CN113376233A - 一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的电极、其制备方法及直接电化学应用 - Google Patents
一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的电极、其制备方法及直接电化学应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的电极、其制备方法及直接电化学应用，首先合成了离子液体基脂质体单体，通过自由基聚合反应制备了离子液体基聚合脂质体，之后利用聚合脂质体结构中离子液体的离子交换性，制备了polysome‑Au复合材料。本发明得到的离子液体基聚合脂质体/金纳米粒子与HRP结合构建修饰电极，由于复合材料具有良好的导电性和生物相容性，固定化的HRP几乎保留了原有的结构，显示出较高的电活性和电催化作用。polysome‑Au复合材料可以有效的促进HRP与电极表面的直接电子传输。此外，Nafion/HRP/polysome‑Au/GCE修饰电极对H2O2和NaNO2表现出较好的分析检测性能。
Description
技术领域
本发明公开涉及电化学技术领域，尤其涉及一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的电极、其制备方法及直接电化学应用。
背景技术
电化学传感器由于结构简单，高效和灵敏，而被视为一种有效的分析检测方法。其中酶基电化学生物传感器因其高催化活性，特异性和生物相容性，在传感器领域引起了人们的广泛关注。辣根过氧化物酶HRP能催化过氧化氢或氧化多种亚硝酸盐，是构建电化学生物传感器最常用的酶之一。由于HRP在裸电极上的直接电子转移被HRP氧化还原中心周围的蛋白质壳所屏蔽。此外HRP的生物活性不稳定，天然酶难以再利用。酶固定在纳米颗粒或纳米材料上有望解决这些问题。因此，固定化酶层的构建能够加速电子转移并保留其特定生物活性。迄今为止，大量的纳米材料已被用作固定酶的基质材料，用于电化学生物传感器的构建。
离子液体由于完全由离子组成，它们的蒸汽压力可以忽略不计，而且可能的阳离子和阴离子范围很广，这意味着可以很容易控制离子液体的特性。离子液体具有良好的导电性、不挥发性、不燃烧、较宽的电化学窗口，这些特性使其广泛的应用于电化学和电分析化学等领域。
脂质体作为一种具备优良特性的仿生纳米材料，在各种生物应用方面引起了广泛关注，特别是在电化学生物传感器领域。脂质体因其是一种由磷脂双分子层组成、内部为水相的闭合囊泡，具有与细胞膜类似的膜结构。因此可以提供一个良好的生物相容的微环境来稳定固定化酶的构象。因此，所制备的脂质体酶生物传感器具有良好的分析性能。
近年来，金属纳米粒子因其电子传输性、生物相容性、低细胞毒性和光学特性，而被广泛用于各种生物传感器的制造中。此外，许多工作表明，固定在金纳米颗粒上的酶可以保持其生物催化和电化学活性。
发明内容
鉴于此，本发明公开提供了一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的电极、其制备方法及直接电化学应用。聚脂质体/金纳米复合材料是一种新型的功能性纳米材料，用其构建化学修饰电极都表现出较好的电化学响应，具有良好的电催化性能，且适用于实际样品的分析检测；
第一方面，本发明提供了一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，制备离子液体基聚脂质体/金纳米复合材料polysome-Au；
步骤二，选择玻碳电极，并对其进行预处理；
步骤三，将辣根过氧化物酶溶液HRP与聚脂质体/金纳米复合材料polysome-Au溶液混合，向混合物中加入Nafion溶液后，将得到最终分散液；然后，将上述分散液滴到预处理的玻碳电极上，使多余的水份缓慢蒸发；最终得到新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极Nafion/HRP/polysome-Au/GCE。
优选地，所部步骤一制备离子液体基聚脂质体/金纳米复合材料包括如下步骤：
1)合成离子液体基脂质体liposome，由阳离子溴代咪唑啉离子液体的亲水头部和两条长链端烯的疏水尾部组成；
2)合成离子液体基聚脂质体polysome，由脂质单体疏水尾部烯烃之间的热引发交联聚合得到；
3)制备聚脂质体/金纳米复合材料polysome-Au：利用聚合脂质体结构中离子液体的离子交换性，将离子液体基聚脂质体与金纳米粒子通过原位还原方法结合。
优选地，所述步骤1)中离子液体基脂质体liposome浓度为1.00mg/mL，具体制备方法为：
1)向甲苯中依次加入2-甲基咪唑、三乙胺和溴代-11-碳烯，在90℃反应48小时；反应结束后冷却至室温，抽滤除去胺盐固体，所得滤液蒸干溶剂，用正己烷多次洗涤，再次蒸干溶剂正己烷后，将产物用乙腈-乙酸乙酯混合溶剂重结晶，真空干燥得到黄白色粉末，即为脂质体单体；
取脂质单体溶于去离子水中，超声1小时，完全分散得到澄清透明溶液，即为离子液体基脂质体。
优选地，所述步骤2)合成离子液体基聚脂质体polysome，具体包括：向离子液体基脂质体溶液中加入K2S2O8，100℃氮气保护下反应24小时，得到乳白色悬浊液；将乳白色悬浊液冷却至室温，8000rpm离心20min，将所得的固体产物用去离子水离心洗涤三次，然后冷冻干燥，所得到固体即为离子液体基聚脂质体。
优选地，所述步骤3)具体为：将离子液体基聚脂质体分散在去离子水中，在磁力搅拌下向其中滴加HAuCl4溶液,在室温条件下搅拌30min；
反应结束后，8000rpm离心15min除去多余的HAuCl4，将离心所得固体产物重新分散于去离子水中；滴加还原剂NaBH4反应2h，得到橘红色分散液，8000rpm离心15min，固相产物离心水洗三次；冷冻干燥，得到聚脂质体/金纳米复合物。
优选地，选择直径3mm的玻碳电极，预处理方法包括，先将玻碳电极在抛光布上分别用直径为0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末抛光，然后依次用去离子水、无水乙醇、去离子水超声清洗2min。
优选地，所述步骤三，辣根过氧化物酶溶液HRP与聚脂质体/金纳米复合材料polysome-Au溶液的混合体积比为1:1，将混合物旋涡搅拌10分钟，并在4℃下储存24小时；向混合物中加入等体积的Nafion溶液后，将得到的最终分散液再旋涡搅拌5分钟；然后，将上述分散液滴到预处理的玻碳电极上，用烧杯覆盖，使多余的水在4℃下缓慢蒸发；得到新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极Nafion/HRP/polysome-Au/GCE。
本发明第二方面还提供了一种采用上述制备方法制得的修饰电极Nafion/HRP/polysome-Au/GCE。
第三方面，本发明还提供了一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的应用，Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极用于对H2O2和NaNO2进行催化及分析检测。
本发明的有益效果：
本发明中将脂质体和金纳米粒子通过原位还原方法结合，制备了一种兼具结构稳定性、生物相容性和电子传输性的离子液体基聚脂质体/金纳米粒子复合物。利用其作为电极材料，与HRP结合构建化学修饰电极。通过电化学实验结果表明这种复合材料可以有效地促进HRP与电极之间的直接电子转移。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明的公开。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明公开实施例提供的离子液体基liposome分散在水溶液中的实物图片(a)，Zeta电位图(b)和动态光散射图(c)；
图2为本发明公开实施例提供的离子液体基polysome分散在水溶液中的实物图片(a)，Zeta电位图(b)和动态光散射图(c)；
图3为本发明公开实施例提供的离子液体基polysome-Au分散在水溶液中的实物图片(a)，Zeta电位图(b)和动态光散射(c)；
图4为本发明公开实施例提供的(A)liposome，(B)polysome，(C)polysome-Au的SEM照片；
图5为本发明公开实施例提供的(A)liposome，(B)polysome，(C)polysome-Au的TEM照片；
图6为本发明公开实施例提供的HRP(a)和HRP/polysome-Au(b)的紫外-可见吸收光谱图；
图7为本发明公开实施例提供的HRP(a)和HRP/polysome-Au(b)的FT-IR谱图；
图8为本发明公开实施例提供的Bare GCE，polysome/GCE，polysome-Au/GCE，HRP/polysome/GCE，HRP/polysome-Au/GCE修饰电极在5mM K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1:1)，0.1MKCl为支持电解质溶液中的阻抗谱图；其中频率范围从0.1Hz-100 KHz，振幅为5mV；开路电位为0.26V；
图9为本发明公开实施例提供的Nafion/HRP/GCE(a)，Nafion/HRP/liposome/GCE(b)，Nafion/HRP/polysome/GCE(c)和Nafion/HRP/polysome-Au/GCE(d)修饰电极在N2饱和的0.1M PBS(pH 7.0)中的循环伏安曲线图；其中扫速：200mV/s；
图10为本发明公开实施例提供的(A)Nafion/HRP/polysome-Au/GCE在N2饱和的PBS(pH 7.0)中扫速从100mV/s到800mV/s循环伏安曲线图；(B)峰电流与扫速的线性关系图；
图11为本发明公开实施例提供的(A)Nafion/HRP/polysome-Au/GCE在N2饱和的不同pH下的PBS溶液中的循环伏安曲线图。扫速：200mV/s；(B)式电位与pH值的关系图；(C)还原峰电流与溶液pH值之间的关系图；
图12为本发明公开实施例提供的(A)Nafion/HRP/polysome-Au/GCE在N2饱和的PBS(pH 7.0)溶液中连续扫描50圈的循环伏安曲线图，扫速：200mV/s；(B)扫描圈数和相应的峰电流变化趋势图；
图13(A)为本发明公开实施例提供的Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极在N2饱和的PBS(pH 7.0)中，对H2O2的催化循环伏安曲线图(扫速：200mV/s)；(B)Nafion/HRP/polysome/GCE修饰电极在N2饱和的PBS(pH 7.0)对H2O2的催化循环伏安曲线图(扫速：200mV/s)；
图14(A)为本发明公开实施例提供的Nafion/HRP/polysome-Au/GCE和Nafion/HRP/polysome/GCE修饰电极在0.1M PBS(pH 7.0)中连续加入50μM H2O2的计时安培图；电位：-0.38V；(B)电催化电流与H2O2浓度的关系图；
图15为本发明公开实施例提供的Nafion/HRP/polysome-Au/GCE对1mM UA,1mMAA,1mM DA和100M H2O2在0.1M pH 7.0PBS中的安培响应；电位：-0.38V；
图16(A)为本发明公开实施例提供的Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极在N2饱和的PBS(pH 7.0)中对NaNO2的催化循环伏安曲线图(扫速：200mV/s)；(B)催化峰电流与NaNO2浓度校正曲线图；(C)Nafion/HRP/polysome/GCE修饰电极在N2饱和的PBS(pH 7.0)中，对NaNO2的催化循环伏安曲线图(扫速：200mV/s)；(D)催化峰电流与NaNO2浓度校正曲线图；
图17为本发明公开实施例提供的Nafion/HRP/polysome-Au/GCE在含N2饱和的0.1MPBS(pH 7.0)中第一天和保存10天后的循环伏安曲线。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的***的例子。
酶的直接电化学在生物***和电化学生物传感器的研究中引起了广泛的关注。然而，酶在电极上的直接电子转移通常难以观察，因为酶的活性位点深埋在蛋白质基质中。因此，各种固定基质和介质被用来促进蛋白质的电子转移。
纳米材料在生物传感器中的集成，显著提高了生物传感器的灵敏度、检出限、响应时间等分析特性。因此，新型功能性纳米材料是众多酶基电化学生物传感器的关键组成部分。
本实施方案将兼具较好导电性以及生物相容性的离子液体基聚和脂质体/金纳米粒子复合物引入到生物传感界面的构建中；
首先，本实施方案提供了聚脂质体/金纳米复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，合成离子液体基脂质体；
可选地，所述离子液体基脂质体的合成包括如下步骤：取15.00mL甲苯加入到50mL圆底烧瓶中，向其中依次加入2-甲基咪唑、三乙胺和溴代-11-碳烯，在90℃反应48小时。反应结束后冷却至室温，抽滤除去胺盐固体，所得滤液蒸干溶剂，用正己烷多次洗涤，再次蒸干溶剂后，将产物用乙腈-乙酸乙酯混合溶剂重结晶，其中乙腈-乙酸乙酯的体积比约为1:3，真空干燥得到黄白色粉末，即为脂质体单体。取脂质单体10.0mg溶于10.0mL去离子水中，超声1小时，完全分散得到澄清透明溶液，此即为离子液体基脂质体liposome，浓度为1.00mg/mL。离子液体基脂质体是由阳离子溴代咪唑啉离子液体的亲水头部和两条长链端烯的疏水尾部组成。
从图1(a)可知，liposome为澄清透明的溶液，未观察到有明显的沉淀，说明其具有很好的水溶性，这是由于liposome的表面的离子液体的高亲水性所决定的。未聚合的脂质体liposome水溶液稳定性好，贮存一周后无明显沉淀。从图1(b)可以看出，脂质体liposome的Zeta电位值为+114mV，未聚合脂质体溶液的正表面电荷是由于咪唑基阳离子的存在。这种表面电荷使得liposome之间具有较强的静电排斥作用，从而使liposome具有较好的稳定性。从图1(c)可知，liposome的粒径为234nm。
步骤二，合成离子液体基聚脂质体；
可选地，聚合脂质体是由脂质单体疏水尾部烯烃之间的热引发交联聚合得到的。具体制备过程如下，取0.04g liposome溶液25.00mL于两口瓶中，加入10.0mg的K2S2O8，100℃氮气保护下反应24小时，得到乳白色悬浊液。将悬浊液冷却至室温，8000rpm离心20min，将所得的固体产物用去离子水离心洗涤三次，然后冷冻干燥，所得到固体即为聚合脂质体polysome。
从图2(a)可知，polysome为半透明的溶液，说明其在水中可以稳定存在。从图2(b)可知，polysome溶液Zeta电位值是+24.7mV，polysome溶液表面电荷性质与liposome类似，说明自由基聚合反应并未改变聚合脂质体的表面电荷性质。从图2(c)可知，polysome溶液的平均粒径是1755nm，相对于liposome而言，polysome粒径的增大是由于聚合引起部分颗粒的团聚所造成的。
步骤三，制备聚脂质体/金纳米复合物
取5.0mg的polysome分散再50.00mL去离子水中，在磁力搅拌下向其中滴加5.00mL的HAuCl4(10.00μL的HAuCl4分散于20.00mL去离子水中),在室温条件下搅拌30min。反应结束后，8000rpm离心15min除去多余的HAuCl4，将离心所得固体产物重新分散于10mL去离子水中。滴加1mL还原剂NaBH4(将1.0mg NaBH4分散于1mL去离子水中)反应2h，得到橘红色分散液，8000rpm离心15min，固相产物离心水洗三次。冷冻干燥，得到聚脂质体/金纳米复合物polysome-Au。
从图3(a)可知，polysome与HAuCl4离子交换之后经过NaBH4还原得到浅粉色的polysome-Au澄清溶液，说明有金纳米粒子附着于polysome上。从图3(b)可知，polysome-Au溶液Zeta电位值是+24.1mV，与polysome的电位接近。从图3(c)可知，polysome-Au溶液的平均粒径是1302nm，证明经过纳米Au修饰的polysome粒径没有被破坏。
从图4(A)中可以明显看出不规则的多层片状结构的存在，其边缘形状不规则，这与未聚合的脂质体liposome在水溶液中所固有的球形形貌完全不一样，这种原因是由于liposome结构稳定性差，在干燥状态下由于与基底发生了融合，从而形成多层膜结构，导致球形囊泡结构被破坏。然而图4(B)中在完全相同的条件下，聚合后单体间通过聚合形成的价键连接，polysome具有较好的结构稳定性，在干燥状态下仍然保持了较好的球形形貌。由于聚合还引起了部分团聚，球体之间界限分明，大小较为均匀，粒径大小约为200nm。这种结构稳定性不仅使得polysome在干燥的条件下保持球形结构，而且使得它耐受其表面金的原位还原，对于无机AuNPs在脂质体基底上的第一步装饰，利用polysome结构中离子液体的离子交换性，并经过氯金酸的交换反应以及硼氢化钠的还原反应，AuNPs在脂质体表面负载，制备得到polysome-Au纳米球，其形貌如图4(C)所示，从图中可以清晰地看到球形囊泡结构的存在，粒径大小与polysome一致，约为200nm。一方面由于聚合后脂质体的结构稳定性，使其经过原位负载AuNPs后的形貌依然保持球形结构的稳定。另一方面，由于原位负载AuNPs后的polysome-Au的导电性能的增加，使其SEM图像清晰稳定。
通过图5(A)中TEM图可以看出，liposome的囊泡结构被破坏，说明在干燥状态，未聚合脂质体的结构难以稳定存在。从图5(B)可以明显观察到，经聚合后，在视野中稳定分布着球形囊泡结构的脂质体材料，且表面光滑，界限明显，粒径分布在150-220nm之间。从图5(C)可以看出，经过AuNPs的原位生长，观察到脂质体的球形形貌得以很好保存，形貌和大小与polysome一致，但原本光滑的表面出现一些衬度较深的黑点，这些黑点为原位生成的AuNPs，大小在3-4nm左右，分布较为均匀。此外AuNPs具有较好的单分散性，未观察到团聚现象，说明polysome对原位生长的AuNPs具有稳定作用，这种单分散纳米粒子的生成，可以有效地促进电子的传输。
本实施方案还提供了一种Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极的制备方法：
将7.5mg/mL的HRP溶液与1.0mg/mL的polysome-Au溶液体以体积比为1:1的比例混合，将混合物旋涡搅拌10分钟，并在4℃下储存24小时。
向混合物中加入等体积1％Nafion溶液后，将最终分散液再旋涡搅拌5分钟。然后，将7.0μL上述分散液滴到预处理的玻碳电极(GCE)上，然后用烧杯覆盖，放入冰箱内以使多余的水在4℃下缓慢蒸发。得到Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极。其他修饰电极，包括本实施方案以后涉及的Nafion/HRP/GCE、Nafion/HRP/liposome/GCE、Nafion/HRP/polysome/GCE也是用上述同样方法制备。
其中所述电极预处理包括：玻碳电极(直径3mm)在使用之前，先将其在抛光布上分别用直径为0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末抛光，然后依次用去离子水、无水乙醇、去离子水超声清洗2min。最后以铁***为探针，在-0.2～0.8mV电位范围内，扫速为100mV/s，做循环伏安曲线。当氧化峰和还原峰电位差小于70mV时，说明电极表面达到活化和清洁的要求，最后用高纯氮气吹干备用。
对HRP/polysome-Au复合物进行表征，由于固定化酶自身结构的保存对于生物传感器的构建非常重要，因此利用紫外-可见吸收光谱研究了固定化酶可能的结构变化。从图6中可以看出，曲线a中游离HRP在403nm处出现明显的吸收峰，属于酶的典型Soret带。相比之下，从图中曲线b可以观察到HRP/polysome-Au复合物在403nm处也出现了一个吸收峰，与天然HRP的Soret带完全一致，说明固定化以后HRP的天然结构得到了很好的保留。
图7为HRP和HRP/polysome-Au的FT-IR谱图，polysome-Au进一步与HRP相互作用后，图中的曲线b说明HRP/polysome-Au的FTIR光谱显示出与polysome-Au类似的吸收带。其中一个吸收带位于1125cm-1处，归因于咪唑的C-H形变振动，1390cm-1归因于咪唑的C-H弯曲振动。此外，位于1661cm-1和1539cm-1处的吸收带可归因于HRP的酰胺I(C＝O)和II(N-H)红外吸收带的形状。这些吸收带基本上与游离HRP的吸收带相同(曲线a)，表明结合的酶的二级结构在固定后不受干扰。
应用上述电极作了如下电化学实验，以0.1M pH＝7.0的磷酸缓冲溶液(phosphatebuffer solution，PBS)，作为支持电解质。所有的电化学实验都使用CHI620B电化学工作站进行循环伏安法检测，使用三电极体系，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，修饰电极Nafion/HRP/polysome-Au/GCE为工作电极。电化学实验开始前，先取8.00mL PBS缓冲溶液放入小烧杯中，用高纯氮气除氧30min，若无特殊说明，在实验过程中一直保持氮气氛围。
图8Bare GCE、polysome/GCE、polysome-Au/GCE、HRP/polysome/GCE、HRP/polysome-Au/GCE修饰电极在5mM K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1:1)，0.1M KCl为支持电解质溶液中的阻抗谱图，频率范围从0.1Hz-100 KHz，振幅为5mV；开路电位为0.26V。利用电化学阻抗谱图可以证实材料在电极表面电荷转移阻力的大小，不同修饰电极的阻抗谱结果显示为线性部分和半圆形部分，其直径对应于电荷转移电阻。如图8中所示，裸电极、polysome/GCE和polysome-Au/GCE修饰电极的电阻值分别为200Ω、775Ω和541Ω，这种电阻值的依次减小，说明了polysome材料具有导电性质，而在polysome上固载Au后，进一步提高了导电性。HRP/polysome/GCE和HRP/polysome-Au/GCE两种修饰电极的电阻值由930Ω降低至642Ω。说明由于AuNPs的引入，使得polysome-Au复合材料具有较好的电子传输性，从而有利于促进酶与电极表面之间直接电子的传输。另外当负载了HRP后，HRP/polysome/GCE和HRP/polysome-Au/GCE电阻值增大，通过EIS结果进一步表明酶被成功固定化。
从图9可以看出，在电位扫描范围-0.8～0.2V内，在Nafion/HRP/liposome/GCE修饰电极上没有电化学响应，说明liposome不能作为氧化还原酶与电极表面直接电子转移的有效界面。在Nafion/HRP/GCE和Nafion/HRP/polysome/GCE上出现一对较弱的氧化还原峰，从曲线c可以读出Epa＝-0.305V和Epc＝-0.345V分别为氧化峰电位和还原峰电位，通过计算得出式电位为-0.325V，峰位差(△Ep)为40mV。氧化还原峰是由于HRP与电极之间发生了直接电子转移而产生的，对应于是HRP酶的FeⅢ/FeⅡ氧化还原中心。而在曲线d上可以观察到氧化还原峰电流明显增加。由此说明polysome-Au复合材料的生物相容性和导电性可以加速HRP与电极表面之间的电子转移速率，因此使电化学信号增大。从曲线d可以得出氧化还原峰电位分别为Epa＝-0.307V和Epc＝-0.349V，通过计算得出式电位为-0.328V，式电位与前面所得结果一致，说明该峰也为HRP的特征峰。△Ep为42mV，这不仅说明Nafion/HRP/polysome-Au/GCE的可逆性较好，而且表明电子转移较快。结果表明，尽管HRP被polysome固定化后可以实现直接的电化学反应，但是添加金纳米粒子后可以进一步促进HRP的电子转移反应。
根据法拉第定律Q＝nFAΓ*，这里，Γ*：表面覆盖量；Q：反应消耗的电量；n：电子转移数，这里取1；F为法拉第常数96493；A：电极面积。由此公式，可以估算出电活性的HRP在电极表面的覆盖度(Γ*)约为2.71×10-11mol·cm-2。这个值接近HRP在电极表面单层理论覆盖值(2.0×10-11mol·cm-2)，说明具有电活性的辣根过氧化物酶是以单层的状态存在的。
本实施方案合成了离子液体基脂质体单体，通过自由基聚合反应制备了离子液体基聚合脂质体，利用聚合脂质体结构中离子液体的离子交换性，制备了polysome-Au复合材料。利用动态光散射、Zeta电位、扫描电镜和透射电镜等技术对复合材料的表面形貌、结构和性质进行了表征。将离子液体基聚合脂质体/金纳米粒子与HRP结合构建修饰电极，利用FT-IR和UV-vis技术对酶复合材料的性质进行了考察。并对该修饰电极的直接电化学性质进行了研究。结果表明，Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极的电子转移速率常数为5.08s-1，检出限为11.56μM，灵敏度为0.15μA·mM-1·cm-2，具有较好的选择性和稳定性，对H2O2和NaNO2有较宽的线性检测范围。此外Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极对人血清样品中的H2O2具有较好的分析检测性能。具体如下所示：
图10(A)所示为Nafion/HRP/polysome-Au/GCE电极在氮气饱和0.1M pH 7.0PBS中，扫描速率分别为100、200、300、400、500、600、700和800mV/s时的循环伏安曲线。研究结果表明，阳极峰电流和阴极峰电流随着扫描速率的增大而增大。通过图10(B)可以看出，峰电流与扫速呈良好的线性关系，其中线性回归方程：阳极：y＝-0.13289-0.0076x，r＝-0.999；阴极：y＝0.26045+0.00908x，r＝0.999，由此说明该电极反应是一个表面控制的过程。
此外，当扫描速率为200mV/s，Ipa/Ipc的电流比值约为1:1，表明HRP在该电极上的电化学反应是准可逆的。峰位差△Ep＝42mV，并且n△Ep<200mV时，电子传递系数(α)估计为0.5。电子转移速率常数(ks)可根据Laviron理论来确定：
其中n为电子转移数，F为法拉第常数，θ为扫描速率，R为气体常数，T为开尔文温度，m为与△Ep有关的常数。通过计算得出ks为5.08s-1。结果表明，所制备的电极能够促进HRP与电极表面之间的电子转移。
如图11(A)所示，随着pH值增加，Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极阳极和阴极的峰值电位均出现负向移动，说明HRP的电化学行为受到PBS的pH值的影响。并从图11(B)可以看出，当pH值从5.5增加到8.0时，式电位呈线性下降，其斜率为-57.46mV/pH，这接近可逆质子耦合单电子转移过程的预期理论值-58.6mV/pH，表明电极和HRP之间的电子转移伴随着单个质子化。如图11(C)所示，最大峰值电流出现在pH值7.0时。结果表明HRP在中性pH溶液中具有较高的活性，这与其它基于HRP的电化学传感器的研究结果一致；
如图12所示，通过在扫描速率为200mV/s的N2饱和0.1M磷酸盐缓冲溶液中连续进行50个电位循环，来检测所开发的生物传感器的循环稳定性。如图12(A)所示即使连续扫描50次，Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极的循环伏安曲线稳定性好，式电位无明显变化。从图12(B)可以看出，经过50次连续扫描后，氧化还原峰电流变化在2％以内，这说明修饰电极Nafion/HRP/polysome-Au/GCE具有良好的稳定性。
图13(A)和(B)显示了在扫速为200mV/s下，连续添加H2O2时，Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极和Nafion/HRP/polysome/GCE修饰电极的CV响应，如图A和B所示，在pH 7.0的N2饱和PBS缓冲溶液中，随着H2O2的加入，HRP固定化电极的电化学行为发生了显著变化。还原峰值电流明显增大，两种修饰电极分别在-0.34V和-0.30V左右出现了一个明显的还原峰，而氧化峰电流逐渐减小直至消失。结果显示了H2O2典型的电催化还原过程。显然，H2O2的还原是由于HRP(FeII)的电催化作用，它可以在还原H2O2的同时被氧化成HRP(FeIII)，然后通过其与电极的直接电子转移能力迅速还原回HRP Fe(II)。HRP对H2O2的催化过程的机理如下所示：
HRP[Heme(FeIII)]+H2O2→Compound I+H2O
Compound I+e-→Compound II
Compound II+e-→HRP[Heme(FeIII)]
如图14(A)所示，当H2O2连续添加到不断搅拌的PBS缓冲溶液中时，Nafion/HRP/polysome-Au/GCE都显示出催化电流的瞬时增加，这表明所制造的生物传感器对H2O2还原的快速响应。尽管Nafion/HRP/polysome/GCE也显示出催化电流，但是随着H2O2浓度的增加，催化电流逐渐减小直至消失。根据图14(A)中，在信噪比为3的情况下，两种修饰电极估计检测限分别为7.39μM和11.56μM。灵敏度分别为0.24μA·M-1·cm-2和0.15μA·M-1·cm-2。表观米氏(Michaelis Menten)常数
是酶底物动力学的指标，通常用于评估固定化酶的生物学活性。
越小，生物活性就越高。当H2O2浓度高时，观察到平稳电流，显示出Michaelis Menten动力学的典型特征。通过Lineweaver Burk方程，确定该Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极的
值约为48.63μM。
为了确定可能的干扰物质是否对HRP生物传感器的影响，采用Nafion/HRP/polysome-Au/GCE检测了葡萄糖(Glu)、抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)和多巴胺(DA)等干扰物质的选择性和抗干扰能力。如图15所示，在N2饱和pH 7.0的PBS缓冲液中添加100M H2O2后，电流响应明显增强。当注射10倍浓度的干扰物后，电流无变化。而H2O2引起的电流变化不受这些干扰物的影响。表明了该生物传感器对干扰物质的良好抗干扰能力和对H2O2的良好选择性。
如图16(A)和(C)所示，当将NaNO2加入PBS时，在一个约0.8V处观察到一个新的还原峰，这表明了由亚硝酸根歧化反应产生的NO的还原。此外，峰值电流随着PBS中NaNO2浓度的增加而增加。电催化过程可以描述如下：
3NO2 -+2H+→2NO+NO3 -+H2O
HRP-Fe(II)+NO→HRP-Fe(II)-NO
HRP-Fe(II)-NO+e-+2H+→HRP-Fe(II)+H2O+N2O
图16(B)和(D)分别为Nafion/HRP/polysome-Au/GCE和Nafion/HRP/polysome/GCE修饰电极对NaNO2催化峰电流与NaNO2浓度的校正曲线。从图B中可以看出，在10mM～1400mM的范围内NaNO2浓度与催化峰电流呈良好的线性关系，线性回归方程为y＝0.0130x+2.370(R2＝0.994)，x和y分别代表NaNO2浓度(mM)和还原峰电流(μA)，从图D中可以看出，在10mM～400mM的范围内NaNO2浓度与催化峰电流呈较好的线性关系，线性回归方程为y＝0.0069x+3.037(R2＝0.996)，两种修饰电极的检出限分别为2.06mM和3.88mM(S/N＝3)，由校正曲线的部分直线斜率得到灵敏度分别为0.19μA·mM-1·cm-2和0.10μA·mM-1·cm-2。
图17研究了Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极在贮存10天后的电催化反应。如图所示，与存储前测得的曲线原始信号相比，贮存10天后的Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极的CV曲线显示了稍弱的电流响应。阳极峰电流从1.63μA降低为1.54μA，降低值范围在5％以内，说明Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极具有可接受的储存稳定性。
对Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极对人血清实际样品中的H2O2的分析检测性能进行了考察。分析检测结果如表2.1所示，回收率在96.3％至103.6％之间。所得结果表明，该电极适用于分析实际样品中的H2O2，这可归因于其高灵敏度，高选择性。
表2.1 Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极对实际样品中H2O2的分析检测性能
本实施方案首先合成了离子液体基脂质体单体，通过自由基聚合反应制备了离子液体基聚合脂质体，之后利用聚合脂质体结构中离子液体的离子交换性，制备了polysome-Au复合材料。与未聚合的liposome相比，本发明提供的复合材料不仅具有较好的结构稳定性，还兼具良好的生物相容性和电子传输性。此外由于表面离子液体的稳定作用，使得AuNPs以单分散的形式负载与polysome之上。
将离子液体基脂质体、离子液体基聚合脂质体和离子液体基聚合脂质体/金纳米粒子与HRP结合构建修饰电极，利用FT-IR和UV-vis技术对酶复合材料的性质进行了考察。由于复合材料具有良好的导电性和生物相容性，固定化的HRP几乎保留了原有的结构，显示出较高的电活性和电催化作用。并对该修饰电极进行了直接电化学性质的考察。结果表明，polysome-Au复合材料可以有效的促进HRP与电极表面的直接电子传输。此外，Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极对H2O2和NaNO2表现出较好的分析检测性能，例如较高的灵敏度，较宽的线性检测范围以及较低检出限。实验结果表明该方法适用于HRP的固定化，在生物传感器或生物反应器的构建方面具有潜在的应用前景。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。
Claims (9)
1.一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，制备离子液体基聚脂质体/金纳米复合材料polysome-Au；
步骤二，选择玻碳电极，并对其进行预处理；
步骤三，将辣根过氧化物酶溶液HRP与聚脂质体/金纳米复合材料polysome-Au溶液混合，向混合物中加入Nafion溶液后，将得到最终分散液；然后，将上述分散液滴到预处理的玻碳电极上，使多余的水份缓慢蒸发；最终得到新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极Nafion/HRP/polysome-Au/GCE。
2.根据权利要求1所述的一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的制备方法，其特征在于，所部步骤一制备离子液体基聚脂质体/金纳米复合材料包括如下步骤：
1)合成离子液体基脂质体liposome，由阳离子溴代咪唑啉离子液体的亲水头部和两条长链端烯的疏水尾部组成；
2)合成离子液体基聚脂质体polysome，由脂质单体疏水尾部烯烃之间的热引发交联聚合得到；
3)制备聚脂质体/金纳米复合材料polysome-Au：利用聚合脂质体结构中离子液体的离子交换性，将离子液体基聚脂质体与金纳米粒子通过原位还原方法结合。
3.根据权利要求2所述的一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中离子液体基脂质体liposome浓度为1.00mg/mL，具体制备方法为：
1)向甲苯中依次加入2-甲基咪唑、三乙胺和溴代-11-碳烯，在90℃反应48小时；反应结束后冷却至室温，抽滤除去胺盐固体，所得滤液蒸干溶剂，用正己烷多次洗涤，再次蒸干溶剂正己烷后，将产物用乙腈-乙酸乙酯混合溶剂重结晶，真空干燥得到黄白色粉末，即为脂质体单体；
取脂质单体溶于去离子水中，超声1小时，完全分散得到澄清透明溶液，即为离子液体基脂质体。
4.根据权利要求2所述的一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的制备方法，其特征在于，所述步骤2)合成离子液体基聚脂质体polysome，具体包括：向离子液体基脂质体溶液中加入K2S2O8，100℃氮气保护下反应24小时，得到乳白色悬浊液；将乳白色悬浊液冷却至室温，8000rpm离心20min，将所得的固体产物用去离子水离心洗涤三次，然后冷冻干燥，所得到固体即为离子液体基聚脂质体。
5.根据权利要求2所述的一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：将离子液体基聚脂质体分散在去离子水中，在磁力搅拌下向其中滴加HAuCl4溶液,在室温条件下搅拌30min；
反应结束后，8000rpm离心15min除去多余的HAuCl4，将离心所得固体产物重新分散于去离子水中；滴加还原剂NaBH4反应2h，得到橘红色分散液，8000rpm离心15min，固相产物离心水洗三次；冷冻干燥，得到聚脂质体/金纳米复合物。
6.根据权利要求1所述一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的制备方法，其特征在于，选择直径3mm的玻碳电极，预处理方法包括，先将玻碳电极在抛光布上分别用直径为0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末抛光，然后依次用去离子水、无水乙醇、去离子水超声清洗2min。
7.根据权利要求1所述一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的制备方法，其特征在于，所述步骤三，辣根过氧化物酶溶液HRP与聚脂质体/金纳米复合材料polysome-Au溶液体的混合体积比为1:1，将混合物旋涡搅拌10分钟，并在4℃下储存24小时；向混合物中加入等体积的Nafion溶液后，将得到的最终分散液再旋涡搅拌5分钟；然后，将上述分散液滴到预处理的玻碳电极上，用烧杯覆盖，使多余的水在4℃下缓慢蒸发；得到新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极Nafion/HRP/polysome-Au/GCE。
8.一种采用权利要求1所述的制备方法制得的修饰电极Nafion/HRP/polysome-Au/GCE。
9.一种新型脂质体基辣根过氧化物酶构建的修饰电极的应用，其特征在于，Nafion/HRP/polysome-Au/GCE修饰电极用于对H2O2和NaNO2进行催化及分析检测。
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