CN113373197B - 一株锁掷酵母在生产类胡萝卜素和胞外多糖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株锁掷酵母在生产类胡萝卜素和胞外多糖中的应用，属于微生物及微生物发酵领域。本发明选取了从食醋中筛选得到的一株锁掷酵母作为发酵菌株，用于生产类胡萝卜素和胞外多糖，将此锁掷酵母菌株通过高密度发酵培养，菌体细胞72‑86h可以达到＞80g/L，类胡萝卜素含量可达菌体干重的900ug/g。同时通过调节培养基组分，可以获得7.9‑11.4g/L的胞外多糖，此胞外多糖为磷酸二酯多糖，该多糖可显著地增强免疫的作用，显著提升了发酵过程的附加值。本发明的菌株培养条件粗放，营养要求低，类胡萝卜素产率高，其副产物胞外多糖也具备生产应用价值，具备良好的工业化应用前景。

Description

一株锁掷酵母在生产类胡萝卜素和胞外多糖中的应用
技术领域
本发明涉及一株锁掷酵母在生产类胡萝卜素和胞外多糖中的应用，属于微生物及微生物发酵领域。
背景技术
微生物类胡萝卜素是酵母、藻类、霉菌和细菌等产油微生物储存在细胞内的类胡萝卜素。微生物类胡萝卜素的特点和优势主要体现在：与植物来源的类胡萝卜素产品相比，微生物类胡萝卜素不会与粮食生产竞争，且不占用大量耕地；基本不受全球气候和植物生长季节条件等自然条件变化的影响；使用微生物进行类胡萝卜素生产的周期更短；微生物利用工业废料或其他廉价原料用作碳源；微生物可以通过代谢工程的方法对其细胞进行修饰，用于富集特定的脂肪酸，减少所需的化学合成步骤[1]。目前对微生物类胡萝卜素在食用类胡萝卜素方面的开发应用主要集中在利用微生物来生产高附加值的功能性类胡萝卜素，例如采用寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、裂壶藻(Schizochytrium sp.)和吾肯氏壶藻(Ulkenia sp.)菌生产DHA，采用高山被孢霉(Mortierellaalpina)生产ARA。对采用酵母菌进行功能性类胡萝卜素的生产还较少，产油酵母。酵母被广泛的认为是最适合用于生产微生物类胡萝卜素的一类菌种，目前研究最多的类胡萝卜素酵母有解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、粘红酵母 (Rhodotorulaglutinis)、隐球酵母(Cryptococcuscurvatus)、斯达氏类胡萝卜素酵母 (Lipomycesstarkeyi)等。类胡萝卜素酵母受菌种和培养条件的影响，不同产油酵母利用葡萄糖作为碳源进行补料分批发酵时的产油能力不尽相同，类胡萝卜素产量在5-800ug·L-1，而胞内类胡萝卜素含量也不等，类胡萝卜素对葡萄糖的转化率不高。
此外，微生物胞外多糖是许多学科的研究目标，目前主要关注其生产工艺的优化，阐明其生物学的功能，确定其生物合成途径以及基于产品特性的应用开发。目前研究已经表明微生物胞外多糖的结构具有显著的多样性，但仅对其中的少量产品进行了工业发展潜力的研究，如黄原胶和葡聚糖等[3,4]。与其他天然来源的多糖相比，已经工业化的微生物多外多糖具有更短生产周期和更便捷的提取方法，并且微生物多外多糖的生产过程是在发酵罐中进行的，不会与其他粮食和作物竞争其生产的土地,而且它们还可以充分利用其他农业的废弃物资源作为其生产的原料。此外，胞外多糖由于其独特的结构和理化性质，使其广泛应用在食品、生物材料、水性体系的流变改性剂和医疗等方面。能生产胞外多糖的真菌包括金黄色葡萄球菌 (Aureobasidium)念珠菌(Candida)和隐球菌(Cryptococcus)等菌属。真菌生产的胞外多糖大多为同多糖，但杂多糖也很常见。此类聚合物单独或与其他糖类(例如半乳糖、木糖)组合成含有D-甘露糖、糖醛酸和非糖取代基的生物多糖(Xu Y,Guo Y,DuanS,et al.Effects of ultrasound irradiation on the characterization andbioactivities of the polysaccharide from blackcurrant fruits[J]. UltrasonicsSonochemistry,2018,49:206-214.)。尽管研究了真菌胞外多糖中的化学结构，并报道了其生物学活性，但是仍未对其进行深入研究。
在过去的几十年的发展中，机械的现代化发展伴随着能源的大量消耗，不可再生资源例如石油、煤炭、天然气被大量开发和应用，能源危机越来越严重。由微生物来源的类胡萝卜素之所以未被大规模应用主要限制在生产成本高，因此越来越多的研究集中在其发酵条件的优化及通过利用廉价原料来降低其生产成本。但是廉价的原料总伴随着类胡萝卜素产量的降低，并且目前的生产菌株在生产类胡萝卜素的同时，还产生了诸多无法利用的副产物，进一步加重了生产成本。
发明内容
针对目前微生物发酵生产类胡萝卜素菌株生产效率低、生产成本高等问题，本发明提供一种红色好氧酵母菌，该菌株在发酵生产类胡萝卜素的同时，还能生产一种为磷酸二酯多糖的胞外多糖，该多糖可显著地增强免疫的作用，显著提升了发酵过程的附加值。
本发明提供了一种提升类胡萝卜素产量的方法，所述方法是以锁掷酵母(Sporidioboluspararoseus)为发酵菌株，在含有玉米浆和葡萄糖的反应体系中发酵生产；所述锁掷酵母已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021729。
在一种实施方式中，将培养至对数期的锁掷酵母按发酵体系的5～15％接种至发酵体系中，在25～30℃培养60～70h。
在一种实施方式中，将OD600为0.4-0.5的锁掷酵母按照发酵体系体积的10％接种至发酵体系中，在28℃培养64h。
在一种实施方式中，发酵体系中的葡萄糖和玉米浆的初始浓度分别为50～70g/L和 5～15g/L。
在一种实施方式中，发酵体系中的葡萄糖和玉米浆的初始浓度分别为60g/L和10g/L。
在一种实施方式中，在发酵15～60h补加葡萄糖，并控制发酵体系中的残糖量为15～20g/L。
在一种实施方式中，在发酵18～56h补加葡萄糖，并控制发酵体系中的残糖量为20g/L。
在一种实施方式中，反应过程中控制溶氧15～25％。
在一种实施方式中，反应过程中控制溶氧20％。
本发明提供了一种提升胞外多糖产量的方法，所述方法是以锁掷酵母为发酵菌株，在含有玉米浆和葡萄糖的反应体系中发酵生产；所述锁掷酵母已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021729。
在一种实施方式中，发酵体系中葡萄糖和玉米浆的初始浓度分别为50～70g/L和15～25g/L。
在一种实施方式中，发酵体系中葡萄糖和玉米浆的初始浓度分别为60g/L和20g/L。
在一种实施方式中，在发酵开始至20～25h期间补加玉米浆，玉米浆浓度为80～120g/L，补料速度为0.1～0.2L·h-1。
在一种实施方式中，在发酵开始至24h期间补加玉米浆，玉米浆浓度为100g/L，补料速度为0.125L·h-1。
在一种实施方式中，反应过程中控制溶氧20％。
在一种实施方式中，反应时间不少于60h。
在一种实施方式中，反应时间为64h。
本发明的有益效果：本发明选取了从食醋中筛选得到的一株锁掷酵母作为发酵菌株，用于生产类胡萝卜素和胞外多糖，将此锁掷酵母菌株通过高密度发酵培养，菌体细胞64h可以达到＞80g/L，类胡萝卜素含量可达菌体干重的900ug/g，本发明的菌株培养条件粗放，营养要求低，类胡萝卜素产率高，便于工业化生产。同时通过调节培养基组分，可以获得7.9-11.4 g/L的胞外多糖，此胞外多糖为磷酸二酯多糖，该多糖可显著地增强免疫的作用，显著提升了发酵过程的附加值。
生物材料保藏
本发明所提供的锁掷酵母，分类命名为近粉红锁掷孢酵母ZQHLSporidioboluspararoseus ZQHL，已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： M 2021729，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
实施例1：锁掷酵母培养生产类胡萝卜素和胞外多糖
选用培养基如下：
(1)斜面活化培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨1，酵母膏1，pH6.0。
(2)液体种子培养基(g/L)：葡萄糖40，玉米浆20，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，pH6.0， 100mL/500mL三角瓶。
(3)发酵培养基(25L体系)(g/L)：
表1发酵培养基组分
Figure BDA0003173644970000031
Figure BDA0003173644970000041
注：配制时，按照30L的试剂用量配制。调整pH为6.0-6.5，添加0.1-0.3％(v/v)的消泡剂(25mL)；
(4)补料培养基：
①葡萄糖：浓度800g/L。
②玉米浆：浓度100g/L。
(5)培养方法：
①斜面活化培养：
将菌株从保藏斜面接到活化斜面培养基上，28℃培养48h。
液体种子培养：接到种子培养基中，28℃震荡(100r/min，往复式摇床，振幅8cm)培养 16h，OD600为0.4-0.5。
②发酵罐发酵培养：在50L发酵罐中加入35L发酵培养基，将种子液按接种量10％(V/V) 加入发酵培养基中，在28℃培养64h，发酵过程中各参数见表2 ；发酵18h开始补加800g/L 的葡萄糖，在18-56h期间根据残糖补糖，控制发酵体系中残糖在20g/L。
表2发酵条件各参数
Figure BDA0003173644970000042
注：发酵过程中控制溶氧为20％。
(6)产物的鉴定
①类胡萝卜素
将发酵液离心获得菌体，加入一倍质量的酒精，超微粉碎研磨，用正己烷提取，收集有机溶剂层，真空去除正己烷得到锁掷酵母产的类胡萝卜素，使用装备有DAD检测器和C18 柱(25mm×4.6mm)的日立L-2000高效液相色检测锁掷酵母油脂中的类胡萝卜素组成，类胡萝卜素含量约为900μg/g菌体干重。
②胞外多糖
胞外多糖产量的测定：取10mL发酵上清液加入20mL无水乙醇，6000r·min-1离心10min，沉淀60℃烘箱中烘干至恒重，苯酚硫酸法检测胞外粗多糖产量，产量为7.9±0.4g/L发酵液。
实施例2
具体实施方式参见实施例1，区别在于，发酵培养基中玉米浆初始浓度为20g·L-1；同时，在发酵过程中流加浓度为100g/L的玉米浆，玉米浆补料速度0.125L·h-1，从发酵开始时至24h进行补料，剩余时间停止流加玉米浆。
胞外多糖产量的测定：取10mL发酵上清液加入20mL无水乙醇，6000r·min-1离心10min，沉淀60℃烘箱中烘干至恒重，苯酚硫酸法检测胞外粗多糖产量。通过底物优化后，增加玉米浆的浓度，可提升胞外多糖的产量，锁掷酵母的胞外多糖的产量为11.4±0.4g·L-1比优化前提高44.3％。类胡萝卜素产量约为820μg/g菌体干重。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种提升类胡萝卜素产量的方法，其特征在于，以近粉红锁掷孢酵母（Sporidioboluspararoseus）ZQHL为发酵菌株，在含有玉米浆和葡萄糖的反应体系中发酵生产；所述近粉红锁掷孢酵母ZQHL已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021729，所述葡萄糖和玉米浆的初始浓度分别为50~70g/L和5~15g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将培养至对数期的近粉红锁掷孢酵母 按发酵体系的5~15%接种至发酵体系中，在25~30℃培养60~70 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在发酵15~60 h补加葡萄糖，并控制发酵体系中的残糖量为15~20 g/L。
4.根据权利要求1~3任一所述的方法，其特征在于，反应过程中控制溶氧15~25%。
5.一种提升胞外多糖产量的方法，其特征在于，以近粉红锁掷孢酵母ZQHL为发酵菌株，在含有玉米浆和葡萄糖的反应体系中发酵生产；所述近粉红锁掷孢酵母ZQHL已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021729，所述葡萄糖和玉米浆的初始浓度分别为50~70g/L和15~25g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在发酵开始至20~25 h期间补加玉米浆，玉米浆浓度为80~120g/L，补料速度为0.1~0.2 L·h-1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反应过程中控制溶氧15~25%。
8.根据权利要求5~7任一所述方法，其特征在于，反应时间不少于60 h。
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