CN113372462A - 一种高纯度银线莲多糖的提取方法 - Google Patents
一种高纯度银线莲多糖的提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高纯度银线莲多糖的提取方法，包括：将银线莲全植株预处理得到预处理粉末，进而采用热水浸提法进行提取，得到提取液浓缩后用80％乙醇醇沉，静置离心，收集沉淀并用无水乙醇和丙酮洗涤，挥干有机试剂，将挥干后沉淀复溶于水，溶液经透析、浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖；将银线莲精多糖复溶于超纯水，分别用20％、60％和80％乙醇醇沉，静置离心收集沉淀；将得到的不同分级组分的沉淀复溶于水，经冷冻干燥后得到银线莲多糖的不同分级组分。本发明提取方法工艺简单，易于推广应用，能够快速高效地同时获得多个高纯度的银线莲多糖组分。
Description
技术领域
本发明属于植物多糖提取技术领域，具体涉及一种高纯度银线莲多糖的提取方法。
背景技术
银线莲学名斑叶兰，为兰科斑叶属多年生草本植物，是一种呈现白网脉斑状的植物，主要分布于我国台湾省和广东省等地区。银线莲是我国传统的中药材，以全草入药，具有较高的药用价值，在其他地区已被广泛地用作营养草药茶，具有清肺止咳、解毒消肿、止痛，治肺结核咳嗽和支气管炎等功效。
目前，国内外报道的上百种天然多糖中，植物多糖占据了95％。这些植物多糖除了具有膳食纤维(多糖)清除毒素、控制食量、平衡脂肪和稳定血糖的生物活性外，在免疫调节、抗辐射、抗凝血、抗肿瘤和抗HIV病毒等方面也发挥着一定的作用。由于天然多糖具有毒副作用小、使用安全等优点，近年来多糖功能食品得到迅速发展。目前，没有针对银线莲多糖制备的文献或专利公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度银线莲多糖的提取方法，该方法操作简单、高效快速，有效保存了银线莲多糖生物活性的同时，极大地提高了银线莲多糖的纯度，并且，本发明方法工艺过程绿色环保，能够保证食品的安全性。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种高纯度银线莲多糖的提取方法，包括以下步骤：
1)取新鲜银线莲全植株洗净、晾晒干燥，粉碎机磨粉后过筛，得到银线莲粉末用15-20倍体积95％食用乙醇室温下浸泡48h后离心，收集沉淀，挥干乙醇得到预处理粉末；
2)将预处理粉末溶解于15-20倍体积的超纯水，70-90℃水提6-8h，水提液离心，取离心后上清液，沉淀重复水提、离心2-4次，合并上清液，将所得上清液真空浓缩；
3)向浓缩液中缓慢加入95％的食用乙醇并大力搅拌，当乙醇浓度达到80％停止加入，4℃静置10-20h，离心收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇和丙酮各洗涤2-3次，再次离心得到沉淀挥干溶剂；
4)将挥干后的沉淀按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水，离心收集上清液置于透析袋中，透析袋放入蒸馏水透析72h，透析液浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖；
5)将步骤4)制得的银线莲精多糖按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水得到银线莲精多糖水溶液，向溶液中缓慢加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到20％停止加入，4℃静置10-20h，离心分别收集沉淀与上清液；
6)将步骤5)得到的沉淀按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水，所得溶液置于透析袋中，透析袋放入蒸馏水中透析72h，透析液浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖分级组分，记为I；
7)向步骤5)得到的上清液中继续缓慢加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到60％停止加入，4℃静置10-20h，离心分别收集沉淀与上清液；
8)将步骤7)得到的沉淀按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水，所得溶液置于透析袋中，透析袋放入蒸馏水中透析72h，透析液浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖分级组分，记为II；
9)向步骤7)得到的上清液中继续缓慢加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到80％停止加入，4℃静置10-20h，离心收集沉淀，将沉淀按质量体积比 (g/mL)1：50-1：100复溶于水，所得溶液置于透析袋中，透析袋放入蒸馏水中透析72h，透析液浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖分级组分，记为III。
进一步地，步骤1)所述过筛目数为60-80。
进一步地，步骤1)至步骤9)中所述离心均为3000-5000rpm转速下离心 5-10min。
进一步地，步骤2)所述真空浓缩为在真空度-0.1MPa条件下将上清液浓缩至原有体积的1/10。
进一步地，步骤2)或步骤3)所述真空浓缩与大力搅拌均在旋转蒸发器中操作，旋转蒸发器设定的温度为55℃。
进一步地，步骤4)、步骤6)、步骤8)和步骤9)中所述透析袋其相对截留分子量为3500Da。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以新鲜银线莲全植株为原料，通过热水提取和乙醇分级沉淀技术获得三个级分的高纯度银线莲分级多糖组分，其主要优点是：1、多糖制备步骤简单；2、涉及溶剂少，可实现植物多糖的高效分离；3、制备工艺绿色环保，可为天然产物中高纯度多糖提供参考，应用前景广阔。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的银线莲精多糖及其分级多糖组分的凝胶渗透色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1
步骤一：以银线莲全植株为原料，蒸馏水洗净，晾晒干燥，之后用粉碎机磨粉，过60目筛，得银线莲粉末，备用；
步骤二：取银线莲粉末50g，于室温下，用20倍的95％的食用乙醇浸泡 48h，之后离心10min(5000rpm)，收集沉淀，挥干乙醇，获得预处理粉末；
步骤三：将预处理粉末溶解于20倍的超纯水，于80℃下提取8h，浸提2 遍，合并上清液；
步骤四：将上清液离心，去除沉淀，旋转蒸发器浓缩(真空度-0.1MPa)，浓缩至原有体积的1/10，得到银线莲浓缩液；
步骤五：向银线莲浓缩液中缓慢加入95％的食用乙醇，大力搅拌，当乙醇浓度达到80％时停止加入，4℃静置12h；
步骤六：将步骤五得到的银线莲溶液离心10min(5000rpm)，弃去上清液，收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇和丙酮各洗涤2次，离心(5000rpm,10min) 收集沉淀，置于通风橱内，挥干有机试剂；
步骤七：将挥干后沉淀按质量体积比1:100(g/mL)复溶于水，高速离心机离心10min(5000rpm)，去除沉淀，得到上清液，所得上清液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72h；
步骤八：透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖AF-1；
步骤九：将AF-1按质量体积比1:100(g/mL)复溶于水，获得银线莲精多糖水溶液；
步骤十：向步骤九中的银线莲精多糖水溶液中缓缓加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到20％时停止加入，4℃静置20h，将上述醇沉体系离心(5000 rpm，10min)，分别收集沉淀和上清液；
步骤十一：将步骤十的沉淀按质量体积比(g/mL)1:100复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-20-1；
步骤十二：向步骤十的上清液中继续缓缓加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到60％时停止加入，4℃静置12h，将上述醇沉体系离心(3000rpm,10 min)，分别收集沉淀和上清液；
步骤十三：将步骤十二的沉淀按质量体积比(g/mL)1:100复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72 h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-60-1；
步骤十四：向步骤十二的上清液中继续缓缓加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到80％时停止加入，4℃静置12h，将上述醇沉体系离心(3000rpm,10 min)，收集沉淀；
步骤十五：将步骤十四的沉淀按质量体积比(g/mL)1:100复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72 h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-80-1。
实施例2
步骤一：以银线莲全植株为原料，蒸馏水洗净，晾晒干燥，之后用粉碎机磨粉，过60目筛，得银线莲粉末，备用；
步骤二：取银线莲粉末50g，用18倍的95％的食用乙醇于室温下浸泡48h，之后离心5min(5000rpm)，收集沉淀，挥干乙醇，获得预处理粉末；
步骤三：将预处理粉末溶解于18倍的超纯水，于70℃下提取7h，浸提2 遍，合并上清液；
步骤四：将上清液离心，去除沉淀，旋转蒸发器浓缩(真空度-0.1MPa)，浓缩至原有体积的1/10，得到银线莲浓缩液；
步骤五：向银线莲浓缩液中缓慢加入95％的食用乙醇，大力搅拌，当乙醇浓度达到80％时停止加入，4℃静置15h；
步骤六：将步骤五得到的银线莲溶液离心5min(5000rpm)，弃去上清液，收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇和丙酮各洗涤3次，离心收集沉淀，置于通风橱中，挥干有机试剂；
步骤七：将步骤六中的沉淀按质量体积比1:80(g/mL)复溶于水，高速离心机离心5min(5000rpm)，去除沉淀，得到上清液，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72h；
步骤八：透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖AF-2；
步骤九：将银线莲多糖按质量体积比1:80(g/mL)复溶于水，获得银线莲精多糖水溶液；
步骤十：向步骤九中的银线莲精多糖水溶液中缓缓加入无水乙醇，并搅拌当乙醇浓度达到20％时停止加入，4℃静置15h，将上述醇沉体系离心(5000rpm, 5min)，分别收集沉淀和上清液；
步骤十一：将步骤十的沉淀按质量体积比(g/mL)1:80复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-20-2；
步骤十二：向步骤十的上清液中继续缓缓加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到60％时停止加入，4℃静置15h，将上述醇沉体系离心(5000rpm,5min)，分别收集沉淀和上清液；
步骤十三：将步骤十二的沉淀按质量体积比(g/mL)1:80复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72 h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-60-2；
步骤十四：向步骤十二的上清液中继续缓缓加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到80％时停止加入，4℃静置15h，将上述醇沉体系离心(5000rpm,5 min)，收集沉淀；
步骤十五：将步骤十四的沉淀按质量体积比(g/mL)1:80复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72 h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-80-2。
实施例3
步骤一：以银线莲全植株为原料，蒸馏水洗净，晾晒干燥，之后用粉碎机磨粉，过60目筛，得银线莲粉末，备用；
步骤二：取银线莲粉末50g，用15倍的95％的食用乙醇于室温下浸泡48h，之后离心10min(5000rpm)，收集沉淀，挥干乙醇，获得预处理粉末；
步骤三：将预处理粉末溶解于15倍的超纯水，于90℃下提取6h，浸提2 遍，合并上清液；
步骤四：将上清液离心，去除沉淀，旋转蒸发器浓缩(真空度-0.1MPa)，浓缩至原有体积的1/10，得到银线莲浓缩液；
步骤五：向银线莲浓缩液中缓慢加入95％的食用乙醇，大力搅拌，当乙醇浓度达到80％时停止加入，4℃静置20h；
步骤六：向步骤五得到的银线莲溶液离心10min(5000rpm)，弃去上清液，收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇和丙酮各洗涤4次，离心收集沉淀，置于通风橱，挥干有机试剂；
步骤七：将步骤六中的沉淀按质量体积比1:50(g/mL)复溶于水，高速离心机离心8min(5000rpm)，去除沉淀，得到上清液，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72h；
步骤八：透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖AF-3；
步骤九：将银线莲多糖按质量体积比1:50(g/mL)复溶于水，获得银线莲精多糖水溶液；
步骤十：向步骤九中的银线莲精多糖水溶液中缓缓加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到20％时停止加入，4℃静置20h，将上述醇沉体系离心(5000rpm, 8min)，分别收集沉淀和上清液；
步骤十一：将步骤十的沉淀按质量体积比(g/mL)1:50复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-20-3；
步骤十二：向步骤十的上清液中继续缓缓加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到60％时停止加入，4℃静置20h，将上述醇沉体系离心(5000rpm,8min)，分别收集沉淀和上清液；
步骤十三：将步骤十二的沉淀按质量体积比(g/mL)1:50复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72 h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-60-3；
步骤十四：向步骤十二的上清液中继续缓缓加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到80％时停止加入，4℃静置20h，将上述醇沉体系离心(5000rpm,8 min)，收集沉淀；
步骤十五：将步骤十四的沉淀按质量体积比(g/mL)1:50复溶于水，所得溶液置于透析袋中进行透析，相对截留分子量为3500Da，在蒸馏水中透析72 h，透析液经浓缩、冷冻干燥获得银线莲精多糖分级组分，记为AF-80-3。
下面，结合上述具体实施例1中所制得样品，对本发明所述的高纯度银线莲多糖的基本理化指标作进一步说明。
1、材料与方法
葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcA)标准品，美国Sigma公司；牛血清白蛋白，上海晶纯生化科技股份有限公司；考马斯亮蓝G-250，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；不同分子量的葡聚糖标准品(Dextran T-10、Dextran T-40、 Dextran T-50、Dextran T-70、Dextran T-500、Dextran T-2000)，瑞典Pharmacia 公司；浓硫酸、咔唑等均为分析纯试剂，上海国药集团化学试剂有限公司。
2、主要仪器与设备
Cary 60UV-Vis分光光度计(安捷伦科技有限公司)、Agilent 1260高效液相色谱仪。
3、实验方法
3.1银线莲分级多糖得率测定
将冻干后的分级多糖称重，以银线莲多糖质量计算得率，分级多糖得率＝ (分级多糖质量/银线莲多糖质量)×100％.
3.2银线莲分级多糖中性糖、糖醛酸和蛋白质含量测定
以葡萄糖为标准品，采用苯酚硫酸法测定银线莲分级多糖中中性糖含量；以葡萄糖醛酸为标准品，采用硫酸-咔唑法测定银线莲分级多糖中糖醛酸含量；以牛血清白蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法测定银线莲分级多糖中蛋白质含量。每个样品平行测定三次。
3.3银线莲多糖及其分级多糖组分的分子量分布和均一性检测
采用高效分子排阻色谱***对银线莲分级多糖组分进行分子量分布和均一性检测，色谱及样品前处理条件如下：
色谱条件：保护柱：Ultrahydrogel Guard Column(40mm×6mm I.D.，美国Waters公司)；分析柱：线性凝胶柱UltrahydrogelTM Linear column(300mm ×7.8mm I.D.，美国Waters公司)；检测器：示差检测器；检测器及柱温箱温度：35℃；流动相：0.1mol/L NaNO3(含0.02％NaN3，w/w)；流量：0.6mL/min；进样量：20μL；采样时间：30min；数据处理软件：Agilent ChemStation B.04.02。
样品前处理条件：将银线莲多糖及其分级多糖组分、葡聚糖系列标准品和葡萄糖用0.1mol/L NaNO3(含0.02％NaN3,w/w)的溶液溶解，配制成2.0mg/mL 的溶液，过0.22μm水系滤膜后进样。
4、实验结果
4.1银线莲多糖及其分级多糖基本理化性质分析
银线莲多糖及其分级多糖组分的基本理化性质分析结果如表1所示。由表1 可知，以银线莲多糖为基准，其分级多糖组分AF-20-1、AF-60-1和AF-80-1 的总回收率为90.48％，为银线莲多糖的主要成分。分级多糖组分(AF-20-1、 AF-60-1和AF-80-1)的总糖含量(中性糖和糖醛酸含量之和)均大于90％。
表1：实施例1中银线莲分级多糖成分组成测定结果(平均值±标准偏差)
注：a：以银线莲全草预处理粉末为基准；b：以银线莲多糖为基准
4.2银线莲多糖及其分级多糖组分纯度鉴定
实施例1中银线莲多糖及其分级多糖组分(AF-20-1、AF-60-1和AF-80-1) 的凝胶渗透色谱图如图1所示。由图1，AF-1为银线莲多糖的凝胶渗透色谱图，峰宽较宽，表明银线莲多糖中存在不同分子质量的级分。经乙醇分级醇沉处理后，制备得到的银线莲多糖分级组分(AF-20-1、AF-60-1和AF-80-1)的凝胶渗透色谱图中均呈现较为单一对称峰，结合AF-20-1、AF-60-1、AF-80-1总糖含量均在90％以上，可以判定AF-20-1、AF-60-1、AF-80-1为高纯度的银线莲多糖。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本申请进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本申请的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，其均应涵盖在本申请请求保护的技术方案范围当中。
Claims (6)
1.一种高纯度银线莲多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取新鲜银线莲全植株洗净、晾晒干燥，粉碎机磨粉后过筛，得到银线莲粉末用15-20倍体积95％食用乙醇室温下浸泡48h后离心，收集沉淀，挥干乙醇得到预处理粉末；
2)将预处理粉末溶解于15-20倍体积的超纯水，70-90℃水提6-8h，水提液离心，取离心后上清液，沉淀重复水提、离心2-4次，合并上清液，将所得上清液真空浓缩；
3)向浓缩液中缓慢加入95％的食用乙醇并大力搅拌，当乙醇浓度达到80％停止加入，4℃静置10-20h，离心收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇和丙酮各洗涤2-3次，再次离心得到沉淀挥干溶剂；
4)将挥干后的沉淀按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水，离心收集上清液置于透析袋中，透析袋放入蒸馏水透析72h，透析液浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖；
5)将步骤4)制得的银线莲精多糖按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水得到银线莲精多糖水溶液，向溶液中缓慢加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到20％停止加入，4℃静置10-20h，离心分别收集沉淀与上清液；
6)将步骤5)得到的沉淀按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水，所得溶液置于透析袋中，透析袋放入蒸馏水中透析72h，透析液浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖分级组分，记为I；
7)向步骤5)得到的上清液中继续缓慢加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到60％停止加入，4℃静置10-20h，离心分别收集沉淀与上清液；
8)将步骤7)得到的沉淀按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水，所得溶液置于透析袋中，透析袋放入蒸馏水中透析72h，透析液浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖分级组分，记为II；
9)向步骤7)得到的上清液中继续缓慢加入无水乙醇并搅拌，当乙醇浓度达到80％停止加入，4℃静置10-20h，离心收集沉淀，将沉淀按质量体积比(g/mL)1：50-1：100复溶于水，所得溶液置于透析袋中，透析袋放入蒸馏水中透析72h，透析液浓缩、冷冻干燥后得到银线莲精多糖分级组分，记为III。
2.根据权利要求1所述一种高纯度银线莲多糖的提取方法，其特征在于，步骤1)所述过筛目数为60-80。
3.根据权利要求1所述一种高纯度银线莲多糖的提取方法，其特征在于，步骤1)至步骤9)中所述离心均为3000-5000rpm转速下离心5-10min。
4.根据权利要求1所述一种高纯度银线莲多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)所述真空浓缩为在真空度-0.1MPa条件下将上清液浓缩至原有体积的1/10。
5.根据权利要求1所述一种高纯度银线莲多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)或步骤3)所述真空浓缩与大力搅拌均在旋转蒸发器中操作，旋转蒸发器设定的温度为55℃。
6.根据权利要求1所述一种高纯度银线莲多糖的提取方法，其特征在于，步骤4)、步骤6)、步骤8)和步骤9)中所述透析袋其相对截留分子量为3500Da。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103463438A (zh) * | 2013-08-23 | 2013-12-25 | 浙江磐谷药源有限公司 | 斑叶兰破壁冻干粉的炮制方法及应用 |
| CN106866832A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-06-20 | 南昌大学 | 一种高纯度竹荪多糖的制备方法 |
| CN107496435A (zh) * | 2017-08-18 | 2017-12-22 | 中国人民解放军第二军医大学 | 金线莲苷在制备抗疲劳药物中的应用 |
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2021
- 2021-06-03 CN CN202110619660.8A patent/CN113372462A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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