CN113358871A - 一种检测Tg-抗Tg抗体复合物的胶体金试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可检出Tg与抗Tg抗体的结合复合物的胶体金试纸条，设置有检测线；所述胶体金结合垫中含有结合抗体标记的胶体金颗粒；检测线中锚定了捕获抗体，结合抗体为抗Tg多克隆抗体，捕获抗体为鼠抗人IgG抗体。本发明通过使用Tg免疫与人亲缘关系较远的动物，获得了独特的抗血清，该抗血清与鼠抗人IgG抗体联合可用于制备检测Tg‑抗Tg抗体复合物的胶体金试纸条。通过使用特定的抗血清组合，解决了单种抗血清制备的试纸条在定量检测过程中相关性差的问题。本发明的试纸条还有检全血的功能，通过使用本发明的胶体金试纸条，可快速检测受检者外周血中Tg‑抗Tg抗体复合物及含量，为监控分化型甲状腺癌康复者的复发提供了便利的工具。
Description
技术领域
本发明涉及甲状腺癌诊断领域，更特别地，涉及一种检测Tg-抗Tg抗体复合物的胶体金试纸条。
背景技术
甲状腺球蛋白(Tg)是一种由甲状腺滤泡上皮细胞分泌的糖蛋白，分子量约660kD,是甲状腺滤泡内胶质的主要成分。分化型甲状腺癌(DTC)患者体内的Tg含量升高，因此Tg是DTC的关键血清学指标，可协助DTC的初诊和确诊。DTC患者康复后，由于血清中曾经出现过高浓度的Tg，所以在免疫***的作用下，诱导出了抗Tg抗体(TgAb)。所以，当DTC康复者复发DTC时，虽然Tg的分泌量升高，但是由于体内存在TgAb的原因，导致了Tg迅速被抗体结合，并形成复合物。在这种情况下，使用常规的Tg检测试剂盒检测不到血清Tg含量。医生往往据此误判，认为受检者的体内没有发生Tg含量上升，不存在复发的情况。
因此，需要一种检测可检测出Tg-抗Tg抗体复合物的试剂盒，由此来获得更准确的检测信息。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种可检出Tg与抗Tg抗体的结合复合物的胶体金试纸条，底板，以及设置在所述底板上依次连接的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设置有检测线；所述胶体金结合垫中含有结合抗体标记的胶体金颗粒；所述检测线中锚定了捕获抗体，其特征在于，所述结合抗体为抗Tg多克隆抗体。
在一个具体实施方案中，所述抗Tg多克隆抗体中含有使用人Tg免疫鱼类获得的血清。
在一个具体实施方案中，所述抗Tg多克隆抗体中含有人Tg免疫黄颡鱼血清。
在一个具体实施方案中，所述抗Tg多克隆抗体中还含有人Tg免疫羊血清和人Tg免疫鸭血清。
在一个具体实施方案中，所述抗Tg多克隆抗体人Tg免疫黄颡鱼血清、人Tg免疫鸭血清和人Tg免疫羊血清的量比为按体积比10:2:1。
在一个具体实施方案中，所述捕获抗体为鼠抗人IgG抗体。
在一个具体实施方案中，所述硝酸纤维膜上还设置有质控线，所述质控线比所述检测线远离所述胶体金结合垫。
在一个具体实施方案中，所述质控线中锚定了鼠抗黄颡鱼IgM抗体、鼠抗鸭IgG抗体和鼠抗羊IgG抗体。
在一个具体实施方案中，所述样品垫与所述胶体金结合垫交界处设置有滤血膜。
本发明通过使用Tg免疫与人亲缘关系较远的动物，获得了独特的抗血清，该抗血清与鼠抗人IgG抗体联合可用于制备检测Tg-抗Tg抗体复合物的胶体金试纸条。并且，通过使用特定的抗血清组合，解决了单种抗血清制备的试纸条在定量检测过程中相关性差的问题。本发明的试纸条还有检全血的功能，通过使用本发明的胶体金试纸条，可快速检测受检者外周血中Tg-抗Tg抗体复合物及含量，为监控分化型甲状腺癌康复者的复发提供了便利的工具。
附图说明
图1为不同种属来源的抗Tg抗血清对Tg-抗Tg抗体复合物的结合力统计图；
图2为本发明的试纸条的结构示意图；
图3为定量检测试纸条的硝酸纤维膜的俯视图；
图4为样品垫、滤血膜、胶体金结合垫的示意图；
图5为使用黄颡鱼抗血清制备的定量试纸条测试100-250ng/ml Tg-抗Tg抗体复合物形成的线性关系曲线；
图6为使用草鱼抗血清制备的定量试纸条测试100-250ng/ml Tg-抗Tg抗体复合物形成的线性关系曲线；
图7为使用组合抗血清制备的定量试纸条测试100-250ng/ml Tg-抗Tg抗体复合物形成的线性关系曲线。
其中，1、底板、2、样品垫，3、胶体金结合垫，4、硝酸纤维膜，41、检测线，42、质控线，5、吸水垫，6、滤血膜。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、抗体筛选和制备
为了研究Tg-抗Tg抗体复合物的检测抗体，我们尝试了多种途径。
首先，尝试使用多种抗Tg单克隆抗体分别与Tg-抗Tg抗体复合物进行亲和实验，结果显示，所有使用的市售抗Tg单克隆抗体和我们自己研发的抗Tg单克隆抗体均没有展示出有效的抗体滴度。
我们深入研究了原因，结果显示，由于Tg引发的抗血清本身含有抗Tg多克隆抗体，这些抗体与Tg形成复合物后，遮蔽了Tg上的绝大部分表位，导致Tg的单克隆抗体基本不可能与复合物结合。因此，我们需要寻找新的特异性抗体。
为了寻找新针对Tg的特异性抗体，我们使用人Tg全长蛋白免疫了多种不同种属的动物，并通过使用Tg-抗Tg抗体复合物来评价抗血清效价。
结果如图1所示，稀释2560倍后，黄颡鱼和草鱼的抗血清具有的较高结合值。与鱼类相比，禽类的抗血清具有相对较低的结合值，鸡抗血清的结合值在禽类中较高。哺乳动物抗血清的结合值十分低，其中羊抗血清相对较高。总体而言，鱼类抗血清和禽类抗血清具有一定的效价，可用于检测Tg-抗Tg抗体复合物。哺乳动物中，羊的抗血清呈现一定的阳性反应，也可能可用于检测Tg-抗Tg抗体复合物。
2、试纸条的制备
基于以上实验，我们准备利用双抗夹心的方法来制备胶体金试纸条。以鱼类、禽类等抗血清作为与胶体金的结合抗体。由于Tg-抗Tg抗体复合物中的抗Tg抗体是人抗体，所以，选择鼠抗人IgG抗体作为捕获抗体。
Tg试纸条的结构如图3和4所示，包括长方形的底板1，以及设置在所述底板1上依次搭接的样品垫2、胶体金结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5。在一个优选实施方案中，样品垫2与胶体金结合垫3之间的交界面增大，以提高样品扩散效率。优选地，样品垫2与胶体金结合垫3的交界处做成上部突出的形状，胶体金结合垫3与样品垫2的交界处做成下部突出的形状，并且这两个部分相互契合，以增大接触面，并且，由于交界处，样品垫2在上，胶体金结合垫3在下，在重力的作用下有利于样品从样品垫2扩散到胶体金结合垫3上。
样品垫2为经过磷酸缓冲液处理的玻璃纤维膜，所述磷酸缓冲液为含有1-5％BSA和表面活性剂的磷酸缓冲液。
胶体金结合垫3为涂覆了结合抗体的胶体金颗粒的玻璃纤维膜。胶体金结合垫3中含有胶体金颗粒，胶体金颗粒上结合抗Tg多克隆抗体(黄颡鱼抗血清、草鱼抗血清、鸡抗血清、鸭抗血清或鹅抗血清)。滴加在样品垫2中的样品如果存在Tg-抗Tg抗体复合物，复合物扩散至胶体金结合垫3中后，可通过胶体金颗粒。带有胶体金颗粒的复合物继续向硝酸纤维膜4扩散，并在硝酸纤维膜4上聚集显示。
胶体金颗粒标记结合抗体的方法如下：
1)胶体金的配制：用双蒸水将1％的氯金酸溶液稀释成0.01％，煮沸，加入柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，知道液体呈亮红色，停止加热，补足因煮沸而损失的水分，即得到胶体金；
2)在胶体金加入抗血清，混匀后静置，离心取沉淀，洗涤两遍后，得到标记了AP8的胶体金颗粒。将标记了抗血清的胶体金颗粒喷涂在玻璃纤维膜上，制备成胶体金结合垫3。
在一个优选实施方案中，如图4所示，样品垫2与胶体金结合垫3交界面上设置有滤血膜6。该设置使得本发明的试纸条可用于检测全血样品，而非局限于血清或组织洗脱液。
在一个优选实施方案中，在滤血膜上标记抗红细胞抗体(RBC)，可截留红细胞，而血液中的其他物质在静电引力的驱动下，顺利通过滤血膜并向胶体金垫移动。用全血样本做快速诊断检测，其中一项难点就是在保证目标物质能够不受影响的通过样品垫且血细胞可以被完全隔离在外，使最终检测结果不受血细胞的颜色干扰，从而实现外周血直接用于检测，而不需要从外周血提取血清再用于检测。
硝酸纤维膜4上设置有检测线411。检测线411上锚定了包被鼠抗人IgG抗体，带有胶体金颗粒的复合物在硝酸纤维膜4上扩散时，遇到检测线411时，与检测线411中锚定的捕获抗体结合，聚集于检测线411上，带有胶体金颗粒的复合物在检测线上聚集越多，则显色越深。
硝酸纤维膜4上还设置有质控线42，质控线42比检测线41远离胶体金结合垫3。质控线412上锚定了结合抗体的二抗(例如，鼠抗黄颡鱼IgM、鼠抗草鱼IgM、鼠抗鸡IgG、鼠抗鸭IgG或鼠抗鹅IgG)。当胶体金颗粒扩散至质控线42处时，聚集于质控线42上。因此，胶体金颗粒在扩散过程中，先遇到检测线41，结合了Tg-抗Tg抗体复合物的胶体金颗粒聚集于检测线41上，没有结合复合物的胶体金颗粒继续向前扩散，在遇到质控线42时，聚集于质控线42上。由于胶体金颗粒丰度远大于复合物，因此无论样品中是否存在Tg-抗Tg抗体复合物，质控线42都将显色。
硝酸纤维膜4的制备方法如下：
1)将硝酸纤维膜在封闭液中封闭60min，封闭液为含有1％BSA和0.1％吐温-20的0.01M的磷酸缓冲液(pH 7.0)；
2)将捕获抗体和质控抗体分别加入到点膜稀释液中，得到捕获抗体点膜液和质控抗体点膜液，将捕获抗体点膜液和质控抗体点膜液分别按2μL/cm的量喷涂在相隔5mm的检测线和质控线上。其中，点膜稀释液为含有0.15M氯化钠、10mM乙二胺四乙酸、1g/L叠氮钠和25g/L甲醇的0.01M的磷酸缓冲液(pH 7.4)。捕获抗体点膜液的浓度为3.5μg/mL，质控抗体点膜液的浓度为1.5μg/L。
定性检测时，将50μL外周血、血清或组织洗脱液样品加入到50μL样品预处理溶液中，搅拌混匀后，滴加在检测试纸条的样品垫的加样区，于20-30℃下进行层析5min。通过观察检测线和质控线即可确定样品中是否含有复合物。即，当检测线和质控线都显色时，样品中含有复合物；当检测线不显色，质控线显色时，样品中不含Tg。
在一个具体实施方案中，样品预处理液为含有0.3-0.5％氯化铵、0.1％碳酸氢钾的0.1M的磷酸缓冲液。使用该样品预处理液，可裂解全血样品中的红细胞，有利于全血样品的检测。
定量检测时，需要准备色值读数***。将层析反应后的试纸条放置在色值-浓度***的扫描装置下进行扫描，扫描后的图像经过色值读数***进行处理得到检测值，根据检测值与标准曲线的对应关系，可得出复合物的浓度。
在实际使用过程中，由于Tg-抗Tg抗体复合物在受检者外周血中的存在周期较短，因此为了提高精度，在取样时可在20分钟内间隔多次取外周血进行检测，以防止错过复合物在外周血中存在的窗口期。
3、定性试纸结果
我们将不同浓度的Tg(1000、500、250、100、50、20ng/ml)用含有Tg诱导的人抗血清(过量)处理后，使用上述试纸条进行定性检测。
在使用上文中的定量检测试纸进行检测。结果如表1所示，黄颡鱼抗血清制备的试纸检测限低于50ng/ml，高于30ng/ml。草鱼抗血清制备的试纸检测限低于100ng/ml，高于50ng/ml。鸡抗血清制备的试纸检测限低于500ng/ml，高于250ng/ml。鸭和鹅抗血清制备的试纸检测限低于250ng/ml，高于100ng/ml。鉴于人体内血清Tg的正常值为3-40ng/ml，因此，可使用黄颡鱼抗血清制备的试纸条和草鱼抗血清制备的试纸条进行定性检测。
表1使用不同结合抗体的试纸条的检测含有不同浓度的Tg-抗Tg抗体复合物的结果
4、定量试纸条的优化
在定量试纸条实验过程中，我们发现了新的问题，使用黄颡鱼或草鱼的抗血清制备的试纸条在定量检测中得不到良好的线性关系。使用100、125、150、175、200、225、250ng/ml的样品浓度跑定量试纸条。然后将试纸条用于色值-浓度***进行标准曲线建立。结果如图5和6所示，无论是使用黄颡鱼抗血清还是使用草鱼抗血清制备的试纸条，相关系数R2均小于0.95，作为浓度测定是不合格的。
不受现有理论的约束，我们推测原因可能是，人血清中虽然含有覆盖Tg蛋白绝大部分表位的抗体，但是每个Tg蛋白在被血清孵育后，与其中的抗体的结合具有一定的随机性，导致每个Tg-抗Tg抗体复合物露出的表位也不完全一样。有的复合物可能会露出黄颡鱼抗血清或草鱼抗血清可结合的表位，有的可能不会露出，从而在限制了线性相关性。
为此，我们实验了多种抗血清组合用于制备试纸条。发现，使用亲缘关系较近种属的抗血清组合(例如黄颡鱼抗血清+草鱼抗血清)不能弥补相关性的缺陷。在试验了多种组合后，我们发现，当将黄颡鱼抗血清、鸭抗血清和羊抗血清以10:2:1的体积组合作为结合抗体制备的试纸条。结果如图7所示，使用该组合可获得高于0.99的线性相关系数，大大提高了检测值与实际值的相关性，可用于作为定量检测试纸条。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种可检出Tg-抗Tg抗体的结合复合物的胶体金试纸条，底板(1)，以及设置在所述底板(1)上依次连接的样品垫(2)、胶体金结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5)，所述硝酸纤维膜(4)上设置有检测线(41)；所述胶体金结合垫(3)中含有结合抗体标记的胶体金颗粒；所述检测线(41)中锚定了捕获抗体，其特征在于，所述结合抗体为抗Tg多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述抗Tg多克隆抗体中含有使用人Tg分别免疫多个物种获得的血清。
3.根据权利要求2所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述抗Tg多克隆抗体中含有人Tg免疫黄颡鱼血清。
4.根据权利要求3所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述抗Tg多克隆抗体中还含有人Tg免疫羊血清和人Tg免疫鸭血清。
5.根据权利要求4所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述抗Tg多克隆抗体人Tg免疫黄颡鱼血清、人Tg免疫鸭血清和人Tg免疫羊血清的量比为按体积比10:2:1。
6.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述捕获抗体为鼠抗人IgG抗体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维膜(4)上还设置有质控线(42)，所述质控线(42)比所述检测线(41)远离所述胶体金结合垫(3)。
8.根据权利要求7所述的试纸条，其特征在于，所述质控线(42)中锚定了鼠抗黄颡鱼IgM抗体、鼠抗鸭IgG抗体和鼠抗羊IgG抗体。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫(2)与所述胶体金结合垫(3)交界处设置有滤血膜(6)。
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