CN113373118B

CN113373118B - 杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN113373118B
Application number: CN202110569618.XA
Authority: CN
Inventors: 陈志南; 边惠洁; 杨向民; 朱平; 孙秀璇; 朱昱蒙; 南刚; 王彬; 杨旭
Original assignee: Air Force Medical University of PLA
Current assignee: Air Force Medical University of PLA
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113373118A

Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用，杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C2020217；从杂交瘤细胞株中克隆得到了抗人OPRM1单克隆抗体轻、重链可变区基因。所得重链和轻链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区，具有特征性的抗体高变区序列。基于上述已克隆到的抗人OPRM1单克隆抗体轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便用于制备靶向OPRM1的诊断或治疗性药物，比如肿瘤和/或药物成瘾。

Description

杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用。

背景技术

恶性肿瘤目前仍是我国重大公共卫生问题和首要致死原因。原发性肝癌俗称“癌中之王”，恶性进展快，治疗难度大，病死率高，是一种非常凶险的疾病，最新统计显示，肝癌在世界范围内肿瘤致死率排名第三位，在我国肿瘤致死率排名第二位，对居民生命健康危害极大。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌中最主要的、最普遍的一种，其发病凶险，进展速度快，平均自然生存时间仅为3至6个月。临床上对肝癌病人的治疗仍无明显突破，因此研究肝癌的诊断和治疗具有重要的意义。

自1975年

和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体(McAb)相继出现，它们在疾病诊治的基础研究和临床应用方面发挥了积极的作用,其中肝癌单抗的研制更是为这种难治性肿瘤带来了新的希望。近二十年，关于肝癌单抗的研究大多为甲胎蛋白和抗生长因子单抗。在肝癌单抗的制备方面,多采用传统免疫方法，即以可溶性物质或肝癌培养细胞为免疫原，由于肿瘤抗原的变异或部分丢失，因而该方法难以获得高亲和性、高特异性的肝癌单抗。用肿瘤特异性高表达抗原免疫动物制备单抗已有成功报道。该法虽然制备抗原麻烦，但能较好地筛选到目的靶点的单抗，不失为治疗性单抗制备的好方法。

阿片受体在脑中分布广泛，见诸于脊髓、外周感觉神经和自主神经中。经典的阿片受体是七次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)，主要包括μ阿片受体(Mu opioidreceptor，MOR，亦称OPRM1，OPRM，MOR-1等)、δ阿片受体(Delta opioid receptor，DOR)和κ阿片受体(Kappaopoid receptor，KOR)三类；其中，μ阿片受体OPRM1是目前报道的参与镇痛和介导药物成瘾相关的受体。目前这些经典受体类型的基因已经被克隆，结构生物学验证该类受体均为7次跨膜受体，可激活百日咳毒素不敏感G_αi/o家族的G蛋白，包括G_αz。证据表明μ、δ和k阿片受体存在不同亚型，但观察到的功能差异和药理学差异的分子基础尚不清楚。内源性阿片***在调节疼痛感知方面起到功能性作用，因此阿片受体激动剂是有效的镇痛药。在NCBI的Aceview的数据库中，人源阿片受体μ受体OPRM由400个氨基酸残基组成，与大鼠的该受体同源性可达95％。人的μ受体至少存在19种RNA剪辑转录本(Transcript variants)并预测(Predicted in Aceview)出编码18种不同的剪切异构体，这些剪切异构体的功能大都不明确。

阿片受体OPRM1属于Gi/o型GPCR中的一员，而其他Gi/o型GPCR如A2肾上腺素、腺苷A1等在激动剂慢性作用后则无依赖耐受现象出现。为了解释这一现象，用阿片受体OPRM1的胞内片段如C-末端筛选直接与阿片受体相互作用的特异性蛋白。其中与μ阿片受体的相互作用蛋白研究最多的，有钙调蛋白(Calmodulin)、丝蛋白A(Filamin A)、Periplakin、PKCI、RGS4和TRPV1等。这些蛋白与阿片受体的相互作用使得受体激活后效应发生了改变，进一步提示阿片受体激活后并非完全局限于与公认的G蛋白偶联。也有报道以阿片受体C-端为诱饵筛选***依赖大鼠的脑cDNA文库得到A20结合的核因子抑制蛋白1(ABIN1)，显示ABIN1蛋白对μ阿片受体与配体结合的亲和力及激动活性能够产生一定的影响，提示可能有更多或者更加特异性的蛋白参与了阿片受体后的调节，特别是针对代谢通路的改变研究也是重要的方面。

近年来，阿片类受体与肿瘤的关系受到广泛关注，其实验和临床研究对肿瘤细胞及其微环境的影响机制、临床预后也有相应的报道。这类受体往往也高表达在肿瘤细胞的表面，通过激活相关蛋白来调控细胞内的信号传导，进而影响细胞的极性、增殖、黏连、迁移等特性，特别是在肝癌的表达上呈现强阳性表达，该分子的表达提示其表达量可能与肝癌的发生发展密切相关，有望成为治疗肝癌治疗的新靶点。下面我们就对文献中阿片类受体与常见肿瘤发生发展作以简要的回顾。

阿片受体与肺癌：在全球，肺癌是男性与女性癌症患者死亡的首要原因，近期有许多文献报道阿片类受体及药物可通过不同的作用机制来影响肺癌的发生发展及患者预后。Singleton等将34个肺癌患者的肺癌组织以及癌旁肺组织的标本进行分析，发现肺癌组织中MOR明显处于高表达状态，比癌旁肺组织高出2倍。Kim等研究发现，阿片受体在人肺癌组织和细胞中的表达能够抑制肺癌细胞的增殖，***(阿片受体的作用配体)对肺癌细胞的生长抑制发生在细胞周期的S期。当阿片受体被沉默后***对肺癌细胞的生长抑制将减弱。Lennon等研究表明，MOR的过表达能够增加Akt和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活化，从而促进非小细胞肺癌的生长和转移。Mathew等将Lewis肺癌LLC用外周类阿片拮抗剂甲基纳曲酮或沉默MOR表达处理后，其可抑制LLC的增生及迁移，可使肺癌组织大小减少，同时抑制了一半以上的肺癌组织的转移。

Fujioka等研究表明，μ阿片受体活化可以促进非小细胞肺癌H2009细胞的增殖及侵袭，其作用途径与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)活化后促进丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase,MAPK/ERK)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)的磷酸化有关。同样的，在非小细胞肺癌H358细胞中，MOR也可以促进阿片类药物和生长因子诱导的肺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化(epithelial mesenchymaltransition,EMT)，其影响机制与磷酸肌醇3激酶信号通路的激活有关。Maher等对纳入的99例在胸腔镜下行肺叶切除术的非小细胞肺癌患者进行回顾性分析，发现患者5年内肺癌术后的复发率与术中及术后96h内阿片类受体激动剂药物的使用剂量呈正相关。综上所述，在相关阿片类受体与肺癌的研究中，阿片类受体及药物对肺癌的发生发展有抑制作用也有促进作用，其作用机制迄今为止尚未有明确定论。

阿片受体与乳腺癌：目前有大量的文献提示大量表明阿片受体与乳腺癌的发展密切相关。Bimonte等发现在体外研究中，***能够促进乳腺癌细胞的增殖，抑制MDA-MB-231细胞的凋亡。Weingaertner等在人类BT474乳腺癌细胞中研究发现，慢性***治疗可以抑制癌细胞的生长，通过提高乳腺癌细胞对ErbB靶向疗法的敏感性，其涉及的分子机制与细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和Akt信号的磷酸化有关。Afsharimani等通过建立小鼠乳腺癌模型，发现***可以改变肿瘤细胞生长所需要的微环境从而抑制了肿瘤的增殖及迁移能力，其通过减少基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和增加其内源抑制剂(TIMP-1)的水平来起作用。Ecimovic等研究证明，在***受体阴性MDA-MB-231和***受体阳性MCF7乳腺癌细胞中，NET1基因能够增加癌细胞的表达，并促进其迁移，而***既可以增加NET1的表达，也可对癌细胞迁移起直接作用。在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)异种移植小鼠模型体内研究发现，经***处理的小鼠其肿瘤明显大于其他对照组。并且***还能够促进血管生成，从而加快乳腺癌的进展。

近年来有研究发现编码人μ阿片受体基因(μ-opioid receptor gene,OPRM1)中最常见的突变位点为A118G，其基因多态性与乳腺癌的发展密切相关。Bortsov等通过对美国2039例乳腺癌患者的OPRM1和其生存率之间的关系进行研究，发现A118G基因的多态性能够减少乳腺癌患者的病死率，该研究认为阿片类药物的使用可以增加乳腺癌患者的生存率，但其相关效能还不明确。

阿片受体与肝癌：在肝癌细胞的相关研究中，Lu等通过干扰RNA合成或给予特异性抑制剂来下调MOR在人肝癌细胞中的表达，发现肝癌细胞的增殖被显著抑制且细胞凋亡速率增加，并将细胞周期阻滞在G0/G1期，MOR的下调可导致丝裂原活化蛋白激酶7(MAPkinase kinase,MKK7)表达和c-Jun氨基末端激酶(c-Junterninal kinase,JNK)活化的磷酸化增加。与此相反，MKK7通路的阻断可以逆转MOR的抗肿瘤作用。而Tang等则研究δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)在肝癌细胞中的表达，发现当DOR基因表达被沉默或抑制时，肝癌细胞的增殖受到抑制，肿瘤细胞出现凋亡，细胞周期被阻滞，肿瘤细胞的侵袭和迁移力均显著下降，而高表达的DOR可促进肝癌的进展。我们前期的研究显示，OPRM1在肝癌细胞上较正常组织高表达，而且该受体的表达与肝癌细胞的侵袭和转移能力密切相关；通过组织芯片的免疫组化分析，我们也发现该分子广泛的分布于不同阶段的肝癌组织上，与肝癌的进展和预后密切相关。

除了肺癌、乳腺癌、肝癌等，关于阿片类受体及药物与其他肿瘤的研究也不在少数。在胃癌中，Qin等研究发现，***能显著抑制体外培养的胃癌MGC-803细胞生长和增殖，并将细胞周期阻滞在G2/M期；其抑制胃癌进展的机制可能与caspase-9和caspase-3的活化以及survivin和NF-κB的抑制有关。在人类结肠癌细胞系HT-29中，有研究结果表明，***可以通过干扰肿瘤侵袭性来影响其进展，在肿瘤细胞的细胞核中，MOR呈过表达状态。关于癌症预后，Smith等对24例接受阿片类生长因子治疗的晚期胰腺癌患者进行研究，分析得出，阿片类生长因子可以显著提高患者的临床效益和生存率。Cao等通过建立裸鼠人鼻咽癌CNE-2模型，研究发现低剂量的***可潜在地拮抗顺铂的细胞毒性，抑制顺铂诱导的细胞凋亡，并减少新血管的形成，从而抑制肿瘤生长，其影响机制与***降低caspase-3的活性和增加Bcl-2/Bax的比值有关。然而高剂量的***作用于鼻咽癌却具有相反的效果。而Gonzalez-Nunez等在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系中的研究则相反，他们发现低剂量的***可促进未分化细胞的增殖，降低miR133b的表达水平，而较高剂量的***可抑制细胞增殖，并能降低相关miR133b和miR128的水平，而不会触发细胞凋亡。

发明内容

本发明的一个目的在于提供杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C2020217，保藏时间：2020年10月28日；保藏单位地址：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

本发明的第二个目的在于提供单克隆抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因，以便两者重组后可表达出特异性识别和结合阿片受体OPRM1的抗体活性片段。

本发明的第三个目的在于，本发明的单克隆抗体的基因或多肽在制备用于诊断和/或治疗癌症药物中的应用，或者制备治疗OPRM1介导的药物耐受和/或成瘾药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C2020217。

单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C2020217的杂交瘤细胞株产生，该单克隆抗体特异性识别μ阿片受体蛋白。

单克隆抗体，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

单克隆抗体，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

单克隆抗体，单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列包括：如SEQ ID NO：5所示的重链可变区CDR1；如SEQ ID NO：6所示的重链可变区CDR2；如SEQ ID NO：7所示的重链可变区CDR3；

单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括：如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区CDR1；如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR2；如SEQ ID NO：10所示的轻链可变区CDR3。

抗体或其抗原结合片段，具有：

重链可变区氨基酸序列，包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的同源序列；

轻链可变区氨基酸序列，包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少80％序列一致性的同源序列。

抗体或其抗原结合片段基因的制备方法，由引物于保藏编号为CCTCC NO：C2020217的杂交瘤细胞株中克隆得到；

引物包括：

小鼠重链可变区(V)区扩增引物：

上游引物(VH-F):5’-GGGGATATCCACCATGATGGAATGGAGTTGGATATTTC-3’；

下游引物(VH-R)：5’GTCGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAGTGAG-3’；

小鼠轻链可变区(V)区扩增引物：

上游引物(VL-F)：5’-GATGTGAGCTCGTGATGGAATCACAGACTCAGGT-3’；

下游引物(VL-R)：5’-GGAGTGCAGTCTCATTTCCAGCTTGGTCC-3’；

其中：划线处为限制性酶切位点。

本发明所述的抗体或其抗原结合片段在制备诊断或***药物中的应用。

比如，所述的肿瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌。

本发明所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗阿片受体介导的药物耐受和/或成瘾药物中的应用。

通过查询人的cDNA文库找到人MOR的cDNA序列(NCBI：NM_000914)，对此序列进行优化后，将其***载体pCI-neo中构建重组载体pCI-neo-MOR，再将此重组载体转染进入人胚肾细胞(HEK293T)和小鼠的肾癌细胞(Renca)，构建稳定过表达人MOR的转化细胞系。然后，采用质粒DNA结合细胞免疫的策略，结合传统的杂交瘤制备技术，筛选并制备靶向人MOR的单克隆抗体。最后，采用酶联免疫吸附和蛋白免疫印迹实验检测了单抗的亲和性与特异性，采用细胞免疫荧光和流式细胞术检测了单抗结合空间构象抗原的能力。

本发明应用一套设计的引物成功地从培养的抗肝癌特异性单抗OPRM1-3A5C7杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因；所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区，其编码多肽可以特异结合阿片受体OPRM1。基于上述已克隆到的抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，具备识别OPRM1表达阳性的细胞及组织。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1为RT-PCR扩增的抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图，图中M表示DL-2000DNA Marker，Lane 1表示3A5C7重链可变区基因，Lane 2表示3A5C7轻链可变区基因；

图2抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因***T载体后的DNA测序图谱；

图3抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因***T载体后的DNA测序图谱；

图4免疫荧光检测单克隆抗体3A5C7与不同人肿瘤细胞系表面抗原OPRM1结合情况；

图5单克隆抗体3A5C7对人不同肝癌细胞株的人OPRM1的表达情况的Western-blot检测结果；

图6单克隆抗体3A5C7对人肝癌及其癌旁组织中的典型免疫组织化学染色图，其中左上图为癌旁组织，右上图为肝癌组织，左下和右下分别为局部放大，其中的Bar值为20μm；

图7为不同浓度的3A5C7单抗对肝癌细胞HepG2和Huh7细胞的克隆形成的影响能力测定，其中A图中的NC为空白对照，NIg为阴性的鼠IgG对照；B图为A的克隆形成统计结果，所有实验均重复三次，统计数据表示为平均值±SEM，*P＜0.05；

图8为3A5C7单抗抑制***镇痛耐受体内热板实验，其中上图为小鼠的体重变化，而下图为剂量依赖性镇痛作用的最大可能效力的情况，其中*为morphine vs morphine+Ab；而#为morphine+Nlg vs morphine+Ab；此外计算％MPE＝((TA-TB)/(cutofvalue-TB))*100；TA:actual latency(s)；TB:basal latency(s)；cutoff value:30s。

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。

具体实施方式

在通过示例性描述、实施例和结果进一步详细描述本公开的各种实施方案之前，应理解本公开的化合物、组合物和方法在应用中不限于以下描述中阐述的具体实施方案和实施例的细节。本文提供的描述仅用于说明目的，而无意在限制意义上进行解释。这样，本文所使用的语言旨在给予尽可能广泛的范围和含义，并且实施方式和实施例是示例性的，而不是穷举的。另外，应理解，本文所采用的措词和术语仅仅是出于描述的目的，除非另有说明，否则不应视为限制性的。此外，在下面的详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本公开的更透彻的理解。然而，对于本领域普通技术人员将显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下实施本公开。在其他情况下，没有详细描述本领域普通技术人员公知的特征，以避免说明书有不必要的复杂。申请人意图将对本领域普通技术人员显而易见的所有替代、替换、修改和等同方式都包括在本公开的范围内。根据本公开内容，无需过度实验即可制备和实施本文公开的所有化合物、组合物、方法、应用和用途。因此，尽管已经根据特定实施方案描述了本公开的化合物、组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，本文描述的化合物、组合物、方法以及方法的步骤或步骤的顺序可以有变化而不脱离本发明构思的概念、精神和范围。

说明书中提到的或在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物(包括公开文章)均以引用的方式明确地全文并入本文，其程度与每篇单独的专利或出版物被具体和单独地指出以引用方式并入的程度相同。

除非本文另有定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。在本文中使用时，特定术语“单/单个”仅限于“一个”。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。

如本文所用，术语“抗体”既可以指完整的“全长”抗体，也可以指其DCLK1结合片段(本文也称为抗原结合片段，抗原结合部分，结合片段或结合部分)。如本文所用，术语“抗体”包括但不限于合成抗体，单克隆抗体，重组产生的抗体，内抗体(intrabody)，多特异性抗体(包括双特异性抗体)，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体等。

根据本发明的一个方面，本发明涉及一种抗人OPRM1的单克隆抗体3A5C7重链和轻链可变区基因。该单克隆抗体的重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性3A5C7单抗的杂交瘤细胞株OPRM1-3A5C7中克隆的。

本发明人应用一套设计的引物成功地从培养的抗肝癌特异性OPRM1-3A5C7杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。培养物名称：小鼠杂交瘤细胞株OPRM1-3A5C7；中国典型培养物保藏中心的保藏编号：CCTCC C2020217；

抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因全长为354bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因全长为336bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合人μ阿片受体靶点OPRM1的抗体活性片段。

本发明人应用引物成功地从培养的抗肝癌特异性单抗OPRM1-3A5C7杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。经美国国立生物技术信息中心NCBI(National Centerfor Biotechnology Information，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，2020-11-26)序列分析平台和IMGT数据库(Lefranc,2001)进行序列分析，结果表明重链V-GENE同源性最高的是Musmus IGHV1-14*01F，其一致性达到94.44％(272/288nt)，J-GENE来自Musmus IGHJ4*01F，而D-GENE来自Musmus IGHD2-1*01F；Junction区具有NH3-CADGNYNFAMDFG-COOH的特征序列。轻链可变区的V-GENE同源性最高的是Musmus IGKV8-27*01F，其一致性达到96.3％(286/297nt),J-GENE来自Musmus IGKJ2*01F,Junction区具有NH3-CHQYFSSYTF--COOH的特征序列。该抗体的IMGT数据库分析显示该抗体均属于小鼠免疫球蛋白重排后的重链V-D-J区或轻链V-J区基因。所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述已克隆到的抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体。

本发明人用过表达的OPRM1分子细胞株结合DNA免疫小鼠，通过杂交瘤制备方法获得特异性抗人OPRM1单抗，其中单抗3A5C7可与表达该靶点的细胞株特异性染色结合，显示了良好的结合活性，所制备杂交瘤细胞已递送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC C2020217，细胞活性100％，同时所制样品符合《人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点》的要求。

大量研究表明阿片类受体及药物可通过不同的作用机制来影响肿瘤的发生发展。阿片类受体及药物可通过抑制细胞凋亡、促进血管生成和肿瘤细胞的迁移来促进肿瘤生长；此外，也有研究表明其也可发挥促进细胞凋亡和抗血管生成作用。关于阿片类受体及药物与肿瘤发生发展的相关机制，还需要我们进行更科学、更全面的相关研究。因此，应用OPRM1的完整受体分子进行靶向单抗的制备则能获得针对该分子的特异性抗体，为理解OPRM参与的肿瘤发生发展和药物成瘾等提供了新的有效途径，为肝癌、肺癌、乳腺癌、肠癌等肿瘤的研究和药物开发提供有效的治疗候选靶点。

抗体在肿瘤治疗应用方面的研究主要集中在：

(1)肿瘤单抗在肿瘤相关抗原研究中的应用：单克隆抗体的发展提供了一个发现新肿瘤相关抗原或肿瘤抗原新位点的有效手段。这些抗原可用于临床血清学检查，具有一定的诊断和评价治疗效果的意义。

(2)肿瘤单抗导向药物研究：以单抗为载体的放免显像诊断、导向化疗和导向放疗近年取得了实质性进展。主要有：①化学药物—单抗交联物；②细胞毒素—单抗交联物；③放射性核素—单抗交联物等。

以本发明所述的轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可直接用于有关疾病特别是肿瘤、药物耐受成瘾中的应用。另外，以本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽及其衍生物作为载体，交联上细胞毒性药物、毒素、放射性核素、酶和生物反应调节剂等作为导向药物，可用于有关疾病特别是肝癌等OPRM1阳性肿瘤的诊断及治疗。

从本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽出发，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式：

(1)嵌合抗体。是用鼠MAb的V区与人Ig的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应，故在肿瘤等疾病的治疗中显示出良好的效果。

(2)人源化抗体。针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基镶饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。

(3)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-C1组成Fab抗体、用一多肽(GLy4Ser)₃接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。

(4)多价微型抗体。主要有双链抗体、(ScFv)₂、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)₂、F(ab’)₃、(ScFv)₄等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，既能穿透肿瘤组织，亦在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。

(5)双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。

(6)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。

(7)重组免疫毒素。将编码抗体和毒素的基因重组而产生，特点是高效，非特异毒性低，体内稳定性好，易穿透肿瘤及体内使用较安全。

(8)噬菌体抗体。把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因Ⅲ或基因Ⅷ连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘筛出所需的特异性抗体。

以上述由轻、重链可变区基因编码的多肽重组或衍生的抗体分子为载体，交联上各种抗癌或抗药物耐受成瘾的效应物质而形成的免疫偶联物或导向药物主要有下列几种形式：

(1)抗体-核素偶联物。该偶联物可将核素有效地导向肿瘤组织局部，从而减少了因放疗外照射引起的正常组织损伤及有关的不良反应，并可对肿瘤进行定位诊断和导向治疗。这种方法即为放射免疫显像和放射免疫治疗。与单抗偶联的常用核素有¹²⁵I，¹³¹I，¹¹¹In，⁹⁰Y，⁹⁹Tc^m，¹⁸⁸Re和¹⁸⁶Re等。

(2)抗体-化疗药物偶联物。该偶联物能特异地导向肿瘤，可减低对正常组织的损伤，减少化疗药物的毒副作用。常偶联的化疗药物如：烷化剂中的磷酸酰胺；抗代谢中的氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶；抗生素类阿霉素、表阿霉素、柔红霉素；植物类长春新碱、丝裂霉素等。

(3)抗体-毒素偶联物。该偶联物又称免疫毒素。其杀伤细胞作用强且不依赖于生物辅助机制。其杀伤肿瘤机制与放疗，化疗不同，所以一般放疗、化疗效果差的肿瘤可用，应用前景广阔。常用的毒素有篦麻毒素、白喉毒素、红豆毒素、肥皂草毒素、假单孢菌外毒素、链球菌溶血素、穿孔素等。

(4)抗体-生物反应调节剂(BRM)偶联物。BRM单独调节机体的免疫能力和杀伤肿瘤细胞已取得较好的疗效。但由于其输入体内后仅有部分到达肿瘤靶部位，其杀伤作用得不到充分发挥且有毒副作用。将BRM与单抗偶联，通过单抗携带其到达靶部位而发挥杀伤肿瘤的作用，使这些因子的作用更强，且更加专一。常用的BRM有INF和IL-2等。

(5)抗体导向酶解前药。将抗体与药物专一性活化酶的偶联物注入体内，间隔一定时间后注入前药，使其在肿瘤部位转化成高浓度抗癌活性药以杀伤肿瘤细胞。目前，可作为前药的有苯甲酸氢芥的谷氨酰胺衍生物、磷酸鬼臼乙叉戒、磷酸丝裂霉素、葡糖苷酸柔红霉素、阿霉素、5-氟胞嘧啶和头孢菌素氮芥等。活化酶有羧肽酶G₂、碱性磷酸酶、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、β-葡糖苷酶和氨基肽酶等。

(6)免疫脂质体。将MAb偶联到脂质体的表面能充分将MAb与抗原特异性结合的导向性及脂质体能包裹大量药物的特性融为一体，再包埋上有关药物，则可提高药物靶向性和疗效。

实施例一、OPRM1-3A5C7杂交瘤细胞株的制备

OPRM1-3A5C7杂交瘤的制备是采用DNA载体免疫(金斯瑞，南京，化学合成，2019.01)加过表达OPRM1的鼠RENKA细胞加强免疫，之后采用传统的融合方法进行免疫和制备，具体所用的方法如下：

1、将OPRM1(NCBI：NM_000914)的基因克隆如真核表达载体pCI-neo的EcoR I/XhoI中，挑单克隆经过序列测定后，培养大体积(2000mL)摇菌进行质粒大提。用无菌生理盐水溶解并调整重组质粒DNA的浓度，分光法检测质粒溶液的A280nm:A260nm以确定纯度，最后1％琼脂糖凝胶电泳相对定量后取少量作为DNA免疫原。

2、免疫方案：18g左右雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)按常规洁净级条件饲养，对照纯化的蛋白抗原常规免疫时，基础免疫与CFA充分混匀后接种量为100μg/500μl/只(背部皮下多点注射)，加强免疫与IFA充分混匀后接种量为50μg/500μl/只(背部及腹腔皮下多点注射)。蛋白抗原脾内免疫时不加任何佐剂，接种量为20μg/50μl/只；质粒DNA免疫前先用1％戊巴比妥钠按75mg/Kg体重腹腔注射麻醉，待肌肉松驰后将质粒DNA多点注射入小鼠的两侧胫前肌和两侧股四头肌内，基础免疫接种量为100μg/100μl/只，加强免疫接种量为50μg/100μl/只。DNA-Cell免疫时，皮内基础免疫质粒DNA接种量为100μg/100μl/只，脾内基础免疫质粒DNA接种量为50μg/50μl/只，加强免疫均为腹腔细胞注射，接种量为10⁶/500μl/只(注：基础免疫用注射器注射于小鼠尾根部肌肉处；加强免疫用100μL 1x10⁵混合肝癌细胞静脉注射，同时用400μL 9x10⁵混合肝癌细胞腹腔注射加强免疫)。各组小鼠每次免疫前均禁食4h后用玻璃毛细管尾静脉取血，按常规法分离制备血清，-70℃冻存。

3、每隔2周以相同剂量DNA加不完全福氏佐剂腹腔加强免疫。

4、细胞融合前3天检测小鼠血清多抗的效价，效价高者进行加强免疫，剂量同上。

5、3天后收集免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以数量比为5:1的比例在PEG-l000作用下融合，HAT培养液选择培养。

6、以稳定表达抗原OPRM1的RANKA/293T细胞筛选阳性克隆，进行滴片(铺有LN等)，37℃5％CO2放置培养箱孵育4小时后，冷丙酮固定；使用前，2％马血清和5％脱脂奶粉/PBS4℃封闭4小时，之后加入培养上清或腹水，再加入FITC标记的羊抗人或羊抗鼠IgG染色，采用间接细胞ELISA筛选阳性克隆。

实施结果：通过杂交瘤融合结合间接细胞ELISA筛选，获得多株反应阳性的细胞杂交瘤细胞株。将二次获得的杂交瘤阳性克隆孔连续有限稀释2-3次后，大量扩增并液氮冻存。10-15天后取上清进行ELISA筛选阳性克隆，将筛选的阳性克隆孔作有限稀释，再进行3次亚克隆。挑选OD值大于2的3A5克隆即得OPRM1-3A5杂交瘤细胞。之后再次克隆化100％阳性率后，获得杂交瘤细胞株OPRM1-3A5C7，同样采用细胞ELISA进行分泌产物的确定，将所制备OPRM1-3A5C7杂交瘤细胞已递送中国典型培养物保藏中心保藏(保藏编号：CCTCC NO：C2020217)。

实施例二、抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻、重链可变区基因的克隆

所用细胞株OPRM1-3A5C7为第四军医大学细胞工程研究中心采用传统的融合方法获得的一株分泌高亲和力、高特异性鼠源性抗人OPRM1抗体的杂交瘤细胞株(中国典型培养物保藏中心保藏编号：CCTCC NO：C2020217)；

1、3A5C7单抗可变区基因的克隆与序列分析

取处于对数生长期的OPRM1-3A5C7杂交瘤细胞(5×10⁶个)，采用异硫氰酸胍一步法提取OPRM1-3A5C7杂交瘤细胞的总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测；

随后以Oligo(dT)₁₅(Promega公司)为随机引物，反转录合成cDNA第一链。Oligo(dT)₁₅(Promega公司)为随机引物的反转录方案如下：20μL反应体系中依次加入1μgOPRM1-3A5C7杂交瘤细胞的总RNA(2μL)，0.5ug随机引物Oligo(dT)₁₅(1μL),4ulMgCL₂(25mM)2μL 5×dNTPs,2μL 10×缓冲液,0.5μL RNase抑制剂，加入反转录酶AMV 15U(0.75μL)，用水补至20μL，混匀，42℃水浴1h，煮沸3min，反应产物置于-20℃备用；然后，用设计的3A5C7单抗可变区基因PCR扩增引物扩增出抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因(VH)和抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因(VL)。

设计的3A5C7单抗可变区基因PCR扩增引物序列如下：

小鼠重链可变区(V)区扩增引物：

上游引物(VH-F):

5’-GGGGATATCCACCATGATGGAATGGAGTTGGATATTTC-3’；

下游引物(VH-R)：

5’GTCGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAGTGAG-3’；

小鼠轻链可变区(V)区扩增引物：

上游引物(VL-F)：

5’-GATGTGAGCTCGTGATGGAATCACAGACTCAGGT-3’；

下游引物(VL-R)：

5’-GGAGTGCAGTCTCATTTCCAGCTTGGTCC-3’；

其中：划线处为限制性酶切位点；

PCR扩增反映按常规方法进行：以反转录合成的cDNA为模板，分别用采用家族特异性的小鼠重链可变区(V)区扩增引物和小鼠轻链可变区(V)区扩增引物扩增得到抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因(VH)和抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因(VL)。反应体系为：模板cDNA 2.5u1，dNTP(各0.4mM),10×Buffer 5ul,Ex Taq DNA聚合酶1.25u,5’端和3’端引物各5ul(约30pmol)，加水至50ul,混匀，瞬时离心后，加入1-2滴液体石蜡，置PCR仪上反应。反应条件:94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。

扩增的PCR产物VH和VL经低溶点琼脂糖凝胶(1.5％)电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(promega Inc)回收纯化后，凝胶电泳鉴定(见附图1)。之后将目的片段克隆至T载体，目的片段T载体克隆测序方案如下：将PCR产物凝胶电泳分离后回收，连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul，连接缓冲液5ul，混匀后4℃过夜，转化大肠杆菌JM109，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序分析(序列如图2和图3所示)。

经过对扩增产物VH的基因序列分析，VH的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，扩增产物VL的基因序列如SEQ ID NO:2所示，VH编码的多肽产物如SEQ ID NO:3所示，VL编码的多肽产物如SEQ ID NO:4所示；

2、抗体轻重链可变区同源性及CDR区分析

(1)、同源性分析

利用美国国立生物技术信息中心NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，2020-09-16)，同时也采用IMGT数据库(Lefranc,2001)对1中扩增得到的抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因(VH)和抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因(VL)进行同源性分析。结果表明，VH与数据库中“Mus musculus clone 7/08PEC B1b IgM 2immunoglobulin mu heavy chainvariable region mRNA,partial cds”的同源性最高，同源性为92％，如表1所示；VL与数据库中“Mus musculus kappa light chain of Mab7 mRNA,partial cds”同源性最高，同源性为95％，如表2所示。以上结果表明本发明所获得的抗体是一株全新的抗体。

表1.重链可变区基因同源性分析

表2.轻链可变区基因同源性分析

(2)、CDR区分析

为了确认抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区和抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区上的CDR，本发明人借助源自IMGT蛋白质数据库提供的抗体序列信息数据库进行分析比对，结果表明本发明所涉及的抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3；

所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：GYTSTSNVVH(SEQ ID NO:5)；

CDR2：YISPINEGTKYNEKFKG(SEQ ID NO:6)；

CDR3：GNYNFAMDF(SEQ ID NO:7)；

所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：KSSQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO:8)；

CDR2：WASTRES(SEQ ID NO:9)；

CDR3：HQYFSSYT(SEQ ID NO:10)；

实施例三、细胞免疫荧光法检测抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7与肿瘤细胞的结合

人肝癌细胞HepG2、Huh7；人肺癌细胞A549、H460；人结肠癌细胞HCT-8；人乳腺癌细胞MCF-7、MBA-MD-231各取1×10⁵个细胞种于35mm培养皿中，37℃，5％CO₂过夜培养使其贴壁。次日取密度适宜的细胞染色。弃培养基，1×PBS洗3次，5min/次；4％的多聚甲醛室温固定10min；1×PBS洗3次，5min/次。在培养皿中央的小圈内加入100μl 5％的山羊血清，室温封闭30min；用1×PBS将制备的Anti-OPRM1单抗3A5C7稀释(1：200)后加入到小圈内，放入湿盒，4℃孵育8-10h，将培养皿从湿盒中取出吸出待检一抗并弃掉，用1×PBS浸洗细胞3次，每次5min。然后开始避光，加入荧光二抗(1:200)和DAPI(1:50)的混合液，室温孵育1h后用1×PBS浸洗3次，每次5min，洗掉未结合的二抗及DAPI，倒置荧光显微镜或者共聚焦显微镜拍照保存。

结果：如图4所示，OPRM1单抗3A5C7可与不同的肿瘤细胞株发生特异性染色，包括人肝癌细胞HepG2、Huh7；人肺癌细胞A549、H460；人结肠癌细胞HCT-8；人乳腺癌细胞MCF-7、MBA-MD-231；细胞膜染色强阳性，表明该抗体可结合多种不同来源的肿瘤细胞类型。

实施例四、Western blot检测肝癌细胞中OPRM1的表达

将1×10⁶的人肝癌细胞系HepG2、Huh7(购自ATCC,Manassas,VA,USA)；Hep3B,SNU368，Bel7404(来自西京医院肝胆外科)；人胎肝细胞LO2(本室保存)种植于6孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养过夜。第二天用RIPA细胞裂解液裂解细胞，离心，取上清。加入5×上样缓冲液，煮沸。各取5μL上样，经10％SDS-PAGE电泳分离后，常规方法转至PVDF上。5％脱脂奶粉封闭1h，加入抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7(1μL/mL)室温静置2h，PBST洗膜后，加至HRP-羊抗鼠IgG二抗(PIERCE)室温静置1h，PBST洗膜后，加入ECL发光缓冲液，Image Station4000MM(KODAK)荧光/化学发光成像***采集信号，拍照。

实施结果：如图5所示，在所有的肝癌细胞的裂解上清中，均出现特异性条带，分子量大约45KDa，符合预期大小，实验结果表明制备的3A5C7抗体可特异性识别细胞裂解液中的OPRM1分子。

实施例五、免疫组织化学法检测肝癌组织中OPRM1的表达

取肝癌和肝旁组织石蜡切片(本实验室组织库保存)，常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水、水化组织芯片；3％H₂O₂阻断灭活内源性过氧化物酶；正常羊血清工作液封闭；以抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7为一抗，生物素标记的兔抗鼠IgG抗体为二抗，辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液为三抗，DAB显色，苏木精复染，脱水透明后封片、镜检。

实施结果：免疫组织化学染色结果如图6所示，所制备抗体在肝癌组织中可见特异性着色,着色程度均为强阳性，其着色部位为癌细胞胞膜和胞浆；胞膜深染而与正常组织极少结合，单克隆抗体3A5C7与肿瘤组织具有特异的结合。结果提示，本发明所涉及的抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7具备组织抗原识别特异性。

实施例六、平板克隆形成检测单抗3A5C7对肝癌细胞的增殖能力的影响

细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

平板克隆形成：将处于对数生长期的肝癌细胞胰酶消化后，于6孔板培养板中各实验组接种500个细胞/孔，继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定30-60min，PBS洗涤1次；每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20min；PBS洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照(分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照)，最后选取三个不同的视野进行统计分析。

实施结果：克隆形成试验表明，与阴性对照(NIg：鼠抗体)相比，抗体3A5C7处理组的细胞生长，无论是克隆形成的大小或数目均以抗体浓度依赖性方式受到显着抑制(图7A)，单抗3A5C7无论是肝癌细胞HepG2或Huh7的增殖均具有显著的抑制作用(图7B)。

实施例七、抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7参与抑制***镇痛耐受的体内研究阿片受体长期以来被认分布于中枢神经***。外周阿片受体介导的镇痛作用对动物和人的炎性疼痛尤其显著。***是最经典强阿片类药物，以***为代表的阿片类药物是目前临床上无法替代的强效镇痛药，但是长期慢性使用会导致药物耐受(tolerance)和依赖性(dependence)，***对经典μ阿片受体基因(OPRM1)敲除小鼠不产生镇痛作用，不产生耐受和依赖，同时这类小鼠也失去了位置偏爱及纳络酮催促的戒断症状，提示OPRM1是阿片类药物镇痛及成瘾的主要作用分子，因此我们进一步观察了所制备单抗是否参抑制***镇痛耐受。

小鼠热板实验：采用c57/B6雌性小鼠，使用上海欣软信息科技有限公司生产的XR1700型智能热板仪，保持小鼠的足底接触热板，小鼠受热刺激而产生明显的后抽动作做为疼痛的反应指标，以产生痛反应所需的时间(潜伏期)为痛阈值，通过测量给药大鼠痛阈值的改变(潜伏时间的长短)而反映药物的镇痛作用。本研究中连续三天给c57/B6鼠侧脑室注射3A5C7单抗4μg/次,之后再连续7天皮下注射***10mg/kg，这期间每天检测小鼠对热痛的潜伏期(以30s为cutoff值，防止小鼠损伤)，观察小鼠对痛的敏感性(记录潜伏期，潜伏期越长说明***的镇痛效果越好)。

实施结果：通过连续7天给予小鼠相同剂量的***，小鼠的平均体重下降明显，而***与抗体联用组小鼠平均体重下降不明显(图8A)。进一步分析显示，给予生理盐水的小鼠潜伏期接近basal值，连续7天***摄入后，小鼠的***的镇痛能力逐渐下降，且对照IgG不影响***的镇痛能力，相比3A5C7单抗的应用使得***镇痛耐受减弱，说明3A5C7单抗参与了抑制***镇痛耐受(图8B)。

从前面的描述将理解，可以在不背离其真实精神的情况下，对本公开的各种实施方式进行各种修改和改变。除非特别指出，否则本文提供的描述仅用于说明目的，而无意在限制意义上进行解释。因此，尽管这里已经结合某些非限制性的实施方式描述了本公开，使得可以更充分地理解和领会其各方面，但是并不意味着本公开限于这些特定的实施方式。相反，所有替代、修改和等同方式均意图包括在本文所定义的本公开的范围内。因此，上述各示例，包括具体的实施方案，将用于举例说明本公开的实践，应当理解，所示的细节仅是示例性的，仅是出于对特定实施方式的说明性讨论的目的，并且是为了提供被认为是对程序以及发明构思的原理和概念方面的有用且容易理解的描述而展示的。可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下对本文所述的各种组分和组合物的配制，本文所述的方法或本文所述的方法的步骤或步骤顺序进行改变。

核苷酸序列表电子文件

<110>中国人民解放军空军军医大学

<120>杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用

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<212> DNA

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因

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gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gta aag cct ggg 45

act tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac aca tcc act 90

agt aat gtt gtc cac tgg gtg aag cag aag cct ggg cag ggc ctt 135

gag tgg att gga tat att agt cct atc aat gaa gga act aag tac 180

aat gag aaa ttc aaa ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc 225

tcc agc aca gcc ttc atg gag ctc agc agc ctg acc tct gag gac 270

tct gcg gtc tat tac tgt gca gat ggt aac tat aac ttt gct atg 315

gac ttc ggg ggt caa gga acc tca ctc acc gtc tcc tca 354

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<212> DNA

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因

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aac att atg atg aca cag tcg cca tca ttt ctg gct gtg tct gca 45

gga gaa aag gtc act ata aat tgt aag tcc agt caa agt gtt tta 90

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ggg acc aag ctg gaa att aaa 336

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<212> PRT

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因编码的多肽产物

<400>3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15

Thr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Thr 30

Ser Asn Val Val His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 45

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Pro Ile Asn Glu Gly Thr Lys Tyr 60

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 75

Ser Ser Thr Ala Phe Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Gly Asn Tyr Asn Phe Ala Met 105

Asp Phe Gly Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 118

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<212> PRT

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因编码的多肽产物

<400>4

Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Val Ser Ala 15

Gly Glu Lys Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu 30

Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 45

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 60

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr 75

Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 90

Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly 105

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 112

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<212> PRT

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因编码的多肽产物的CDR1

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Gly Tyr Thr Ser Thr Ser Asn Val Val His

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<212> PRT

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因编码的多肽产物的CDR2

<400> 6

Tyr Ile Ser Pro Ile Asn Glu Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

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<212> PRT

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7重链可变区基因编码的多肽产物的CDR3

<400> 7

Gly Asn Tyr Asn Phe Ala Met Asp Phe

<210> 8

<211>17

<212> PRT

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因编码的多肽产物的CDR1

<400> 8

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala

<210> 9

<211>7

<212> PRT

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因编码的多肽产物的CDR2

<400> 9

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

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<211>8

<212> PRT

<213>小鼠

<220>抗人OPRM1单克隆抗体3A5C7轻链可变区基因编码的多肽产物的CDR3

<400> 10

His Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr

Claims

1.杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C2020217。

2.单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C2020217的杂交瘤细胞株产生，该单克隆抗体特异性识别μ阿片受体蛋白。

3.单克隆抗体，其特征在于，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO：1所示；

轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

4.单克隆抗体，其特征在于，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.单克隆抗体，其特征在于，单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列包括：如SEQ IDNO：5所示的重链可变区CDR1；如SEQ ID NO：6所示的重链可变区CDR2；如SEQ ID NO：7所示的重链可变区CDR3；

单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括：如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区CDR1；如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR2；如SEQ ID NO：10所示的轻链可变区CDR3；

该单克隆抗体特异性识别μ阿片受体蛋白。

6.抗体或其抗原结合片段基因的制备方法，其特征在于，由引物于保藏编号为CCTCCNO：C2020217的杂交瘤细胞株中克隆得到；

引物包括：

小鼠重链可变区（V）区扩增引物：

上游引物（VH-F）:5’-GGGGATATCCACCATGATGGAATGGAGTTGGATATTTC-3’；

下游引物（VH-R）：5’GTCGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAGTGAG-3’；

小鼠轻链可变区（V）区扩增引物：

上游引物（VL-F）：5’-GATGTGAGCTCGTGATGGAATCACAGACTCAGGT-3’；

下游引物（VL-R）：5’-GGAGTGCAGTCTCATTTCCAGCTTGGTCC-3’；

其中：划线处为限制性酶切位点。

7.权利要求2-5任一所述的抗体在制备诊断或治疗肝癌药物中的应用。

8.权利要求2-5任一所述的抗体在制备治疗阿片受体介导的药物耐受和/或成瘾药物中的应用。