTAATTCCGTGCGTGTCTGATGG；

SEQ ID No.36：CATATTGTCCGCCTCAATTGAAAC；

SEQ ID No.37：GAGGCGGACAATATGCCTCTCAAGCCGATTCTCC；

SEQ ID No.38：CATTATACGAAGTTATTCTAGACTACGCATCCGTGCCCAGAG；

SEQ ID No.39：ACTAGTGAGCTCATTTCTGCTCTGCTACATGGGTATG；

SEQ ID No.40：AGTGCCAAGCTTATTTGGATTCGGGCGTATGTTGAG。

其次，PCR扩增天冬酰胺酶序列(从起始密码子到终止密码)。可以用DNA做模板扩增，保留编码基因的内含子，也可以用cDNA做模板扩增或人工合成基因，去除基因的内含子。所用引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5～40所示，天冬酰胺酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～4所示：

SEQ ID No.1：ATGCCTCTCAAGCCGATTCTCCTGTCTGCCCTGGCCAGTCTCGCCTCGGCCATGAAACTGTTAGTGCTGGGCACCGGCGGCACCATTGCAAGCGCCAAAACCGAAATGGGCTATAAAGCAGCACTGTCAGCAGATGATATTTTACAGTTAGCAGGTATTCGTCGCGAAGATGGCGCCAAAATTGAAACCCGTGATATTCTGAATTTAGATAGTACCTTAATTCAGCCGGAAGATTGGGTGACCATTGGTCGCGCCGTTTTTGAAGCCTTTGATGAATATGATGGCATTGTTATTACACATGGCACAGATACCTTAGCCTATACCTCTAGTGCACTGAGCTTTATGATTCGTAATCCGCCGATTCCGGTTGTTCTGACCGGCTCAATGCTGCCGATTACCGAACCGAATAGCGATGCCCCGCGCAATCTGCGTACCGCCCTGACCTTTGCACGTAAAGGCTTTCCGGGCATTTATGTGGCCTTTATGGATAAAATTATGCTGGGAACTCGTGTGTCTAAAGTTCATAGCTTAGGTCTGAATGCATTTCAGAGTATTAATTATCCGGATATTGCCTATGTTAAAGGTGATGAAGTGTTAGTGCGTCATAAACCGCGCATTGGTAATGGTGAACCGCTGTTTGATCCGGAATTAGATCCGAATGTGGTTCATATTCGCTTAACTCCAGGCCTGTCTCCGGAAGTTCTGCGTGCCGTTGCACGTGCCACCGATGGTATTGTTTTAGAAGGCTATGGCGCAGGTGGCATTCCGTATCGCGGTCGTAATCTGCTGGAAGTTGTGTCAGAAACCGCACGCGAAAAGCCAGTTGTGATGACCACCCAGGCCCTGTATGGCGGTGTGGATCTGACCCGCTATGAAGTTGGTCGTCGTGCCTTAGAAGCAGGCGTGATTCCGGCAGGCGATATGACCAAAGAAGCCACCTTAACCAAACTGATGTGGGCCCTGGGTCATACCCGCGATCTGGAAGAAATTCGCAAAATTATGGAACGCAATATTGCAGGCGAAATTACCGGCTCT；

SEQ ID No.2：ATGCCTCTCAAGCCGATTCTCCTGTCTGCCCTGGCCAGTCTCGCCTCGGCCTCTCCGCTGCTCTACTCGCGGACCACCAATGAAACCTTCGTCTTCACCAATGCCAATGGCCTCAACTTCACCCAGATGAACACCACCCTGCCGAACGTGACCATTTTCGCAACGGGTAGGTGGACCGAGTATACCTCAGGTAGTGCGACCGATAGTTAACCGCAACTCACAGGTGGTACCATCGCGGGCTCCGATTCCAGCTCAACCGCCACGACCGGCTACACCTCCGGAGCAGTCGGGGTCCTGTCCCTCATCGATGCGGTGCCATCCATGCTGGATGTGGCCAATGTTGCCGGCGTCCAGGTGGCCAACGTGGGAAGCGAGGATATCACCTCTGACATCCTGATTTCCATGTCCAAGAAGCTGAACCGCGTTGTATGTGAGGACCCGACCATGGCCGGTGCTGTCATCACCCACGGCACCGACACCCTCGAGGAGACTGCCTTCTTCCTGGACGCCACTGTCAACTGTGGCAAGCCAATTGTCATCGTGGGTGCCATGCGCCCATCCACGGCCATCTCAGCTGACGGGCCCTTCAATCTGCTCGAAGCCGTGACGGTGGCTGCCTCCACGTCGGCGCGCGATCGCGGTGCCATGGTGGTCATGAACGATCGCATTGCCTCGGCCTACTATGTGACCAAGACCAATGCCAACACTATGGACACCTTCAAGGCCATGGAGATGGGCTACCTTGGCGAGATGATCTCCAACACCCCTTTCTTCTTCTACCCGCCCGTCAAGCCAACCGGTAAGGTGGCCTTTGACATCACCAACGTGACTGAGATCCCCCGTGTGGACATTCTGTTTTCTTATGAGGACATGCACAACGACACCCTCTACAACGCCATCTCCAGTGGTGCCCAGGGAATTGTGGTGAGTGTGATTTCCTTGATCTCTCTCTATAAAACTTGGAATGGACGCTGATGAGAATAGATTGCCGGGGCTGGTGCTGGAGGCGTCACAACCTCCTTCAATGAGGCTATCGAGGATGTCATCAACCGTTTGGAGATCCCTGTCGTGCAGAGTATGCGCACAGTCAATGGGGAAGTGCCACTGTCAGACGTGAGCAGCGACACCGCCACCCACATCGCCAGTGGATACCTAAACCCGCAGAAGTCCCGCATTCTGTTGGGATTGCTGCTATCCCAGGGAAAGAATATCACCGAAATCGCTGACGTGTTTGCTCTGGGCACGGATGCGTAG；

SEQ ID No.3：ATGGGTGTCAATTTCAAAGTTCTTGCCCTGTCGGCCTTAGCTACTATTAGCCATGCTTCGCCTCTCCTATATCCTCGAGCCACAGACTCGAACGTCACCTATGTGTTCACCAACCCCAATGGCCTGAACTTTACTCAGATGAACACCACCCTGCCAAACGTCACTATCTTCGCGACAGGTACACACTACCCTTAGCCTACTCGCACAAGCCCCCCTTCATCACAACAAAAACTAACAAGAAAAAACAGGCGGCACAATCGCGGGCTCCAGCGCCGACAACACCGCAACAACAGGTTACAAAGCCGGTGCAGTCGGCATCCAGACACTGATCGACGCGGTCCCGGAAATGCTAAACGTTGCCAACGTCGCTGGCGTGCAAGTAACCAATGTCGGCAGCCCAGACATCACCTCCGACATTCTCCTGCGTCTCTCCAAACAGATCAACGAGGTGGTCTGCAACGACCCCACCATGGCCGGTGCAGTGGTCACCCACGGCACCGACACGCTCGAAGAATCCGCCTTCTTCCTCGACGCCACGGTCAACTGTCGCAAGCCCGTGGTCATCGTCGGCGCCATGCGCCCTTCAACCGCCATCTCGGCTGACGGCCCCCTCAACCTCCTGCAATCCGTCACCGTCGCCACGAGCCCCAAGGCCCGAGACCGCGGCGCCCTGATTGTCATGAACGACCGCATCGTATCCGCCTTCTACGCCTCCAAGACGAACGCCAACACCGTCGATACATTCAAGGCCATCGAAATGGGTAACCTGGGCGAGGTCGTCTCCAACAAACCCTACTTCTTCTACCCCCCAGTCAAGCCAACAGGCAAGACGGAAGTAGATATCCGGAACATCACCTCCATCCCCAGAGTCGACATCCTCTACTCATACGAAGACATGCACAATGACACCCTTTACTCCGCCATCGACAACGGCGCAAAGGGCATCGTTGTAAGTCTCGTCCACTCTCAATATGAACCCCATCTATCAAAAACACCCCCAGAACCCCTCCACCAAAATACTAATCCAAATAAAAAAACAGATCGCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGTCTCCACCCCCTTCAGCGCCGCCATGGAAGACATCACAACCAAACACAACATCCCCATCGTAGCCAGCACGCGCACCGGAAACGGGGAGGTGCCGTCCTCCGCCGAGTCGAGCCAGATCGCAAGCGGGTATTTGAACCCCGCAAAGTCACGCGTTTTGCTTGGCTTGTTGCTTGCCCAGGGGAAGAGTATTGAGGAAATGAGGGCGGTTTTTGAGCGGATTGGGGTTGCTTGA；

SEQ ID No.4：ATGACTGTACCCGCCCAGAATAAGAGCCATGTTATCATTGACAGAAACGGCATCATCGAAAATAGACACCTGGTCCACGCCGCGATAGTCGACTCAGCCGGAAAGGTTCTCTTCTCTCTCGGCGATCCATCGCGAGTGACACTCCTCCGATCTGCAGCCAAACCAGTTCAAGCACTAGCGGTTGCGGAGACTGGCGCCCTCGAGCATTTTGCTTTTGACGATGGTGATCTGGCTCTTATGTGTGCCTCGCATAGTAGCGAGGACCGGCATATCGAGCGGGCTCGACGAATGCTCGCTAAGTCGCAGCATACGGAGGACCAATTGCGGTGTGGTGGCCATCCTTCAATAAATCCGGCGATCAACAACGAATGGATCAAGCGGGACTTCGAACCGACGGCAGTCTATAACAATTGTTCCGGCAAACATGCGGGTATGCTGGCTGGGGCCAAAGCTATTGGTGCCTCCGCAGACAATTACCATCTCCTGACGCATCCAATCCAGGCCAGCGTCAAGAGAGTCGTGGAAGAAGTAGCTGGGTTAAGCGAGGAAGAGGTTCAGTGGGGGCTTGACGGCTGCAATATGCCGGCGCCTGCATTTCCCCTTTCTCACTTGGCCAAGGTATATGCTTCATTTGCCCAGGCATCAGACGCAGTAGCCAGTGGCAGTCCAGTCACGCCCAGGGTGCAGCTGATGGGAAAGATCTTCAATGCCATGGCTCAAATGCCCGAGATGGTTGGCGGCGAGGGTCGCTTCTGTACTATCTTAATGAGTGCTCTTGGTGGCTCTACCATCGGCAAGGTCGGTGCAGATGGCTGCTACGCCGTTGGAATGCGCGAGTCTGAACAGACGAAGGGAATTGGAGCAGAGGGCGCAGTTGGGATCGCCGTCAAGATTGAAGACGGCAATCTAGGTATACTGTATGCCGCGGTTGCTGAAATATTAGCGCAGCTGAAGCTCTGTAATCGGGAGGACATGCAGACTCTGGAGACATATCATAATCCGAAGATGAAGAACACCATGGGAATTGTCACTGGTACTGCGAGGTTTGACTTTGAGTTTCTTTGCACCAGGGGGGCAATTTTACTCTAA。

用DNA限制性内切酶PacI/XbaI，消化里氏木霉表达质粒LML2.1。用无缝克隆或DNA连接酶将启动子、天冬酰胺酶序列连接到LML2.1质粒的PacI/XbaI位点，构建中间质粒。中间质粒构建成功后，再用DNA限制性内切酶SwaI消化上述中间质粒，将相应的终止子序列连入上述SwaI位点，得到相应的重组表达质粒(如图1A)。这里所用的表达载体主要提供农杆菌接合转移位点的作用，所以，除了LML2.1外，可以用以下任一种农杆菌二元载体：PZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、pPK2，但不仅仅限于这些载体。

二、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶基因的敲除

首先，PCR分别扩增里氏木霉EGL1、XYN1，BGL1、PEP1、SLP1、GAP1、TRE81070、TRE120998和TRE123234编码基因的起始密码子ATG上游600～1000bp(上游序列)和终止密码子TAA(或TAG、TGA)下游约600～1000bp长度的DNA序列(下游序列)。所用引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.41～76所示：

XYN1敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.41：ATTACGAATTCTTAATTAAGGAGTCTAAGGCACACCAGTA；

SEQ ID No.42：CATTATACGAAGTTATTCTAGACGGCTGAACCTAGTCATCCT；

SEQ ID No.43：ATTACGAATTCTTAATTAATGACTAGGTTCAGCCGTTAAAG；

SEQ ID No.44：CATTATACGAAGTTATTCTAGATGATTATTTGTGCGTGTTTTCC；

BGL1敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.45：ATTACGAATTCTTAATTAATGCTGTTACATTCAAGGTTGGA；

SEQ ID No.46：CATTATACGAAGTTATTCTAGATGGTCAAGACTGGTAGGAAGAA；

SEQ ID No.47：ACTAGTGAGCTCATTTCAGGATAGGCATCAGAGCAGTA；

SEQ ID No.48：AGTGCCAAGCTTATTTGAAGCATTCGGCGGTTGTT；

EGL1敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.49：ATTACGAATTCTTAATTAAAAATCTGTCCTCGTCCTTTGTC；

SEQ ID No.50：CATTATACGAAGTTATTCTAGAGCATCCAGCGGTAGTTCCA；

SEQ ID No.51：ACTAGTGAGCTCATTTCGTCGTCTTCTCCAACATCC；

SEQ ID No.52：AGTGCCAAGCTTATTTGGTGCTTGACATGGCTTGA；

PEP1敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.53：ATTACGAATTCTTAATTAAAGAAGCAGAAAGGCTGGTGA；

SEQ ID No.54：CATTATACGAAGTTATTCTAGAATGGGATCAATGATGGAACG；

SEQ ID No.55：ACTAGTGAGCTCATTTCTTGAATATCGGAGAAGGTTGC；

SEQ ID No.56：AGTGCCAAGCTTATTTAAGCGTTGAGCAGGAAGACC；

SLP1敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.57：ATTACGAATTCTTAATTAATTCAAGCCAGGGAGAAAGAA；

SEQ ID No.58：CATTATACGAAGTTATTCTAGACACCATCAAGTATGCGTAGGG；

SEQ ID No.59：ACTAGTGAGCTCATTTACACTCTATCCCGCTTGTCTGA；

SEQ ID No.60：AGTGCCAAGCTTATTTGCTGGTACGGAATGGTATTCTTC；

GAP1敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.61：ATTACGAATTCTTAATTAAAAATGGCATACCAGCTTTCA；

SEQ ID No.62：CATTATACGAAGTTATTCTAGAGCTTCGGACTCAACCAGGAC；

SEQ ID No.63：ACTAGTGAGCTCATTTTCAAGAAGAGGCAGAGGGTA；

SEQ ID No.64：AGTGCCAAGCTTATTTACGTGGAGAAATCGGAATAT；

TRE81070敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.65：ATTACGAATTCTTAATTAAATCATGTTCTTTGTTGCGGTAG；

SEQ ID No.66：CATTATACGAAGTTATTCTAGACGGGAGGCTGGAGTATTG；

SEQ ID No.67：ACTAGTGAGCTCATTTTAAAGTGGTGGCGAGGTG；

SEQ ID No.68：AGTGCCAAGCTTATTTGGCGCAAGAAGCTGAAAT；

TRE120998敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.69：ATTACGAATTCTTAATTAAGTCGTGCCTGAGGTCCAT；

SEQ ID No.70：CATTATACGAAGTTATTCTAGATCTGACGGTGAGGTTGCA；

SEQ ID No.71：ACTAGTGAGCTCATTTGACTGGCGGTCATTACGT；

SEQ ID No.72：AGTGCCAAGCTTATTTGCTCATCAATACCCGACTTT；

TRE123234敲除质粒构建引物：

SEQ ID No.73：ATTACGAATTCTTAATTAAAAGTCCTCCCGCACATCA；

SEQ ID No.74：CATTATACGAAGTTATTCTAGATGGCACGAAGAAGGTACTGA；

SEQ ID No.75：ACTAGTGAGCTCATTTCAGACTATGGTGGTTTGGG；

SEQ ID No.76：AGTGCCAAGCTTATTTAGAGCGTAGCGATGTGGT。

用DNA限制性内切酶PacI/XbaI，消化里氏木霉表达LML2.1质粒。用无缝克隆或DNA连接酶将上游序列连接到LML2.1质粒的PacI/XbaI位点，构建中间质粒。中间质粒构建成功后，再用DNA限制性内切酶SwaI消化上述中间质粒，将相应的下游序列连入上述质粒的SwaI位点，得到相应的敲除质粒(如图1B)。这里所用的表达载体主要提供农杆菌接合转移位点的作用，所以，除了LML2.1外，可以用以下任一种农杆菌二元载体：PZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、pPK2，但不仅仅限于这些载体。

三、表达天冬酰胺酶的里氏木霉基因工程菌构建

表达天冬酰胺酶的里氏木霉基因工程菌，是通过携带天冬酰胺酶表达载体的根癌农杆菌结合转移转化里氏木霉，再通过抗性标记回收获得基因工程菌；具体制备步骤为：

首先将携带重组蛋白质表达载体电转化根癌农杆菌，用卡那霉素(50μg/mL)筛选出阳性根癌农杆菌；将LB液体培养的阳性根癌农杆菌转接至液体IM，将里氏木霉的孢子稀释成10⁵～10⁸个/mL范围的梯度浓度孢子悬液。把上述IM中根癌农杆菌和里氏木霉孢子悬液等体积混合，点到固体Induction Medium Plates平板的硝酸纤维素膜上(115℃灭菌后通过超净台无菌操作贴在固体平板上表面)。放在25℃下共培养48h后，通过超净台无菌操作把膜转移至加了20g/L葡萄糖、潮霉素(150μg/mL)和头孢霉素(400μg/mL)的PDA培养基将平板放在28℃下培养5-7天，收集孢子，浓度稀释至在板上以单克隆形式长出，涂PDA平板(含20g/L葡萄糖、150μg/mL潮霉素和150μg/mL头孢霉素)，28℃下培养48h后，挑取单克隆于PDA孔板(含20g/L葡萄糖、150μg/mL潮霉素和150μg/mL头孢霉素)，在28℃下培养5-7天，收集孢子，并刮菌丝提基因组，PCR验证并送测序。

将获得的阳性重组里氏木霉菌株接种于马丁氏液体(含木糖20g/L)培养基中诱导抗性基因缺失，28℃、200rpm摇床培养48h后，挑取少量菌丝点到PDA(含20g/L葡萄糖)平板上，在28℃下培养5-7天，收集孢子，浓度稀释至在板上以单克隆形式长出，涂PDA平板(含20g/L葡萄糖或木糖)，28℃下培养48h。挑取单克隆于PDA孔板(含20g/L葡萄糖或木糖)，28℃下培养24h。挑取孔板中带菌丝的小块琼脂至PDA孔板(含20g/L葡萄糖、150μg/ml潮霉素和150μg/ml头孢霉素)，验证抗性缺失是否成功。在28℃下培养5-7天后挑选抗性缺失成功的收集孢子。

实施例2发酵生产

一、工程菌在摇瓶中表达天冬酰胺酶

将获得的阳性重组里氏木霉菌株接种于马丁氏液体(含乳糖20g/L)培养基中，28℃、200rpm振荡培养48h后，取发酵液400μL，12500转离心5min，取发酵液上清。里氏木霉工程菌株发酵液上清作为粗酶液，进行蛋白质变性电泳分析其中天冬酰胺酶的纯度(图2)。如图2所示：条带一——蛋白质分子量的marker；条带二——原始里氏木霉发酵液；条带三——第一轮改造后，利用cbh1启动子表达天冬酰胺酶发酵液；条带四——第二轮改造后，利用cbh1、cbh2启动子表达天冬酰胺酶发酵液；条带五——第三、四轮改造后，利用cbh1、cbh2、egl2、egl3启动子表达天冬酰胺酶发酵液；条带六——第五、六轮改造后，利用cbh1、cbh2、egl2、egl3、xyn2、xyn3启动子表达天冬酰胺酶发酵液；条带七——第七轮改造后，敲除xyn1；条带八——第八轮改造后，敲除egl1和bgl1，天冬酰胺酶纯度提高到80％；条带九——第九轮改造后，敲除蛋白酶pep1，天冬酰胺酶稳定性显著提高，粗酶液可以在4℃冰箱中稳定存放90天，酶活下降10％以内，明显优于SLP1、GAP1、TRE81070、TRE120998或TRE123234等其他五个蛋白酶敲除菌株的效果；检测胞外蛋白酶活力发现，敲除蛋白酶pep1后，胞外蛋白酶活力下降60％，也明显优于SLP1、GAP1、TRE81070、TRE120998或TRE123234等其他五个蛋白酶敲除菌株的效果。

二、工程菌在发酵罐中生产天冬酰胺酶

将获得的阳性重组里氏木霉菌株接种于马丁氏液体(含葡萄糖20g/L)培养基中，28℃、200rpm振荡培养48h后，取发酵液1L，接种于9L新鲜培养基的发酵罐中。使用槐糖-葡萄糖混合物(总糖浓度约500g/L，其中槐糖含量5-20％)流加，维持葡萄糖浓度在0.1％～0.25％，溶氧维持在20％。用30％的谷氨酸钠溶液作为氮源流加，流加速度为30mL/h。

三、天冬酰胺酶活性的测定

(1)溶液配制

A:0.1M柠檬酸：称取柠檬酸21.014g，用纯净水溶解并定容到1L。

B:0.2M Na₂HPO₄：称取Na₂HPO₄ 28.39g，用纯净水溶解并定容到1L。

C：磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液：11.5mL(B)+8.5mL(A)。

D：189mM L-天冬酰胺溶液：称取L-天冬酰胺0.25g，用纯净水溶解并定容到10mL。

E：1.5M三氯乙酸(TCA)：称取三氯乙酸1.225g，用纯净水溶解并定容到5mL。

F：6mM(NH₄)₂SO₄：称取0.7928克(NH₄)₂SO₄，用纯净水溶解并定容到1L。

G：酒石酸钾钠溶液：50克酒石酸钾钠加热溶于水中，加入1.25mL Nessler试剂，搅拌均匀，定容至100mL，放置1小时，离心，取上清。

(2)标准曲线的制定

静置3分钟，上述混合液取50μL与100μL水和50μL Nessler试剂混合，1分钟后在436nm测定吸光度OD。根据OD——NH₃物质的量作图，剔除不好的点，可知：每OD数值代表含有0.3056μmol NH₃。

(3)天冬酰胺酶活性测定

天冬酰胺酶单位(ASNU)定义为在37℃和pH 5.4，1分钟内产生1.0μmol氨所需的酶量。

待测样品37℃温育30min；对照样为37℃温育0min。

置于冰上分别并加入50μL E(1.5M三氯乙酸)而终止反应。

混合样品并在20000g离心2分钟。

取上清50μL，与100μL水和50μL Nessler试剂混合，1分钟后在436nm测定吸光度。用样品的OD减去对照的OD(ΔOD)。

四、天冬酰胺酶的制备

将工程菌的培养物进行板框过滤，获得含有天冬酰胺酶的粗酶液，加入通用的保护剂可制得液态天冬酰胺酶；将上述粗酶液进入喷雾干燥塔进行烘干，加入通用的保护剂，可制成固体天冬酰胺酶粉。液态粗酶液活力达500～2000U/mL，固体酶粉活力可稳定在1000U/g。

实施例3食品加工过程的应用

一、丙烯酰胺标准溶液的配制及标准曲线制作

准确称取丙烯酰胺标准品0.100g，用甲醇溶解并稀释至250mL得到浓度为0.4mg/mL的丙烯酰胺的标准液，密封后放入冰箱(0～4℃)保存。在测定时，分别取适量丙烯酰胺标准液用甲醇稀释配制成浓度为0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0μg/mL系列的标准溶液。

丙烯酰胺在210nm处有最大的吸收波峰，在波长210nm测定并记录其数据，以吸光度为Y轴，丙烯酰胺含量为X轴绘制标准曲线。在0.25～6μg/L的浓度范围内，丙烯酰胺的吸光度与其浓度之间具有良好的线性关系。由于丙烯酰胺水溶液不是很稳定，一般实验中现测现配。用甲醇归零。

标准曲线：Y＝0.0806X-0.0304，R²＝0.9991。

二、烘焙应用实验

1.面粉品种：宁夏塞北雪高筋粉

2.实验方法：一次发酵法

配料：面粉400g；酵母5.5g；糖60g；盐10g；黄油32g；水228g，天冬酰胺酶粉0-300ppm。

3.发酵温度：38℃；湿度：80％；烤箱温度：180℃；烘烤时间：20min。

三、薯片应用实验

实验方法：将天冬酰胺酶加入到50℃磷酸盐溶液中(0.1M，pH 6.0)，酶的终浓度为50U/mL。热烫过的块茎类食品，浸渍到包含天冬酰胺酶的磷酸盐溶液中，孵育0，1或3min后，再进行后续油炸处理。

四、样品中丙烯酰胺的提取

1、取适量样品待测样品置于培养皿中，烘箱85℃，2.5h烘干水分，充分磨碎。

2、称取2.00g烘干后的样品粉末于7mL离心管中，加5mL甲醇，室温振摇5min，8000r/min离心15min。收集第1次的上清液2mL。

3、然后向沉淀中再加入2mL甲醇，室温振摇5min，8000r/min离心15min.收集第2次的上清液2mL。重复此操作一次，共收集到上清液6mL。

4、活化C18固相萃取小柱，先让1mL的甲醇通过，再让1mL的去离子水通过即可。

5、用带针头的注射器避开油层吸取上清液中间的清液5mL,过0.45μm的PVDF滤膜，收集滤液。

6、然后取5mL滤液通过预先活化的C18固相萃取小柱，弃去最初的0.5mL滤液，收集剩余的流出液，将流出液样品稀释20倍用于测定。

7、取3mL用于分析测定，即在波长为210nm下检测吸光度，甲醇作为空白对照。

(5)丙烯酰胺含量计算

丙烯酰胺＝N(Kμg/L﹡9mL)/2.0g

＝90K(μg/kg)

其中N为稀释倍数(20倍)；K为在标准曲线上查到的丙烯酰胺浓度(μg/L)；

9mL为样品溶解体积；2.0g为样品的试验用量。

测定结果如下：

顺序	样品(酶添加量/处理时间)	丙烯酰胺含量(μg/kg)
			1	面包(0)	365.7
2	面包(50ppm)	279.7
			3	面包(100ppm)	271.7
4	面包(300ppm)	210.2
			5	薯片(0min)	785.1
6	薯片(1min)	547.2
			7	薯片(3min)	421.8

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华东理工大学

宁夏夏盛实业集团有限公司

沧州夏盛酶生物技术有限公司

<120> 一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用

<160> 76

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcctctca agccgattct cctgtctgcc ctggccagtc tcgcctcggc catgaaactg 60

ttagtgctgg gcaccggcgg caccattgca agcgccaaaa ccgaaatggg ctataaagca 120

gcactgtcag cagatgatat tttacagtta gcaggtattc gtcgcgaaga tggcgccaaa 180

attgaaaccc gtgatattct gaatttagat agtaccttaa ttcagccgga agattgggtg 240

accattggtc gcgccgtttt tgaagccttt gatgaatatg atggcattgt tattacacat 300

ggcacagata ccttagccta tacctctagt gcactgagct ttatgattcg taatccgccg 360

attccggttg ttctgaccgg ctcaatgctg ccgattaccg aaccgaatag cgatgccccg 420

cgcaatctgc gtaccgccct gacctttgca cgtaaaggct ttccgggcat ttatgtggcc 480

tttatggata aaattatgct gggaactcgt gtgtctaaag ttcatagctt aggtctgaat 540

gcatttcaga gtattaatta tccggatatt gcctatgtta aaggtgatga agtgttagtg 600

cgtcataaac cgcgcattgg taatggtgaa ccgctgtttg atccggaatt agatccgaat 660

gtggttcata ttcgcttaac tccaggcctg tctccggaag ttctgcgtgc cgttgcacgt 720

gccaccgatg gtattgtttt agaaggctat ggcgcaggtg gcattccgta tcgcggtcgt 780

aatctgctgg aagttgtgtc agaaaccgca cgcgaaaagc cagttgtgat gaccacccag 840

gccctgtatg gcggtgtgga tctgacccgc tatgaagttg gtcgtcgtgc cttagaagca 900

ggcgtgattc cggcaggcga tatgaccaaa gaagccacct taaccaaact gatgtgggcc 960

ctgggtcata cccgcgatct ggaagaaatt cgcaaaatta tggaacgcaa tattgcaggc 1020

gaaattaccg gctct 1035

<210> 2

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcctctca agccgattct cctgtctgcc ctggccagtc tcgcctcggc ctctccgctg 60

ctctactcgc ggaccaccaa tgaaaccttc gtcttcacca atgccaatgg cctcaacttc 120

acccagatga acaccaccct gccgaacgtg accattttcg caacgggtag gtggaccgag 180

tatacctcag gtagtgcgac cgatagttaa ccgcaactca caggtggtac catcgcgggc 240

tccgattcca gctcaaccgc cacgaccggc tacacctccg gagcagtcgg ggtcctgtcc 300

ctcatcgatg cggtgccatc catgctggat gtggccaatg ttgccggcgt ccaggtggcc 360

aacgtgggaa gcgaggatat cacctctgac atcctgattt ccatgtccaa gaagctgaac 420

cgcgttgtat gtgaggaccc gaccatggcc ggtgctgtca tcacccacgg caccgacacc 480

ctcgaggaga ctgccttctt cctggacgcc actgtcaact gtggcaagcc aattgtcatc 540

gtgggtgcca tgcgcccatc cacggccatc tcagctgacg ggcccttcaa tctgctcgaa 600

gccgtgacgg tggctgcctc cacgtcggcg cgcgatcgcg gtgccatggt ggtcatgaac 660

gatcgcattg cctcggccta ctatgtgacc aagaccaatg ccaacactat ggacaccttc 720

aaggccatgg agatgggcta ccttggcgag atgatctcca acaccccttt cttcttctac 780

ccgcccgtca agccaaccgg taaggtggcc tttgacatca ccaacgtgac tgagatcccc 840

cgtgtggaca ttctgttttc ttatgaggac atgcacaacg acaccctcta caacgccatc 900

tccagtggtg cccagggaat tgtggtgagt gtgatttcct tgatctctct ctataaaact 960

tggaatggac gctgatgaga atagattgcc ggggctggtg ctggaggcgt cacaacctcc 1020

ttcaatgagg ctatcgagga tgtcatcaac cgtttggaga tccctgtcgt gcagagtatg 1080

cgcacagtca atggggaagt gccactgtca gacgtgagca gcgacaccgc cacccacatc 1140

gccagtggat acctaaaccc gcagaagtcc cgcattctgt tgggattgct gctatcccag 1200

ggaaagaata tcaccgaaat cgctgacgtg tttgctctgg gcacggatgc gtag 1254

<210> 3

<211> 1298

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggtgtca atttcaaagt tcttgccctg tcggccttag ctactattag ccatgcttcg 60

cctctcctat atcctcgagc cacagactcg aacgtcacct atgtgttcac caaccccaat 120

ggcctgaact ttactcagat gaacaccacc ctgccaaacg tcactatctt cgcgacaggt 180

acacactacc cttagcctac tcgcacaagc cccccttcat cacaacaaaa actaacaaga 240

aaaaacaggc ggcacaatcg cgggctccag cgccgacaac accgcaacaa caggttacaa 300

agccggtgca gtcggcatcc agacactgat cgacgcggtc ccggaaatgc taaacgttgc 360

caacgtcgct ggcgtgcaag taaccaatgt cggcagccca gacatcacct ccgacattct 420

cctgcgtctc tccaaacaga tcaacgaggt ggtctgcaac gaccccacca tggccggtgc 480

agtggtcacc cacggcaccg acacgctcga agaatccgcc ttcttcctcg acgccacggt 540

caactgtcgc aagcccgtgg tcatcgtcgg cgccatgcgc ccttcaaccg ccatctcggc 600

tgacggcccc ctcaacctcc tgcaatccgt caccgtcgcc acgagcccca aggcccgaga 660

ccgcggcgcc ctgattgtca tgaacgaccg catcgtatcc gccttctacg cctccaagac 720

gaacgccaac accgtcgata cattcaaggc catcgaaatg ggtaacctgg gcgaggtcgt 780

ctccaacaaa ccctacttct tctacccccc agtcaagcca acaggcaaga cggaagtaga 840

tatccggaac atcacctcca tccccagagt cgacatcctc tactcatacg aagacatgca 900

caatgacacc ctttactccg ccatcgacaa cggcgcaaag ggcatcgttg taagtctcgt 960

ccactctcaa tatgaacccc atctatcaaa aacaccccca gaacccctcc accaaaatac 1020

taatccaaat aaaaaaacag atcgccggct ccggctccgg ctccgtctcc acccccttca 1080

gcgccgccat ggaagacatc acaaccaaac acaacatccc catcgtagcc agcacgcgca 1140

ccggaaacgg ggaggtgccg tcctccgccg agtcgagcca gatcgcaagc gggtatttga 1200

accccgcaaa gtcacgcgtt ttgcttggct tgttgcttgc ccaggggaag agtattgagg 1260

aaatgagggc ggtttttgag cggattgggg ttgcttga 1298

<210> 4

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgactgtac ccgcccagaa taagagccat gttatcattg acagaaacgg catcatcgaa 60

aatagacacc tggtccacgc cgcgatagtc gactcagccg gaaaggttct cttctctctc 120

ggcgatccat cgcgagtgac actcctccga tctgcagcca aaccagttca agcactagcg 180

gttgcggaga ctggcgccct cgagcatttt gcttttgacg atggtgatct ggctcttatg 240

tgtgcctcgc atagtagcga ggaccggcat atcgagcggg ctcgacgaat gctcgctaag 300

tcgcagcata cggaggacca attgcggtgt ggtggccatc cttcaataaa tccggcgatc 360

aacaacgaat ggatcaagcg ggacttcgaa ccgacggcag tctataacaa ttgttccggc 420

aaacatgcgg gtatgctggc tggggccaaa gctattggtg cctccgcaga caattaccat 480

ctcctgacgc atccaatcca ggccagcgtc aagagagtcg tggaagaagt agctgggtta 540

agcgaggaag aggttcagtg ggggcttgac ggctgcaata tgccggcgcc tgcatttccc 600

ctttctcact tggccaaggt atatgcttca tttgcccagg catcagacgc agtagccagt 660

ggcagtccag tcacgcccag ggtgcagctg atgggaaaga tcttcaatgc catggctcaa 720

atgcccgaga tggttggcgg cgagggtcgc ttctgtacta tcttaatgag tgctcttggt 780

ggctctacca tcggcaaggt cggtgcagat ggctgctacg ccgttggaat gcgcgagtct 840

gaacagacga agggaattgg agcagagggc gcagttggga tcgccgtcaa gattgaagac 900

ggcaatctag gtatactgta tgccgcggtt gctgaaatat tagcgcagct gaagctctgt 960

aatcgggagg acatgcagac tctggagaca tatcataatc cgaagatgaa gaacaccatg 1020

ggaattgtca ctggtactgc gaggtttgac tttgagtttc tttgcaccag gggggcaatt 1080

ttactctaa 1089

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attacgaatt cttaattaac ctgtaaagcc gcaatgcagc 40

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catgatgcgc agtccgcggt 20

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggactgcgca tcatgcctct caagccgatt ctcc 34

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cattatacga agttattcta gactacgcat ccgtgcccag ag 42

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actagtgagc tcatttagct ccgtggcgaa agcct 35

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtgccaagc ttatttcatc gtaaccgaga atccagagct g 41

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attacgaatt cttaattacg agaatggtga ggactgagat aa 42

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catggtgcaa tacacagagg gt 22

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtgtattgca ccatgcctct caagccgatt ctcc 34

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cattatacga agttattcta gactacgcat ccgtgcccag ag 42

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

actagtgagc tcatttgctt tcgtgaccgg gcttcaaa 38

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agtgccaagc ttatttatgc gatgcggctc aagacttc 38

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

attacgaatt cttaattaac gcaagtgcct gagtgaagat 40

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cattgtcgat gacggggaga tattat 26

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccgtcatcga caatgcctct caagccgatt ctcc 34

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cattatacga agttattcta gactacgcat ccgtgcccag ag 42

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

actagtgagc tcatttcact ctgagctgaa tgcagaagc 39

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agtgccaagc ttatttcacc aaggcaactc gtccag 36

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

attacgaatt cttaattaag tgaggagatt gtggctacga 40

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cattgcgacg ctatgcttgt g 21

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

catagcgtcg caatgcctct caagccgatt ctcc 34

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cattatacga agttattcta gactacgcat ccgtgcccag ag 42

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

actagtgagc tcatttaacc tggaaacgtg agatgtg 37

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agtgccaagc ttatttccga gtcctgagag ttgtagt 37

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

attacgaatt cttaattaat tgtgatgctg ctgctgatg 39

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

catgttgatg tcttcttgct tcag 24

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gaagacatca acatgcctct caagccgatt ctcc 34

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cattatacga agttattcta gactacgcat ccgtgcccag ag 42

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

actagtgagc tcatttaggg ggctcttctt ttgtgat 37

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

agtgccaagc ttatttcacg acgacaacac ctggat 36

<210> 35

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

attacgaatt cttaattaat tccgtgcgtg tctgatgg 38

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

catattgtcc gcctcaattg aaac 24

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gaggcggaca atatgcctct caagccgatt ctcc 34

<210> 38

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cattatacga agttattcta gactacgcat ccgtgcccag ag 42

<210> 39

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

actagtgagc tcatttctgc tctgctacat gggtatg 37

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

agtgccaagc ttatttggat tcgggcgtat gttgag 36

<210> 41

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

attacgaatt cttaattaag gagtctaagg cacaccagta 40

<210> 42

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

cattatacga agttattcta gacggctgaa cctagtcatc ct 42

<210> 43

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

attacgaatt cttaattaat gactaggttc agccgttaaa g 41

<210> 44

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cattatacga agttattcta gatgattatt tgtgcgtgtt ttcc 44

<210> 45

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

attacgaatt cttaattaat gctgttacat tcaaggttgg a 41

<210> 46

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cattatacga agttattcta gatggtcaag actggtagga agaa 44

<210> 47

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

actagtgagc tcatttcagg ataggcatca gagcagta 38

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

agtgccaagc ttatttgaag cattcggcgg ttgtt 35

<210> 49

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

attacgaatt cttaattaaa aatctgtcct cgtcctttgt c 41

<210> 50

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cattatacga agttattcta gagcatccag cggtagttcc a 41

<210> 51

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

actagtgagc tcatttcgtc gtcttctcca acatcc 36

<210> 52

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

agtgccaagc ttatttggtg cttgacatgg cttga 35

<210> 53

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

attacgaatt cttaattaaa gaagcagaaa ggctggtga 39

<210> 54

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

cattatacga agttattcta gaatgggatc aatgatggaa cg 42

<210> 55

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

actagtgagc tcatttcttg aatatcggag aaggttgc 38

<210> 56

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

agtgccaagc ttatttaagc gttgagcagg aagacc 36

<210> 57

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

attacgaatt cttaattaat tcaagccagg gagaaagaa 39

<210> 58

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

cattatacga agttattcta gacaccatca agtatgcgta ggg 43

<210> 59

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

actagtgagc tcatttacac tctatcccgc ttgtctga 38

<210> 60

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

agtgccaagc ttatttgctg gtacggaatg gtattcttc 39

<210> 61

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

attacgaatt cttaattaaa aatggcatac cagctttca 39

<210> 62

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

cattatacga agttattcta gagcttcgga ctcaaccagg ac 42

<210> 63

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

actagtgagc tcattttcaa gaagaggcag agggta 36

<210> 64

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

agtgccaagc ttatttacgt ggagaaatcg gaatat 36

<210> 65

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

attacgaatt cttaattaaa tcatgttctt tgttgcggta g 41

<210> 66

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

cattatacga agttattcta gacgggaggc tggagtattg 40

<210> 67

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

actagtgagc tcattttaaa gtggtggcga ggtg 34

<210> 68

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

agtgccaagc ttatttggcg caagaagctg aaat 34

<210> 69

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

attacgaatt cttaattaag tcgtgcctga ggtccat 37

<210> 70

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

cattatacga agttattcta gatctgacgg tgaggttgca 40

<210> 71

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

actagtgagc tcatttgact ggcggtcatt acgt 34

<210> 72

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

agtgccaagc ttatttgctc atcaataccc gacttt 36

<210> 73

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

attacgaatt cttaattaaa agtcctcccg cacatca 37

<210> 74

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

cattatacga agttattcta gatggcacga agaaggtact ga 42

<210> 75

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

actagtgagc tcatttcaga ctatggtggt ttggg 35

<210> 76

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

agtgccaagc ttatttagag cgtagcgatg tggt 34

Claims

1.一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉异源表达核苷酸序列如SEQ ID No.1～4任一所示的天冬酰胺酶；所述重组里氏木霉为将里氏木霉中原始的纤维素酶CBH1、CBH2、EGL2、EGL3和木聚糖酶XYN2、XYN3的基因替换为所述天冬酰胺酶的基因，并敲除里氏木霉中的所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶的基因。

2.一组用于构建权利要求1所述的重组里氏木霉的质粒，其特征在于，包括重组表达质粒和敲除质粒，所述重组表达质粒依次包含所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的启动子序列、所述天冬酰胺酶编码的基因序列、基于Cre-loxP介导的可回收的抗性筛选标记和所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的终止子序列；所述敲除质粒依次包含所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶基因的上游同源臂序列、基于Cre-loxP介导的可回收的抗性筛选标记和所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶基因的下游同源臂序列。

3.根据权利要求2所述的质粒，其特征在于，所述所需替换的纤维素酶或木聚糖酶包括纤维素酶CBH1、CBH2、EGL2、EGL3和木聚糖酶XYN2、XYN3；所述所需敲除的纤维素酶、木聚糖酶或蛋白酶采用EGL1、XYN1、BGL1、PEP1、SLP1、GAP1、TRE81070、TRE120998和TRE123234所编码的酶敲除。

4.一种权利要求1所述的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.构建如权利要求2中所述的重组表达质粒；

S2.将所述重组表达质粒转化至里氏木霉中；

S3.构建如权利要求2中所述的敲除质粒；

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤S4中，先筛选出同时含有所述重组表达质粒和敲除质粒的里氏木霉，再筛选出基因组中成功发生同源重组的转化子，再通过标记回收技术，筛选得到无抗性标记的转化子。

6.一种权利要求1所述的重组里氏木霉或权利要求2-3任一项所述的质粒在天冬酰胺酶生产中的应用。

7.一种天冬酰胺酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.利用权利要求1所述的重组里氏木霉或权利要求2-3任一项所述的质粒生产天冬酰胺酶；

S2.从S1的体系中分离得到天冬酰胺酶。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，在步骤S1中，生产天冬酰胺酶的方法包括：将所述重组里氏木霉接种于发酵培养基中，接种量1％～20％，20～37℃，培养2～12天。

9.一种权利要求7或8所述的生产方法生产得到的天冬酰胺酶在面制食品加工中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，权利要求7或8所述的生产方法生产得到的天冬酰胺酶在面制食品烘焙、烧烤、蒸煮、煎炒或油炸中的应用。