CN113355388A - 一种基于核酸外切酶ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素的方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明以纳米金为载体，合成DNA‑抗体检测探针，抗体用于捕获目标物，DNA用于放大信号；黑色96微孔板经抗原包板、封闭、洗涤后，加入检测探针，包被抗原与标准品竞争结合检测探针上的抗体；洗去多余探针及与目标物结合的探针，加入信号DNA及ExoⅢ，与检测探针上的Trigger DNA完成信号放大步骤。本方法对氯霉素的检测限为0.001ng/L，线性范围为0.01‑5ng/L，与链霉素、庆大霉素、卡那霉素等无交叉反应。本发明灵敏度高，可操作性强，能够很好的应用在抗生素检测领域。

Description

一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素 的方法

技术领域

本发明公开了一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素的方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

在传统的免疫测定中，由于标记物产生的可检测信号低，限制了免疫法的检测灵敏度。另外，标记物与抗体的结合率低也导致了较低的灵敏度，不能满足低浓度靶标的检测。尽管仪器分析方法(例如色谱法和质谱法)可以提高检测灵敏度，但它们不像免疫测定法那样方便和简单。因此，在免疫分析的基础上应用新技术提高检测灵敏度是值得研究的方向。

采用核酸信号放大技术的分子测定是最灵敏的检测方法之一。免疫分析和核酸信号放大相结合可以达到协同作用，不仅可以保留免疫分析法的简便性，而且可以通过DNA扩增技术提高方法的灵敏度。免疫-PCR是最早的免疫-核酸策略(I-NAA)。由于PCR需要可变的温度过程和较高的专业要求，限制了其在生物活性物质的检测的应用。等温核酸信号放大技术由于条件温和，扩增效率高，已逐渐用于免疫测定中。由于环介导的等温扩增(LAMP)和滚环扩增(RCA)的反应体系复杂，而且无酶等温信号放大方法，例如杂交链反应(HCR)的效率有待提高。因此，有必要将更简单，更有效的等温核酸信号放大方法应用于免疫测定。

氯霉素(CAP)作为一种低成本且具有出色抗菌性能的广谱抗生素，已被广泛用于治疗奶牛的乳腺炎。但是，CAP对造血***有严重的不良反应，可通过抑制骨髓的造血功能而导致再生障碍性贫血。许多国家标准规定，不得在动物性食品中检测到CAP。因此，高灵敏检测CAP对防止食品中残留过量具有重要意义。

发明内容

[技术问题]

解决传统免疫法的低灵敏度问题，提供一种氯霉素高灵敏检测的便捷方法。

[技术方案]

一种制备用于检测氯霉素的探针的方法，所述方法包括如下过程：

(1)合成纳米金颗粒AuNP：将HAuCl₄分散在水中配制成溶液，加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠，混匀反应，反应结束后，得到有橘红色溶液体系，即为纳米金颗粒分散液；

(2)调节纳米金颗粒分散液的pH至8.5-9.0，加入氯霉素单克隆抗体进行孵育，孵育结束后，获得含有抗体修饰的纳米金颗粒的分散液；记作AuNP-抗体分散液；

(3)将活化后的巯基修饰的Trigger DNA、PEG20000、PBS加入到所得AuNP-抗体分散液中，混匀反应，获得AuNP-抗体-DNA分散液；

(4)在所得AuNP-抗体-DNA分散液中加入BSA进行孵育，孵育结束后，固液分离，得到探针。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，HAuCl₄分散在水中配制成0.01V％HAuCl₄溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，柠檬酸三钠配制成1wt％的水溶液进行添加。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，1wt％的柠檬酸三钠溶液与0.01V％HAuCl₄溶液的体积比为2.5mL：100mL。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，混匀反应的时间为15-20min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，所得纳米金颗粒的粒径为15nm，置于4℃避光保存。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，pH具体可调至8.5。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，每1mL纳米金颗粒分散液中加入18μg氯霉素单克隆抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，孵育的时间为1h。

在本发明的一种实施方式中，所述有巯基修饰的Trigger DNA的序列为：5’-GTTTTTAGGGATGTTACGTACGACTTATTTTTTTTTTTT-SH-3’。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，活化是指利用TCEP活化有巯基修饰的DNA。其中，TCEP与巯基修饰的DNA的摩尔比为100：1。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，活化后，再经Zeba脱盐柱脱盐。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，PEG20000制成30％的水溶液进行添加；添加至使溶液中PEG20000的终浓度为1％。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，加入0.1M的PBS；添加至使溶液中的PBS浓度为0.01M。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，混匀反应包括：先混匀反应5min然后4℃盐老化2h。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，BSA的浓度为10wt％；添加至使溶液中BSA的终浓度为1％。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，孵育的温度为室温，时间为40min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，固液分离是通过在13000rpm离心10-20min。

在本发明的一种实施方式中，将步骤(4)所得的探针分散于200μL 0.01M PBS中(含1％PEG20000和1％BSA，pH＝7.4)，4℃避光保存，一周内使用完。

在本发明的一种实施方式中，所述制备方法具体包括如下步骤：

(1)首先合成15nm的纳米金颗粒(AuNP)：取100mL 0.01％HAuCl₄加入250mL烧杯中，加热至沸腾；搅拌下快速加入2.5mL 1％的柠檬酸三钠；继续搅拌15-20min，直至颜色变为橘红色；温度调0，转速调低，冷却后，获得含有AuNP的分散液，4℃避光保存。

(2)取1mL含有15nm AuNP的分散液，用K₂CO₃调节pH至8.5，加入18μg氯霉素单克隆抗体，室温孵育1h，形成含AuNP-抗体的分散液。

(3)巯基修饰的DNA经TCEP活化后(摩尔比1：100)，Zeba脱盐柱脱盐，与30％PEG20000、0.1M PBS一同加入含AuNP-抗体的分散液中，持续混匀5min后，4℃盐老化2h，形成含有抗体-DNA的分散液。

(4)加入10％BSA，室温孵育40min，13000rpm离心15min，最终合成的探针分散于200μL 0.01M PBS中(含1％PEG20000和1％BSA，pH＝7.4)，4℃避光保存，一周内使用完。

本发明基于上述方法制备得到了一种检测氯霉素的探针。

本发明还提供了一种检测氯霉素含量的方法，所述方法包括如下过程：

96孔黑色微孔板经氯霉素包被抗原(CAP-BSA)包板，BSA封闭后，获得氯霉素包被抗原(CAP-BSA)包板的96孔黑色微孔板；将所得探针利用缓冲液进行稀释，配制成探针分散液；然后将一系列已知浓度的CAP样品和上述探针分散液混合加入到CAP-BSA包板的96孔中，孵育进行竞争反应(此时CAP样品与包被抗原竞争与探针结合)，结束后，清洗96孔黑色微孔板，洗去未结合的探针以及与样品结合的探针后，剩余酶标板上的与包被抗原结合的探针；然后加入信号DNA和ExoⅢ，混匀反应，形成检测样液；将检测获得检测样液于489/517nm处的荧光强度信号，利用浓度与相应的荧光强度构建线性关系，即得检测模型。

在本发明的一种实施方式中，所述信号DNA的序列为：5’-BHQ-GGGATGTCGTACGTAACATCCC/i6FAMdT/AAAAAC-3’。

在本发明的一种实施方式中，所述探针分散液是指将利用每1mL上述AuNP的分散液制得的探针重悬于200μL缓冲液中。

本发明的一种实施方式中，所述稀释时利用80倍的缓冲液进行稀释，然后用于检测。

在本发明的一种实施方式中，缓冲液为0.01M PBS，1％PEG 20000、1％BSA。

在本发明的一种实施方式中，信号DNA在检测样液的浓度为0.3μM。

在本发明的一种实施方式中，ExoⅢ是相对信号DNA和Trigger DNA的杂交体进行添加，在检测样液中的浓度为0.3U/μL。

在本发明的一种实施方式中，氯霉素包被抗原是相对探针上的抗体进行添加，在检测样液的浓度为0.6μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述检测方法具体包括如下过程：

在96黑色微孔板中加入100μL 0.6μg/mL的氯霉素包被抗原(CAP-BSA)，37℃孵育2h，PBST洗涤三次；加入2％BSA，37℃封闭1h，PBST洗涤3次；加入50μL CAP标准品和DNA-抗体探针，37℃竞争1h，PBST洗涤3次；加入0.3μM信号DNA，30U ExoⅢ，37℃反应3h，于489/517nm检测荧光强度信号。

有益效果：

本发明建立用于氯霉素定量检测的核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附分析方法，对氯霉素的检测限为0.001ng/L，线性范围为0.01-5ng/L，对氯霉素具有高选择性。

附图说明

图1本发明原理示意图。

图2(a)合成的15nm AuNP的TEM图；(b)AuNP和DNA-抗体紫外图。

图3实施例4中Trigger DNA的序列筛选结果比对图。

图4为EAIA效果图，在溶液中验证信号放大效果。

图5为核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附分析效果验证图，比较0、5、50ng/LCAP的检测信号，验证方案可行性

图6为实施例4中信号DNA浓度优化比对图；设置0.1、0.3、0.5μM三种浓度，CAP浓度为0、5ng/L，通过抑制率比较效果。

图7为ExoⅢ浓度优化比对图；设置30U、40U、50U三种浓度，CAP浓度为0、5ng/L，通过抑制率比较效果。

图8为检测的标准曲线图，浓度设置为0,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5ng/L。

图9为方案选择性验证，以链霉素、庆大霉素、卡那霉素和甲砜霉素为参照对象。

具体实施方式

试剂和材料：CAP的标准品购自振翔科技有限公司(中国北京)。柠檬酸三钠，吐温20，牛白蛋白(BSA)和聚乙二醇20000(PEG 20000)购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。TCEP购自伊诺凯科技有限公司(中国北京)。Zeba^TM脱盐旋转柱和ExoⅢ购自赛默飞(美国)。单克隆抗体购自Gene Tex(美国)。CAP-BSA购自奥斯特科技有限责任公司(中国南宁)。

包被缓冲液(0.05M CBS，pH 9.6)和10×反应缓冲液(6.6mM MgCl₂，660mM TrisHCl)。所有寡核苷酸均由生工(中国上海)合成，修饰和纯化。

仪器：Tecnai G2 20透射电子显微镜(TEM)(美国)；H1M1酶联免疫分析仪(广州达瑞生物技术有限公司)；T9-UV-vis分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。震荡孵育机(美国，赛默飞)。

实施例1

通过柠檬酸盐还原法制备AuNP。在磁力搅拌器上将100mL的0.01％HAuCl₄加热至沸腾。随后在剧烈搅拌下将2.5mL新鲜制备的1％柠檬酸三钠加入沸腾溶液中。将混合物连续煮沸约15分钟，直到颜色变成橘红色。然后在缓慢搅拌下将溶液冷却至环境温度，补充至100mL分散液后，在4℃下保存。将1mL AuNPs分散液(pH 8.5-9.0)与18μg单克隆抗体在室温下温和搅拌下孵育1h。利用10mM TCEP活化巯基修饰的Trigger DNA(序列为：5’-GTTTTTAGGGATGTTACGTACGACTTATTTTTTTTTTTT-SH-3’)，然后使用Zeba^TM脱盐柱去除过量的TCEP。然后将活化后的巯基修饰的Trigger DNA，30％PEG 20000(终浓度为1％)和0.1M PBS(终浓度为0.01M)与AuNP-抗体混合5分钟，并在4℃下进行盐老化2h。最后，添加10％BSA以封闭AuNP表面上剩余的活性位点。为了去除多余的寡核苷酸，将溶液在13000rpm和4℃下离心15分钟，得到探针。然后将探针重悬于200μL储存缓冲液(0.01M PBS，1％PEG 20000、1％BSA)中，并保存在4℃下。

通过TEM和UV-可见光谱表征，如图2a所示，合成的AuNP粒径约为15nm，分散良好，且无聚集，紫外峰出现在519nm处，连接上DNA和抗体后，519nm处的紫外峰红移至526nm处，且在260nm出现DNA的峰，表明检测探针的成功合成。

实施例2

将100μL一定浓度的CAP-BSA加至96孔板中，并在37℃下孵育2h。用0.05％PBST洗涤3次后，加入250μL 2％BSA在37℃下封闭1h。然后，加入50μL CAP标准液和一定稀释倍数的实施例1所得的DNA-抗体探针，并在37℃下孵育1h以进行竞争反应。洗涤后，加入0.3μMHP，30U ExoIII和反应缓冲液进行反应。在489nm和517nm处获得荧光。

实施例3

抗原浓度为0.6μg/mL，探针稀释倍数为80倍，信号DNA的浓度为0.3μM，ExoⅢ的浓度为0.3U/μL。在此条件下，检测一系列稀释的CAP标准样品浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5ng/L)。在489nm和517nm处获得荧光(FAM/BHQ1)。

如图6所示，获得线性范围为0.01至5ng/L的标准曲线，线性方程为y＝-2867.81x+5277.76(R²＝0.95)，检出限(LOD)为0.001ng/L。

实施例4探究优化

一、探究优化Trigger DNA的选择：

参照实施例1，改变Trigger DNA的序列为如表1中1、2组所示的序列，其他不变，制得相应的探针。

表1 Trigger DNA筛选结果

将所得探针分别按照实施例3的过程用于检测，结果如图3所示。选用第3组序列的Trigger DNA和HP的杂交体在ExoⅢ切割作用下，获得非常显著的强荧光信号，能够实现更加灵敏的检测。

二、探究优化信号DNA的浓度条件：

参照实施例3，改变信号DNA的浓度，分别为0.1μM、0.5μM，其他不变，进行检测。

结果如图6所示。信号DNA的浓度为0.3μM时具有较高的抑制率，检测更加灵敏。

其中，抑制率计算公式：(目标物0ng/L时的荧光信号-目标物5ng/L时的荧光信号)/目标物0ng/L时的荧光信号。

三、探究ExoⅢ的浓度条件：

参照实施例3，改变信号ExoⅢ的浓度，分别为0.4U/μL、0.5U/μL，其他不变，进行检测。

结果如图7所示。ExoⅢ的浓度为0.3U/μL时时具有较高的抑制率，检测更加灵敏。

实施例5

选取牛奶中可能出现的抗生素包括链霉素，卡那霉素，庆大霉素，甲砜霉素，评估方法的特异性。

如图7所示，链霉素，卡那霉素，庆大霉素显示较低的交叉反应性(5％，11％，16％)，而甲砜霉素的交叉反应率较高，因其结构与CAP相似。

实施例6

选取市面上常见的50％、100％脱脂牛奶为实际样品，并稀释一倍用作比较，添加不同浓度的CAP标准品(0.05、0.5、5ng/L)。

如表2所示，得到的回收率的范围为81％至113％，RSD的范围为2％至10％。结果表明，该新方法具有良好的准确性。

表2回收率验证结果

Claims (10)

1.一种制备用于检测氯霉素的探针的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：

(1)合成纳米金颗粒AuNP：将HAuCl₄分散在水中配制成溶液，加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠，混匀反应，反应结束后，得到有橘红色溶液体系，即为纳米金颗粒分散液；

(2)调节纳米金颗粒分散液的pH至8.5-9.0，加入氯霉素单克隆抗体进行孵育，孵育结束后，获得含有抗体修饰的纳米金颗粒的分散液；记作AuNP-抗体分散液；

(3)将活化后的巯基修饰的Trigger DNA、PEG20000、PBS加入到所得AuNP-抗体分散液中，混匀反应，获得AuNP-抗体-DNA分散液；

(4)在所得AuNP-抗体-DNA分散液中加入BSA进行孵育，孵育结束后，固液分离，得到探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每1mL纳米金颗粒分散液中加入18μg氯霉素单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有巯基修饰的Trigger DNA的序列为：5’-GTTTTTAGGGATGTTACGTACGACTTATTTTTTTTTTTT-SH-3’。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，活化是指利用TCEP活化有巯基修饰的DNA；其中，TCEP与巯基修饰的DNA的摩尔比为100：1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PEG20000制成30％的溶液进行添加；添加至使溶液中PEG20000的终浓度为1％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，加入0.1M的PBS；添加至使溶液中的PBS浓度为0.01M。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，BSA的浓度为10wt％；添加至使溶液中BSA的终浓度为1％。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，制备得到的一种检测氯霉素的探针。

9.一种检测氯霉素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：

96孔黑色微孔板经氯霉素包被抗原CAP-BSA包板，BSA封闭后，获得氯霉素包被抗原(CAP-BSA)包板的96孔黑色微孔板；将权利要求8所述的探针利用缓冲液进行稀释，配制成探针分散液；然后将一系列已知浓度的CAP样品和探针分散液加入到CAP-BSA包板的96孔中，孵育进行竞争反应，结束后，清洗96孔黑色微孔板，洗去未结合的探针以及与样品结合的探针后，剩余酶标板上的与包被抗原结合的探针；

然后加入信号DNA和ExoⅢ，混匀反应，形成检测样液；将检测获得检测样液于489/517nm处的荧光强度信号，利用浓度与相应的荧光强度构建线性关系，即得检测模型。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，信号DNA在检测样液的浓度为0.3μM；ExoⅢ在检测样液中的浓度为0.3U/μL；氯霉素包被抗原在检测样液中的浓度为0.6μg/mL。

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