CN113368097A - 葛根素在制备预防和/或治疗肠易激综合征药物中的应用及药物 - Google Patents

葛根素在制备预防和/或治疗肠易激综合征药物中的应用及药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葛根素用于预防、治疗和/或缓解肠易激综合征的用途，葛根素能够通过上调磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p‑ERK)的水平，恢复被阻滞的细胞周期，促进肠上皮细胞的增殖；能够通过上调紧密连接蛋白(occluding)的表达，参与肠上皮屏障的修复，同时能够通过下调下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF1)受体蛋白表达，抑制下丘脑‑垂体‑肾上腺轴(HPA轴)的亢进，改善胃肠道动力和内脏高敏感性。试验证实葛根素对肠易激综合征的疗效显著，见效快、副作用小，是一种高效、安全、稳定、来源广泛的肠易激综合征治疗药物。本发明为预防和治疗肠易激综合征及其并发症提供了一种新的药物来源。

Description

葛根素在制备预防和/或治疗肠易激综合征药物中的应用及 药物
技术领域
本发明属于医药卫生领域，涉及一种用于制备预防、治疗和/或缓解胃肠道疾病的药物或保健品，特别涉及一种中药野葛的有效成分在预防、治疗肠易激综合征的药物或保健食品中的应用。
背景技术
现今社会，人们的学习、工作、生活压力逐渐增大，生活习惯的不规律，饮食结构的不均衡，长期的紧张、焦虑、抑郁等，往往导致胃肠功能失调、脑-肠调节紊乱以及肠道菌群失调等健康问题，肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)就是其中一种，是一组持续或间歇发作，以腹痛、腹胀、排便习惯和(或)大便性状改变为临床表现，而缺乏胃肠道结构和生化异常的肠道功能紊乱性疾病。患者以中青年人为主，发病年龄多见于20～50岁，女性较男性多见，常与其他胃肠道功能紊乱性疾病如功能性消化不良并存伴发。按照大便的性状将IBS分为腹泻型、便秘型、混合型和不定型四种临床类型，我国以腹泻为主型多见。
中医将肠易激综合征(IBS)归为腹痛、泄泻、便秘、郁证等病的范畴，以肝郁、脾虚、肾阳不足为主要病机，而现代医学认为其属于一种功能性胃肠道疾病，以腹痛、腹胀、排便习惯和(或)大便性状改变等为临床表现，但无胃肠道结构和生化异常。IBS主要包括四种亚型，分别为腹泻型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、腹泻和便秘混合型(IBS-M)以及不定型(IBS-U)，常见于青少年，且女性患病率高于男性，我国以腹泻型为主，严重影响了患者的工作和生活质量。目前关于肠易激综合征的具体病因，病机尚不明确，因此尚缺乏有效的治疗措施。主要采用抗胆碱能药物、止泻剂、解痉剂、5-羟色胺能药物、抗抑郁药等对其进行治疗，但效果不佳。
尽管IBS发病机理至今仍不清楚，但研究表明，脑-肠轴双向通信失调、内脏敏感性增高、低度炎症、肠道通透性增强在介导IBS形成的过程中起着重要的作用。促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)是一种介导下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)对应激反应的关键调节肽，参与脑-肠轴互动，通过影响胃肠道动力，内脏高敏感性等参与IBS的发病。肠道紧密连接(TJ)屏障在肠道和全身性疾病的发病机制中起着关键作用，TJ屏障的破坏和细胞旁通透性的增加，导致促炎分子渗透入管腔内部，使粘膜免疫***激活，最终导致持续的炎症和组织损伤。occludin作为一种TJ跨膜蛋白，在维持TJ屏障功能方面发挥着重要的作用。IBS患者结肠组织及外周血中均发现存在低度炎症，炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α在其中发挥着重要的作用。ERK(细胞外调节蛋白激酶)受上游蛋白的激活后，可以通过进一步激活ERK1/2的磷酸化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等多种生物学反应。有研究指出，ERK信号通路在介导IBS肠道通透性增强方面起着至关重要的作用。
IBS作为一种慢性和易复发的胃肠道疾病，目前尚无治愈的办法。用于治疗IBS的药物主要有抗胆碱能药物、促动力药、阿片类药物、解痉剂、2,3-苯并二氮杂卓受体调节剂、肾上腺皮质激素、5-羟色胺能药物、抗抑郁药等。另外催眠治疗、心理治疗、针灸、低FODMAP饮食、益生元及益生菌等也被用于IBS治疗。目前的药物治疗方法旨在减轻症状的严重程度，然而由于药物显著的副作用，大大降低了患者的生活质量。中药作为IBS的补充和替代药物，与合成药物相比，副作用小，患者耐受性好，越来越受到研究者们的广泛关注。
葛根素是豆科植物野葛的主要有效成分，为异黄酮类化合物，分子式为C21H20O9，分子量为416.28，熔点：187-189℃，白色至微黄色结晶性粉末，在甲醇中溶解，在乙醇中略溶，在水中微溶，在三氯甲烷或***中不溶。
葛根素具有血管舒张、心脏保护、神经保护、促进骨形成、降糖、抗炎、抗氧化等药理作用，临床常用于治疗心脑血管疾病、糖尿病、骨坏死、帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症和结肠癌等。但葛根素对于肠易激综合征的治疗，目前未见其报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有肠易激综合征预防和治疗过程中存在的技术问题，提供一种葛根素在制备预防和/或治疗肠易激综合征中的新应用，葛根素预防和治疗胃肠道疾病尤其是肠易激综合征的性能和功效显著，在治疗和预防肠易激综合征中具有广阔的应用前景，为葛根素及其制剂的新的药用用途提供新的途径。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种葛根素在制备用于预防、缓解和/或治疗胃肠道疾病的药物或保健品中的应用。
其中，所述胃肠道疾病为胃溃疡或肠易激综合征。
特别是，所述胃肠道疾病为腹泻型、便秘型和腹泻与便秘混合型以及不定型的肠易激综合征，优选为腹泻型肠易激综合征。
在筛选具有预防、治疗肠易激综合征作用的天然活性成分的过程中，发明人发现葛根素具有强烈的逆转肠道微生物菌群失调紊乱，促进微生物菌群比例正常；促进肠上皮细胞的增殖和修复的作用，可以有效的预防和治疗胃肠道疾病，尤其是肠易激综合征。
其中，所述药物由葛根素和药学可接受的载体组成。
特别是，所述葛根素的纯度超过90％，优选为高于95％。
特别是，药学上可接受的载体通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical excipients，第2版，由A.Wade和P.J.Weller编辑；AmericanPharmaceutical Association出版，Washington and The Pharmaceutical Press,London,1994)等工具书中找到。
其中，所述药物选择通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、皮肤粘膜、尿道、***或静脉途径给药。
特别是，所述药物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。
尤其是，所述口服制剂选择片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂或溶液剂；所述注射剂选择注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；所述局部给药制剂选择霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂、、贴剂、凝胶剂或巴布剂。
本发明中的药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂等形式存在，即药物制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂等形式，但不局限于以上形式。
本发明中所述的葛根素在用于预防、缓解或治疗肠易激综合征时，可以单独使用，也可以通过含有葛根素的药物组合物的形式使用。
本发明提供以葛根素为活性成分，用于预防、缓解或治疗肠易激综合征的药物制剂和相应的药物剂型。所述药物制剂是以所述葛根素为有效活性成分，并包括了药剂学上可接受的其它载体组分。
本发明另一方面提供一种含有葛根素的预防或/和治疗胃肠道疾病的药物或保健品。
其中，所述胃肠道疾病为胃溃疡或肠易激综合征。
特别是，所述胃肠道疾病为腹泻型、便秘型和腹泻与便秘混合型以及不定型的肠易激综合征，优选为腹泻型肠易激综合征。
尤其是，所述葛根素的重量与所述药物或保健品的总重量之比为0.01-10：100。
本发明中所述药物可以采用本领域公知的方法制成各种剂型，例如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂、巴布剂等。
本发明还提供一种治疗肠易激综合征的方法，包括向受试者给予治疗有效量的葛根素，其治疗有效量为0.01-10mg/kg·d，优选为0.1-5mg/kg·d。
除非另外说明，本文所用的术语“治疗有效量”为需要产生有效作用的药物的用量；“治疗有效量”是可以调整和变化的，最终由医务人员确定，其所考虑的因素包括给药途径和制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况以及所治疗疾病的性质和严重程度。
与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：
1、本发明发掘了已知化合物葛根素新的药用价值，将其用于肠易激综合征治疗的新用途(葛根素对减小腹泻型肠易激综合征大鼠的排便次数、增加玻璃小球的排出时间和减小内脏敏感性具有显著性)，并可制备成预防、调理和/或治疗肠易激综合征的药物或保健食品，从而为葛根素的临床应用开拓了一个新的领域。
2、本发明的葛根素具有显著的预防和治疗肠易激综合征的作用，尤其是腹泻型肠易激综合征的作用，采用母子分离和结肠醋酸刺激相结合方法建立腹泻型肠易激综合证动物模型，通过口服途径进行动物试验，结果表明：(1)葛根素能显著减少大鼠排便次数，增加玻璃小球的排出时间，增加直立次数和活动总距离，减少内脏敏感性，并且呈明显的量效关系；(2)通过对粪便16S rRNA测序分析显示，葛根素能够减低厚壁菌门与拟杆菌门的比例(F/B)，通过对拟杆菌、乳杆菌、普雷沃氏菌、瘤胃球菌、消化链球菌等微生物群丰度的影响逆转造模诱导的微生物群生态紊乱，使得大鼠肠道微生物群趋向正常；(3)葛根素能够通过升高p-ERK的水平，恢复被阻滞的细胞周期，促进肠上皮细胞的增殖，同时葛根素能够通过调节下丘脑CRF1受体、结肠紧密连接蛋白occludin的蛋白含量，抑制HPA轴的亢进，参与肠上皮屏障的修复，表明葛根素在腹泻型肠易激综合征具有较强的治疗作用。
3、本发明的葛根素药理作用强，用于预防、调理和治疗肠易激综合征的功效显著，见效快、毒副作用小、安全性好，能够长期服用，且可用现代药理学分析其治疗肠易激综合征的作用机理，具有良好的药用前景。
4、本发明的产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，且服用量小，使用方便，因此易于推广。
5、本发明既可采用单一成分的葛根素制备预防和治疗肠易激综合征的药物，又可采用葛根素与其它药物共同组方，制备多靶点用于肠易激综合征治疗的复方药物。
附图说明
图1是葛根素对IBS-D模型大鼠2h粪便粒数及玻璃小球排出时间的影响结果图，其中：图1A为IBS-D模型大鼠给药前的2h粪便粒数；图1B为IBS-D模型大鼠给药前玻璃小球排出时间；图1C为IBS-D模型大鼠2周给药后第二天的2h粪便粒数；图1D为IBS-D模型大鼠2周给药后第二天的玻璃小球排出时间。
图2是葛根素对IBS-D模型大鼠开场实验行为学参数的影响结果图，其中，图2A为IBS-D模型大鼠给药前直立次数；图2B为IBS-D模型大鼠给药前活动总距离；图2C为IBS-D模型大鼠给药后直立次数；图2D为IBS-D模型大鼠给药后活动总距离。
图3是葛根素对IBS-D模型大鼠腹部抬起和背部拱起容量阈值的影响结果图；其中，图3A为IBS-D模型大鼠药物治疗前腹部抬起和背部拱起容量阈值变化；图3B为IBS-D模型大鼠药物治疗后腹部抬起和背部拱起容量阈值变化。
图4是葛根素对IBS-D模型大鼠远端结肠组织的影响结果图(H&E染色，标尺为200μm)，其中A、B、C、D、E、F、G分别为空白对照组、模型组、阳性药物组、葛根素低剂量组、葛根素中剂量组、葛根素亚高剂量组、葛根素高剂量组。
图5是以GAPDH作为内参，Western Blot分析ERK1+2，p-ERK，occludin及CRF1蛋白的表达的凝聚电泳图，其中(A)中目的蛋白名称为ERK1+2，p-ERK，occludin；(B)Image Jversion 1.51n软件对p-ERK1/ERK1+2蛋白进行光密度分析结果图；(C)Image J version1.51n软件对p-ERK2/ERK1+2蛋白进行光密度分析结果图；(D)Image J version 1.51n软件对occludin蛋白进行光密度分析结果图；(E)以GAPDH作为内参，Western Blot分析CRF1蛋白的表达的凝聚电泳图；(F)Image J version 1.51n软件CRF1蛋白表达的光密度分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明及其有益效果，但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的配方思路、用途范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下通过试验例来进一步阐述本发明所述葛根素用于IBS-D的治疗作用，这些试验例包括了葛根素的药效学试验和作用机制验证试验。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
试验例1葛根素的药效学研究
1材料
1.1药物与试剂
葛根素(含量＞98％)，购自中国西安开来生物工程有限公司，批号：K188904；以中国药品生物制品检定所提供的葛根素标准品对照并进行HPLC标定，含量为98.2％；
阳性药物：匹维溴铵(Dicetel)，法国苏威制药有限公司；批号：H20160396；
葛根素、阳性药物与蒸馏水混合，制成溶液后，灌胃给药。
1.2动物
大鼠：健康SD孕鼠21只，孕期18±2天，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证编号SCXK(京)2016-0006。
2试验方法与结果
2.1 IBS-D模型建立
2.1.1第一阶段：新生期母子分离(2-14天)：
新生大鼠出生当天记为第1天(PND 1)，PND 2-PND 14期间，新生大鼠每天与母鼠分离3h(9:00am-12:00am)，具体操作方法：将母鼠从原笼中取出，置于一个单独的笼子中，新生大鼠留于原笼中，保持其生活环境温度为28±2℃，分离结束后将母鼠重新放回原笼中。空白对照组不予分离处理。
实验期间所有大鼠均保持自由进食饮水，并定期更换垫料和称量体重。PND 15后的4周内不进行任何操作。新生大鼠与母鼠共同饲养至PND 22后断奶，PND 30后分笼饲养。
2.1.2第二阶段：成年期结肠醋酸刺激(PND 42-PND 56)：
PND 42-PND 56，造模组大鼠经异氟烷麻醉后，将石蜡油润滑后的***管(直径：1mm)轻柔地***距离***2cm处，往结肠内灌入0.5％的醋酸溶液0.5mL，然后缓慢拔出***管，使大鼠头部朝下，用手压迫***并将大鼠尾巴抬高30s，以免醋酸流出，然后将大鼠迅速放回笼子中，待苏醒后任其自由活动和进食饮水。空白对照组大鼠除每天结肠内给予相同体积的0.9％生理盐水外，其他干预与造模组相同。
造模持续2周。实验固定在每天早上9:00开始。
2.2分组及给药
造模结束后，对所有造模组大鼠进行内脏敏感性测试，Brishol积分>5分，且AWR为3分时与空白对照组比较具有显著性差异的大鼠认为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组(Model)、匹维溴铵组(Dicetel，15mg/kg)，葛根素(Puerarin)低(6mg/kg)、中(12mg/kg)、亚高(24mg/kg)、高(48mg/kg)剂量组，每组15只，按1.0mL/100g灌胃给药，其中模型组和空白对照组(Control)给予等量生理盐水。于造模结束后第二天开始给药，连续给药2周。
2.3取材及样本处理
给药结束后，第二天将大鼠用水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，收集、分离血浆。颈椎脱臼处死大鼠，分离下丘脑，粪便留样。分别截取近端结肠(距回盲部2cm处)和远端结肠(距***8cm处)各2cm，用生理盐水将血迹和杂质冲洗干净，一部分放入4％的中性***溶液中固定，进行组织病理学切片分析。剩余部分沿肠系膜纵向剖开肠段，生理盐水冲洗后，分别刮取近端和远端肠粘膜，放入冻存管中，经液氮速冻后，放于-80℃冰箱贮存备用(取材操作均在冰上进行)。
2.4药效学研究结果
2.4.1大鼠一般情况观察及体重变化
从第二阶段造模开始，每天观察大鼠的精神状态、皮毛光泽度以及活动情况。并于第1、7、14、21和28天分别称量并记录各组大鼠的体重，测定结果如表1所示。
表1新生大鼠体重变化(g，Mean±SE，n＝8)
Figure BDA0002585088200000071
注：##P<0.01vs Control；**P<0.01，*P<0.05vs Model。
如表1，空白对照组大鼠精神状态良好，大便呈香肠状，边缘清楚，皮毛顺滑有光泽；造模后，各造模组大鼠体重增长缓慢，与空白对照组比较具有显著性差异(P<0.01)，粪便形态呈软的团块状或糊样便，排便次数增加，喜扎堆，精神萎靡，懒动嗜卧，毛色无光泽，竖毛，个别鼠有肛周不洁现象；给药后，阳性药组及葛根素低、中、亚高、高剂量组大鼠体重增长明显，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)，精神状态好转，皮毛变顺滑，腹泻症状好转。
2.4.2 2h粪便粒数、粪便积分及玻璃小球排出时间测定
造模组于造模结束当天(即各药前)早上8:00喂食，9:00禁食，10:00-12:00收集大鼠粪便，计算2h粪便粒数；给药组于给药2周后当天早上8:00喂食，9:00禁食，10:00-12:00收集大鼠粪便，计算2h粪便粒数，根据Brishol分型积分标准记录大鼠粪便积分，求平均积分值，统计结果如表2。
模型组造模结束后的第二天、给药组给药2周后的第二天，将大鼠用异氟烷麻醉后，取直径为3mm的玻璃小球沿***放入距***3cm的直肠内，然后移至垫有清洁滤纸的笼子中，保持自由进食饮水。大鼠苏醒后开始计时，记录大鼠直肠内玻璃小球的排出时间，实验前禁食12h。给药前、后大鼠粪便的粒数和玻璃小球排出时间的统计结果如图1A-D所示。
表2 Brishol分型积分标准
Figure BDA0002585088200000081
其中1、2型为便秘，3、4型为正常，5、6、7型为腹泻。
如图1A-D所示，连续醋酸刺激两周后，各造模组大鼠2h粪便粒数明显增加，玻璃小球排出时间明显缩短，与空白对照组比较具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)，说明造模后，IBS-D大鼠的结肠转运频率加快；连续给药两周后，与模型组比较，葛根素低、中、亚高、高剂量组2h粪便粒数明显减少(P<0.01或P<0.05)，玻璃小球排出时间有延长趋势，其中葛根素高剂量组具有显著性差异(P<0.05)，说明给药后IBS-D大鼠的结肠转运功能得到改善。
2.4.3行为学测试
模型组于造模结束后，给药组于给药2周后分别对所有大鼠进行开场行为活动测试。记录大鼠在5min内的直立(两前肢离地面1cm即可)次数、活动总距离。实验在早上9:00-13:00之间进行，以避免大鼠生理节律的干扰。实验期间定时清理动物***物。
给药前、后大鼠开场行为活动测试统计结果如图2A-D所示。
如图2A-D所示，经过两周的醋酸刺激后，各造模组大鼠的直立次数和活动总距离显著减少，与空白对照组比较，具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)，说明IBS-D模型大鼠伴随抑郁样行为；连续给药两周后，与模型组比较，葛根素低、中、亚高、高剂量组大鼠的直立次数和活动总距离明显增加(P<0.01)，说明各给药组大鼠的抑郁样症状得到明显改善，且葛根素亚高剂量组疗效更明显。
2.4.4大鼠内脏敏感性测定
造模组于造模结束后，给药组给药2周后分别采用直结肠扩张法(CRD)评估大鼠的腹部撤离反射(AWR)：将大鼠用异氟烷麻醉后，将石蜡油润滑后的带气囊的8F导尿管经******结直肠6cm，在***外1cm处用医用胶带将导管与大鼠尾根固定。将大鼠放于20cm×6cm×8cm的观察笼内，待大鼠适应30min且呈安静状态时，逐渐向气囊内注生理盐水，分别观察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的容量阈值，重复3次，每次间隔5min，每次直肠扩张持续20s，数据取平均值。为避免生理节律影响，均在下午13:00-17:00之间进行。实验前大鼠禁食18h。采用AWR行为评分(参照Al-Chaer标准)进行评分。
0分：大鼠直肠扩张时无行为学反应；
1分：直肠扩张时身体静止不动，头部运动减少，定义为初始感知阈值；
2分：直肠扩张时腹部肌肉轻微收缩，但腹肌未抬离桌面，定义为痛觉敏感阈值；
3分：直肠扩张时腹肌强烈收缩并抬离桌面，定义为疼痛阈值；
4分：直肠扩张时骨盆抬起，身体呈弓形，定义为痛觉最大耐受容量阈值。
选取引起4分行为学反应的最小容量阈值来评价内脏敏感性。
如图3A-B所示，醋酸刺激两周后，各造模组大鼠腹部抬起和背部拱起的容量阈值明显降低，与空白对照组比较，具有显著性差异(P<0.01)，说明IBS-D大鼠的内脏敏感性增高；连续给药两周后，与模型组比较，葛根素低、中、亚高、高剂量组大鼠的腹部抬起和背部拱起的容量阈值明显升高(P<0.01或P<0.05)，说明给药后改善了IBS-D大鼠对外部刺激的敏感性。
2.4.5大鼠结肠病理学切片分析
取大鼠远端结肠组织进行石蜡切片H&E染色，用光学显微镜观察大鼠结肠组织病理变化。远端结肠组织H&E染色结果如图4所示。空白对照组大鼠结肠粘膜结构完整，腺体排列整齐，未见炎性细胞浸润和间质水肿；模型组部分结肠与腹腔组织粘连，结肠缩短，腺体排列疏松，不规则，粘膜下层有炎性细胞浸润，可能为淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞；阳性药组及葛根素低、中、亚高、高剂量组症状得到改善，部分腺体排列疏松，粘膜下层可见轻度充血。
试验例2葛根素治疗IBS-D的作用机制研究
1、葛根素对IBS-D大鼠肠道菌群的影响
16S rRNA可以作为揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌***发育和分类鉴定的指标。
本试验收集IBS-D大鼠粪便样本，通过DNA提取、PCR扩增、PCR产物的混样和纯化、建库测序等获得各样本的16S rRNA序列数据，并进一步通过OTU聚类和物种注释分析、样本复杂度分析(Alpha Diversity)、多样本比较分析(Beta Diversity)、环境因子关联分析等鉴定样本的物种组成和群落结构差异，获得菌群表达丰度最高的10个物种，如表3所示。该测序委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。
表3科(Family)水平上最大丰度排名前10物种的相对丰度(％)
Figure BDA0002585088200000101
表3表示科水平排名TOP 10的物种相对丰度，结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠肠道粪便微生物群物种丰度发生很大变化，其中Muribaculaceae(属于拟杆菌纲，S24-7家族成员)、Akkermansiaceae(艾克曼菌科)、Bacteroidaceae(拟杆菌科)物种丰度降低，Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)、Ruminococcaceae(瘤胃球菌属)、Peptostreptococcaceae(消化链球菌科)、Christensenellaceae(属于梭菌纲)物种丰度升高。给予葛根素(24mg/kg)治疗后，与模型组相比，Muribaculaceae(属于拟杆菌纲，S24-7家族成员)、Bacteroidaceae(拟杆菌科)、Lactobacillaceae(乳杆菌科)物种丰度升高，Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)、Ruminococcaceae(瘤胃球菌属)、Peptostreptococcaceae(消化链球菌科)、Christensenellaceae(属于梭菌纲)物种丰度明显降低。研究表明，在抑郁症、IBS、炎症性肠病以及肥胖患者中Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)丰度增加，该种微生物的存在可以加速其他难消化的碳水化合物的发酵，从而导致乙酸盐的产量增加，使得机体的能量摄入、消耗和储存之间的平衡出现紊乱。模型组大鼠粪便中普雷沃氏菌科丰度明显增加，说明该动物模型能够引起大鼠能量代谢紊乱，而葛根素组大鼠粪便中普雷沃氏菌科丰度明显减少，表明葛根素能够通过影响大鼠的能量代谢进而改善IBS的症状。
2、Western blot方法对作用机制进行验证
IBS-D大鼠给药干预后，将大鼠麻醉处死，分离得到下丘脑和远端结肠粘膜组织，存放于-80℃冰箱。Western blot实验时从-80℃冰箱中取出上述样本，按1:9(w/v)比例加入蛋白裂解液，利用超声破碎仪进行组织匀浆，匀浆后的样品置于摇床上充***解30min，转速70rpm，然后4℃，12000r/min，离心10min，取上清置于1.5mL离心管中，采用BCA蛋白测定试剂盒进行蛋白定量，最后用无菌的PBS将蛋白浓度调整为5mg/mL。按4:1的比例加入5X上样缓冲液，煮沸5min，冷却，-20℃保存。配制浓度为10％的SDS-聚丙烯酰胺分离胶和5％的SDS-聚丙烯酰胺浓缩胶，进行电泳分离，其中，蛋白上样量为50μg；电泳条件为：浓缩胶电压80V，30min；分离胶电压100V，60min，电泳完后湿法转至PVDF膜，一抗(CRF1、ERK1+2、p-ERK、occlusion、GAPDH)4℃过夜，清洗干净后二抗室温孵育1h，二抗清洗干净后加入显色试剂，凝胶成像分析***扫描，凝胶电泳分析结果如图5所示。
与空白对照组比较，模型组大鼠结肠p-ERK水平、occludin蛋白含量显著下调(P<0.01)，下丘脑CRF1受体水平显著上调(P<0.01)，与模型组相比，葛根素低、中、亚高剂量组的结肠p-ERK水平、occludin蛋白含量显著上调(P<0.01)，CRF1受体水平显著下调(P<0.01)，表明给药后，大鼠HPA轴的功能亢进状态被抑制，结肠上皮细胞细胞周期抑制解除，细胞开始进行有丝***，结肠TJ屏障在逐渐恢复。
以上试验结果表明，葛根素能显著减少大鼠排便次数，增加玻璃小球的排出时间，增加直立次数和活动总距离，减少内脏敏感性；同时葛根素能够减低厚壁菌门与拟杆菌门的比例(F/B)，通过对拟杆菌、乳杆菌、普雷沃氏菌、瘤胃球菌、消化链球菌等微生物群丰度的影响逆转造模诱导的微生物群生态紊乱，使得大鼠肠道微生物群趋向正常；机制验证表明
葛根素能够通过升高磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)的水平，恢复被阻滞的细胞周期，促进肠上皮细胞的增殖；同时葛根素能够通过调节下丘脑CRF1受体、结肠紧密连接蛋白(occluding)的蛋白含量，上调紧密连接蛋白的表达，抑制HPA轴的亢进，参与肠上皮屏障的修复；同时还能够通过下调下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF1)受体蛋白表达，抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)的亢进，改善胃肠道动力和内脏高敏感性。因此可以确定葛根素对肠易激综合征，尤其是腹泻型肠易激综合征具有显著的治疗作用，可用于制备肠易激综合征的药物。
实施例1葛根素片剂
1、按照如下配比准备原料
Figure BDA0002585088200000121
将葛根素和淀粉混合均匀后，制成颗粒，加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成片，每片0.2g。
实施例2葛根素胶囊剂
1、按照如下配比准备原料
葛根素(纯度大于98％) 100g
维生素C 600g
淀粉 1000g
将葛根素、维生素C和淀粉混合均匀后装胶囊，每粒0.2g。
实施例3葛根素颗粒剂
葛根素(纯度大于98％) 50g
维生素C 600g
蔗糖粉 5000g
将葛根素、维生素C和蔗糖粉混合均匀制成颗粒后装袋，每袋5g。

Claims (9)

1.葛根素在制备用于预防、缓解和/或治疗胃肠道疾病的药物或保健品的用途。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述胃肠道疾病为胃溃疡或肠易激综合征。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物由葛根素和药学可接受的载体组成。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物选择通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、皮肤粘膜、尿道、***或静脉途径给药。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述口服制剂选择片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂或溶液剂；所述注射剂选择注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；所述局部给药制剂选择霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或贴剂。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述葛根素纯度超过90％。
8.一种治疗肠易激综合征的药物或保健品，其特征是含有葛根素。
9.根据权利要求8所述的药物或保健品，其特征是，所述葛根素的重量与所述药物或保健品的总重量之比为0.01-10：100。
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