CN113348248A - 表达***、重组细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
对在高产克隆中持续上调的基因进行转录分析，以评估其增加目的蛋白产生的能力。这些基因的产物(代谢影响产物(MIP))，如肌动蛋白、Erp27、Erp57、Foxa1、PPAR、Ca3和Tagap，可以细分类为不同的功能类别，例如信号传导、蛋白质折叠、细胞骨架组织和细胞存活的。
Description
背景技术和技术领域
重组转基因表达的显着改进稳定地提高了表达重组蛋白(特别是重组治疗性蛋白)的细胞的产率(Farrell,McLoughlin,Milne,Marison,&Bones,2014；Kim,Kim,&Lee,2012；Wurm,2004)。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是一种用于产生重组治疗性蛋白的广泛使用的宿主细胞工厂。其提供了数个优势，包括其产生人样翻译后修饰的能力和在化学成分确定的培养基中以高密度悬浮生长的能力。此外，CHO细胞被认为是产生重组治疗性蛋白的安全宿主(Hansen,Pristovsek,Kildegaard,&Lee,2017)。
到目前为止，细胞工程主要集中在通过改进最大活细胞密度和延长培养时间来提高活细胞浓度的时间积分，以及提高CHO细胞的单位产率，因为这两个参数都是重组治疗性蛋白的体积产率的决定因素(Farrell et al.,2014；Kim et al.,2012)。这是主要是通过调节参与多种细胞功能(如凋亡、代谢、细胞周期和分泌)的基因的表达来实现的(Fischer,Handrick,&Otte,2015)。
然而，一些细胞过程在CHO细胞中不是最佳的，或者仍然限制了治疗性蛋白的产生，并且因此可以通过特定基因的过表达、下调或敲除来改进的这一事实尚未成为如此深入研究的对象(Baek,Kim,Park,&Lee,2015；Hansen et al.,2017)。
内质网(ER)中的蛋白质折叠是治疗性蛋白产生的非常关键的步骤，因此已经被广泛研究(Hansen et al.,2017)。蛋白质二硫键异构酶(PDI)是一种催化天然二硫键形成从而促进蛋白质折叠的酶。PDI还参与了错误形成的二硫键的重排(Wang,Wang,&Wang,2015)。虽然一些研究报告了几种治疗性蛋白在PDI过表达时的单位产率增加，但其他研究没有观察到影响，甚至观察到单位产率或蛋白质效价的下降(Borth,Mattanovich,Kunert,&Katinger,2005；Davis,Schooley,Rasmussen,Thomas,&Reddy,2000；Hayes,Smales,&Klappa,2010；Johari,Estes,Alves,Sinacore,&James,2015；Mohan,Park,Chung,&Lee,2007；Pybus et al.,2014)。PDI家族的另一个成员Erp57也因其在改进治疗性蛋白产生方面的潜力而被研究。Erp57通过与两个ER凝集素伴侣钙网蛋白(CRT)和钙连蛋白(CNX)相互作用，触发糖基化蛋白的二硫键形成(Tannous,Pisoni,Hebert,&Molinari,2015)。发现上调CHO细胞来源的Erp57或同时上调CNX和CRT可提高CHO细胞中血小板生成素的单位产率(Chung,Lim,Hong,Hwang,&Lee,2004；Hwang,Chung,&Lee,2003)。然而，小鼠版本的Erp57的表达降低了α1-抗胰蛋白酶和C1酯酶抑制剂的单位产率(Hansen et al.,2015)。这些相互矛盾的效应可能是由于不同的酶表达水平、来源以及所表达的治疗性蛋白(Hansen etal.,2017)。
鉴于过多的基因表达可以被调节来改进治疗性蛋白产生，更多的全球工程策略都集中在可以作为基因表达的主要调节因子的转录因子的表达上(Gutierrez-Gonzalez etal.,2019)。值得注意的是，ER应激相关转录因子sXBP1、sATF6、ATF4和CHOP的过表达成功地增加了多种治疗性蛋白的单位产率和/或效价(Becker,Florin,Pfizenmaier,&Kaufmann,2008；Cain et al.,2013；Gulis,Simi,de Toledo,Maranhao,&Brigido,2014；Haredy etal.,2013；Ku,Ng,Yap,&Chao,2008；Nishimiya,Mano,Miyadai,Yoshida,&Takahashi,2013；Ohya et al.,2008；Pybus et al.,2014；Tigges&Fussenegger,2006)，尽管sXBPI过表达得到了相互矛盾的结果(Ku et al.,2008；Rahimpour et al.,2013)。此外，对许多细胞过程具有多效性的锌指转录因子YY1的过表达可导致CHO细胞中抗体效价的增加(Tastanova etal.,2016)。
尽管取得了这些进展，但到目前为止，无论何种治疗性蛋白，都很难确定上调或下调CHO细胞活性可以持续产生有利的效应。此外，很少中国仓鼠的基因被研究过其在改进治疗性蛋白产生方面的潜力。同时，越来越多的嵌合治疗性蛋白或工程化治疗性蛋白仍然难以以足够的效价表达用于临床用途和治疗用途(Hansen et al.,2017)。
之前已经描述过，如何将CHO(中国仓鼠卵巢)细胞培养基中缺乏维生素B5与转染维生素B5转运蛋白的表达载体相结合，使得可以确定出能够以非常高的水平表达重组蛋白的细胞变体，包括“易表达”(ETE)曲妥珠单抗，以及“难表达”(DTE)蛋白，否则这些蛋白不能以足以产生治疗性蛋白的水平表达，如Infliximab(国际专利公开WO2016/156574，美国专利公开no.20180066268)。
然而，这些高产和高效率的细胞在所有稳定转染的和选择的细胞中仍然只占很小的比例，并且因此仍然很难确定和分离。本文和/或所附参考文献中引用的出版物，包括专利和专利公开文本，其全部内容通过引用纳入本文。
本领域需要确定这些高产细胞的特定改变，这些改变赋予了构建细胞系，特别是CHO细胞系，这类所需的产生性质，这些细胞系在产生目的分子中总是更有效。本领域还需要利用在高产细胞中发现的特定改变的知识来产生具有这类性质的表达***和细胞。本文中描述的发明解决了这一需求和其他需求。
发明内容
本文公开了表达MIP(即影响代谢的产物)的表达载体/***的用途，特别是其表达MIP或MIP的组合的用途，优选为改进哺乳动物细胞(如CHO细胞)代谢的用途，更特别是改进可导致例如目的蛋白(优选为治疗性蛋白)产生增加的哺乳动物细胞代谢的用途。本文还公开了用于表达一种或多种MIP的工程化细胞。MIP候选列于表1中，并且优选与图1D中所列的细胞功能有关。
MIP优选包括mPPARα和/或Foxa1转录因子、m(小鼠)PPARα和/或Foxa1激活的CHO细胞基因或同源物(如人类同源物)、结构蛋白(如肌动蛋白)、参与细胞基础代谢(如mRNA翻译、信号传导和运输活动)的蛋白(如Tagap、Rassf9、Erp27、Erp57、Clstn3)、细胞存活蛋白(CDK15和Ca3)、凋亡(如CFLAR或SOD1)、谷胱甘肽分解代谢(如GCLM或GGCT)、或它们的具体组合。本发明的细胞过表达所述MIP或MIP人类同源物，和/或用可提高所述MIP活性的化学物质(如苯扎贝特PPAR激动剂和其他化学激动剂或生物激动剂)处理。
在一个实施方案中，本发明涉及一种真核表达***，所述真核表达***包括：至少一个代谢影响产物(MIP)表达载体，其包括至少一个处于至少一个调控序列的控制下编码至少一个MIP的核酸，其中所述MIP优选为表1中的一种，特别是：
-至少一个转录因子，优选为先锋转录因子，如Foxa1(叉头盒蛋白A1)或至少一个参与脂肪酸代谢的转录因子，如至少一个PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)，
-至少一个调节RNA翻译的因子，如Casc3，和/或
-至少一个结构蛋白，如肌动蛋白和/或蛋白质折叠蛋白，如Erp27(内质网蛋白27)，或与相应蛋白质折叠蛋白相互作用的蛋白如Erp57(内质网蛋白57)，
-至少一个参与信号转导、囊泡运输和/或细胞粘附活动的蛋白，如Tagap(T细胞激活GTP酶激活蛋白)、Rassf9(RAS相关结构域家族成员9)、和/或Clstn3(钙同线蛋白3)，
-至少一个参与细胞存活和/或增殖的蛋白，如CDK15(细胞周期蛋白依赖性激酶15)或Ca3(碳酸酐酶3)，
-至少一个参与凋亡的蛋白，如CFLAR(CASP8和FADD样凋亡调节因子)或SOD1(超氧化物歧化酶1)，和/或
-至少一个参与谷胱甘肽分解代谢的蛋白，如GCLM(谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基)或GGCT(γ-谷氨酰环化转移酶)。
所述至少一个MIP包括至少一个PPAR，特别是PPARα、PPARβ/δ或PPARγ。
Foxa1、肌动蛋白、Erp27可任选与Erp57结合。所述至少一个调控序列可以是选自CMV、EF1α、CMV/EF1α、SV40、RSV和PGK的启动子，具有CMV、EF1α、CMV/EF1α、SV40、RSV和PGK的表达水平的启动子以及它们的组合。
所述至少一个MIP可以包括至少一个(包括，例如两个或三个)初级MIP和至少一个、或两个或三个既不是初级MIP也不是次级MIP的另外的MIP。在一个真核表达***中可以存在至少2个、3个、4个、5个或更多个MIP。所述MIP表达载体还可以包括编码所述MIP的核酸上游的第一ITR(末端反向重复)和下游的第二ITR。所述至少一个调控序列可以包括MAR元件或MAR构建体，如MAR 1-68和/或MAR X-29，任选地在第一ITR和第二ITR之间包含单个MAR元件或MAR构建体。所述MIP表达载体可以是转座子供体载体。所述表达***还可以包括转座酶表达辅助载体或mRNA。所述转座酶表达辅助载体可以包括PB(piggybac)转座酶编码序列，任选在上游和下游侧接有非翻译末端区(UTR)。
所述真核表达***还可以包括载体质粒(carrier vector)，所述载体质粒包括至少一个适于***编码目的蛋白的核酸的限制酶切割位点。所述载体质粒还可以包括抗生素抗性基因和/或维生素转运蛋白，如钠-多维生素转运蛋白SLC5A6。所述载体质粒的元件也可以是所述表达***的另一载体的一部分。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，所述方法包括：
(a)用本文公开的表达***的任一个所述表达载体转染细胞和/或
向所述真核细胞中加入表达MIP的基因的蛋白产物的至少一种激活剂，以及
(b)任选地，用包括目的蛋白的载体质粒转染所述细胞。
加入所述真核细胞的所述至少一种激活剂可以是至少一种、两种或所有PPAR的激活剂，特别是PPARα、PPARβ/δ或PPARγ，如苯扎贝特。所述目的蛋白的MA/EL可以大于所述ML的1.5倍、大于所述ML的2倍或甚至大于所述ML的2.5倍或3倍。
在某些实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括在一个容器中的前述权利要求中任一项的所述真核表达***和在第二容器中的如何使用所述***的说明书。所述试剂盒还可以包括至少一种MIP的至少一种激活剂，其中所述MIP优选为至少一种PPAR，特别是PPARα、PPARβ/δ或PPARγ，并且所述激活剂是至少一种、两种或所有PPAR的激活剂，例如苯扎贝特。
在某些实施方案中，本发明还涉及一种重组真核细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括本文公开的任何真核表达***。所述细胞可以被所述MIP表达载体或其包括所述至少1个、至少2个、3个或4个MIP的部分稳定地转染。
本发明还涉及一种真核细胞，所述真核细胞包括至少一个内源MIP或外源MIP，所述MIP处于至少一种外源启动子、外源或重组内源启动子以及它们的组合的控制下，所述外源启动子可以是启动子阶梯的一部分，选自CMV、EF1α、CMV/EF1α、SV40、RSV和PGK，所述外源或重组内源启动子具有CMV、EF1α、CMV/EF1α、SV40、RSV和PGK的表达水平。
附图说明
图1：通过转录组分析确定MIP。
(A)由RNASeq给出的转录组分析，比较未选择的、B5选择的和抗生素选择的细胞产生的易表达(ETE)或难表达(DTE)的目的蛋白。(B)图表示所选择的B5靶基因的两种主要表达模式，这里为在ETE细胞中。基因表达与RNASeq分析中的基因读数相对应。(C)与CHO-M野生型(WT)细胞并与用于曲妥珠单抗产生的多克隆细胞进行比较，确定在曲妥珠单抗高产克隆中上调的转录物。共确定出由32个基因编码的51个mRNA。(D)通过转录组分析和文献筛选确定的候选基因的功能类别(参见表1)。
图2：候选MIP对易表达(ETE)目的蛋白的效应：曲妥珠单抗的产生。
(A)从用于转录组分析的曲妥珠单抗多克隆群中分离出克隆(见图1C)。在后续实验中使用了在补料分批培养中保持快速细胞***率的中间产生的克隆Tras6和Tras14。(B)在Tras14克隆中稳定过表达候选MIP后，在补料分批培养第6天(白条)、第9天(灰条)和第11天(黑条)产生的易表达的曲妥珠单抗抗体。用SRP14过表达作为阳性对照(LeFourn etal.,2013)，并且用表达GFP或空载体转染的细胞作为阴性对照。(C)在补料分批培养第11天产生曲妥珠单抗。通过在曲妥珠单抗克隆中转染增加量的MIP质粒，获得了表达增加量的特定MIP的稳定细胞。(D)在曲妥珠单抗克隆中稳定过表达Foxa1后，补料分批培养第13天产生曲妥珠单抗抗体。(E)Foxa1、Ca3和Rassf9在稳定转染Foxa1(白条)、GFP(灰条)和未转染细胞(黑条)中的相对表达，以说明Foxa1初级MIP过表达时Ca3和Rassf9次级MIP的表达增加。在补料分批培养第8天提取RNA。
图3：候选MIP对难表达(DTE)目的蛋白的效应：英夫利昔单抗(infliximab)的表达。
MIPS在表达难表达(DTE)英夫利昔单抗抗体的重组克隆中稳定过表达。(A)候选基因过表达后，补料分批培养第9天(灰条)和第11天(黑条)产生的英夫利昔单抗抗体。用空载体转染的细胞作为阴性对照。(B)补料分批培养第0天(白条)、第6天(浅灰条)、第9天(黑条)和第11天(深灰条)细胞的活细胞密度。
图4.提供了一个突出了被发现受PPAR调控的B5靶基因的示意图。
图5：易表达(ETE)细胞中的PPAR激活研究：B5选择的细胞中的内源PPAR激动剂。
PPAR瞬时激活分析使用PPAR报告基因DsRed，其启动子包含PPAR反应元件(PPRE)。(A)用过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)-DsRed报告基因瞬时转染或用PPRE报告基因和小鼠PPARα共转染的抗生素(AB)选择的ETE细胞和B5选择的ETE(曲妥珠单抗)细胞。DsRed活性相对于BFP2标记物标准化(参见材料和方法)。(B)PPAR瞬时分析的阴性对照对应于没有PPRE报告基因的DsRed活性。来自子图A和子图B的数据表示来自四个独立实验的校正的DsRed活性的平均荧光±SE。统计：*P≤0.05和**P≤0.02(单侧t检验；配对样本)。(C)解释瞬时PPARα激活数据的示意图。
图6：易表达(ETE)克隆中的PPAR激活研究：外源泛PPAR激动剂的效应。
(A)ETE克隆(曲妥珠单抗)未处理(对照)或在补料分批培养3天后用10mM苯扎贝特PPARα配体处理(+苯扎贝特)。在第6天用RT-qPCR定量候选基因的表达。(B)经10mM苯扎贝特处理补料分批培养1天后的ETE细胞，以及10天后测定的IgG效价。数据为四个独立实验的均值±SE。*P≤0.05和**P≤0.02(t检验；双侧；非配对样本，不等方差)。
图7：难表达(DTE)细胞中的PPARα过表达。
用小鼠PPARα或空载体稳定转染抗生素选择的DTE(英夫利昔单抗)细胞。比较DTE克隆、空载体细胞和PPARα过表达细胞(PPARα_OE)进行基因表达、IgG效价和细胞活力的分析。(A)PPARα靶点、PPARα和IgG基因在未处理的细胞或经苯扎贝特(BEZA)处理的细胞中的基因表达(qRT-PCR)。在补料分批培养的第1天，加入10mM的苯扎贝特。在补料分批培养的第6天提取RNA。英夫利昔单抗IgG单位产率(B)和细胞活力(C)在非选择性培养基或B5饥饿培养基中显示。细胞在非选择性培养基或B5饥饿培养基中以2×105细胞/ml的起始量在12孔板中培养5天，然后转移到非选择性培养基中。在非选择性培养基中培养3天后测定IgG单位产率(PCD)。每项测量都是三个独立培养的结果。统计：*P≤0.05和**P≤0.02(t检验；单侧；非配对样本，不等方差)。
图8：抗生素或B5选择的过表达或不表达PPARαMIP的CHO细胞的代谢分析。
如图所示，在嘌呤霉素或B5选择的多克隆细胞池上用LC-HRMS(液相色谱与高分辨率质谱联用)对维生素B5(图8A)、乳酸(图8B)、乙酰辅酶A(图8C)和酮(3-羟基丁酸)(图8D)进行定量。数据代表来自四个独立生物实验的±SE。统计学：*P≤0.05和**P≤0.02(双侧t检验；配对样本)。这些代谢物的水平也在抗生素选择的DTE(英夫利昔单抗)细胞、稳定转染小鼠PPARα表达载体(PPARa-OE)或空载体的DTE细胞池上进行了定量(图8E-图8H)。数据代表来自三个技术独立实验的±SE。统计学：*P≤0.05和**P≤0.02(双侧t检验；等方差)。
图9：ETE和DTE CHO细胞中的ACTC1过表达。
用编码肌动蛋白的中国仓鼠ACTC1cDNA或空载体稳定转染ETE(曲妥珠单抗，“TRAS”)和DTE(Fc融合蛋白)细胞。比较ETE克隆(对照)、空载体细胞和ACTC1过表达细胞(ACTC1_OE)进行基因表达和IgG效价的分析。(A)ACTC1、IgG轻链(Lc)和重链(Hc)基因表达(qRT-PCR)。每项测量值都是两个独立培养的结果。(B)在非选择性培养基中培养3天后，测定IgG单位产率(PCD)，即每种细胞和每天分泌的IgG的皮克。(C)DTE Fc融合蛋白的产生(Ctrl＝对照，空载体)。
图10：CFLAR、GCLM和ACTC1的单独表达或联合表达对IgG1-贝伐单抗(bevacizumag)表达CHO-M克隆、Fc融合表达CHO-M克隆和Fab酶融合表达克隆的分泌的效应。
用多种转座CFLAR(CASP8样凋亡调节因子和FADD样凋亡调节因子)表达载体、GCLM(谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基)表达载体、ACTC1表达载体分别单独或组合再转染贝伐单抗(bevacizumag)表达克隆(图10A)、fc融合表达克隆(图10B)和fab酶融合表达克隆(DTE)(图10C)。然后，通过每3天或4天的分批传代培养，对所得到的细胞池的单位产率进行评估。结果表示为它们各自的贝伐单抗对照细胞或FC融合对照细胞的PCD值(pg/细胞/天)的百分数(％)。
图11.Erp27和/或Erp57过表达对治疗性蛋白产生的效应。
用Erp27或Erp57表达载体稳定转染或用Erp27和Erp57表达载体共转染产生易表达或难表达治疗性蛋白的克隆。在稳定的多克隆群(子图a-子图e)或克隆(子图f-子图h)的补料分批培养中，对基因表达、细胞生长、细胞活力和蛋白质产生进行了评估。(a)通过qRT-PCR进行评估，产生Tras的克隆中Erp27和Erp57的mRNA水平的定量，表示为在补料分批培养的第0天和第8天，相对于未转染的亲代CHO细胞中Erp27和Erp57的mRNA水平的倍数变化。误差条显示为SD，n＝3，用非配对单尾t检验确定p值。(b)用Erp27和/或Erp57表达载体稳定转染产生Tras的克隆(亲代Tras克隆)，在补料分批培养结束时从细胞培养上清液中测定分泌的曲妥珠单抗的效价。用转染GFP表达载体的细胞作为对照。误差条显示为SD，n＝3，非配对单尾t检验。(c)用减少量的Erp27表达载体和空载体稳定转染亲代Tras克隆，以保持质粒总量不变。用转染空载体质粒的细胞作为对照。在补料分批培养结束时测定曲妥珠单抗效价。误差条显示为SD，n＝3，非配对单尾t检验。(d)如所示，使用Erp27和/或Erp57，或使用GFP表达载体转染后获得的亲代克隆或衍生细胞群，根据在补料分批培养过程中获得的分泌的单克隆抗体的效价来表征产生英夫利昔单抗的克隆。效价用带中间值(中间条)和25％-50％和50％-75％四分位数(框)的Tukey箱须图表示。须延伸到仍在1.5倍四分位数范围内的最低值和最高值。(e)在子图d中分析补料分批培养的活细胞密度。误差条显示为SD，非配对单尾t检验(子图d和子图e，n≥4)。(f)用Erp27和Erp57表达载体，或以空载体(作为对照)稳定转染产生依那西普(etanercept)的克隆。使用
装置分离细胞克隆，并分离具有最高依那西普分泌晕(secretion halo)的克隆，并在补料分批培养结束时表征依那西普效价。相对于对照细胞的效价倍数变化用Tukey箱须图如子图d所示。(g，h)在子图f中分析补料分批培养物的活细胞密度和细胞活力。误差条代表SEM，子图f至子图h(n≥8)。
图12.Foxa1过表达对Tras产生的效应。
用Foxa1或GFP表达载体稳定转染产生Tras的克隆。在10天的补料分批培养过程中评估曲妥珠单抗效价(a)、活细胞密度(b)和细胞活力(c)。n＝5，非配对单尾t检验。效价显示为图2所示的Tukey箱须图，而误差条显示为SD(子图b，子图c)。(d)在补料分批培养的第8天，对Foxa1过表达细胞、GFP表达细胞或亲代Tras克隆上的Foxa1靶基因和图1c中确定的其他相关基因mRNA水平进行RT-qPCR分析。误差条显示为SD，n＝3，配对单尾t检验。(e)在补料分批培养的第0天，用RT-qPCR定量Foxa1过表达细胞、GFP表达细胞或亲代TRAS克隆中Foxa1、Ca3、Rassf9和Tagap的mRNA水平。误差条显示为SD，n＝3，配对单尾t检验。(f)在补料分批培养的第0天、第3天、第6天、第8天和第9天，在Foxa1过表达细胞和亲代Tras克隆中使用羧基-H2DCFDA评估细胞内ROS水平。误差条显示为SD，n＝3，非配对单尾t检验。
图13.Ca3、Rassf9和Tagap过表达对Tras产生的效应。
用Ca3、Rassf9、Tagap或GFP表达载体稳定转染产生Tras的Tras6克隆。在10天的补料分批培养过程中测定曲妥珠单抗效价(a)、活细胞密度(b)和细胞活力(c)。误差条显示为SD，n≥3，非配对双尾t检验。(d)通过RT-qPCR分析定量表达Ca3、Rassf9或Tagap的稳定群中候选基因mRNA水平。提供了相对于对照GFP表达细胞中的mRNA水平的数据。误差条显示为SD，n＝3，配对双尾t检验。(e)用不同量的Ca3表达载体与空载体一起(以保持质粒总量恒定)稳定转染Tras克隆。在补料分批培养结束时，评估从这些细胞获得的曲妥珠单抗效价。误差条显示为SD，n＝3，非配对单尾t检验。
图14.Foxa1过表达对英夫利昔单抗产生的效应。
用Foxa1或GFP表达载体稳定转染产生英夫利昔单抗的克隆，在9天的补料分批培养过程中评估英夫利昔单抗效价(a)、活细胞密度(b)和细胞活力(c)。n＝5，非配对单尾t检验。效价如图2(子图a)所示，而误差条显示为SD(子图b、子图c)。(d)在补料分批培养的第3天、第6天、第7天和第8天，在Foxa1过表达细胞和产生英夫利昔单抗的亲代克隆中使用羧基-H2DCFDA评估细胞内ROS水平。误差条显示为SD，n＝3，非配对单尾t检验。(e)在补料分批培养的第6天，用RT-qPCR定量Foxa1过表达细胞、GFP表达细胞或亲代英夫利昔单抗克隆中Foxa1、Ca3、Rassf9和Tagap的mRNA水平。误差条显示为SD，n＝3，配对单尾t检验。
图15.Tagap过表达对英夫利昔单抗产生的效应。
用Tagap或GFP表达载体稳定转染生产英夫利昔单抗的克隆，并且在9天的补料分批培养过程中评估英夫利昔单抗效价(a)、活细胞密度(b)和细胞活力(c)。n＝4，非配对单尾t检验。效价如图2所示。误差条显示为SD(子图b、子图c)。(d)在补料分批培养的第6天，通过RT-qPCR定量Tagap过表达细胞、GFP表达细胞或亲代克隆中的Foxa1、Ca3、Rassf9和Tagap的mRNA水平。误差条显示为SD，n＝3，配对双尾t检验。
图16.从RNASeq分析或使用qPCR分析获得的候选基因mRNA水平。
亲代CHO细胞、Tras多克隆细胞和Tras高产(HP)克隆中Erp27(a)、Foxa1(b)、Ca3(c)和Tagap(d)的mRNA水平，通过RNASeq分析并且以每千碱基百万转录本(TBM)显示，或使用RT-qPCR分析。提供了相对于亲代CHO细胞的数据。误差条显示为SD。三次生物学重复用于Tras高产克隆，而三次技术重复用于亲代CHO细胞和产生Tras的多克隆细胞群。
图17.补料分批培养分析和产生易表达或难表达的治疗性蛋白的细胞和过表达Erp27，Erp57或两者的细胞mRNA水平。
在补料分批培养过程中，用Erp27和/或Erp57表达载体稳定转染的产生曲妥珠单抗的克隆的活细胞密度(a)和细胞活力(b)。误差条显示为SD，n＝3，非配对单尾t检验。通过qRT-PCR定量不同细胞群中Erp27(c)和Erp57(d)的mRNA水平。提供了相对于对照GFP表达细胞中的mRNA水平的数据。误差条显示为SD，n＝3。(e)qRT-PCR定量Tras克隆中Erp27mRNA水平，所述Tras克隆用减少量的Erp27表达载体和空载体稳定转染以保持质粒总量不变。提供了相对于对照细胞中Erp27的mRNA水平的数据。误差条显示为SD，n＝2。(f和g)qRT-PCR定量稳定转染了Erp27和Erp57表达载体的产生英夫利昔单抗的克隆中Erp27和Erp57mRNA水平。提供了相对于对照细胞中mRNA水平的数据。误差条显示为SD，n＝2。(h)补料分批过程中分析不同细胞群的细胞活力。误差条显示为SD，非配对单尾t检验，n≥4。
图18.补料分批培养过程中候选基因和曲妥珠单抗HC和LC转基因的mRNA水平。
(a)在补料分批培养第0天和第8天，RT-qPCR定量在产生曲妥珠单抗(Tras)的克隆中的Foxa1、Rassf9、Ca3和Tagap的mRNA水平。提供了相对于CHO细胞中的mRNA水平的数据。误差条表示为SD，n＝3。(b)在补料分批培养第8天，RT-qPCR定量在Foxa1过表达细胞、GFP表达细胞或亲代Tras克隆中的Tras重链(HC)和轻链(LC)mRNA水平。提供了相对于对照GFP表达细胞中的mRNA水平的数据。误差条显示为SD，n＝3，配对单尾t检验。
图19.曲妥珠单抗和Ca3mRNA水平的分析。
(a)RT-qPCR定量Cas3、Rassf9和Tagap过表达细胞中Tras免疫球蛋白重链和轻链mRNA水平。提供了相对于对照GFP表达细胞中Tras重链和轻链mRNA水平的数据。误差条显示为SD，n＝3，配对单尾t检验。(b)qRT-PCR定量Tras克隆中Ca3mRNA水平，所述Tras克隆用不同量的Ca3表达载体和空载体稳定转染，以保持质粒总量不变。提供了相对于对照GFP表达细胞中Ca3mRNA水平的数据。
图20.维生素B5选择后ACTC1和TAGAP基因的表达。
在(a)和(b)中，该图显示了ACTC1和TAGAP的mRNA水平的转录组RNA测序(RNA-Seq)分析，将未转染的未经选择的亲代对照细胞(c)与接受抗生素选择或B5选择并表达曲妥珠单抗(ETE，子图a)和干扰素-β(DTE，子图b)的转染细胞进行了比较。选择转染细胞后，将培养物在非选择性完全培养基中培养，并提取总mRNA进行高通量测序以确定接受B5选择过程的细胞群中上调的基因。相对mRNA水平对应于RNA-Seq分析的归一化读取计数。(c)SLC5A6过表达和B5缺乏的选择对ACTC1和TAGAP基因表达的效应。用ACTC1或TAGAP表达载体和嘌呤霉素抗性基因(包括或不包括SLC5A6表达载体)共转染细胞，然后分别在B5缺陷的培养基(B5缺乏)和嘌呤霉素存在下(抗生素选择)选择培养物。将选择的细胞转移到非选择性培养基中，然后通过RT-qPCR对ACTC1和TAGAP的mRNA进行定量。将B5缺乏选择的细胞mRNA水平相对抗生素选择的细胞mRNA水平归一化。(d)分批培养6天后，用LC-MS测定如子图C所述转染和选择的细胞的维生素B5含量。(e)比较抗生素耐药基因(包括或不包括SLC5A6表达载体)转染并且接受抗生素选择的细胞的ACTC1和TAGAP的mRNA水平。通过RT-qPCR确定相对mRNA水平，并将其归一化为耐抗生素细胞mRNA水平。数据为3至5次生物学重复的平均值±SEM。*P≤0.05；**P≤0.02(相对于抗生素选择)(t检验；单尾)。
图21.过表达TAGAP的ETE产生细胞的ACTC1水平
经嘌呤霉素选择的表达曲妥珠单抗抗体的克隆，用CHO TAGAP表达载体或空载体和杀稻瘟菌素(blasticidin)抗性基因稳定地再转染一次，并且选择出带抗杀稻瘟菌素的克隆。通过RT-qPCR使用所得的稳定多克隆细胞池评估TAGAP相对mRNA水平(a)和ACTC1蛋白水平(b)。用ACTC1或GAPDH小鼠抗体探测总蛋白提取物的免疫印迹。将ACTC1信号的比率相对GAPDH的比率归一化，如ImageJ所定量。数据表示3次重复的平均荧光±SEM。**P≤0.02(相对于转染空载体的细胞)(t检验；双尾)。
图22.重组蛋白产生细胞中的ACTC1过表达
(a)将表达英夫利昔单抗抗体的经嘌呤霉素选择的克隆用CHO ACTC1表达载体或空载体以及杀稻瘟菌素抗性基因稳定地再转染，并且选择出抗杀稻瘟菌素的克隆。通过RT-qPCR使用所得的稳定细胞池对ACTC1的相对mRNA水平进行定量。(b)用ACTC1或GAPDH小鼠抗体探测子图B细胞池中总蛋白提取物的免疫印迹。用ImageJ定量ACTC1信号与GAPDH信号的比率。(c)子图C中免疫印迹膜上总蛋白的丽春红(Red Ponceau)染色。数据代表3次重复的平均值±SEM。
图23.ACTC1过表达细胞中DTE重组蛋白的产生
在(a)、(b)和(c)中，该图显示了用ACTC1表达载体或空表达载体稳定再转染的抗生素选择的免疫球蛋白γ(IgG)表达克隆，并且在对另一种抗生素的进行抗性选择后，测定所得稳定细胞池的IgG单位产率。依那西普Fc融合蛋白(Enbrel@)(子图A)、贝伐单抗IgG1(子图B)和英夫利昔单抗IgG1(子图C)的单位产率表示为每个细胞每天分泌的IgG皮克数，为3次重复的平均值±SEM。(d)子图C中分析的细胞英夫利昔单抗IgG水平是在非选择性培养基中，在补料分批培养3天的条件下评估的，其中细胞培养基中释放的IgG效价代表3次生物学重复的平均值±SEM。(e)从两个独立的细胞池中分批培养3天后，使用LC-MS分析测定用ACTC1表达载体或空载体转染的表达英夫利昔单抗的细胞池的乳酸含量。乳酸浓度代表3次技术重复的平均值±SEM。*P≤0.05和**P≤0.02(相对于空载体)(t检验；双尾)。
图24.ACTC1过表达细胞的表征
用抗生素抗性质粒和CHO ACTC1表达载体或空表达载体一起稳定地再转染的表达曲妥珠单抗的CHO细胞克隆。然后选择稳定转染的抗生素抗性细胞，从中分离克隆用于进一步分析。(a)通过RT-qPCR确定的ACTC1相对mRNA水平的定量。(b)图25a的免疫印迹膜总蛋白的丽春红染色。(c)在图25b中进行的补料分批培养10天的克隆的活细胞密度。
图25.ACTC1过表达细胞的产率的表征
用CHO ACTC1表达载体或空表达载体稳定地再转染的曲妥珠单抗表达克隆，并且分离细胞克隆用于进一步分析。(a)用ACTC1或GAPDH小鼠抗体标记的总蛋白提取物的免疫印迹。直方图显示了ACTC1信号相对于GAPDH信号的比率，如使用ImageJ所评估的。图24a显示了丽春红染色的膜。(b)通过双抗体夹心ELISA评估补料分批培养13天后培养上清液中分泌的抗体效价。
图26.ETE克隆中的肌动蛋白聚合水平
(a)来自代表性的ACTC1过表达的曲妥珠单抗克隆(ACTC1_克隆2)，或来自用空表达载体转染的对照克隆(空_克隆2)的细胞上F-肌动蛋白的代表性Sir-actin荧光染色。未染色的细胞用作阴性对照。(b)从流式细胞术分析得到的Sir-actin染色的平均荧光信号。每种条件下共分析2×104个细胞。图上显示的数据代表分析4个独立克隆的平均值±SEM。*P<0.05(t检验；双尾；不等方差)。
图27.ETE克隆中肌动蛋白聚合水平
从流式细胞术得到的所有检测的ACTC1过表达的曲妥珠单抗克隆(ACTC1_克隆)或用空表达载体转染的对照克隆(空_克隆)的细胞上F-肌动蛋白的Sir-actin荧光直方图。未染色细胞用作阴性对照。
图28.根据其F-肌动蛋白聚合水平对产生治疗性蛋白的细胞池进行分类
(a)经Sir-actin染色处理的表达曲妥珠单抗的多克隆群的流式细胞术分析的代表性直方图。图S4描述了未染色对照和其他分析。每次采集共分析5×105个细胞，其中0.4×105至1.4×105个细胞根据它们的低、中或高肌动蛋白聚合(pol)水平通过细胞荧光测定法进行分类，如图所示。(b)将选定的细胞转移到含抗生素的培养基中，然后通过免疫荧光染色细胞荧光测定法分析IgG细胞表面显示。(c)子图B的分选细胞的IgG分泌试验。直方图代表6个细胞池的平均值±SEM。**P≤0.02(t检验；双尾；成对)相对于低肌动蛋白聚合类。
图29.根据其肌动蛋白聚合水平对表达曲妥珠单抗的细胞池进行分类
经Sir-actin染色处理的曲妥珠单抗多克隆群的流式细胞术分析的代表性直方图，如图5的图例所示。顶部的直方图对应于未染色的对照细胞，而下面的直方图代表独立的Sir-actin染色细胞池的流式细胞术分析。
具体实施方式
确定了高产细胞(产生目的蛋白的细胞)中的具体变化，例如，缺乏维生素的细胞水平高于在标准培养基中生长的相应细胞。特别是支持所需水平的目的蛋白产生的代谢因子。研究发现，在一种罕见的CHO细胞亚群中，代谢结果变化由特定CHO细胞基因的过表达导致，或与其相关。因此，确定了与增加CHO蛋白合成相关，与目的蛋白的高产生能力有关的CHO细胞基因表达的变化：这些产物，特别是其合成与重组蛋白高产生相关的蛋白质，被称为代谢影响产物(MIP)，特别是RNA编码的蛋白质，但也包括非编码RNA。因此，比较使用维生素B5选择或使用常规方法选择的高产CHO细胞的mRNA水平，以确定mRNA水平的变化是高产细胞的特定标志。
图1示出了细胞选择方法以及在多种类型的所选高产细胞和对照细胞之间进行的比较。
表1提供了由多种方法确定的候选MIP编码基因的列表。需要注意的是，与代谢相关的MIP可以是调节蛋白，如转录因子(如PPAR或Foxa1)，其mRNA和蛋白水平的增加可以转而激活其靶基因的表达，以及代谢基因本身，如脂质和糖的分解代谢基因，或编码例如mRNA翻译机制成分、细胞结构蛋白(如肌动蛋白)或细胞生存因子(如Ca3或CDK15)的合成代谢基因。
为了确定实际上导致细胞代谢特性改善的基因和蛋白，在表达例如治疗性蛋白的CHO细胞中表达候选MIP，以确定它们的表达增加是否导致目的蛋白产生的改进(图2至图3)。评估了过表达调节MIP(例如，初级MIP)(如Foxa1或PPAR)对其他MIP(例如，次级MIP)表达的效应，以及它们是否可以共同改善细胞代谢，如脂质、脂质前体(如乙酰辅酶A)和副产物(如乳酸)的代谢，从而有可能改善细胞的代谢合适性，转而可以进一步增加目的蛋白(如治疗性IgG)的产生。或者，还测试了过表达结构MIP(如肌动蛋白)是否会导致目的蛋白合成增加，并从而导致目的蛋白产生增加。这些数字表明，一些(但不是全部)候选MIP能够增加易表达(ETE)曲妥珠单抗抗体和/或难表达(DTE)英夫利昔单抗抗体的产生。某些MIP被证明可以提高一种例如治疗性蛋白的产生，但不能提高另一种治疗性蛋白的产生。
根据本发明的真核细胞，包括哺乳动物细胞，如重组哺乳动物细胞，能够保持在细胞培养条件下。这种类型的细胞的非限制性实例是HEK 293(人胚肾)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和小鼠骨髓瘤细胞，包括NS0和Sp2/0细胞。CHO细胞的修饰版本包括CHO-K1和CHO pro-3。在一个优选实例中，可使用SURE CHO-M cellTMline(SELEXIS SA,Switzerland)。这些真核细胞的细胞蛋白可支持转染真核细胞的编码目的蛋白的转基因表达。这些细胞蛋白尤其参与脂质代谢、信号转导、蛋白质转运、转录和翻译、细胞转运、蛋白质修复、蛋白质折叠和细胞粘附，所有这些都是编码目的蛋白的这些转基因表达所必需的，在本文中被称为它们在其他物种(如人类)中的对应物，作为代谢影响产物(MIP)，特别是蛋白质，但也作为表1所示的非编码RNA。可以通过本文所述的MIP真核表达载体将表达这些MIP的一个或多个转基因(MIP转基因)添加到细胞中。可替换地或另外地，内源MIP的表达(即，编码一种或多种MIP的细胞基因组中核酸的表达)可以通过添加一个或多个直接或间接影响MIP表达的物质来刺激，包括表达MIP的内源基因，例如PPAR激动剂苯扎贝特或通过启动子交换，其中这样的内源MIP受到不同的外源启动子或内源启动子的控制，其中每个启动子与这种MIP的特定表达水平相关，因此可以用于改变这种内源MIP的表达。优选地，根据本发明选择的MIP，其表达导致细胞还携带编码目的蛋白的转基因(通常，但不必需在单独的载体上，在本文中称为载体质粒)，以在该细胞未经包括一个或多个选择的MIP的载体转染时，该转基因的表达水平超过转基因的表达水平。编码MIP的核酸通常包含细胞或人类对应物的编码序列(CDS)或由细胞或人类对应物的编码序列(CDS)组成。表1显示了一些MIP。
初级MIP可增加其靶基因和次级MIP的表达，并包括例如如下的调节蛋白：
Foxa1(叉头盒蛋白A1)是一种转录因子，其参与胚胎发育、组织特异性基因表达的建立和分化组织中基因表达的调节。Foxa1被认为充当一种“先锋”因子，因此对于Foxa1来说，通过与核小体核心组蛋白相互作用，为其他蛋白质打开紧密的染色质，并从而取代靶增强子(target enhancer)和/或启动子位点的连接组蛋白。
PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)是配体激活的转录因子。PPAR主要以三种亚型存在：α、β/δ和γ，每种亚型都介导多种脂肪酸(FA)及FA衍生分子的生理作用，并参与FA代谢。PPAR-β/δ的激活可增强脂肪酸代谢。因此，PPAR家族在细胞的能量稳态和代谢功能中起着重要的调节作用。所有的PPAR都与类视黄醇X受体(RXR)异源二聚化，并结合到靶基因DNA上的特定区域。这些DNA序列被称为PPRE(过氧化物酶体增殖物激素反应元件)。PPRE的共同序列由两个与单核苷酸间隔区定向排列的类AGGTCA序列组成。通常，这个序列发生在基因的启动子区域，并且当PPAR与其配体结合时，靶基因的转录会根据基因而增加或减少。具有PPRE、TATA盒和转录起始点的启动子区域可以位于抑制性染色质结构中。配体与PPAR/RXR/辅阻遏物的复合物的结合导致辅阻遏物从配体激活的PPAR/RXR复合物中释放。激活的PPAR/RXR复合物与PPRE结合，可导致染色质结构改变，并释放组蛋白H1。与PPRE结合的PPAR/RXR将辅激活物-乙酰基转移酶复合物靶向启动子。辅激活物-乙酰基转移酶复合物可乙酰化组蛋白尾部(Ac)，从而产生转录活性结构。另外的转录因子(TF)和RNA Pol II起始复合物可被招募到可接近的启动子上，并启动转录。图4突出显示了发现受PPAR调控的B5靶基因，其中大部分最终进入脂质代谢。
可激活PPAR的内源配体(内源激动剂)包括游离脂肪酸和类花生酸(eicosanoids)。PPAR也是许多药物(外源激动剂)的分子靶点。例如，贝特类(fibrates)(如氯贝特(clofibrate)、吉非罗齐(gemfibrozil)、环丙贝特(ciprofibrate)、苯扎贝特和非诺贝特(fenofibrate))可激活PPARα。它们适用于胆固醇紊乱和以高甘油三酯为特征的紊乱。苯扎贝特还能激活其他类型的PPAR，即PPARβ/δ和PPARγ，并因此被认为是一种泛PPAR激活剂。抗糖尿病噻唑烷二酮类(TZD)可激活PPARγ，并用于治疗以胰岛素抵抗为特征的疾病，如糖尿病。GW501516(又称为GW-501,516、GW1516、GSK-516)是一种PPARδ受体激动剂。合成的化学全氟辛酸可激活PPARα，合成的全氟壬酸可激活PPARα和PPARγ。
次级MIP是由于初级MIP(如PPAR和/或Foxa1)的过表达而表达的MIP。如本文别处所述，表达目的蛋白超过阈值水平的细胞不仅以在表达目的蛋白未超过阈值水平的细胞中未观察到的水平表达PPAR和不相关的MIP，而且表达已知或可能受PPAR(如Hmgcs2、Acot1和Cyp4a14)影响的MIP。Ca3和Rassf9是Foxa1的转录靶点，因此可能是次级MIP。下面讨论的MIP可能是也可能不是次级MIP。
结构MIP
细胞骨架由以下多种细胞过程所需的肌动蛋白微丝、微管和中间丝网络组成，如细胞形状和对机械形变的抵抗力(Mays,Beck,&Nelson,1994)、蛋白质合成(Hudder,Nathanson,&Deutscher,2003)、蛋白质运输和分泌(Paavilainen,Bertling,Falck,&Lappalainen,2004；Stamnes,2002)、细胞成分的联合(Knull&Walsh,1992)和代谢通道(Aon&Cortassa,2002)。此外，单克隆抗体产生的增加与细胞骨架蛋白(如肌动蛋白、微管蛋白或肌动蛋白结合的丝切蛋白)的显著增加相关(Dinnis et al.,2006)。最近的研究表明，悬浮CHO细胞由粘附细胞通过破坏细胞外附着基质演变而来的，伴随着细胞骨架的重大变化，如肌动蛋白丝表达的增加，这是与整合素正确相互作用、抵抗剪切应力和悬浮细胞增殖所必需的(Walther,Whitfield,&James,2016)。因此，细胞骨架组织和肌动蛋白丝水平的调节可能会影响悬浮细胞适应性(cell fitness)和重组蛋白的表达，从mRNA翻译到蛋白分泌。
结构MIP直接促成细胞的结构，包括例如肌动蛋白。肌动蛋白单体可聚合以形成组织成在多种不同的细胞过程中发挥基础作用的动态网络的丝。肌动蛋白网络的周转可驱动多种细胞过程，包括细胞运动、细胞粘附、细胞形态变化、囊泡运输和胞质***。ACTC1是心肌肌节细丝的主要蛋白质，负责心脏的肌肉收缩功能。一直以来，ACTC1缺乏主要与心脏病有关(Debold et al.,2010；Wang et al.,2016)。
参与信号转导、囊泡转运活动和细胞粘附的MIP包括例如Tagap(T细胞激活GTP酶激活蛋白)、Rassf9(RAS相关结构域家族成员9)。
Rassf9基因编码的蛋白质定位于核旁内体。该蛋白可与肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶联合，并且可能通过分泌或内体途径参与该酶的运输。Clstn3(钙同线蛋白3)可以调节钙介导的突触后信号。
TAGAP不仅是一种信号蛋白，还参与细胞骨架的组织(参见上文的ACTC1)。因此，TAGAP参与胸腺细胞粘附的丧失以及胸腺细胞和T细胞的细胞骨架重组(Connelly et al.,2014；Duke-Cohan et al.,2018)。TAGAP基因的改变与多种自身免疫性疾病有关(Eyre etal.,2010)。
参与细胞基本代谢(如mRNA翻译)的MIP包括，例如天冬酰胺基-t-RNA合成酶(更多实例参见表1)。
参与蛋白质折叠的蛋白质(也称为蛋白质折叠蛋白)包括被认为具有伴侣活性的Erp27(内质网蛋白27.7kDa)，ERp57是内质网(ER)腔内蛋白，并且是蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族的成员。ERp44也是一种蛋白质二硫键异构酶，参与内质网-高尔基体界面的蛋白质质量控制。
细胞存活和/或增殖蛋白包括CDK15(细胞周期蛋白依赖性激酶15)，其属于一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的大家族，可调节细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化和胚胎发育。Ca3(碳酸酐酶3)可参与二氧化碳的可逆水合作用。
参与细胞凋亡的蛋白质包括CFLAR(CASP8和FADD样细胞凋亡调节因子)或SOD1(超氧化物歧化酶1)。
参与谷胱甘肽分解代谢的蛋白质包括GCLM(谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基)或GGCT(γ-谷氨酰环化转移酶)。
真核细胞(本文中也称为真核宿主细胞或仅为宿主细胞)，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，广泛用于产生重组治疗性蛋白的工业过程中。例如，CHO细胞、NSO、BHK和人胚胎肾-293(HEK-293)的细胞活力依赖于维生素的摄取。哺乳动物细胞不能合成维生素，因此哺乳动物必须从它们的饮食中获得维生素。维生素的主要功能是在如乙酰辅酶A的生物合成等多种酶促反应中充当辅酶因子或辅酶。已表明，在补料分批生物反应器生产条件下，维生素缺乏可以提高细胞克隆的活力及其在分泌的重组治疗性蛋白的效价方面的产率。这些效应是通过降低维生素B5或维生素H的水平来实现的。维生素代谢蛋白可以提高细胞中维生素的利用率，特别是维生素转运蛋白可以作为选择标记物。因此，在维生素缺乏最简单的形式中，在缺乏一种维生素的培养基中，表达相应维生素转运蛋白作为选择标记物的重组真核细胞可以比不表达相应维生素转运蛋白的细胞生长得更好。钠-多维生素转运蛋白SLC5A6已被表征为维生素B5或维生素H的转运蛋白。维生素代谢蛋白的其他实例包括泛酸激酶1、泛酸激酶2或泛酸激酶3。泛酸激酶是辅酶A(CoA)生物合成的关键调节酶。
本发明上下文中使用的转基因是编码给定蛋白质的分离的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列。在MIP的情况下，转基因DNA序列也可以编码非编码RNA。术语“转基因”在本文中用于指通过转染导入细胞(如真核宿主细胞)的DNA序列。因此，转基因总是外源的，但可以是异源的或同源的。
本文中使用的外源核酸是指将涉及的核酸导入宿主细胞。外源核酸的来源可以是表达的同源核酸或异源核酸。相应地，术语“内源”是指在转染前存在于宿主细胞中的核酸分子。术语“异源核酸”是指来源于宿主细胞物种以外来源的核酸分子，而术语“同源核酸”是指来自与宿主细胞相同物种的核酸分子。因此，根据本发明的外源核酸可以利用异源核酸或同源核酸中的一种或两种。例如，人干扰素基因的cDNA在CHO细胞中是异源外源核酸，但在HeLa细胞中是同源外源核酸。类似地，当通过载体导入CHO细胞时，表1所示的编码MIP的基因是外源核酸，这种外源核酸是异源的(例如人、鼠、大肠杆菌(E.coli))或同源的(例如黑线仓鼠(Cricetulus griseus))。
除了MIP转基因外，根据本发明的一些转基因是编码目的蛋白的转基因，例如治疗性蛋白、具有治疗活性的ergo蛋白，包括免疫球蛋白(Ig)和Fc融合蛋白。某些免疫球蛋白，如英夫利昔单抗(类克(Remicade))或凝血因子VIII，尤其难以表达，因为大多数是未表征的细胞瓶颈。借助本发明的MIP表达载体、重组真核细胞和方法，可以确定和/或打开这些瓶颈。
表达转基因(如目的蛋白)的克隆的单位产率(如IgG产率)被确定为产生阶段，通常从第3天到第7天，计算的IgG浓度相对于活细胞密度积分(IVCD)的斜率，并以每细胞和每天的pg(pcd)表示。
易表达(ETE)转基因，特别是编码目的蛋白的转基因，如治疗性蛋白，在CHO的标准培养基中以高于10pcd的水平表达。ETE转基因的实例是曲妥珠单抗抗体。
难表达(DTE)转基因，特别是编码蛋白的转基因，特别是目的蛋白，如治疗性蛋白质，在CHO的标准培养基中以低于10pcd的水平表达。DTE转基因的实例包括编码英夫利昔单抗IgG1(类克)、依那西普Fc融合
或贝伐单抗，或其他分泌蛋白(如凝血因子VIII和干扰素β蛋白)的转基因。
本位所用的术语“转基因”不应包括未转录的侧翼区域，如RNA转录起始信号、聚腺苷酸化添加位点、启动子或增强子。
根据本发明的载体是能够将另外的核酸(如编码MIP的核酸)转运到细胞内的核酸分子。例如，质粒是一种类型的载体，逆转录病毒或慢病毒是另一种类型的载体。在某些实施方案中，载体在转染之前线性化。
MIP表达载体包括调控序列，如启动子、增强子、基因座控制区(LCR)、基质附着区(MARS)、支架附着区(SARS)、绝缘体元件和/或核基质相关DNA，所述调控序列可导致整合到表达载体中的MIP的有效转录。这些调控序列总是外源的，并且通常是异源的(见下文)。
启动子是指能够控制编码序列表达的DNA序列。在一些实施方案中，启动子序列包括近端和更远端的上游元件，后者元件通常被称为增强子。因此，“增强子”是一种能够刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是同源的或异源的。
MIP表达载体，以及本文公开的任何其他载体或重组细胞可以包括一个或多个启动子，所述启动子选自：CMV、EF1α、CMV/EF1α融合启动子、SV40、RSV、PGK及它们的组合，所述启动子可以用于例如在对各自启动子特异的表达水平表达任何一种MIP或其组合。例如，启动子CMV/EF1α(通常称为非常强的启动子)可用于以CMV/EF1α启动子特异的第一表达水平(＝CMV/EF1α启动子表达水平+/-5％或10％)表达相应的基因，而启动子CMV(在全长时通常被称为强启动子(以下称为“CMV启动子”))和弱启动子(当作为用于降低表达的经修饰全长CMV启动子(有时称为“最小CMV启动子”)提供时)可用于以第二表达水平(＝CMV启动子表达水平+/-5％或10％)表达相应的基因，其中，第一表达水平超过CMV启动子特异的第二表达水平。根据要表达的目的蛋白的类型，可以使用一个启动子或另一个启动子。在某些实施方案中，启动子是可诱导的。不同的启动子可以是包括至少两个启动子的启动子阶梯的一部分。
启动子交换包括在宿主细胞内引入一个或多个启动子和/或产生一个或多个启动子的变体(本文中称为“重组启动子”)，其表现出一种以上的表达水平(例如，启动子阶梯)，或者不同的调控特性(例如，对所选基因的更严格的调节控制)，也可用于改变例如真核细胞(宿主细胞)(如CHO细胞)内源MIP的表达水平。
启动子阶梯包括多个启动子，它们的启动子活性水平不同。启动子阶梯可以包括2、3、4、5或更多个启动子，每个启动子都与在启动子控制下提供的基因表达水平的活性相关，例如，超过第一表达水平的第二表达水平。启动子阶梯可能与内源MIP基因相关，也可能与外源对应物相关。该阶梯将允许根据以对表达目的产物的转基因以某水平进行表达所需的MIP水平来切换启动子。这种阶梯也可以用于优化在不同类型的这种转基因情况下使用的表达水平。
根据本发明的载体质粒是适于将表达目的蛋白的转基因转运到细胞中的一种表达载体。它还包括调控序列，并且通常具有至少一个限制酶切割位点，该位点适于***编码目的蛋白的核酸和任选地抗生素抗性基因和/或维生素转运蛋白(如钠-多维生素转运蛋白SLC5A6)。表达载体还可以包含复制起点。如本领域技术人员容易理解的，表达目的蛋白的转基因也可以整合到MIP载体中。
转座子是一种可移动的遗传元件，其通过“剪切粘贴”或“复制粘贴”机制有效地在载体和染色体之间进行转座。在转座过程中，转座子***的转座酶(例如，PiggyBac转座子***中的PB转座酶)识别位于转座子两端的转座子特异的末端反向重复序列(ITR)(任何转座子***都有5′ITR和3′ITR)，并将内容物从原始位点移出并整合到染色***点，如TTAA染色***点。在此过程中，转座子***的转座子***(例如，PiggyBac转座子***中的PB转座酶)识别位于转座子两端的转座子特异性末端反向重复序列(ITR)，并将其从原始位点移出并整合到染色***点，例如TTAA染色***点。例如，PiggyBac转座子***的强大活性使得两个ITR之间的目的基因能够容易地被动员到靶基因组中。
例如，在美国专利公布2010/0154070中描述了PiggyBac转座子***，其全部内容通过引用纳入本文(也参见美国专利公布2015/0361451)。在非病毒载体中，转座子有吸引力是因为它们能够在宿主基因组内的多个位点高频整合单个拷贝的DNA序列。与病毒载体不同，据报道一些转座子没有优先整合到细胞基因附近，因此它们不太可能引入有害突变。此外，转座子易于产生和处理，通常包括转座子供体载体/质粒(或仅包含两侧有反向重复序列的货物DNA的转座子载体)和转座酶表达辅助载体/质粒(在本文中也称为“转座酶表达载体”)或mRNA。为了在不干扰内源转座子拷贝的情况下在多种细胞系中动员DNA，开发了几种转座子***。例如，最初从粉纹夜蛾(cabbage looper moth)中分离出来的PiggyBac(PB)转座子可以有效地将货物DNA转座到多种哺乳动物细胞中。在转座子供体质粒中，表观遗传调控元件可用于保护货物DNA在靠近质粒载体上的转基因时免受不需要的表观遗传效应。例如，MAR可以增加货物DNA基因组的整合和转录，同时防止异染色质沉默，以强大的人类MAR1-68和MARX-29元件为例。它们还可以充当绝缘体，并从而阻止邻近细胞基因的激活。因此，MAR元件已被用于在质粒载体或病毒载体的情况下介导高且持续的表达(参见美国专利公开号2015/0361451，其全部内容通过引用明确地纳入本文)。
MAR元件(也称为MAR序列或MAR)属于更广泛的表观遗传调控元件组，其还包括边界元件或绝缘元件，如cHS4、基因座控制区(LCR)、稳定的抗阻遏物(STAR)元件、普遍存在的染色质开放(UCOE)元件或组蛋白修饰物(如组蛋白去乙酰化酶(HDAC))。
MAR元件可以根据它们主要基于的已识别的MAR来定义：因此，MAR构建体是其大多数核苷酸(50％加上，优选为60％、70％或80％)基于MAR S4的MAR元件。在MAP中经常发现一些简单的序列基序，如高A和T含量。其他常见的基序有A盒、T盒、DNA解链基序、SATB1结合位点(H-box、A/T/C25)以及用于脊椎动物或果蝇属的共有拓扑异构酶II位点。
MAR通常被表征为真核染色体DNA中核基质附着的序列。MAR的性质仅部分由其一级结构决定。例如，已知在MAR元件中发现的典型一级结构(如富含AT的区域)会导致三级结构，即定义MAR功能的某些曲率。因此，MAR通常不仅由其一级结构来定义，还由其二级、三级结构来定义，例如其曲率度和/或物理性质(如熔化温度)。
在MAR元件中常见的富含AT/TA-二核苷酸的弯曲DNA区域(以下称为“富含AT区”)是包括大量A和T的弯曲DNA区域，特别是以二核苷酸AT和TA的形式。在优选实例中，所述DNA区域在一段100个连续的碱基对上含有至少10％的二核苷酸TA和/或至少12％的二核苷酸AT，优选地在一段100个连续的碱基对上(或者当富含AT的区域长度较短时，在相应的较短的一段上)含有至少33％的二核苷酸TA，和/或至少33％的二核苷酸AT，同时具有弯曲的二级结构。然而，“富含AT区”可以短至约30个核苷酸或更少，但优选为约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约350个核苷酸或约400个核苷酸长或更长。
一些结合位点通常也具有相对较高的A和T含量，例如SATB1结合位点(H-box，A/T/C25)和脊椎动物(RNYNNCNNGYNGKTNYNY)(SEQ ID NO：154)或果蝇(GTNWAYATTNATNNR)(SEQID NO：155)的共有拓扑异构酶II位点。然而，通过区域弯曲模式的比较，可以容易地将结合位点区域(模块)，特别是包括一簇结合位点的TFBS区域与来自高A和T含量的MAR元件的富含AT和TA二核苷酸的区域(“富含AT区”)区别开。例如，对于人类MAR 1_68，后者可具有超过约3.8或约4.0的平均曲率度，而TFBS区域则可具有低于约3.5或约3.3的平均曲率度。已鉴定的MAR区域如本文其他部分所述，可通过可替代方式来确定，例如但不限于相对解链温度。然而，这些值是种属特异性的，并因此可随种属而不同，并例如可以更低。因此，各个富含AT和TA二核苷酸区域可具有更低的曲率度例如从约3.2至约3.4，或从约3.4至约3.6，或从约3.6至约3.8，且TFBS区域可具有按比例更低的曲率度，例如低于约2.7、低于约2.9、低于约3.1、低于约3.3。在SMAR Scan II中，将由本领域技术人员选择各自更低的窗口值。
一些优选鉴定的MAR元件包括但不限于MAR 1_68、MARX_29、MAR 1_6、MAR S4、MARS46，包括所有它们在WO2005040377和美国专利公开20070178469中公开的排列，其通过引用明确地纳入到本申请中以公开这些MAR元件和其他MAR元件的序列。鸡溶菌酶MAR也是优选实例(参见美国专利No.7,129,062，其也明确地纳入到本文中以公开MAR元件)。
如果载体被认为包含单一的MAR，这意味着在这个载体中有一个MAR，并且在该载体中没有其他相同或不同类型或结构的MAR。在某些实施方案中，这种单一的MAR位于编码例如目的蛋白的转基因整合位点的下游，例如在转基因整合位点和3′ITR之间。在某些实施方案中，这种转基因是编码位于5′ITR和3′ITR之间MIP的CDS。MAR跟随编码MIP的CDS的3′端的多腺苷酸化信号，位于多腺苷酸化位点和3′ITR之间。启动子如CMV启动子和/或CMV/EF1α融合启动子位于编码MIP的5′ITR和CDS处。
本文所用的转染是指将核酸(包括裸露或纯化核酸或携带特定核酸的载体)导入细胞，特别是真核细胞，包括哺乳动物细胞。在本发明的上下文中，可以使用任何已知的转染方法。其中一些方法包括增强生物膜的渗透性以将核酸带入细胞。突出的实例是电穿孔或微孔化。这些方法可以单独使用，或者可以由声波、电磁和热能、化学渗透促进剂、压力等支持，以选择性地提高核酸进入宿主细胞的通量率。其他转染方法也在本发明的范围内，例如基于载体的转染，包括脂质体转染或病毒(也称为转导)和基于化学的转染。然而，任何将核酸带入细胞的方法都可以使用。瞬时转染的细胞将在短时间内携带/表达转染的RNA/DNA，而不会将其传递下去。稳定转染的细胞将持续表达转染的DNA并传递下去：外源核酸已经整合到细胞的基因组中。根据本发明的稳定转染的细胞包括，例如，在用转座子载体转染后，MIP转基因已经成为细胞基因组的一部分的细胞。
在完全培养基中生长的细胞可利用标准浓度的所有维生素。标准浓度在本文中称为1×。B1、B5和H(1×)的标准浓度分别设定为7.5μM，2.5μM和0.5μM。确定了B5对CHO细胞具有约10-4×至10-3×(0.25nM至2.5nM)的生长限制浓度范围，而10-2×和更高的浓度允许正常培养生长。B1对CHO细胞的限制浓度被确定为10-5×(15pM)至10-4×(150pM)，而H对CHO细胞的限制浓度低于10-5×(5pM)。
在具有限制浓度的所述维生素的培养基(限制性培养基或缺陷型培养基)中，相对于完全培养基(1×)中存在的相应维生素的所述标准浓度，所述浓度小于1×，例如，10-1×、10-2×、10-3×、10-4×和10-5×。如果维生素浓度超过标准参照培养基(在本文中也称为“饱和培养基”)(例如，完全培养基中量的2×，3×，4×，5×或10×)则认为维生素的浓度是饱和的。
本发明尤其利用了这样一个事实，即在限制性培养基中，细胞的生长和/或***可能被阻滞，并且细胞产生MIP，该MIP导致目的蛋白以最大的阻滞/表达水平产生(“MA/EL”，[g/1])。当目的蛋白与一个或多个编码在细胞阻滞期间产生的MIP的基因共转染到细胞中时，当一个或多个MIP不存在/当细胞生长和/或***没有被阻滞时，目的蛋白可以以超过由相同类型的细胞表达的蛋白质的最大水平(“ML”，[g/1])的MA/EL产生。MA/EL可以大于1.5×ML、大于2×ML、甚至大于2.5×ML或3×ML。例如，当由重组细胞(如未经MIP共转染的重组CHO细胞)表达的目的蛋白(如抗体)的ML可以为约1g/l的抗体，目的蛋白(如由也表达一个或多个MIP的重组细胞表达的抗体)的MA/EL可以为约1.5g/l或2g/l的抗体或更多。
表达***/载体通常包含选择标记基因，其有助于选择用包含编码目的蛋白的多核苷酸的载体转化的真核细胞(宿主细胞，在本文中也称为重组真核细胞)。该基因表达的选择标记(或“选择标记蛋白”)通常基于抗生素抗性。例如，通过添加嘌呤霉素，可以使用嘌呤霉素抗性选择表达盒来鉴定已用该盒成功转化的细胞。然而，对抗生素没有任何抗性的选择也是可能的。在本发明的情况下，维生素代谢蛋白，特别是维生素转运蛋白，可以单独或与其他选择标记结合用作选择标记。因此，在其最简单的形式中，在缺乏一种维生素如B5(泛酸)、维生素B1(硫胺素)和/或H(B8或生物素)的培养基中，表达相应维生素转运蛋白作为选择标记的重组真核细胞可以比不表达相应维生素转运蛋白的细胞生长得更好。然而，如本文所述，即使在标准培养基中，维生素转运蛋白也提供了生长优势，并因此可用作选择标记。除了基于例如抗生素抗性的选择标记基因之外，本发明的表达***可以包含作为选择标记的一种或多种维生素代谢蛋白，特别是一种或多种维生素转运蛋白，例如钠-多维生素转运蛋白SLC5A6。
与本文公开的多核苷酸和蛋白质序列具有超过50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸和蛋白质也是本发明的一部分，单独或者作为本文公开的任何***(例如载体和细胞)、细胞、方法和试剂盒的一部分。本发明的核酸可以与任何野生型序列相差至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或更多个核苷酸。在许多情况下，优选由相应基因/cDNA的CDS组成的核酸。
术语序列一致性是指对核苷酸序列或氨基酸序列一致性的度量。通常，比对序列以获得最高顺序的匹配。“一致性”本身在本领域中具有公认的含义，并且可以使用已公开的技术进行计算。(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of SequenceData,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,NewYork,1991)。虽然存在多种方法测定两个核苷酸序列之间的一致性，术语“一致性”是本领域技术人员所熟知的(Carillo,H.&Lipton,D.,SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
任何具体的核酸分子是否与例如编码MIP的特定核酸序列或其一部分至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，可以常规地使用已知的计算机程序来确定，如用DNAsis软件(Hitachi Software,San Bruno,Calif)进行初始序列比对，随后用ESEE 3.0版DNA/蛋白质序列软件进行多序列比对。
氨基酸序列是否与例如蛋白质形式的MIP或其一部分至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，可以常规地使用已知的计算机程序来确定，如BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)。BESTFIT使用“Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)”的局部同源性算法来寻找两个序列之间的最佳同源性片段。许多MIP被深入地研究，并且有一个，但通常不止一个保守区域。如本领域技术人员将理解的，核酸/蛋白质序列的变异优选地(如果不是排他地)在相应MIP的这种一个或多个保守区域之外。
当使用DNAsis、ESEE、BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定具体序列是否例如与根据本发明的参照序列95％一致时，设定参数根据参照核酸序列或氨基酸序列的全长计算一致性百分比，并且与参照序列中核苷酸总数存在高达5％的同源性差距是允许的。
选择的MIP对转基因表达的效应
如上所述，Foxa1在过表达时通常会增加细胞活力、活细胞密度以及易表达和难表达的治疗性蛋白的产生。这种效应可能与Foxa1介导的Tagap上调有关。事实上，当Foxa1过表达时，Tagap可以暂时增加活细胞密度，并且观察到易表达和难表达的治疗性蛋白的效价增加。
Tagap是Rho GTP酶激活蛋白(GAP)家族的信号蛋白成员。在胸腺细胞中，Tagap显示出调节活性RhoA的丰度，从而促进细胞骨架重组和β1整合素介导的粘附的释放，允许胸腺细胞从皮质迁移到髓质(Duke-Cohan et al.,2018)。此外，发现Tagap和心肌肌动蛋白α(ACTC1)在维生素B5选择的产生治疗性蛋白的细胞中以非常高的水平上调，并且Tagap的过表达显示出增加ACTC1的表达，其转而增加多种治疗性蛋白的产生。因此，在CHO悬浮细胞中，TAGAP可以作为细胞内细胞骨架信号到细胞表面整合素的介质，从而改善细胞增殖、活力和对悬浮的适应。
有意思地，在适应悬浮的CHO细胞中观察到球形整合素聚集，以及肌动蛋白含量的增加和球形肌动蛋白鞘的形成(Walther,Whitfield,&James,2016)。因此，Tagap表达的增加有助于改善肌动蛋白介导的细胞适应悬浮环境。由于肌动蛋白细胞骨架参与分泌途径的调节，Tagap上调也有助于提高治疗性蛋白质的分泌(Stamnes,2002)。值得注意的是，在Tras高产克隆中上调的另一个候选基因，Arhgap42(Rho GTP酶激活蛋白42)是一种Rho GTP酶激活蛋白，其被证明位于肌动蛋白应激纤维和粘着斑(focal adhesion)，并促进细胞运动(Hu et al.,2018；Luo et al.,2017)。此外，Arhgap42也是Foxa1靶基因。因此，Arhgap42的表达也在本发明的范围内，优选以增加效价和活细胞密度。
如上所述，ACTC1(肌动蛋白α心肌1)基因已知参与心肌α肌动蛋白的合成。它还通过重组真核细胞(如CHO细胞)来改善ETE和DTE治疗性蛋白质的表达和分泌。据观察，ACTC1水平的提高伴随着总肌动蛋白聚合的减少，这意味着细胞骨架的组织控制或影响治疗性蛋白的表达或分泌。为了支持这一观察结果，研究表明肌动蛋白聚合水平自发降低的CHO细胞池分泌的重组蛋白水平显著更高。由于肌动蛋白过表达细胞释放的治疗性蛋白的增加并不伴随着IgG轻链和重链mRNA的增加(数据未显示)，因此得出这样的结论，即这种肌动蛋白效应是转录后的。
所述数据支持了ACTC1过表达积累了过量的肌动蛋白单体，这可能会扰乱细胞内G/F-肌动蛋白的平衡，从而导致观察到的F-肌动蛋白聚合形式的减少。肌动蛋白动力学和基因表达的相互作用已经在哺乳动物细胞中被提出。例如，研究发现了使用引发F-肌动蛋白破坏的化学试剂处理原代小鼠细胞会导致翻译和蛋白质合成的整体抑制，并且激活了细胞应激反应(Silva,Sattlegger,&Castilho,2016)。这可以表明无论是自发的还是由ACTC1过表达引起的肌动蛋白聚合的减少，都介导了CHO细胞重组蛋白表达的增加，并且这不会损害细胞***或细胞活力。可以推断，F-肌动蛋白解聚可能会引起肌动蛋白组装的翻转，从而增强囊泡和蛋白质的运输。例如，colifin是一种肌动蛋白解聚蛋白，可诱导肌动蛋白重组，从而促进小分子的胞吐和囊泡运输(Birkenfeld,Kartmann,Betz,&Roth,2001)。类似地，选择聚合肌动蛋白水平较低的CHO悬浮细胞可以显示出较高的细胞骨架重组，转而可以改善重组蛋白的分泌。然而，ACTC1过表达的另一个有利效应是导致早期糖酵解的细胞毒性乳酸副产物的积累减少。报道表明，细胞骨架与乳酸积累的相互作用显示出干扰细胞骨架可以抑制乳酸转运体和进入***(Tosco,Faelli,Gastaldi,Paulmichl,&Orsenigo,2008)，表明CHO细胞肌动蛋白解聚可以防止有毒的细胞内乳酸浓度的积累。
总体而言，有几种机制可以解释肌动蛋白过表达对真核细胞(如CHO细胞)蛋白质产生的正效应，这可能与这些细胞的基础代谢和糖酵解产生的能量以及蛋白质分泌的潜在激活有关。总之，可以表明ACTC1过表达和/或使用SiR-actin染色和细胞分选检测F-肌动蛋白聚合的自发变化都可以用于促进从稳定的细胞池中分离高表达CHO细胞。
这可以表明，细胞骨架蛋白和细胞骨架组织的调节可用于提高生物技术目的的蛋白产生。
如上所述，Erp27是一种选择性地与未折叠蛋白质结合并与ER中的二硫键异构酶Erp57相互作用的蛋白质(Alanen et al.,2006；Kober et al.,2013)。如上所述，Foxa1是一种参与多种器官发育的先锋转录因子(Zaret&Carroll,2011)。研究表明，这些MIP的特定组合的表达改进了补料分批培养中的细胞密度和细胞活力，提高了易表达和难表达的治疗性蛋白的产生，并减少了活性氧物质，为高效治疗性蛋白的产生提供了新的途径。表2显示了与亲代CHO细胞和Tras多克隆细胞(PC)相比，Tras高产克隆(HPC)中上调的基因(图11-图15)。
位于ER的蛋白质Erp27被证实参与易表达和难表达的治疗性蛋白质的高水平产生。尽管Erp27是PDI家族的氧化还原非活性成员，但其可能参与蛋白质折叠，因为其选择性地与未折叠的蛋白质结合并与二硫键异构酶Erp57相互作用(Alanen et al.,2006；Koberet al.,2013)。值得注意的是，难表达的蛋白质容易错误折叠，并且未折叠的蛋白质反应(UPR)显示在难表达的蛋白质表达时被激活(参见综述Hansen et al.,2017)。因此，Erp27和Erp57的过表达可能直接有助于减少错误折叠的难表达蛋白质的积累，从而防止或延缓UPR诱导的细胞凋亡。这很好地解释了在表达难表达蛋白质的细胞中，Erp27和Erp57共同过表达时细胞活力和活细胞密度的增加。虽然Erp27和Erp57在内质网应激时显示出上调(Bargsted,Hetz,&Matus,2016；Kober et al.,2013)，这种上调可能不足以处理大量错误折叠的重组蛋白。除了增加治疗性蛋白的产生，Erp27和Erp57的过表达也可以防止产品的质量问题，因为发现抗体质量随着细胞活力的下降而下降(Kaneko,Sato,&Aoyagi,2010)。相比之下，曲妥珠单抗抗体的高产生并没有引发完全的UPR反应(Le Fourn et al.,2014)，这与Erp27过表达，无论是否与Erp57结合，在这些条件下都不能提高细胞活力以及对活细胞密度没有或几乎没有效应的发现一致。然而，正如Erp27适度过表达增加曲妥珠单抗效价的事实所表明的，在这些条件下CHO细胞的折叠能力可能仍是一个瓶颈。
虽然ER中的蛋白质折叠被证明是产生几种治疗性蛋白质的限制性步骤，但关于PDI和Erp57过表达对治疗性蛋白质产生的效应，发表了相互矛盾的结果(参见综述Hansenet al.,2017)。
在易表达和难表达的蛋白高产克隆以及Foxa1过表达细胞中也观察到Ca3的上调，在Tagap过表达细胞中的上调程度较小。值得注意的是，Ca3显示出能抑制H2O2诱导的细胞凋亡并降低H2O2诱导的ROS活性(Raisanen et al.,1999；Shi et al.,2018)。Ca3还显示出可以保护细胞免受低氧应激的影响(参见综述Di Fiore et al.,2018)。重要的是，在补料分批培养过程中观察到ROS的积累，并且氧化应激被证明影响抗体的产生和半乳糖化(Ha,Hansen,Kol,Kildegaard,&Lee,2018)。此外，在补料分批培养中添加抗氧化剂黄芩素或S-磺酸半胱氨酸(S-sulfocysteine)可以提高补料分批培养中的细胞活性和抗体产生(Ha etal.,2018；Hecklau et al.,2016)。发明人一致地发现，在补料分批培养的最后几天，Foxa1过表达细胞中ROS积累减少，细胞活力提高。相反，虽然Ca3的过表达导致了Tras效价的增加，但发明人没有观察到对细胞活力的任何正效应。一种可能的解释是，Ca3没有在正确的水平上过表达。也可能Foxa1介导的细胞活力的增加需要其他基因的激活。一个可能的候选基因是CDK15，其也在Tras高产克隆中上调，并被证明能保护细胞免受凋亡(Park,Kim,Kim,&Chung,2014)，然而，CDK15是否是Foxa1的靶基因仍有待测试。
最后，在易表达和难表达的高产克隆以及Foxa1过表达细胞中也观察到了Rassf9的上调。Rassf9被证明与再循环内体有关，并被认为通过与整合膜蛋白的相互作用来调节囊泡的运输(Chen,Johnson,&Milgram,1998)。虽然Rassf9的过表达只导致Tras14的治疗性蛋白效价增加，而不是Tras6，但其可能参与治疗性蛋白的分泌。
总体而言，可以观察到几个CHO细胞基因的上调有助于提高各种易表达和难表达的治疗性蛋白的产生。有趣的是，其中几个CHO基因似乎被Foxa1转录激活因子上调。因此，发明人得出结论，Foxa1的表达提高可能引起一个有利于高水平治疗性蛋白产生的转录程序，并且这为提高重组目的蛋白的产生提供了一种方便的途径。
本发明将在下面通过非限制性实例进行解释。
实施例
候选MIP选择
RNASeq概述
破译了B5选择过程中细胞内发生的遗传变化和代谢变化。为此，通过RNASeq进行了转录组分析，将B5与未选择的细胞进行比较，并将抗生素与未选择的细胞进行比较(图1A)。确定了在AB选择和B5选择之间表达显著上调(至少增加1.5倍，P>0.5)的基因，并在ETE和DTE重组细胞系中检测到该基因。发现三十一(31)个候选基因作为B5选择目标(表1)。
这些基因的表达模式可以分为两类(图1B)。第一类包括大多数候选基因，经抗生素(AB)选择后，重组蛋白转染后的基因表达下降(上图)。然而，基因表达在B5选择的重组细胞中有提高。这种表达模式的假设是，由于竞争细胞机制以大量产生重组蛋白，基因转录受到挑战。相反，B5选择可以改善整体细胞适应性和新陈代谢，从而提高目的基因的表达。
对于第二种表达模式(图1B下图)，与未转染的细胞相比，经AB和B5选择的细胞都诱导了靶基因，在经B5选择的细胞中表达更高。在这种情况下，靶基因可以被诱导以响应所述重组蛋白，并参与重组蛋白产生和从细胞分泌的不同步骤，或者为由炎症反应引起的解毒过程的一部分。
B5选择主要诱导了酶和转运蛋白等代谢基因的改变(9/31靶基因)。由于B5的选择是基于缺乏B5引起的初级代谢的变化，因此预计大量的靶基因将是多种细胞代谢的一部分。
意外地，这些基因中有5个与脂质代谢有关。通过深入研究文献，发明人发现其中三个基因，即Hmgcs2，Acot1和Cyp4a14，是一个共同的转录因子PPAR的靶点(Rakhshandehroo et al.,2010)。
羟甲基戊二酰辅酶A合酶2(Hmgcs2)编码一种线粒体蛋白质，其通过将乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合形成HMG辅酶A催化酮体生成的第一反应。其决定了饥饿动物的肝脏中脂肪酸的代谢命运(Vila-Brau et al,2011)。
Acot1编码可催化酰基辅酶A水解为游离脂肪酸和辅酶A(CoASH)的酰基辅酶A硫酯酶。其参与长脂肪酸代谢。
Cyp4a14是一种细胞色素P450，已被证明参与小鼠的肝损伤、炎症和纤维化(Zhang,2017)。
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是属于核激素受体超家族的配体激活转录因子，在体内营养平衡中起重要作用(Kersten et al.,2000)。已知有三种不同的PPAR亚型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。所有的PPAR都可与核受体RXR形成异源二聚体，然后与位于其靶基因启动子上的PPAR反应元件(PPRE)序列结合。由PPAR对转录的激活依赖于许多不同的步骤，包括配体与PPAR的结合、PPAR与靶基因的结合、辅阻遏物的去除和辅激活物的募集、染色质结构的重塑以及最终促进基因转录(Michalik et al.,2006)。PPAR可调节在脂质和碳水化合物代谢、血管生物学、组织修复、细胞增殖和分化以及两性异形中起作用的基因的表达(Wahli et al.,2012)。因此，本研究将重点放在PPAR和PPAR靶点上，以检查B5选择和PPAR激活之间是否存在导致PPAR靶点激活的联系。
另一个注意到的靶基因是参与肌动蛋白合成的ACTC1基因。细胞骨架的组织对许多细胞成分，如蛋白质的合成和分泌(Hudder et al,2003)或代谢网络的稳定性(Aon andCortassa,2002)非常重要。因此，重组蛋白产生的增加可能与细胞骨架的增加、分泌途径(ER伴侣)和代谢机制的增加有关(Dinnis et al,2006)。最近的研究表明，悬浮CHO细胞是由粘附细胞通过重组其细胞骨架来增强其皮质下肌动蛋白鞘进化而来的(Walther,2016)。因此，肌动蛋白的调节可能会影响悬浮细胞适应性和重组蛋白产生。
与治疗性蛋白的高产率相关的基因鉴定
表现出与CHO细胞以高水平产生治疗性蛋白相关的表达变化的基因被鉴定和测试为用于改进治疗性蛋白产生的新细胞工程候选物。为此目的，进行了转录组分析以比较三种不同类型的细胞：CHO细胞克隆以高水平产生易表达的曲妥珠单抗(Tras)抗体，同时保持高细胞密度，显示平均单位产率为每细胞每天分泌19.3pg(pg/细胞/天)Tras，并且分析了平均最大活细胞密度(VCD)为每毫升4330万个细胞。将这些细胞系与抗生素选择稳定表达转基因的细胞(单位产率为7.4pg/细胞/天，最大VCD为3630万个细胞/ml)后获得的Tras多克隆细胞群以及亲代未转染的CHO细胞进行比较(图1c)。
根据两个标准选择候选基因：首先，选择与亲代CHO细胞相比在Tras高产克隆中显著上调的113个mRNA(图1c)。还选择了与多克隆Tras表达细胞池相比在高产克隆中上调的1774个mRNA。发现51个mRNA符合这两个标准，对应于32个基因，其上调表达可能与Tras高产率有关(图1c，表2)。利用RT-qPCR在不同的样本上进一步证实了候选基因mRNA水平的变化(图16，数据未显示)。意外地，本体分析表明了候选蛋白编码基因大多与信号和细胞粘附有关(表2，图1d)。还确定了参与蛋白质折叠(Erp27)、细胞存活(Ca3、Cdk15、Vegfd)、细胞生长(Clstn3)、囊泡运输(Rassf9、Clstn3)和细胞骨架组织(Mybpc2、Tagap、Arhgap42)有关的基因，这些都是之前被提出影响治疗性蛋白质产生的细胞功能(表2，图1d，Baek et al.,2015；Fischer et al.,2015；Hansen et al.,2017)。有趣地，与其在亲代CHO细胞中的表达相比，这些候选基因中的大多数也在CHO细胞克隆中上调，高水平产生了另一种易表达的抗体(贝伐单抗)和难表达的干扰素β蛋白(数据未显示)。这表明候选基因的上调并不仅仅与显示出高曲妥珠单抗产率的细胞相关，从而表明这些候选基因可能参与了多种易表达和难表达的治疗性蛋白的高水平产生。
图4至图10说明了PPAR、ACTC1和其他多种来源的MIP候选物对ETE和DTE CHO细胞系产生的正效应的总结。
图1和表2显示：
·与曲妥珠单抗高产率相关的基因包括参与蛋白质折叠、细胞存活、囊泡运输和细胞骨架重塑的基因。
·Foxa1是一种先锋转录因子，在曲妥珠单抗高产克隆中被上调，并且可能激活有利于治疗性蛋白产生的转录反应。
·B5选择诱导了脂质代谢基因的改变。
·PPAR转录因子似乎是某些B5靶向脂质基因的调节因子。
·细胞骨架的调节和形态通过肌动蛋白产生可能在细胞适应性和重组蛋白产生中起作用。
注释图1和表1：
为了确定与曲妥珠单抗高产率相关的基因，进行了转录组分析。在该分析中，选择了与CHO-M WT细胞相比，在曲妥珠单抗高产克隆中上调的基因，并与曲妥珠单抗产生的细胞多克隆进行了比较(图1C)。鉴定出与高产率相关的32个基因(候选基因，表1)。重要的是，这些基因的表达可能是曲妥珠单抗高产率的原因或结果。将进一步重点放在这样的潜在候选基因上，即这些候选基因基于它们的功能可以提高治疗性蛋白的产率(图1D)。
图2和图3提供了这些不同的MIP(Erp27、Erp57、Ca3、CDK15、Rassf9、Clstn3、Tagap和Foxa1)对曲妥珠单抗(ETE)和英夫利昔单抗(DTE)产生的效应的总结。
治疗性蛋白高产克隆中发现的MIP候选基因
候选基因的过表达可增加曲妥珠单抗产生(图2)：
图2A至图2E显示了候选MIP对曲妥珠单抗(易表达(ETE)的抗体)产生的效应。为此目的，从用于转录组分析的曲妥珠单抗多克隆群中分离出两个保持快速细胞***的曲妥珠单抗中等产生克隆。用质粒稳定转染这些克隆以表达MIP(Tagap、Rassf9、Erp27、Erp57、Erp27+Erp57、Clstn3、CDK15、Ca3和Foxa1)。在补料分批培养的不同时间，对这些稳定群中的曲妥珠单抗产生进行评估。以SRP14的过表达作为阳性对照，表达GFP的细胞或经空载体转染的细胞作为阴性对照。虽然Rassf9、Foxa1和Ca3的过表达增加了曲妥珠单抗产生，但Erp57、Clstn3和CDK15的过表达以及Erp27和Erp57的共同过表达不影响曲妥珠单抗产生。Tagap过表达对曲妥珠单抗产生有可变效应，但有时是正效应。当强过表达时，Erp27降低了曲妥珠单抗产生，当轻微过表达时，Erp27增加了曲妥珠单抗产生。根据数据库，Ca3和Rassf9是Foxa1的转录靶点。在Foxa1过表达细胞中确实存在Ca3和Rassf9的过表达。这些结果强烈表明Foxa1过表达可诱导提高曲妥珠单抗产生的基因的转录。
总之，发明人发现：
·Rassf9、Ca3和Foxa1的过表达可提高曲妥珠单抗产生。
·当强过表达时，Erp27可降低曲妥珠单抗产生，而当轻微过表达时，Erp27可增加曲妥珠单抗产生。
·Erp57、Clstn3和CDK15的过表达以及Erp27和Erp57的共同过表达对曲妥珠单抗产生无影响。
·Foxa1转录反应可能为曲妥珠单抗产生形成有利的环境。
特定候选MIP的过表达可增加英夫利昔单抗(难表达(DTE)抗体)产生(图3)：
图3A和图3B显示了候选MIP对英夫利昔单抗(难表达(DTE)抗体)产生的效应。用表达MIP的质粒稳定转染英夫利昔单抗产生克隆。在补料分批培养的不同时间，对这些稳定群中的英夫利昔单抗产生进行评估。以空载体转染的细胞作为阴性对照。尽管Erp27或Erp57的表达没有增加英夫利昔单抗产生，但Erp27和Erp57的共表达或Tagap的表达增加了英夫利昔单抗产生。在补料分批培养的第9天和第11天，过表达Tagap和Erp27+Erp57的细胞的活细胞密度较高。
总之，发现了Tagap的过表达和Erp27和Erp57的共同过表达可提高补料分批培养第6天和第9天的活细胞密度，并改进了英夫利昔单抗产生。
Erp27是一种存在于内质网中的蛋白质，其可与未折叠的蛋白质结合(Kober etal.,2013)。虽然Erp27最初被注释为蛋白质二硫键异构酶(PDI)，但其不具有任何氧化还原活性。具体地，Erp27包含PDI的非催化b和b′结构域，但其缺乏催化二硫醇-二硫化物交换所需的CXXC活性位点(Alanen et al.,2006)。然而，已知Erp27与PDI Erp57相互作用，从而触发二硫键的形成(Alanen et al.,2006)。Erp57表达的增加显著地增加了CHO细胞中血小板生成素的产率(Hwang et al.,2003)。
Erp27单独过表达或与Erp57一起过表达可增加治疗性蛋白的产生
由于Erp27在体外和体内均显示与二硫键异构酶Erp57结合(Alanen et al.,2006)，因此假设Erp27-Erp57复合物参与治疗性蛋白折叠，提供产生优势。
通过评估Erp27和Erp57过表达对曲妥珠单抗分泌水平的效应来评估这一假设。为此目的，从先前用于转录组分析的曲妥珠单抗多克隆群中分离克隆，并且选择在补料分批培养中表现出高产率(多克隆群的1.8倍)、同时保持快速细胞***率的克隆。值得注意的是，在补料分批培养的第0天或第8天，该克隆的Erp27mRNA水平与亲代CHO细胞相比，上调了3至6倍(图11a)。相反，在第0天，在CHO亲代细胞和产生Tras的克隆中，Erp57mRNA水平相似，而在第8天，观察到克隆中的Erp57mRNA水平轻微上调至1.2倍。该克隆经Erp27和/或Erp57表达载体稳定转染，或以GFP表达载体稳定转染作为对照，在多克隆群的补料分批培养过程中评估了分泌的Tras的水平。
当Erp57过表达或和Erp27共表达过表达时，在补料分批培养的第6天，活细胞密度增加，而在第10天，细胞活力降低(图17a，图17b)。总体而言，Erp57过表达细胞的Tras效价水平与对照细胞的相似(图11b)。相反，补料分批培养过程中的生长和细胞活力不受Erp27过表达的影响(图17a，图17b)。然而，Erp27过表达导致了Tras水平下降，这也在Erp57共表达时被注意到(图11b)。发明人注意到，与产生Tras的克隆相比，Erp27过表达导致了Erp27mRNA水平显著增加(图17c至图17d)，表明这种过表达水平可能导致这些蛋白活性的代谢失衡，从而确实降低Tras的表达。因此，稳定转染的细胞中Erp27表达载体的量被调低。事实上，在Erp27过表达减少的情况下，观察到了Tras水平增加14％(图11c和图17e)。总体而言，该结果表明Erp27的适度过表达增加了Tras产生。
如转录组分析所表明的，在以高水平表达难表达的干扰素β的克隆中，Erp27mRNA的表达也增加了(数据未示出)，因此进一步评定了Erp27和Erp57过表达对难表达的治疗性蛋白生产的效应。英夫利昔单抗嵌合免疫球蛋白(Infli)和依那西普Fc融合蛋白被用作另外两个难表达的治疗性蛋白的实例。与对Tras获得的结果相反，在表达英夫利昔单抗的克隆中，Infli效价不受Erp27过表达的影响，而在Erp57过表达时降低(图11d和图17F，图17g)。然而，在补料分批培养的第9天和第11天，Erp27和Erp57的共同过表达得到了英夫利昔单抗效价相对于表达GFP的对照细胞分别增加了61％和72％(图2d)。此外，在补料分批培养的第9天，Erp27和Erp57共同过表达形成了活细胞密度和细胞活力的增加(图11e和图17h)。
还评定了Erp27和Erp57共同过表达在产生依那西普克隆中的效应。分离共表达Erp27和Erp57的单个的亚克隆，并使用
细胞克隆成像设备评定Erp27和Erp57的产生。从Erp27和Erp57过表达细胞群或对照细胞群中分离显示出最宽依那西普分泌晕的细胞克隆，并在补料分批培养中评定衍生细胞克隆的依那西普产生。Erp27和Erp57过表达后，活细胞密度和细胞活力提高，并且活细胞的平台期延长，效价增加37％(图11f至图11h)。综上所述，这些结果支持Erp27的适度过表达可增加易表达的治疗性蛋白的产生，并且Erp27和Erp57联合过表达可以提高产生不同难表达治疗性蛋白的细胞的活细胞密度、细胞活力和效价。
Foxa1过表达可增加曲妥珠单抗产生并减少氧化应激
意外地，发明人发现在与曲妥珠单抗高产率相关的32个基因中，有一种称为Foxa1的先锋转录因子。Foxa1可以激活有利于治疗性蛋白产生的转录反应。Foxa1可以与抑制性异染色质结构结合，其可以独立于其他转录因子而释放基因表达(参见综述，Zaret&Carroll,2011)。Foxa1参与不同器官的发育，如肝、胰腺、肺和***(Friedman&Kaestner,2006)。因此，发明人假设Foxa1可以激活一个有利于产生治疗性蛋白(如Tras)的转录程序。
一致地，在补料分批培养的第0天和第8天，与亲代CHO细胞相比，Tras克隆中的Foxa1mRNA表达增加，分别上调1.5倍和2.1倍(图18a)。在转录组分析中，在Tras高产克隆中观察到相对于亲代CHO细胞对照的3倍上调，因此表明Foxa1表达可以进一步增加(见表2)。因此，用Foxa1表达载体稳定地转染了产生Tras的克隆。在CMV/EF1α强启动子控制下的Foxa1稳定表达导致了在抗生素介导的选择过程中细胞死亡增加(数据未显示)。然而，用一个最小的CMV启动子取代这个强启动子消除了这一不希望的效应，并且当Foxa1过表达时，最终Tras效价增加了57％(图12a)，而Foxa1mRNA在补料分批培养的第0天和第8天分别上调了40倍和14倍(图12d，图12e)。当比较Foxa1过表达细胞和对照细胞直到第6天时，补料分批培养中的细胞生长是相似的，Foxa1过表达细胞继续***到第9天，平均活细胞密度达到3100万个细胞/ml，而对照细胞在第8天达到1900万个细胞/ml的峰值(图12b)。此外，Foxa1过表达细胞的活力一直保持在90％以上直到第9天，而对照细胞活力从第7天开始下降，并在第9天低于75％(图12c)。
在产生Tras克隆中Ca3、Rassf9和Tagap在Foxa1的过表达时被上调
几项研究已经证明，可以通过延长补料分批培养中的细胞存活来提高产率(参见综述，Kim et al.,2012)。在已确定的32个基因中，Ca3和CDK15(见图2b)可促进细胞存活。Ca3可保护细胞免受氧化应激(Di Fiore et al.,2018)，而CDK15可保护细胞免受凋亡(Park et al.,2014)。因此，这些蛋白质的过表达可能会延长补料分批培养中细胞的寿命，从而提高产率。
另一个关注点是在运输囊泡中发现的两种蛋白(Rassf9和Clstn3)(Chen et al.,1998；Rindler et al.,2007)，它们可能参与治疗性蛋白分泌。
Tagap是一种信号蛋白，参与胸腺细胞粘附的丧失和胸腺细胞和T细胞的细胞骨架重组(Connelly et al.,2014；Duke-Cohan et al.,2018)。类似地，对于肌动蛋白，Tagap过表达可以改善细胞对悬浮的适应，并可以触发细胞骨架重组，从而改善分泌。值得注意的是，Tagap在B5选择的细胞中也过表达。
Foxa1是一种先锋转录因子这一事实表明，其可以直接增加曲妥珠单抗重链(HC)和轻链(LC)转基因的转录。然而，在Foxa1过表达时，没有观察到曲妥珠单抗HC和LC mRNA水平的显著变化(图18b)。为了证实Foxa1介导的曲妥珠单抗效价的提高是由CHO细胞基因的转录激活导致的，这些基因也在Tras高产克隆中上调(表2)。使用
门户网站确定潜在的Foxa1靶基因(Rouillard et al.,2016)。因此，确定在Tras高产克隆中上调的25个蛋白编码基因中，11个被预测为Foxa1靶基因，包括Foxa1基因本身(表2)。因此，发明人测试了这些基因是否在曲妥珠单抗产生克隆中在Foxa1过表达时上调，发现Ca3和Rassf9在补料分批培养的第8天在Foxa1过表达时高度上调，而其他Foxa1潜在靶基因的表达没有显著变化(图12)。此外，虽然Erp27在Foxa1过表达细胞中没有上调，但观察到Tagap候选基因的上调，还发现其在产生非常高水平治疗性蛋白的维生素B5选择细胞中上调。值得注意的是，在补料分批培养的第0天，在Foxa1过表达细胞中，Rassf9、Ca3和Tagap mRNA也有上调，表明它们的上调不是由于在Foxa1过表达细胞的第8天观察到的高细胞生长(图12e)。由于Ca3已被证明可以保护细胞免受氧化应激(参见综述，Di Fiore,Monti,Scaloni,DeSimone,&Monti,2018)，因此使用活性荧光染料羧基-H2DCFDA来评估细胞内活性氧(ROS)的水平。有趣的是，虽然在第3天，Foxa1过表达细胞的ROS水平略有上升，但在第6天、第8天和第9天，Foxa1过表达细胞的ROS水平降低(图12f)。
Ca3和Tagap过表达可增加曲妥珠单抗产生
为了验证Foxa1过表达导致的Tras效价升高是否是Ca3、Rassf9和/或Tagap上调的结果，使这三个候选基因在产生Tras的克隆中稳定过表达，并对从补料分批培养获得的Tras效价进行评定。一致地，Tagap过表达时，从产生Tras的克隆中获得了较高的Tras效价，而Ca3或Rassf9过表达没有检测到有效应(图13a)。当Tagap过表达时，在培养的第6天和第8天观察到活细胞密度增加，在第8天最大活细胞密度为3100万个细胞/ml(图13b)。然而，细胞活力从第9天开始急剧下降(图13c)。Tagap过表达时Tras产生的增加与Foxa1过表达时的水平相似，效价为1331μg/ml，尽管从Tagap过表达观察到长期补料分批培养的细胞活力较低(图12a-图12c和图13a-图13c)。Tagap过表达时，也观察到Tras的HC和LC的表达略有增加(分别为1.6和1.3)(图19a)。
有趣的是，Tagap过表达时，Ca3的表达也增加了10倍(图13d)。为了评定单独的Ca3过表达缺乏效应是否是由不利的表达水平造成的(图13a-图13c)，滴定了用于建立稳定细胞系的表达载体的量。在较高的Ca3过表达水平下，曲妥珠单抗效价略有增加，而活细胞密度和活力不受影响(图13e和图19b，以及未显示的数据)。总之，虽然Tagap过表达可以重现Foxa1介导的曲妥珠单抗效价的增加，并暂时提高活细胞密度，但Tagap过表达会在补料分批培养结束时降低细胞活力。总体而言，Foxa1对细胞活力和细胞生长以及蛋白质效价的正效应可能来自其对几个靶基因表达的效应。
Foxa1还可改进难表达治疗性蛋白的产生
进一步评定了Foxa1过表达对难表达的英夫利昔单抗分泌的效应。令人印象深刻的是，Foxa1过表达后，英夫利昔单抗的产生增加了接近一倍，平均效价达到378μg/ml，Foxa1mRNA水平增加了8.2倍(图14a，图14e)。值得注意的是，Foxa1过表达细胞显示从第6天到第9天活细胞密度显著增加，在第7天达到最大活细胞密度1220万个细胞/ml，而对照细胞仅达到860万个细胞/ml的活细胞密度(图14b)。一致地，发明人观察到，Foxa1表达细胞的细胞活力保持显著较高，防止了从第7天起观察到的对照细胞的细胞活力崩溃(图14c)。这伴随着在第7天和第8天Foxa1过表达细胞中ROS积累的减少(图14d)。与在产生Tras的克隆中Foxa1过表达后观察到的类似，Ca3、Rassf9和Tagap的mRNA水平也在Foxa1过表达后上调(图14e)。一致地，发明人在Tagap过表达后获得了45％的英夫利昔单抗产生的增加，平均效价为283μg/ml(图15a)。因此，虽然Tagap过表达可以重现Foxa1介导的Tras效价增加，但其只能部分模拟Foxa1诱导的英夫利昔单抗效价的增加。在产生Tras的克隆中观察到，Tagap过表达导致了英夫利昔单抗克隆的活细胞密度迅速增加，在第6天的最大活细胞密度为1200万个细胞/ml(图15b)。然而，与Foxa1过表达细胞相比，Tagap过表达后细胞活力基本保持不变(图15c)。值得注意的是，产生英夫利昔单抗的克隆中Tagap过表达也导致了Ca3mRNA水平的上调(图15d)。综上所述，这些结果表明Foxa1过表达可以用于增加CHO细胞中难表达和易表达的治疗性蛋白的产生水平，并且这种效应可能部分源于Foxa1介导的Tagap表达水平的提高。
B5选择中发现的候选MIP(PPAR)
图5A和图5B显示了，无论是否有PPRE报告序列，在AB和B5选择的细胞中观察到了DsRed(Discosoma sp.Red)活性的显著增加，表明DsRed的表达是独立于PPAR激活而被诱导的。这种诱导可以用B5选择的细胞比AB选择的细胞整体上适应性改进来解释。
然而，当外源加入mPPARα时，仅在PPRE报告基因控制下，B5选择的细胞中DsRed的活性才显著更高。结果表明，B5选择产生了稳定的细胞，组成性地产生了一种未知的PPAR激动剂，这可能是B5选择可以被细胞感知为饥饿应激。因此，与AB选择的细胞相比，外源性PPARα在B5选择的细胞中更为活化。
总结：
·在B5饥饿选择过程中积累了未识别的PPAR激动剂。
·与抗生素选择的细胞相比，B5选择的细胞中更好的适应性导致了总体上更好的基因表达。
·在B5选择的细胞中，外源PPARα活化更高，导致了与抗生素选择的细胞相比，PPAR靶基因的表达更高。
图6A和图6B显示了苯扎贝特(2-[4-[2-(4-氯苯甲酰)乙基]苯氧基]-2-甲基丙酸)的活性。据报道，苯扎贝特是一种通用的PPAR泛激动剂(Wilson et al.,2000；Inoue etal.,2002)。
苯扎贝特已经作为抗高血脂症的药物在临床上使用。在补料分批3天后，在ETE上加入苯扎贝特可诱导RNA-Seq筛选中发现的PPAR靶基因HmgCs2和Acot1，以及已知的PPAR靶基因DBl1、Ascl1(Rakhshandehroo et al.,2010)和RXR核受体(图6A)。Cyp4a14在加入苯扎贝特时没有被诱导，这可能意味着通过其他激动剂或PPAR的其他控制机制可能被用于控制该基因的表达。有趣的是，B5靶基因Slc22a14被苯扎贝特激活。Slc22a14基因已经被表明与小鼠雄性能育性有关(Maruyama,2016)，但尚未有与PPAR反应相关的功能被描述。
在补料分批的第3天加入苯扎贝特显著提高了在补料分批培养过程中受到饥饿应激时的细胞存活率(数据未显示)，但在正常的补料分批培养条件下没有观察到IgG产生的提高(参见M&M以了解补料分批培养)。补料分批培养的第3天对应于细胞***的指数期。在补料分批培养过程中(第1天)较早地添加苯扎贝特，显示了在补料分批培养结束时有利于重组蛋白(图6B)。
苯扎贝特还在DTE细胞中被测试。然而，虽然诱导了相同的靶基因，但细胞产生和细胞适应性未改进。因此，通过苯扎贝特的PPAR激活和靶基因诱导似乎不足以克服细胞合成难表达蛋白质的瓶颈。
由于苯扎贝特可以在高浓度下改变细胞***和细胞代谢，这是因为它对所有PPAR的激活都有强的广泛效应，所以在ETE和DTE细胞中增加苯扎贝特对细胞***、细胞活力和重组蛋白产生都未显示任何有利效应(数据未显示)。
综上所述，已发现(见图6)：
·通过B5选择确定的PPAR靶点可以在CHO细胞中化学诱导。
·强调为B5靶点的Slc22a14转运体，被表明是一个新的PPAR靶点。
·这种诱导可导致ETE细胞中更好的IgG产生。
·表达DTE蛋白的重组细胞不受苯扎贝特诱导的影响。
在无应激完全培养基中培养时，与野生型细胞和空载体细胞相比，PPARα过表达细胞(例如，PPARα_OE)在PPAR靶基因表达和IgG产生方面未表现出任何差异。然而，当加入苯扎贝特时，存在于PPARα_OE中的外源PPARα被激活，并随后诱导PPAR靶基因和RXR核因子以及IgG轻链和重链的转录(图7A)。该增加导致了PPARα_OE细胞中更高的IgG产率(图7B)。
综上所述，已发现(图7A和图7B)：
·外源PPAR的激活可以产生具有改进的细胞适应性的DTE细胞，从而改进了DTE治疗性蛋白产生。
综上所述，已发现(图8A-图8D)：
·在B5选择的细胞中乳酸降低。
·PPAR过表达可导致CHO细胞中乳酸含量降低。
B5选择中发现的候选MIP(肌动蛋白)
图9已表明，肌动蛋白基因的过表达生成了治疗性蛋白产生改进的ETE细胞。用转座ACTC1表达载体对Fc融合表达克隆进行再转染。然后，每隔3天或4天通过分批条件下其传代培养来评估所得细胞池的单位产率。结果表现为PCD相对于FC融合对照细胞PCD值的倍数变化。结果表明在悬浮CHO细胞中的肌动蛋白过表达可以通过调节细胞骨架的组织和聚合来改进治疗性蛋白产生和分泌。
在进一步的实验中，将用编码“易表达”(ETE)曲妥珠单抗或“难表达”(DTE)英夫利昔单抗或依那西普
治疗性蛋白的表达载体和维生素B5转运体SLC5A6或抗生素抗性基因共转染的CHO细胞作为对照。然后根据细胞在B5缺陷培养基中存活的能力或抗生素抗性分别选择细胞，并通过RNA测序确定差异性表达的细胞基因。抗生素选择后，ACTC1和TAGAP的表达均低于未转染细胞，而B5选择后，ACTC1和TAGAP的表达增加(图20a和图20b)。在SLC5A6表达和维生素B5饥饿后TAGAP的表达增加是通过使用抗生素或B5选择分离的四种独立的表达曲妥珠单抗的CHO细胞系验证(图20c)。
B5选择后的基因诱导可能是由于之前研究(Pourcel et al.,2019)发现的选择过程中发生的B5饥饿引起的，也可能是由于SLC5A6本身的过表达引起的，因为其介导了细胞摄入更高的维生素B5(图20d)，或者是由这两种效应的结合引起的。B5是乙酰辅酶A的重要辅助因子，乙酰辅酶A是中枢代谢和能量代谢的关键元件，可能与细胞骨架调节有关。为了区分这些可能性，过表达SLC5A6转运体的细胞系在没有任何B5缺陷的情况下产生，这表明SLC5A6的表达增加足以显著上调ACTC1基因，而TAGAP的表达没有显著增加(图20e)。因此，B5选择过程可以通过SLC5A6过表达介导的B5胞内导入增加来激活ACTC1基因表达，而TAGAP表达的显著增加则需要SLC5A6过表达和B5饥饿的结合。还观察到TAGAP过表达增加了ACTC1mRNA和蛋白质积累(图21)，这表明B5选择过程导致的ACTC1表达增加可能是TAGAP上调的部分原因。
在表达几种DTE蛋白(如依那西普
Fc融合蛋白或贝伐单抗或英夫利昔单抗IgG1)的抗生素选择细胞克隆以及表达ETE曲妥珠单抗免疫球蛋白的克隆上，评定了ACTC1过表达对重组蛋白表达的效应。用ACTC1编码序列与另一个抗生素选择基因一起再次转染这些细胞克隆，然后选择过表达ACTC1的抗生素抗性细胞(图22a-图22c)。3-4天后，在分批培养条件下评估所得细胞池的单位产率，表明ACTC1的高水平表达对CHO细胞产生DTE蛋白有正效应(图23a-图23c)。对产生英夫利昔单抗的ACTC1过表达细胞池的进一步分析表明，在补料分批培养10天后，IgG效价显著增加(图23d)。
随后对ACTC1过表达克隆个体进行了分析。为此，用ACTC1或空表达载体再次转染产生曲妥珠单抗的克隆，并使用
设备挑选单个的克隆。用空载体转染的8个克隆和24个ACTC1表达克隆来验证ACTC1转录表达，在其中随机选择4个对照克隆和4个ACTC1高表达克隆进行进一步分析(图24a)。通过免疫印迹验证了ACTC1蛋白过表达(图25a和图24b)。在4个ACTC1过表达克隆中，与空载体克隆相比，3个ACTC1过表达克隆在补料分批培养13天后显示出最高的IgG效价(图25b和图24c)。
为了确定ACTC1过表达引起的治疗性蛋白分泌增加是否可能是由细胞代谢改变导致的，发明人通过对ACTC1过表达细胞池的质谱分析来测量主要代谢标记。值得注意的是，发明人评定了乳酸的积累，乳酸是糖酵解早期的有毒副产品，已被记录为治疗性蛋白质产生的瓶颈(Lao&Toth,1997)。这表明与对照细胞相比，ACTC1过表达细胞在分批培养3天后乳酸积累明显减少(图2e)。总体而言，发明人因此得出结论，ACTC1基因过表达显著改进了多种治疗性蛋白的分泌，并且这种效应可能与减少有毒的乳酸代谢副产物的积累有关。
肌动蛋白聚合水平在重组蛋白分泌中的意义
发明人随后评定了ACTC1过表达是否会影响肌动蛋白的聚合状态。为此，发明人依靠SiR-actin染色，其与F-肌动蛋白特异性结合(
et al.,2014)，产生与肌动蛋白聚合成正比的染色细胞的荧光水平。比较ACTC1和曲妥珠单抗表达克隆相对于对照克隆的SiR-actin染色显示对照克隆比ACTC1过表达克隆有更高的荧光，表明ACTC1过表达显著降低了肌动蛋白聚合水平(图26a、图26b和图27)。
为了进一步评估肌动蛋白聚合是否会影响重组蛋白的表达，将两个表达曲妥珠单抗蛋白但未经ACTC1载体转染的独立CHO细胞多克隆群用SiR-actin染色。然后根据它们的低、中或高荧光水平(图28a和图29)将染色的细胞分成三个独立的细胞批次，以对每个的荧光水平获得6个细胞池。然后评估显示出低、中、高水平聚合肌动蛋白的细胞的IgG分泌水平和IgG单位产率(图28b，图28c)。高SiR-actin染色细胞显示出比低SiR-actin染色细胞显著更低的IgG表达水平，从而支持这样的结论：即使没有ACTC1过表达，肌动蛋白聚合水平较低的细胞也能介导更高的重组蛋白分泌。
单独或联合表达MIP对不同治疗性蛋白表达CHO克隆的分泌的效应
注释图10：
用多个单独的或组合的转座CFLAR--表达载体、GCLM--表达载体、ACTC1-表达载体再转染贝伐单抗表达克隆(图10A)、Fc融合表达克隆(图10B)和Fab酶融合表达克隆(图10C)。然后，通过每3天或4天的分批传代培养评估所得到的细胞池的单位产率。结果表示为其各自的贝伐单抗对照细胞或FC融合对照细胞的PCD值(pg-1.细胞-1.天-1)的百分比(％)。
总结图10：
在转染表达载体MIP(如CFLAR--表达载体、GCLM--表达载体、ACTC1-表达载体)后，CHO细胞分泌的治疗性蛋白有增加。
表1：通过转录组分析(第四列和第五列)和文献筛选(第六列)确定候选基因。第三列描述了候选基因的功能分类。
表2.与亲代CHO细胞和Tras多克隆细胞(PC)相比，Tras高产克隆(HPC)中上调的基因。
1根据以下标准选择与亲代CHO细胞和Tras多克隆细胞相比Tras高产细胞克隆中上调的基因:log2倍变化>0.5并且p值<0.05。
2根据ChIP-seq数据库(ENCODE转录因子靶基因数据库)和使用Harmonizome门户网站获得的低或高通量转录因子功能研究(TRANSFAC组织的转录因子靶基因数据库)(Rouillard et al.,2016)，被列为Foxa1靶基因的基因。
表3:编码选择的测试的和可能的MIP的序列
表4.用于图16-19的RT-qPCR分析的引物的列表
| 基因 | 正向引物(FP) | SEQ ID NO(FP) | 反向引物(RP) | SEQ ID NO(RP) |
| Erp27 | TGCAGCTGGCTTATTTAACACC | 120 | CCTGGAAGAGCTTAGCTGCC | 137 |
| Erp57 | TGGAACTCACGGACGAAAACT | 121 | AGGGGCGAAGAACTCGACTA | 138 |
| SDHA | TGGCGTGGATGTCACTAAGG | 122 | CAGCACCTGCCCTTTGTAGT | 139 |
| Foxa1 | AAAGGGGACCCCCACTACTC | 123 | TGCCTTGAAGTCCAGCTTGT | 140 |
| Ca3 | GGAATCGCTGTTGTTGGCAT | 124 | GAGCCTCCTTGCCCTTAGTC | 141 |
| Rassf9 | TGGCACAGCTAGAAGAACGG | 125 | TCTTCACTTCCGTCGATGCC | 142 |
| Epcam | TGTTTGGTGATGAAGGCGGA | 126 | TCGTTGTTCTGTATGGCCCC | 143 |
| Pcdhb3 | CTGGGTCTAGGCGCTATTCTG | 127 | CTACCCTGAGCCCCAAATCC | 144 |
| Slc25a23 | TCCGAGATTCAGCAGAGCTTC | 128 | CGCCATTCCTGCCAATCAATG | 145 |
| Pde1a | TGGGTGTTTCTTGGGGTAGG | 129 | ACCCACCAAGAGTCACGTTG | 146 |
| Edn1 | AGAAGGTTGGAGGCCATCAC | 130 | TGCTCGGTTGTGTGTCAACT | 147 |
| Fras1 | CACACCCACCTGGAAAGTCA | 131 | GTTAGGCCATCTTCCCGAGC | 148 |
| Frk | GCCCAGTCCCCTCTTGATTT | 132 | GCAGAGCTGAGAGAGTTCCC | 149 |
| Arhgap42 | CAGTTCAACTTGCAGAATACAAGG | 133 | TGGCTGGGTGGTCTGTAATC | 150 |
| Tagap | GCCCACCATCCTACGAAGAG | 134 | GAGCCGTGTTCCATTTGAGC | 151 |
| TrasHC | GACTCCGATGGGTCGTTCTT | 735 | CATGACGGAGCAGGAGAACA | 152 |
| Tras Lc | GCGGACTACGAGAAGCACAA | 136 | CGGTTGAACGACTTGGTCAC | 153 |
材料与方法
MIP候选的选择和发现
候选基因序列和DNA载体构建体
使用NCBI BLAST软件对小鼠中的同源基因进行比对，确定RNAseq MIP候选基因的基因组序列和cDNA序列。使用SELEXIS CHO-M基因表达数据库确定相应基因的转录序列和积累。
CHO-M(Sure CHO-M Cell LineTM(SELEXIS Inc.,San Francisco,USA))，用GoScript反转录***(Promega)从106个CHO-M细胞(NuclePoSpinTMRNA试剂盒；Macherey-Nagel)中提取1μg总RNA，通过反转录方法扩增cDNA文库。
通过切除绿色荧光蛋白(GFP)基因并用MIP CDS替换它，将MIP编码序列(CDS)克隆到pBSK_ITR_BT+_EGFP_X29_ITR载体(SELEXIS Inc.，San Francisco，USA)中。
载体的构建如下:通过PCR(Phusion高保真DNA聚合酶；Finnzymes，THERMO FISHERSCIENTIFIC)从CHO-M cDNA文库中扩增出CDS，从ATG到终止子使用带有限制性位点的引物。然后，通过相应的限制性内切酶对cDNA产物和pBSK_ITR_BT+_EGFP_X29_ITR载体进行双消化。最后，将cDNA连接到pBSK_ITR_BT载体上，GFP序列在用相同的限制性内切酶消化后被切除。
pBSK_ITR_BT+_EGFP_X29_ITR载体包括由CMV/EF1α启动子和BGH多腺苷酸化信号以及接着的hMAR X29组成的表达盒。所述表达盒的两侧是piggyBac转座子的末端反向序列。
使用真核表达盒表达了GFP蛋白，所述真核表达盒由编码序列上游的人巨细胞病毒(CMV)增强子和人甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，接着猿猴病毒40(SV40)多腺苷酸化信号、人胃泌素终止子和SV40增强子组成(Le Fourn et al.,2013)。pSG5_PPARα载体来自Issemann and Green，1990。
杀稻瘟菌素(BLASTICIDIN)载体(pBlast)含有由来自pRc/RSV质粒(INVITROGEN/LIFE TECHNOLOGIES)的SV40启动子控制的杀稻瘟菌素抗性基因。
RNASeq分析
用于RNASeq分析的细胞如下：
-CHO-M WT细胞
-用嘌呤霉素和B5或仅用嘌呤霉素选择的表达依那西普(ENBREL)Fc融合蛋白(难表达)的多克隆细胞群。
-用嘌呤霉素和B5或仅用嘌呤霉素选择的表达曲妥珠单抗IgG(易表达)的多克隆细胞群。
-用嘌呤霉素选择的表达曲妥珠单抗IgG(易表达)的克隆。
-用嘌呤霉素选择的表达贝伐单抗IgG(易表达)的克隆。
-用嘌呤霉素选择的表达干扰素β(难表达)的克隆。
这些细胞在不经抗生素选择的情况下在旋转管中培养4天。使用NucleoSpin RNA试剂盒(Macherey-Nagel)从细胞中分离总RNA。使用片段分析仪(Advanced Analytical)评估RNA质量。使用Illumina
链式mRNA-seq试剂(Illumina)将0.5μg至1μg的总RNA转换为cDNA完成RNA-seq文库的制备。RNA-seq文库100nt的配对末端在Illumina HiSeq
上测序。将读数映射到CHO-K1转录组(RefSeq,2014)。
细胞培养、稳定转化及稳定多克隆系分析
悬浮中国仓鼠卵巢细胞(CHO-M)在补充了L-谷氨酰胺(PAA，Austria)和HT添加剂(GIBCO，INVITROGEN LIFE SCIENCES)的SFM4CHO Hyclone无血清培养基(SFM，THERMOSCIENTIFIC)中，于37℃、5％CO2的潮湿空气中保持悬浮培养。用于这些实验的其他细胞培养基是缺陷BalanCD Cho-M Growth A(B-CDmin；Irvine Scientific)，补充了维生素B1(盐酸硫胺素；SIGMA ALDRICH)、维生素B5(DL-泛酸钙；TCI)和维生素H(生物素，SIGMAALDRICH)。
根据制造商的建议(NEONDEVICES，INVITROGEN)通过电穿孔用pBSK-MIP、pBlast和pCS2-U5-PBU3IgG1-Hc或IgG1-Lc表达载体转染CHO-M细胞。在补加了7.5μg/ml杀稻瘟菌素的SFM4CHO培养基中培养3周以实现稳定细胞系的生产。
选择表达GFP或IgG的GFP和IgG1产生细胞多克隆系用于如下的进一步实验：用于杀稻瘟菌素选择，将细胞接种在补充了10mg/ml杀稻瘟菌素的SFM培养基中2周，然后转移到SFM培养基的孔中5天，随后加入有SFM培养基的50ml旋转管中。
为了先用嘌呤霉素、再用B5对细胞进行双重选择，先用嘌呤霉素选择出多克隆稳定细胞系，然后以20000细胞/ml接种于B5选择培养基中7天(使用B-CD全培养基作为阴性对照)，然后转移到SFM全培养基孔中7天，然后再接种到具有SFM培养基的针型管(pin tube)中。
采用CyAn ADP流式细胞仪(Beckman Coulter)进行流式细胞术分析，确定荧光细胞百分比和GFP阳性细胞的荧光强度。用夹心ELISA测量细胞培养上清液中的免疫球蛋白浓度。用RT-定量PCR检测确认GFP、IgG1Lc、IgG1Hc和MIP转录物积累，然后进行分析。
采用流式细胞仪(Beckman CoulterTM)进行FACS分析评定表面IgG显示。通过在FACS Aria III(BD)上进行细胞分选以获得表达IgG的稳定克隆、扩增该克隆并分析IgG产生水平(夹心ELISA)。
用瞬时测定对过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件(PPRE)和PPAR激活进行测量
瞬时转染测定按如下进行：在没有或有pSG5_PPARα载体的情况下，用PPRE-TK-DsRed(由Michalik lab.,University of Lausanne提供)或TK-DsRed(从原载体剪下的PPRE序列)分别转染CHO细胞。以pE-BFP2-Nuc(2xNLS)用作内转染对照。其含有受最小CMV启动子控制的eBFP2(增强型蓝色荧光蛋白2)编码序列和核定位序列NLS。转染48小时后用Beckman Coulter Gallios cell
通过流式细胞术观察细胞，并通过Kaluza
软件分析信号。DsRed活性(检测波长：638nm)相对于BFP2标记(检测波长：488nm)标准化。
补料分批性能评估
根据具有如下改变的Le Fourn等(2013)进行补料分批培养的生长和IgG分泌性能：将稳定转染用于表达MIP的IgG产生克隆以300000细胞/ml接种于50mL falcon中的5mL培养基。分别于3天、6天、8天、9天、10天和13天后检测活细胞密度和IgG效价(g/L)。
定量PCR分析
从106个细胞中提取总RNA，并用GoScript反转录***(Promega)反转录成cDNA以进行定量PCR(qPCR)分析。使用
480SYBR Green I Master和LightCycler480II仪器(Roche)通过qPCR对转录物积累进行定量。转录水平相对于SDHA管家基因的水平进行归一化。
代谢物分析(代谢物提取、样本量归一化)
代谢物提取
为了进行代谢物定量，用1000μL预冷的MeOH:H2O(4:1，体积/体积)溶剂混合物提取细胞颗粒，作为有效地沉淀蛋白质、抑制代谢和提取宽范围极性代谢物的最佳折衷方案。然后，对样品进行探针式超声(4次脉冲×5秒)以完全裂解细胞并改进代谢物提取。为了促进蛋白质沉淀，将样品于-20℃孵育1小时，然后于4℃以13000rpm离心15分钟。收集所得上清液并在真空浓缩器(LABCONCO,Missouri,US)中蒸发至干燥。然后，将样品提取液在100μLMeOH:H2O(4:1)中复溶并注入LC-MS***。
蛋白质定量
将蛋白质颗粒蒸发并用短探针超声(5次脉冲×5秒)在20mM Tris-HCl(pH 7.5)、4M盐酸胍、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1％Triton、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸盐、1mM Na3CO4和1μg/ml亮肽素中裂解。用BCA蛋白分析试剂盒(THERMO SCIENTIFIC,Masschusetts,US)测量(A562nm)总蛋白浓度(HIDEX,Turku,Finland)。
数据采集-LC-HRMS
提取的样品通过亲水相互作用液相色谱偶联高分辨率质谱(HILIC-HRMS)在负电离模式下的进行分析，使用Q-
仪器(四级杆
质谱仪)(THERMO FISHERSCIENTIFIC)在70000半最大值全宽(FWHM)的质量分辨率下运行。采用ZIC pHILIC柱(100mm，2.1mm I.D.以及5μm粒径)对代谢物进行色谱分离。流动相由A＝20mM醋酸铵和20mMNH4OH溶于水，pH 9.3和B＝100％CAN组成。从90％B(0分钟-1.5分钟)到50％B(1.5分钟-8分钟)进行线性梯度洗脱，随后进行等度步骤(8分钟-11分钟)和线性梯度降至45％B(11分钟-12分钟)。在这些条件下保持3分钟。最后，建立初始色谱条件，作为9分钟的后运行用于柱再平衡。流速为300μL/分钟，柱温为30℃，进样量为2.5μl。ESI源条件设置如下：探针加热器温度200℃，鞘气60a.u.，辅助气体15a.u.，毛细管温度280℃以及ESI喷雾电压-3600V。使用全扫描模式作为采集模式来定量乳酸、丙酮酸盐、3-羟基丁酸盐和泛酸，而采用平行的反应监测采集模式来定量乙酰辅酶A，使用30eV作为碰撞能量。
数据处理
使用Thermo Fisher Scientific软件(Xcalibur 4.0
THERMOFISHER SCIENTIFIC)处理原始LC-HRMS数据。采用外部校准曲线进行代谢物定量。
统计分析
结果用平均值±平均值的标准误差(SEM)或平均值±标准差(SD)表示。统计分析采用单尾或双尾学生t检验进行。子图中的星号指的是统计概率。小于0.05的统计概率值被认为是显著的。
材料和方法：
评估MIP的单独或联合表达对不同治疗性蛋白表达CHO克隆分泌的效应
CFLAR、GCLM、ACTC1:
DNA载体构建
PB转座酶表达载体pCS2+U5V5PBU3含有由非洲爪蟾β-珠蛋白基因5'和3'非翻译末端区(UTR)包围的PB转座酶编码序列。该质粒按如下进行构建：将来自pBSSK/SB10的3'UTR317bp片段(由Dr S.Ivies善意提供)***到pCS2+U5(INVITROGEN/LIFE Technologies,Paisley,UK)中以得到pCS2+U5U3。PB转座酶编码序列(2067bp，GenBank登录号：EF587698)由ATG:biosynthetic(Merzhausen，Germany)合成，并克隆到两个UTR之间的pCS2+U5U3主链上。PB对照载体对应于未修饰的pCS2+U5质粒(图10，左子图)。通过将由ATG:biosynthetic(Merzhausen，Germany)合成的PB 235bp 3'和310bp 5'末端反向重复序列(ITR)引入pBluescript SK-质粒(pBSK ITR3'-ITR5'，图1，右子图)产生不同的转座子载体。然后，在来自pRc/RSV质粒(INVITROGEN/LIFE Technologies)的SV40启动子的控制下，将嘌呤霉素抗性基因(PuroR)***到两个ITR之间。本研究中使用的MAR1-68和MARX-29元件、嘌呤霉素抗性因和GFP基因如前所述。
CHO细胞系的细胞培养、稳定转染及亚克隆
悬浮中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)保持在补充了L-谷氨酰胺(PAA，Austria)和HT添加剂(GIBCO，INVITROGEN life sciences)的SFM4CHO Hyclone无血清培养基(THERMOSCIENTIFIC)、37℃、5％CO2的潮湿空气中。根据制造商的建议(Neon devices,Invitrogen)，通过电穿孔用携带嘌呤霉素抗性基因的重组目的蛋白表达载体电转染CHO-K1细胞。2两天后，将细胞转移到含10μg/ml嘌呤霉素的T75板中，并且细胞在选择条件下继续培养2周。通过有限稀释法产生表达贝伐单抗IgG、Fc融合或循环激素的稳定单细胞克隆，扩增该克隆并对其生长表现和产生水平进行分析。选择表达最高蛋白水平的贝伐单抗IgG-、Fc融合-产生细胞克隆，用于进行进一步的生化实验。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析循环激素表达CHOM克隆。
然后，通过如下所述的电穿孔用多种代谢改进蛋白(MIP)表达载体和携带杀稻瘟菌素抗性基因的质粒共转染这些克隆中的一些。然后，将如上所述细胞在含有10μg/ml杀稻瘟菌素的培养基中培养两周。通过有限稀释法分离出稳定克隆，并用Clonepix设备分离克隆，然后进行生长和产生分析。
细胞培养和转染分析
将CHO-M细胞在补充了L-谷氨酰胺(PAA，Austria)和HT添加剂(GIBCO，INVITROGENlife sciences)的SFM4CHO Hyclone无血清培养基(THERMO SCIENTIFIC)中，于37℃、5％CO2的潮湿空气中保持悬浮培养。根据根据制造商的建议(Neon devices，INVITROGEN)通过电穿孔将转座子供体质粒转移到这些细胞中。如前所述，从分批培养物中进行重组蛋白分泌水平的定量(参见Le Fourn et al.,2013)。简而言之，将分批培养中表达免疫球蛋白的细胞群在50ml微型生物反应器试管(TPP,Switzerland)中，于37℃、5％CO2加湿培养箱中培养7天以进行评估。用夹心ELISA法测量细胞培养上清液中的免疫球蛋白浓度。
或者，使用
设备从表达三个IgG中的每一个的未分选和未选择的群中分离出两个克隆。简而言之，用半固体培养基固定单个的细胞，并在包埋后10天挑选分泌大量IgG的克隆。这些细胞系在旋转管式生物反应器中以3×105细胞/ml的密度在含蛋白胨的生长培养基(Hyclone SFM4CHO添加8mM谷氨酰胺)中每3天至4天传代一次，该培养基在保持37℃和5％CO2的加湿培养箱中，以180rpm回旋式振荡。
当评定多克隆细胞群时，从以1×105细胞/ml的细胞密度接种并在50ml旋转管式生物反应器中的5ml完全培养基中培养6天后的细胞中测定IgG效价。或者，将克隆群的摇瓶培养物以3×105细胞/ml的密度接种到SFM4CHO培养基中以开始补料分批产生过程。在保持37℃和5％CO2的0rpm摇动的加湿培养箱中(25ml摇瓶和旋转管)，用125ml摇瓶中的25ml培养体积或50ml TPP培养管中的5ml培养体积进行补料分批产生测定。在第0天、第3天和第6天至第8天，分别饲喂初始培养体积16％的化学成分确定的浓缩饲料(HYCLONE，Cell Boost5，52g/l)，将所述产生进行10天。培养过程中不添加谷氨酰胺和葡萄糖。每天使用
机器(MILLIPORE)测量培养物的活力和活细胞密度(VCD)。用双夹心ELISA测定对分泌到培养基中的MAb浓度进行确定。
分批培养和补料分批培养
表达贝伐单抗IgG、Fc融合和循环激素的单个的克隆的生长和产生性能在50ml微型生物反应器试管(TPP,Switzerland)中于37℃、5％CO2的加湿培养箱中分批培养7天进行评估。在细胞培养的第3天、第4天和第7天，用Guava
流式细胞仪***(MILLPOLE)确定细胞密度和细胞活力。用夹心ELISA法测量细胞培养上清液中的IgG效价。在指定的处理时间采样日绘制细胞密度(Cv.ml 1)和IgG效价值(pg.ml)。
用从第3天至第7天(产生期)计算的MIP浓度对活细胞积分数(IVCD)的斜率来测定重组蛋白表达克隆的单位IgG产率，表示为pg/细胞/天(pcd)。在补料分批产生培养物中，细胞以0.3×106细胞/ml接种到125ml摇瓶中的25ml SFM4CHO Hyclone无血清培养基中。将培养物保持在37℃和5％CO2的条件下搅拌。每天用商用Hyclone饲料(THERMO SCIENTIFIC)饲养培养物。每天评估细胞密度和IgG产生。
Erp27和Erp57：
DNA载体构建
为了获得候选基因编码序列(CDS)，用NucleoSpinTM RNA试剂盒(MACHEREY-NAGEL)从CHO-M细胞(SURE CHO-M Cell LineTM,Selexis SA,Switzerland)中分离总RNA。使用GoScript反转录***(Promega)进行反转录。将候选基因CDS***到pBSK_ITR_BT+_X29_ITR(pBSK_ITR)或pBSK_ITR_Blast载体中。pBSK_ITR载体包括由CMV/EF1α启动子和BGH多腺苷酸化信号以及接着的hMAR X-29组成的表达盒(Le Fourn,Girod,Buceta,Regamey,&Mermod,2014)。所述表达盒的两侧是piggyBac转座子的末端反向序列。在pBSK_ITR_Blast载体中，在hMAR X-29之后***了由SV40启动子控制的杀稻瘟菌素抗性基因。在Erp27和Erp57在表达难表达蛋白的细胞中过表达实验中或者在滴定Erp27或Ca3过表达时，使用pBSK_ITR质粒，并且用携带在SV40启动子的控制下的杀稻瘟菌素抗性基因的质粒共转染细胞。在其他实验中，使用了pBSK_ITR_Blast载体。在Foxa1过表达的实验中，用最小的CMV启动子取代CMV/EF1α启动子，用于Foxa1和GFP二者的表达。piggyBac转座酶表达载体(pCS2+U5V5PBU3)之前已有描述(Ley et al.,2013)。
活性氧类物质的分析
用6-羧基-2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(羧基-H2DCFDA,THERMOFISHERSCIENTIFIC)检测细胞内活性氧(ROS)水平。在补料分批培养的不同天数，将200万个细胞在含50μM羧基-H2DCFDA的PBS中孵育30分钟。然后将细胞离心，重悬于1ml PBS中，并用DAPI染色以排除死亡细胞。通过流式细胞术分析DAPI阴性细胞群中的羧基-H2DCFDA荧光(
BECKMAN COULTER)。
细胞培养、稳定转化以及稳定多克隆系分析
将细胞在补充了5％HyClone Cell Boost 5添加剂(GE HEALTHCARE)、8mM L-谷氨酰胺(PAA,Austria)和1×HT添加剂(GIBCO)的SFM4CHO Hyclone无血清培养基(GEHealthcare)中，于37℃、5％CO2的加湿培养箱中保持悬浮培养。产生曲妥珠单抗或英夫利昔单抗抗体的多克隆CHO-M细胞如前所述产生并进行表征(Le Fourn et al.,2014)。通过在FACS Aria II(BD)上进行细胞分选以获得表达IgG的稳定克隆、扩增该克隆并用夹心ELISA分析IgG产生水平。按照制造商的操作规程(
转染***100uL试剂盒,INVITROGEN)，通过电穿孔用pBSK_ITR_CDS、pBlast和pCS2+U5V5PBU3或者用pBSK_ITR_Blast_CDS和pCS2+U5V5PBU3再次转染产生曲妥珠单抗或英夫利昔单抗的克隆，以获得过表达候选基因的稳定细胞系。用3μg/ml或7.5μg/ml的杀稻瘟菌素(INVIVOGEN)选择具有稳定***的细胞。对于产生依那西普的克隆，分离共表达Erp27和Erp57的单个的亚克隆，并用ClonePix细胞克隆成像设备评定Erp27和Erp57产生。从Erp27和Erp57过表达或对照细胞群中分离出显示最宽依那西普分泌晕的细胞克隆。
ACTC1和TAGAP：
DNA载体构建
用NCBI BLAST软件与小鼠中的同源基因比对后，确定ACTC1和TAGAP基因的基因组序列和cDNA序列。对Selexis SA CHO K1细胞(CHO-M)进行转录序列RNAseq分析。cDNA文库用
反转录***(PROMEGA)通过从106个CHO-M细胞(NucleoSpinTMRNA试剂盒；MACHEREY-NAGEL)中分离的1μg总RNA反转录产生。将ACTC1和TAGAP编码序列(CDS)克隆到pBSK_ITR_BT+_EGFP_X29_ITR转座表达载体(Le Fourn,Girod,Buceta,Regamey,&Mermod,2014)中，得到pBSK-ACTC1和pBSK-TAGAP表达载体。pBSK_ITR_BT+_EGFP_X29_ITR载体包括由CMV/EF1α启动子和BGH多腺苷酸化信号以及接着hMAR X-29组成的表达盒(Le Fourn,Girod,Buceta,Regamey,&Mermod,2014)。所述表达盒的两侧是piggyBac转座子的末端反向序列。杀稻瘟菌素载体(pBlast)含有由来自pRc/RSV质粒(Invitrogen/LifeTechnologies)的SV40启动子控制的杀稻瘟菌素抗性基因。
细胞培养与稳定转染
将CHO K1细胞在补充了L-谷氨酰胺(PAA，Austria)和HT添加剂(GIBCO，INVITROGEN LIFE SCIENCES)的SFM4CHO
无血清培养基(SFM,ThermoScientificTM)中，于37℃、5％CO2的潮湿空气中保持悬浮培养。用于这些实验的其他细胞培养基是缺陷BalanCD Cho-M Growth A(B-
IRVINE SCIENTIFIC)，补充了维生素B1(盐酸硫胺素；SIGMA ALDRICH)、维生素B5(DL-泛酸钙；TCI)和维生素H(生物素，SIGMA ALDRICH)。根据制造商的建议(NEONDEVICES，INVITROGEN)通过电穿孔用pBSK-ACTC1或TAGAP、pBlast和pCS2-U5-PBU3IgG1-Hc或IgG1-Lc表达载体转染CHO-M细胞。在补加了7.5μg/ml杀稻瘟菌素的SFM4CHO培养基中培养3周以实现稳定细胞系的产生。选择表达IgG的多克隆细胞群进行如下的进一步实验：用于杀稻瘟菌素选择，将细胞接种在补充了10mg/ml杀稻瘟菌素的SFM4CHO培养基中2周，然后转移到含有未补充培养基的孔中5天，随后转移到50ml旋转管中。
稳定的多克隆细胞系和单克隆细胞系的分析
如以前所述(Pourcel et al.,2019)，进行了补料分批性能评估、IgG细胞表面染色、IgG细胞分泌测定和维生素B5代谢物定量。简而言之，补料分批培养中的IgG分泌性能与之前报道的相同(Le Fourn et al.,2014)。细胞表面IgG的测定与之前报道的相同(Brezinsky et al.,2003)，并且使用Molecular
的ClonePixTMFL Imager对表达重组IgG的细胞池进行亚克隆。为了定量维生素B5代谢物，用1mL冷MeOH:H2O(4:1，体积/体积)溶剂混合物提取细胞颗粒，然后进行探针式超声。在-20℃孵育1小时后获取上清液，随后于4℃、13000rpm离心15分钟，收集并蒸发至干燥，然后用100μL MeOH:H2O(4:1)复溶并注入LC-MS***。将蛋白颗粒蒸发并用短探针超声在20mM Tris-HCl(pH 7.5)、4M盐酸胍、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1％Triton、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸钠、1mMNa3VO4和1μg/ml亮肽素中裂解。提取的样品通过HILIC-HRMS在负电离模式下的进行分析，使用Q-
仪器(Thermo Fisher
)在70000半最大值全宽的质量分辨率下运行。使用Thermo Fisher
软件(Xcalibur 4.0
THERMOFISHER SCIENTIFIC)处理原始LC-HRMS数据。采用外部校准曲线进行代谢物定量。
RNA RT-PCR及测序RNA-seq分析
为了进行RNA反转录和实时定量PCR(RT-qPCR)分析，从106个细胞提取总RNA，并用polyT引物反转录成cDNA。使用EUROGENTEC Inc.的SYBR Green-Taq聚合酶试剂盒和ABIPrism 7700PCR仪(APPLIED BIOSYSTEMS)，通过qPCR对转录物积累进行定量。将转录水平相对于GAPDH管家基因的转录水平进行归一化。B5和嘌呤霉素选择的CHO细胞的RNASeq分析如以前所述(Pourcel et al.,2019)。
简而言之，总RNA提取自：i)亲代CHO细胞，ii)经过B5缺乏/嘌呤霉素选择或仅嘌呤霉素选择的表达干扰素β和B5转运蛋白SLC5A6表达载体的CHO细胞克隆，iii)如以前所述用B5缺乏/嘌呤霉素选择或仅嘌呤霉素选择的表达曲妥珠单抗和SLC5A6表达载体的CHO细胞池。使用Illumina
链式mRNA-seq试剂(ILLUMINA)从0.5μg至1μg总RNA获得cDNA。RNA-seq文库100nt的配对末端在Illumina HiSeq
上测序。将读数映射到CHO-K1转录组(RefSeq,2014)。
蛋白质样品的制备和免疫印迹
对总肌动蛋白含量的评估如下。从经PBS洗涤的107个细胞进行蛋白质提取，随后将细胞团块重悬于RIPA裂解缓冲液(150Mm NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0，1％NP-40，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中并搅拌30分钟。通过离心(5分钟，15.000g)将细胞碎片沉淀并随后收集上清液。用6％-14％SDS/PAGE胶、Mini-Protean Tetra胶(Bio-Rad)和Mini TransBlot Cell(Bio-Rad)对等体积的蛋白质样品进行变性凝胶电泳和免疫印迹，并将蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶粉在TBST(20mM三羟甲基氨基甲烷，135mM NaCl，0.1％吐温-20，pH 7.6)中于室温封闭膜1小时。然后将膜与α-心脏肌动蛋白多克隆抗体(PA5-21396，Invitrogen，稀释度1：500)或GAPDH抗体(sc-32233，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，稀释度1：500)孵育过夜，然后与抗小鼠的HRP结合二级抗体(G21040，Invitrogen，稀释度1：1000)孵育1小时。使用SuperSignal West Pico
(34580，THERMO SCIENTIFIC)和
成像***(BIO-RAD)将蛋白质条带可视化。用
的斐济分布(NIH，Bethesda，MD)对所得蛋白质条带强度进行量化。
通过荧光激活的细胞分选法对肌动蛋白聚合的分析
通过将2×105细胞/ml接种于SFM中并于37℃、5％CO2培养3天，在细胞培养物中评定聚合肌动蛋白(F-actin)的水平。从每个培养物中收集106个细胞的3份等份试样，并将细胞重悬于补充了200nM SiR-Actin(CY-
SPIROCHROME)的新鲜培养基中，并于37℃、5％CO2孵育4小时。然后通过流式细胞仪(BD FACS Aria II,BD BIOSCIENCES,SanJose,CA)根据细胞的荧光水平(Abs 652nm，Em 674nm，低、中和高荧光)对细胞进行分选。这些细胞群被扩增并保持于37℃、5％CO2直到进一步分析。
应当理解，本发明的***(载体/细胞等)、方法和试剂盒可以以多种实施方案的形式被纳入，本文仅公开了其中的几个实施方案。对于本领域技术人员来说显然存在不背离本发明的精神的其他实施方案。因此，本文所述的实施方案是说明性的并且不应被解释为限制性的。
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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atgttaatat gcctcaccag aaacttgggt ggtgtctctg ggttcttcca agtggtcttc 60
gtggtcagtc tatttctggt gcttttcaag gcagtccgat tctacttaag aaggcagtgg 120
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tctggacgaa gttgggatga agaccttgaa gagcaggact caccaggaaa cagcacagtc 240
aggagcagag ttttacagag cggggaacaa ggaaatgcca aacagggtga caggcagatc 300
acgattgagg aggagtcgtc tccaggaaac aaagaagacg tggagggtga tgaccaggat 360
gaccatcaaa aagggtgttt ggaaagaaag tatgatatga tttgtgagtt ttgtagaaag 420
cacaggatca ttctccgacg catcatcgga ggcattttat tgactggttt cctggctctg 480
gtgattgcag cctgtgtact aaacttccac agagcccttc ctctatttgt gatcaccgtg 540
gttaccatct tctttgttat ctgggatcac ttgatggcca aatatgagca tcgaatcgat 600
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aggtcagaac tccatgccat tatgacagct ggctttgcca caattgctgg aagcgtattg 1260
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<210> 9
<211> 684
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 9
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<210> 10
<211> 1284
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 10
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<210> 11
<211> 1827
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 11
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<210> 12
<211> 2283
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 12
ggtgtcgtga ggattagctt ggtactaata cgactcacaa gcttgccgcc accatgaggg 60
ctggatgagg gctggactgg agacagcaga cattgccata gtggccctgt attttatcct 120
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gcc 2283
<210> 13
<211> 1686
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 13
atgtcctcgg aggtgatcag ggcgaccgca gggatggtac tagcagagct gtatgtctct 60
gatcgagaag gaaatgatgc aacaggagat ggaactaagg agaaaccatt taaaacaggc 120
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ccataa 1686
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<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 14
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<212> DNA
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<400> 15
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actaggcacc agagtttcac cacaaagaca gacaagatca aaccacaaag agaaattaga 1320
aagcactcca tgtcgttttc cttcacctct cacaaaaaag tgctgccccg gacctccagc 1380
actgggtctg agaaatccaa agacttttct agagaccaaa tcaagaaggg tttgaggaaa 1440
gacagccagc ttgctggcag aatcatccag gaaaatgagt cagaaatcca aaacttcagc 1500
ttgtctagaa cctgggccct ctcggttgac aatgtgttcc agctaattga tgtgaggaag 1560
ccaggaagcc caccatccta cgaagaggcc attcattacc aggcatctgg attcacagcc 1620
tacagtggcc agacggtcag cagtatgaga gcaagaatgc tcaaatggaa cacggctctg 1680
cctcctctgc cttctcgcct tggaggtgac cacagtgaag ggacacccgg tggacacaga 1740
ctgtctcccc tgactgagtg ctggaaacag agtcagactg tcagtgtctc tgtggaaact 1800
caggggagat ctgagcagca cggattgagg atggtgtctg aaacgatgca gaaggctaag 1860
ttagactgtc tcaggcgaca acacagccac atggtctttg aggtcgacca actacagggt 1920
gctaaagaat cctacattta g 1941
<210> 18
<211> 186
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 18
atggacccca actgctcctg ctccaccggc agcacctgca cctgctccag ttcctgtggc 60
tgcaaagact gcaagtgcac ctcctgcaag aagagctgct gctcctgctg cccagtgggc 120
tgctccaagt gtgcccaggg ctgcgtctgc aaaggggcat cggacaagtg cacgtgctgt 180
gcctaa 186
<210> 19
<211> 1407
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 19
atggtggaca cagagagccc catctgtcct ctctccccac tggaggcaga tgacctggaa 60
agtcccttat ctgaagaatt cttacaagaa atgggaaaca ttcaagagat ttctcagtcc 120
atcggtgagg agagctctgg aagctttggt tttgcagact accagtactt aggaagctgt 180
ccgggctccg agggctctgt catcacagac accctctctc cagcttccag cccttcctca 240
gtcagctgcc ccgtgatccc cgccagcacg gacgagtccc ccggcagtgc cctgaacatc 300
gagtgtcgaa tatgtgggga caaggcctca gggtaccact acggagttca cgcatgtgaa 360
ggctgtaagg gcttctttcg gcgaactatt cggctgaagc tggtgtacga caagtgtgat 420
cggagctgca agattcagaa gaagaaccgg aacaaatgcc agtactgccg ttttcacaag 480
tgcctgtctg tcgggatgtc acacaatgca attcgctttg gaagaatgcc aagatctgaa 540
aaagcaaaac tgaaagcaga aattcttacc tgtgaacacg acctgaaaga ttcggaaact 600
gcagacctca aatctctggg caagagaatc cacgaagcct acctgaagaa cttcaacatg 660
aacaaggtca aggcccgggt catactcgcg ggaaagacca gcaacaaccc gccttttgtc 720
atacatgaca tggagacctt gtgtatggcc gagaagacgc ttgtggccaa gatggtggcc 780
aacggcgtcg aagacaaaga ggcagaggtc cgattcttcc actgctgcca gtgcatgtcc 840
gtggagaccg tcacggagct cacagaattt gccaaggcta tcccaggctt tgcaaacttg 900
gacttgaacg accaagtcac cttgctaaag tacggtgtgt atgaagccat cttcacgatg 960
ctgtcctcct tgatgaacaa agacgggatg ctgatcgcgt acggcaatgg ctttatcaca 1020
cgcgagttcc ttaagaacct gaggaagccg ttctgtgaca tcatggaacc caagtttgac 1080
ttcgctatga agttcaatgc cttagaactg gatgacagtg acatttccct gtttgtggct 1140
gctataattt gctgtggaga tcggcctggc cttctaaaca taggctacat tgagaagttg 1200
caggagggga ttgtgcacgt gcttaagctc cacctgcaga gcaaccatcc agatgacacc 1260
ttcctcttcc caaagctcct tcaaaaaatg gtggaccttc ggcagctggt cacggagcat 1320
gcgcagctcg tacaggtcat caagaagacc gagtccgacg cagcgctgca cccactgttg 1380
caagagatct acagagacat gtactga 1407
<210> 20
<211> 1308
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 20
atggctccct ttggaagaaa tttgttgaag acgcgacata agaacagatc tccaactaaa 60
gacatggatt ctgaggagaa ggaaattgtg gtttgggttt gccaggagga aaagattgtc 120
tgtggattaa ctaaacgcac cacctccacc gatgtcatcc aggctttgct ggaggaacat 180
gaggctacat ttggagagaa gagatttcta ctgggcaagg ccagtgacta ctgcatcgta 240
gagaagtgga ggggctcaga gcgggccctt cctccactga cgaggatcct gaagctatgg 300
aaggcttggg gagatgagca agccaacatg cagtttgttt tggttaaaac agatgccttt 360
ctcccagttc cactgtggag gacagcggaa accaaactag tgcaaaatag tgaaaagcct 420
tgggagctca gtccggcgaa ctacatgaaa actttgccac cagataaaca aaaacgaatc 480
gtcaggaaaa ccttccgaaa actggctaaa attaagcagg acatgttttc tcatgatcgg 540
gacagtatgg agactttggt tcatctaatt atttctcagg accacactat tcaccagcaa 600
gtacaaagaa tgaaagagtt agatatggaa attgagaaat gtgaggctaa gatccacttg 660
gaccgggtag ggaatgatgg ggacaattac gttcaggagg catatttaat gcccagggtt 720
agtgaaaagg agcaaatgct agactttcaa cctgaggaca gccaggctct ggtggacgtg 780
cacgatggtg aggggatggc acagctagaa gaacggctgc agtactaccg agtgctcatc 840
gaaaagctct cggctgaaat tgagagagag ttgaagagct tgggcatcga cggaagtgaa 900
gattcagagg gggcagctgc ctgtgaactc gaaaactctg atttagaaaa tgtgaagtgc 960
gatttggaga agagtatgaa agctggtttg aaaatctact ctcacttgag tggcatccag 1020
aaagagatta aatacagtga ctcattgctt cagatgaaag caagagaata cgaactcctg 1080
gccaaggagt tcagttcgtt tcaccttagc aacaaagatg gatgccaatt aaaagaaaac 1140
aaaggaaagg aacacgaggc tgccagcggc agtgcggaga tccctccatt aactcaaagg 1200
gcattcaaca catacacaaa tgacacagat tcggacactg gcattagctc caaccacagc 1260
caggactctg agacaactct gggagatgtg ctgctgttgt caacgtaa 1308
<210> 21
<211> 825
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 21
atggaaatct ccaggtccgc atgcctagtc ctttcattta tcctcatgtg tgggctggtc 60
ccagaagtca tggcagatgc tgaagaaacc tcaggcggtc tcggcactac ccaggaaccc 120
atatggctcc cagacatccc agctacggag gaattcatca gtgctgctga agtggccatc 180
ataggtttct tccaggattt agaaataccg atagtgccca tattccgcag cacggctcaa 240
cagttccgag acataccatt cggaatcagc aacagttctg cggttctgag ccactacaac 300
gtcaccagaa acagcatctg cctcttccga ctggttgaca atgaacaact gcacttggat 360
gctgaagaca ttgaaaactt agatgcctcc aagttgagcc gtttcattca gatgcacagc 420
ctccgctggg tgacagagta cagccctctg attgcagctg gcttatttaa caccatggtt 480
cagactcacc ttctcctgat aatgaacaag acttccccgg agtatgaaaa gagcctgcag 540
caataccggg aggcagctaa gctcttccag ggacagatcc tctttgttct ggtggacagc 600
ggcaaggggg ggaaccgaaa ggtgatatcc tatttccaac taaaggagtc tcagctgccg 660
gctctggcca tttatgaaag tgtgaatgac aagtgggaca cactgcccat cacagaagtc 720
acagtggaga aagtccaagg cttctgtgat ggcttcctaa aggggacact gctgagagat 780
cacgatgtgg aaggagatgc agaggcgcgg aaggaggagc tctga 825
<210> 22
<211> 1518
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 22
atgcgcttca gctgcctagc gctgctcccg ggcgtggcgc tgctgctcgc ctcggcccgc 60
ctcgccgccg cctctgacgt gctggaactc acggacgaaa acttcgagag tcgcgtctcc 120
gacacgggct ctgcgggcct catgctagtc gagttcttcg ccccttggtg tggacattgc 180
aagaggcttg cccctgagta tgaagctgca gcaactagat tgaaaggaat agtcccatta 240
gcaaaggttg attgcactgc caacacaaac acctgtaata agtatggagt cagtggctac 300
ccaaccctta aaatatttag agatggtgaa gaagcaggtg cttatgatgg gcctaggact 360
gccgatggaa ttgtcagcca cttgaagaaa caagcaggac cagcttcggt tcctctcagg 420
tctgaggaag aatttaagaa gttcattagt gataaagatg cttcggtggt gggctttttc 480
agggatttat tcagtgacgg tcactctgaa ttcctaaaag cagccagcaa cttgagagat 540
aactacagat ttgcacacac caacgttgag tctctggtga aggagtatga tgataatgga 600
gaggggatca ctttatttcg tccttcacat cttgctaaca agtttgaaga caaaactgtg 660
gtatatactg aacagaaaat gaccagtggc aagataaaaa ggtttatcca ggaaagcatt 720
tttggtatct gtcctcatat gacagaagac aataaagatt tgatacagag caaggactta 780
cttacagcct actatgatgt tgactatgaa aagaatgcta aaggttccaa ctattggaga 840
aacagagtga tgatggtggc aaaaaaattc ctggatgctg gacacaaact caactttgct 900
gtagctagcc gtaaaacctt tagccatgag ctgtccgact ttggcttaga aagcactact 960
ggagaggttc ctgttgtagc aatcagaact gctaaaggag agaagtttgt catgcaggaa 1020
gagttctcga gggacgggaa ggctctggag cggttcctgc aggattactt tgatggcaac 1080
ctgaagagat acctcaagtc tgaacctatc ccagagacca acgatgggcc tgtcaaggtt 1140
gtggtagcag aaaattttga tgacatagtg aataatgaag ataaggatgt gctgattgaa 1200
ttttatgccc cttggtgtgg tcactgtaag aatctggagc ccaaatataa agaactggga 1260
gagaaactca gcaaagaccc aaatattgtt atagccaaga tggatgccac agctaatgat 1320
gtgccttctc catatgaagt caaaggtttt cctaccatct acttttcacc agccaacaag 1380
aagctaaatc caaagaagta tgaaggtggc cgtgaattaa atgattttat taactatcta 1440
caacgagaag ctacaacccc ccctataatt caagaagaaa aacccaagaa gaagaagaag 1500
gcacaagagg acctctaa 1518
<210> 23
<211> 2874
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 23
atgactctcc tgctgctgtc cctcttgctg gcctccctgc tccagctcag ctctggcaac 60
aaagccaaca agcacaagcc ctggatcgag gcagagtacc agggcattgt catggagaat 120
gacaacactg tcctgttgaa tccaccactc tttgccttgg ataaagatgc cccgctgcgc 180
tatgcaggtg agatctgtgg cttccggctg catgggtctg gggtaccctt tgaggctgtg 240
atcctggaca aggcaacagg tgaagggctg atccgggcca aggagccggt ggactgtgag 300
gcccagaagg aacacacctt taccatccag gcttatgact gtggcgaggg gcccgatggc 360
accaacacca agaagtctca caaggcaacc gtgcatgtcc gcgtcaacga tgtgaatgag 420
tttgccccgg tctttgtgga gcgtctgtac cgtgctgcag tgacagaggg gaagctgtat 480
gaccgcatct tacgcgtgga agccatcgat ggcgactgct cccctcagta cagccagatc 540
tgctactatg agattcttac acccaacatt cctttcctca tcgacaatga cggcaacatt 600
gagaacacag agaagctgca gtacagtggt gagaaactct acaagttcac ggtgacagcg 660
tacgactgtg ggaagaagcg ggctgcggat gacgcggagg tggagataca ggtgaagccc 720
acctgcaagc ccagctggca aggctggaac aaaaggattg agtacgcccc aggcgccggg 780
agtttggctt tgttccctgg catccgcctg gagacctgtg atgaaccatt gtggaacatc 840
caggccacca tagagctgca gaccagccat gtggccaagg gctgtgaccg agacaactac 900
tccgaaaggg cactgcggaa gctctgtggc gctgctactg gggaggtaga cctgttgccc 960
atgcctggcc ccaatgccaa ctggacagcg ggactctcag tgcactacag ccaggacagc 1020
agcctcatct actggttcaa tggcacccaa gctgtgcaag ttcccctggg tggcccagca 1080
gggctgggct ctgggccgca ggatggcctt agtgaccact ttaccctgtc cttctggatg 1140
aaacatggcg tgactcccaa caaggggaag aaggaggaag agaccatcgt gtgtaacaca 1200
gtccagaatg aggacggctt ctctcactac tcactgactg tacatggctg cagaatctcc 1260
ttcctctact ggccactgct tgagagtgcc cgtccggtca agttcctctg gaagctggag 1320
caggtatgtg acgacgagtg gcaccactat gccctgaacc tcgagttccc cacggtcaca 1380
ctctacactg atggcatctc ctttgaccct gctctcatcc atgacaatgg tctcatccac 1440
ccacccagga gggagcctgc actcatgatt ggggcctgct ggactgaaga gaagaacaga 1500
gaaaaggaaa aaggaggaga caacagtaca gacacaaccc caggagaccc cttgctgatc 1560
caccactact tccacggcta cctggctggt ttcagcgtgc gctcaggtcg cctggagagc 1620
cgtgaggtca tcgagtgcct ctatgcatgc cgggaggggc tggactatag ggatttcgag 1680
agcctgggca aaggcatgaa ggtccacgtg aacccctcgc agtccctgct caccctggag 1740
ggggatgatg tggagacctt caaccatgcc ctgcagcatg tggcttacat gaacactctg 1800
cgctttgcca cacccggcgt caggccgctg cgcctcacca ccgctgtcaa gtgcttcagt 1860
gaagagtcct gcgtctccat ccctgaagtg gaaggctatg tggtggtcct tcagcctgat 1920
gccccccaga tccttctgag tggcacagct cattttgccc gcccagcggt ggactttgag 1980
ggacccgacg gggtcccttt gttccctgac cttcagatca cctgctccat ttctcaccag 2040
gtggaggcca aagcagatga gagctggcag ggcacagtga cagacacacg catgtcagat 2100
gagattgtac acaacctgga cggctgtgaa atttctctgg tgggagatga cctagaccct 2160
gagcgagaaa gcctgctctt ggacatggca tccttgcagc agcgaggcct ggaactcacc 2220
aacacatctg cctacctcac cattgctggg gtggaaacca tcactgtgta tgaagagatc 2280
ctgaggcacg ctcgttatca gctccggcat ggagctgccc tgtatgctag gaaattcagg 2340
ctttcctgtt cggagatgaa tggccgctac tccagcaacg aattcattgt ggaggtcaac 2400
gtccttcata gcatgaaccg ggtggcccac cccagccatg tgctcagctc acagcagttc 2460
ttgcaccgag gtcaccagcc tcctcctgag atggctggac acagcctggc cagctcccac 2520
cggaactcca tggtccccag tgctgcgact ctcatcattg tggtgtgtgt gggcttcctg 2580
gtgcttatgg tcatcctggg cctagtgcga atccactccc ttcaccgccg cgtctcagga 2640
actggcggac cctcaggggc ttccactgac ccgaaagacc ctgacctctt ctgggatgac 2700
tctgctctca ccattatcgt gaaccccatg gagtcctacc agaaccagca ggccagtgtg 2760
gcaggggttg ctggtggcca gcaagaggaa gaggacagca gtgactcaga ggcagccgac 2820
ttccccagca gcgacgagag acgcatcgtt gaaagccccc cacaccgcta ctga 2874
<210> 24
<211> 1308
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 24
atgggtcagg agctgtgtgc aaagagacag ccaggatgca gttgctacca ccgttcggag 60
agaggggagg cgcacagctg tcagagaagc cagcctggga gcaccgaggc tgctgcgttc 120
gagctaacag acataaaagg agcaacgtgt tccttgtctt catttcaccc caggggactc 180
cagggccctg gtgaccagaa gctggagagc aaaaggcccc ggagtaacag tgactctttt 240
caggaagaga atctgaggca agggttgcca tggaagaaga gcctcccttt tggggcagcc 300
tcatcttatt tgaacttgga gaagctgggt gaaggctctt atgccacagt ttacaagggg 360
attagcagga taaatggaca actagtagct ctaaaggtga tcagcatgaa cgccgaggag 420
ggtgtgcctt tcacagccat ccgggaagcc tccctcctga agggtctgaa gcatgccaac 480
attgtcctct tgcatgacat tgtgcacacc aaagagactc tgacattcgt atttgaatac 540
atgcacacag atctggccca gtacatgtct cagcatcccg gaggccttca tcctcacaat 600
gtcaggcttt tcatgtttca acttctgcga ggcctggcat acatccacca tcagcatgtt 660
cttcacaggg acctgaaacc tcagaacttg ctcatcagtc acctgggaga gctcaaattg 720
gctgactttg gtcttgctcg agccaagtcc attcccagcc agacgtactc ttcagaagtg 780
gtgacactgt ggtaccggcc acctgacgcc ttgctgggag ccactgagta ctcctctgag 840
ctagacatat ggggcgcagg ctgcatcttt attgaaatgt tccagggtca acctttgttt 900
cctggggttt ccaacatcct ggaacagctg gagaagatct gggaggtact gggagtccct 960
acagaggaca cctggcctgg agtctccaag ctgcctaact acaatccaga atggttcccg 1020
ctgcctaagc ctcaaagcct gcagattgtc tggagcaggt tgggtggagt tcctgaagct 1080
gaagacctgg cctcccagat gctaaaaggt ttccctaggg accgagtatc agcacaggaa 1140
gcactcgttc atgattattt cagtgtcctt ccatcccagt tgtaccagct tcctgatgaa 1200
gagtctttgt ttgcagtttc aggagtgaag ctaaagccag aaatgtgtga cctttcagcc 1260
tcctacagga agggtcacta cctagccggg tttaacaaat gttggtga 1308
<210> 25
<211> 783
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 25
atggctaagg agtggggtta tgccagccac aatggtcctg aacactggca tgaactttat 60
ccaattgcca aaggggacaa tcagtcaccc attgagctgc atactaaaga catcaagcat 120
gacccctctt tgcaaccctg gtcagcatct tacgatcctg gctctgctaa gaccatcctg 180
aataatggga agacctgcag agttgtgttt gatgacacgt atgacaggtc tatgctgagg 240
ggtggtcctc tctctggacc ctatcgactt cgccagtttc atcttcactg gggctcctcg 300
gatgaccatg gctctgagca cacagtggat ggagtgaagt atgctgctga gcttcacctg 360
gttcactgga acccaaagta caacaccttc ggagaagctc taaagcaacc cgatggaatc 420
gctgttgttg gcatttttct gaagatagga cgggagaaag gagagttcca gattttcctt 480
gatgccctgg acaaaattaa gactaagggc aaggaggctc ctttcaccca cttcgaccca 540
tcctgcctgt ttcctgcttg ccgcgactac tggacctatc atggctcctt caccacgcca 600
ccctgcgagg agtgcatcgt gtggctgctg ttgaaggagc ccatgaccgt gagctcagac 660
cagatggcca agctgcgtag tctattcgcc agcacggaga atgagccccc ggtgcctctg 720
gtggggaatt ggcgcccccc gcagccggtc aagggtaggg tggtgagggc ctctttcaag 780
tga 783
<210> 26
<211> 1305
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 26
atgaactccg gcctgggttc catgaactcc atgaacagct acatgaccat gaacaccatg 60
accacgagcg gcaatatgac accggcttcc ttcaacatgt cctacgccaa cccgggccta 120
ggagccggcc tgagtccggg tgctgtggcc ggcatgcccg gaggctctgc cggcgccatg 180
aacagcatga ccgcggcagg cgtcacggcc atgggtgcag cgctgagccc gggaggcatg 240
ggctccatgg gcgcgcagcc cgcagcctct atgaacggcc tgggtcccta tgcggcagcc 300
atgaacccgt gcatgagccc catggcgtac gcgccgtcca acttgggccg cagccgcgct 360
gggggcggcg gcgactccaa gacattcaag cgcagctacc cgcacgccaa gccgccctac 420
tcctacatct cgctcatcac catggccatc cagcaggcgc ccagcaagat gctcacactg 480
agcgagatct accagtggat catggacctc ttcccctatt accgtcaaaa ccagcagcgc 540
tggcagaact ccatccgcca ctcgctgtct ttcaacgact gtttcgtcaa ggtggcgcga 600
tccccggaca aaccgggcaa gggctcctac tggacgctgc acccggactc cggcaacatg 660
ttcgagaacg gctgctactt gcgccgtcaa aagcgcttca agtgtgagaa gcagccgggg 720
gccggaggcg ggagcggggg cgccggctcc aagggtggcc ccgaaagccg caaggacccc 780
tcaggcgcag gtaaccacgc cgagtcgccc cttcatcggg gtgtgcacgg aaaggctggc 840
cagctagagg gcgcgccggc ccccgggccc gccgccagcc cccagactct ggaccacagc 900
ggggccacag cgacaggggg cgcttcggag ttgaagtctc cagcctcttc ctctgcgccc 960
cccataagct ccgggcctgg ggcgctggca tctgtacccc cctctcaccc ggcgcacggc 1020
ctggcacccc acgaatcgca gctgcacctg aaaggggacc cccactactc ctttaatcac 1080
ccgttctcta tcaacaacct catgtcctct tcggagcagc agcacaagct ggacttcaag 1140
gcatatgagc aggcactcca gtactctcct tatggtgcca ccttgcccgc cagtctgccc 1200
cttggcagcg cctcagtggc cacaaggagc cccatcgagc cctcagcact ggagccggcc 1260
tactaccaag gtgtgtattc cagacccgtg ctaaatactt cctag 1305
<210> 27
<211> 879
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 27
atggaagact cgatggatat ggacatgagc cctcttaggc cacagaacta ccttttcggt 60
tgtgaactaa aagctgacaa agattatcac tttaaggtgg ataatgatga gaatgaacac 120
cagttgtcac taagaacggt tagtttaggg gcaggggcaa aagatgaatt acacatcgta 180
gaggcagaag caatgaatta tgaaggcagt ccaattaaag taacgctggc aacattgaaa 240
atgtccgtac aaccaacagt ttcccttggt ggctttgaaa ttacaccacc tgtggtgtta 300
cggttgaggt gtggttcagg gcctgtgcac attagtggac agcatctagt agctgtagag 360
gaagatgcag agtcagagga tgaagatgag gaggatgtga aactcttaag tatgtctggc 420
aagcgatctg ctcctggagg tggtagcaaa gttccacaga aaaaagtaaa aatcgatgaa 480
gatgaggatg atgatgatga agatgatgaa gacgatgaag atgatgatga tgatgatttt 540
gatgatgaag aaactgaaga aaaagttcca gtgaagaaat ctgtacgaga taccccagcc 600
aaaaatgcac aaaaatcaaa ccaaaatgga aaagacttaa aaccatcaac accaagatca 660
aaaggtcaag agtccttcaa aaaacaggaa aaaactccta aaaccccaaa aggacctagt 720
tctgtagaag acattaaggc aaaaatgcaa gcaagtatag aaaaaggtgg ttctcttccc 780
aaagtggaag ccaagttcat taattatgtg aagaattgct tccggatgac tgaccaggag 840
gctattcaag atctctggca gtggaggaaa tctctttaa 879
<210> 28
<211> 2106
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 28
atggcggacc ggcgtcggca gcgcgcttcc caggacactg aggacgaaga atctggtgct 60
tcgggttctg acagcggctc tccggcgcgg ggcggcggca gctgcagcgg gagcgccgga 120
ggcggcggca gtggctcgct gccgtctcag cgcggcggcc gcggcggggg ccttcatctg 180
cggcgggtgg agagcggggg cgccaagagc gccgaggagt cggagtgtga gagtgaagat 240
ggcatggaag gcgatgctgt tctttccgat tatgaaagtg cagaagattc agaaggtgaa 300
gaaggagaat acagtgagga ggaaaactcc aaggtggagc tgaaatcaga aggtaatgat 360
gctgctgatt cctcagcaaa agagaaggga gaagaaaagc ctgatactaa aggcactgtg 420
actggagaga ggcaaagtgg ggatggacag gagagcacag agcctgtaga gaataaagtg 480
ggtaaaaaag gccctaagca tttggatgat gatgaagatc ggaaaaatcc agcgtatata 540
ccaaggaaag ggctcttctt tgagcatgat cttcgagggc aaactcagga agaggaagtc 600
cgacccaagg gacgtcagcg aaagctatgg aaggatgagg gtcgctggga gcatgataag 660
ttccgtgaag atgaacaggc tccaaagtcc cgacaggaac tcattgccct ttatggctat 720
gatattcgat ctgctcacaa tcctgatgac atcaaacccc ggagaatccg gaagcctcga 780
tttggaagtc ccccacaaag agatccaaat tggattggtg atagatcaaa caagtcccat 840
cgccaccagg gtcctggggg taccctacca ccaaggacat ttattaatag gaatgcatca 900
ggtactggcc gcatgtctgc atccaggaat tattcacgat ctgggggctt caaggaaggt 960
cgtactagtt tcaggcctgt ggaggctggt gggcagcatg gtggccggtc tggtgagact 1020
cataaacatg aagctaatta ccggtcacga cgtctggagc aaacccctat gagggatcca 1080
tctccagaac cagatgctcc gttgcttggc agtcctgaga aagaagaggc ggcctcggag 1140
acaccagctg ccgctcctga cactgtacca ccagctcctg acaggcccat tgagaagaaa 1200
tcctattccc gggcaagaag gacccggacc aaagtggggg atgcaatgaa agctgctgag 1260
gaggctcctc ctccagctga agggctcact tcagcagcca caatcccaga aacagctcct 1320
cctccagctg ctaagactgg gaactgggag gctccagtag attctaccac aggtggactg 1380
gagcaagatg tggcacagct aaatatagca gaacaaaact ggagtccagg acagccttcg 1440
ttcctgcaac cacgggagct tcgaggtatg cccaaccaca tacatatggg agcaggacct 1500
ccacctcagt ttaaccggat ggaagaaatg ggtgtccagg gtagtcgagc taaacgttat 1560
tcatcccagc ggcagagacc tgtgccagag ccccctgctc ctcctgtcca tatcagtatc 1620
atggagggac attactatga tccattgcag ttccagggac caatctatac ccatggcgac 1680
agccctgccc cactgcctcc acagggcatg attgtacagc cagaaatgca ccttcctcat 1740
ccaggtttac atccccatca gtcaccagca cctctgccca atccgggtct ctacccacca 1800
ccagtgtcca tgtctccagg acaaccacca ccccagcagt tgctcgctcc tacttacttt 1860
tctgctccag gtgtcatgaa ttttggtaac cccagttacc cttatgctcc aggagcatta 1920
cctcctcctc cacctcctca tctgtatcct aacacacagg ctccatcaca ggtgtatggg 1980
ggagtgacct actataaccc tgcccagcag caggtgcagc caaaaccctc cccaccccgg 2040
aggactcccc agccagtgtc catcaagccc cctccacctg aggttgtaag caggggttcc 2100
agttaa 2106
<210> 29
<211> 1101
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 29
atggctaagc cccaggtggt tgtggctcct gtgctaatgt ctaagctgtc tgcgaacgcc 60
cccgaatttt acccatcagg ttattctaat tataccgaat cctatgagga tgtttgtgag 120
gattatccca ctctaccaga atatgttcag gatttcctga atcatctcac agagcagcct 180
ggcagttttg aaacagaaat tgaacagttt gcagaaaccc tgaatggatg ggtcacaaca 240
gacgatgctt tgcaagagct tgtggaactc atctaccagc aggccacgtc tatcccaaat 300
ttctcttaca tgggagctcg cctgtgtaat tacctgtccc atcatctgac aattagccca 360
cagagtggca acttccgcca attgctactt caaaggtgcc ggacggaata tgaagctaaa 420
gacgaagctg caaaaggaga tgaagtgact cgaaaacgat tccatgcctt tgttctgttt 480
ctgggagaac tgtatcttaa cctggagatc aaaggaacaa atggacaggt tacaagagca 540
gatattcttc aggttggcct acgggaactg ctgaatgctc tgttctccaa tcctatggat 600
gacaacttaa tttgtgcagt aaagttgcta aagttgacag ggtcagtttt agaagatact 660
tggaaggaaa aggggaaaac tgatatggaa gaagtaattc agagaattga aaatgttgtc 720
ctagatgcaa actgcagcag agatgtaaaa cagatgctct tgaagcttgt agaacttcga 780
tcaagtaact ggggcagagt ccatgcaact tcaacataca gagaagctac ccctgaaaat 840
gaccctaact actttatgaa tgaaccaaca ttttatacat ctgatggtgt tcctttcact 900
gcagctgacc cagattacca agagaagtat caggagttac ttgaaagaga ggactttttt 960
ccagattatg aagaaaatgg aacagattta tccggggctg gtgacccata cttggatgat 1020
attgatgatg agatggaccc agagattgaa gaagcttatg aaaagttttg tttggaatca 1080
gagcgtaagc gaaaacagta a 1101
<210> 30
<211> 1440
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 30
atgtcggaca gtttcgatcg ggctccaggt gctggtcggg gccggagccg gggcctgggc 60
cgcggagggg gcgggcctga gggcggcggg ttcccgaacg gagcggggcc tgcggagcgg 120
tcgcggcacc agccgccgcc gcagcccaaa gccccgggct tcctgcagcc gccgccgctg 180
cgccagccca ggaccgcccc gccgccaggg gcccagagcg aggcccccgc cggctccgcg 240
cggcctcccc gacctggggc gctcccagaa caaacgcgtc cccagagagc tccacctagt 300
tcacaggata aaatcccaca gcagaactcg gagtcagcaa tggctaagcc ccaggtggtt 360
gtggctcctg tgctaatgtc taagctgtct gcgaacgccc ccgaatttta cccatcaggt 420
tattctaatt ataccgaatc ctatgaggat gtttgtgagg attatcccac tctaccagaa 480
tatgttcagg atttcctgaa tcatctcaca gagcagcctg gcagttttga aacagaaatt 540
gaacagtttg cagaaaccct gaatggatgg gtcacaacag acgatgcttt gcaagagctt 600
gtggaactca tctaccagca ggccacgtct atcccaaatt tctcttacat gggagctcgc 660
ctgtgtaatt acctgtccca tcatctgaca attagcccac agagtggcaa cttccgccaa 720
ttgctacttc aaaggtgccg gacggaatat gaagctaaag acgaagctgc aaaaggagat 780
gaagtgactc gaaaacgatt ccatgccttt gttctgtttc tgggagaact gtatcttaac 840
ctggagatca aaggaacaaa tggacaggtt acaagagcag atattcttca ggttggccta 900
cgggaactgc tgaatgctct gttctccaat cctatggatg acaacttaat ttgtgcagta 960
aagttgctaa agttgacagg gtcagtttta gaagatactt ggaaggaaaa ggggaaaact 1020
gatatggaag aagtaattca gagaattgaa aatgttgtcc tagatgcaaa ctgcagcaga 1080
gatgtaaaac agatgctctt gaagcttgta gaacttcgat caagtaactg gggcagagtc 1140
catgcaactt caacatacag agaagctacc cctgaaaatg accctaacta ctttatgaat 1200
gaaccaacat tttatacatc tgatggtgtt cctttcactg cagctgaccc agattaccaa 1260
gagaagtatc aggagttact tgaaagagag gacttttttc cagattatga agaaaatgga 1320
acagatttat ccggggctgg tgacccatac ttggatgata ttgatgatga gatggaccca 1380
gagattgaag aagcttatga aaagttttgt ttggaatcag agcgtaagcg aaaacagtaa 1440
<210> 31
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 31
atgtctgctg aagtcatcca tcaggttgaa gaagcacttg atacagatga gaaggagatg 60
ctgctctttt tgtgccggga tgttgctata gatgtggttc cacctaatgt cagggacctt 120
ctggatattt tacgggaaag aggtaagctg tctgtcgggg acttggctga actgctctac 180
agagtgaggc gatttgacct gctcaaacgt atcttgaaga tggacagaaa agctgtggag 240
acccacctgc tcaggaaccc tcaccttgtt tcggactata gagtgctgat ggcagagatt 300
ggtgaggatt tggataaatc tgatgtgtcc tcattaattt tcctcatgaa ggattacatg 360
ggccgaggca agataagcaa ggagaagagt ttcttggacc ttgtggttga gttggagaaa 420
ctaaatctgg ttgccccaga tcaactggat ttattagaaa aatgcctaaa gaacatccac 480
agaatagacc tgaagacaaa aatccagaag tacaagcagt ctgttcaagg agcagggaca 540
agttacagga atgttctcca agcagcaatc caaaagagtc tcaaggatcc ttcaaataac 600
ttcaggctcc ataatgggag aagtaaagaa caaagactta aggaacagct tggcgctcaa 660
caagaaccag tgaagaaatc cattcaggaa tcagaagctt ttttgcctca gagcatacct 720
gaagagagat acaagatgaa gagcaagccc ctaggaatct gcctgataat cgattgcatt 780
ggcaatgaga cagagcttct tcgagacacc ttcacttccc tgggctatga agtccagaaa 840
ttcttgcatc tcagtatgca tggtatatcc cagattcttg gccaatttgc ctgtatgccc 900
gagcaccgag actacgacag ctttgtgtgt gtcctggtga gccgaggagg ctcccagagt 960
gtgtatggtg tggatcagac tcactcaggg ctccccctgc atcacatcag gaggatgttc 1020
atgggagatt catgccctta tctagcaggg aagccaaaga tgttttttat tcagaactat 1080
gtggtgtcag agggccagct ggaggacagc agcctcttgg aggtggatgg gccagcgatg 1140
aagaatgtgg aattcaaggc tcagaagcga gggctgtgca cagttcaccg agaagctgac 1200
ttcttctgga gcctgtgtac tgcggacatg tccctgctgg agcagtctca cagctcacca 1260
tccctgtacc tgcagtgcct ctcccagaaa ctgagacaag aaagaaaacg cccactcctg 1320
gatcttcaca ttgaactcaa tggctacatg tatgattgga acagcagagt ttctgccaag 1380
gagaaatatt atgtctggct gcagcacact ctgagaaaga aacttatcct ctcctacaca 1440
<210> 32
<211> 822
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 32
atgggcaccg acagccgcgc ggccaaggcg ctcctggcgc gggcccgcac cctgcacctg 60
cagacgggga acctgctgaa ctggggccgc ctgcggaaga agtgcccgtc cacgcacagc 120
gaggagcttc atgattgtat ccaaaaaacc ttgaatgaat ggagttccca aatcaaccca 180
gatttggtca gggagtttcc agatgtcttg gaatgcactg tatctcatgc agtagaaaag 240
ataaatcctg atgaaagaga agaaatgaaa gtttctgcaa aactgttcat tgtagaatca 300
aactcttcat catcaactag aagtgcagtt gacatggcct gttcagtcct tggagttgca 360
cagctggatt ctgtgatcat tgcttcacct cctattgaag atggagttaa tctttccttg 420
gagcatttac agccttactg ggaggaatta gaaaacttag ttcagagcaa aaagattgtt 480
gccataggta cctctgatct agacaaaaca cagttggaac agctgtatca gtgggcacag 540
gtaaaaccaa atagtaacca agttaatctt gcctcctgct gtgtgatgcc accagatttg 600
actgcatttg ctaaacaatt tgacatacag ctgttgactc acaatgatcc aaaagaactg 660
ctttctgaag caagtttcca agaagctctt caggaaagca ttcctgacat tcaagcgcac 720
gagtgggtgc cgctgtggct actgcggtat tcggtcattg tgaaaagtag aggaattatc 780
aaatcaaaag gctacatttt acaagctaaa agaaggggtt ct 822
<210> 33
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 33
atgtgtgacg acgaggagac caccgccctg gtgtgcgaca acggctctgg gctggtgaag 60
gccggctttg cgggcgatga cgcgccccgc gctgtcttcc cgtccatcgt gggccgcccg 120
cggcaccagg gagttatggt gggtatgggt cagaaggact cctacgtagg tgatgaagcc 180
cagagcaaga gaggcatcct gaccctgaag tatcccatcg agcatggtat catcaccaac 240
tgggacgaca tggagaagat ctggcaccac accttctaca atgagctccg tgtggctccc 300
gaggagcacc ccaccctgct cacagaggcc ccgctgaacc ccaaggccaa ccgggagaag 360
atgactcaga tcatgtttga gaccttcaat gtccctgcca tgtacgtggc catccaggca 420
gtgctatccc tgtatgcttc tggccgtacc acaggcattg ttctggactc tggggatggt 480
gtaactcaca atgtccccat ctatgagggc tacgctttgc cccatgccat catgcgtctg 540
gatctggctg gtcgggacct cactgactac ctcatgaaga tcctcactga gcgtggctac 600
tcctttgtca ccactgctga acgtgaaatt gtccgtgaca ttaaagagaa gctgtgctat 660
gtcgccctgg attttgagaa tgagatggcc acagctgcct cttcctcctc cctggagaag 720
agctatgaac tgcctgatgg ccaagtcatc actattggca atgagcgctt ccgctgtcct 780
gagacactct tccagccctc cttcattggt atggaatctg ctggcatcca tgaaacaact 840
tacaatagca tcatgaagtg tgacattgat atccgcaagg acctgtatgc caacaatgtc 900
ttatctggag gcaccactat gtaccctggt attgctgatc gtatgcagaa ggaaatcact 960
gctctggctc ctagcaccat gaagattaag attattgctc cccctgagcg taaatactct 1020
gtctggattg ggggctccat cctggcctct ctgtccacct tccagcaaat gtggattagc 1080
aagcaagagt acgatgaggc aggcccatcc attgtccacc gcaaatgctt c 1131
<210> 34
<211> 564
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 34
atggccaact cgggctgcaa ggacgtcacg ggtccagatg aggagagttt tctgtacttt 60
gcctacggca gcaacctgct gacagagagg atccacctcc gaaacccctc ggcggcgttc 120
ttctgtgtgg cccgcctgca ggattttaag cttgactttg gcaattccca aggcaaaaca 180
agtcaaactt ggcatggagg gatagccacc atttttcaga gtcctggcga tgaagtgtgg 240
ggagtagtat ggaaaatgaa caaaagcaat ttaaattctc tggatgagca agaaggggtt 300
aaaagtggaa tgtatgttgt aatagaagtt aaagttgcaa ctcaagaagg aaaagaaata 360
acctgtcgaa gttatctgat gacaaattac gaaagtgctc ccccatcccc acagtataaa 420
aagattattt gcatgggtgc aaaagaaaat ggtttgccgc tggagtatca agagaagtta 480
aaagcaatag aaccaaatga ctatacagga aaggtctcag aagaaattga agacatcatc 540
aaaaaggggg aaacacaaac tctt 564
<210> 35
<211> 462
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 35
atggcgacga aggccgtgtg cgtgctgaag ggcgacggcc cagtgcaggg catcatcaat 60
ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattaa aggactgact 120
gaaggcctgc atggattcca tgttcatgag tttggagata atacagcagg ctgtaccagt 180
gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga aaacacggtg ggccaaagga tgaagagagg 240
catgttggag acttgggcaa tgtgactgct gacaaagatg gtgtggccga tgtgtctatt 300
gaagattctg tgatctcact ctcaggagac cattgcatca ttggccgcac actggtggtc 360
catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtacaaa gacaggaaac 420
gctggaagtc gtttggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aa 462
<210> 36
<211> 822
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 36
atggaaatct ccaggtccgc atgcctagtc ctttcattta tcctcatgtg tgggctggtc 60
ccagaagtca tggcagatgc tgaagaaacc tcaggcggtc tcggcactac ccaggaaccc 120
atatggctcc cagacatccc agctacggag gaattcatca gtgctgctga agtggccatc 180
ataggtttct tccaggattt agaaataccg atagtgccca tattccgcag cacggctcaa 240
cagttccgag acataccatt cggaatcagc aacagttctg cggttctgag ccactacaac 300
gtcaccagaa acagcatctg cctcttccga ctggttgaca atgaacaact gcacttggat 360
gctgaagaca ttgaaaactt agatgcctcc aagttgagcc gtttcattca gatgcacagc 420
ctccgctggg tgacagagta cagccctctg attgcagctg gcttatttaa caccatggtt 480
cagactcacc ttctcctgat aatgaacaag acttccccgg agtatgaaaa gagcctgcag 540
caataccggg aggcagctaa gctcttccag ggacagatcc tctttgttct ggtggacagc 600
ggcaaggggg ggaaccgaaa ggtgatatcc tatttccaac taaaggagtc tcagctgccg 660
gctctggcca tttatgaaag tgtgaatgac aagtgggaca cactgcccat cacagaagtc 720
acagtggaga aagtccaagg cttctgtgat ggcttcctaa aggggacact gctgagagat 780
cacgatgtgg aaggagatgc agaggcgcgg aaggaggagc tc 822
<210> 37
<211> 1515
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 37
atgcgcttca gctgcctagc gctgctcccg ggcgtggcgc tgctgctcgc ctcggcccgc 60
ctcgccgccg cctctgacgt gctggaactc acggacgaaa acttcgagag tcgcgtctcc 120
gacacgggct ctgcgggcct catgctagtc gagttcttcg ccccttggtg tggacattgc 180
aagaggcttg cccctgagta tgaagctgca gcaactagat tgaaaggaat agtcccatta 240
gcaaaggttg attgcactgc caacacaaac acctgtaata agtatggagt cagtggctac 300
ccaaccctta aaatatttag agatggtgaa gaagcaggtg cttatgatgg gcctaggact 360
gccgatggaa ttgtcagcca cttgaagaaa caagcaggac cagcttcggt tcctctcagg 420
tctgaggaag aatttaagaa gttcattagt gataaagatg cttcggtggt gggctttttc 480
agggatttat tcagtgacgg tcactctgaa ttcctaaaag cagccagcaa cttgagagat 540
aactacagat ttgcacacac caacgttgag tctctggtga aggagtatga tgataatgga 600
gaggggatca ctttatttcg tccttcacat cttgctaaca agtttgaaga caaaactgtg 660
gtatatactg aacagaaaat gaccagtggc aagataaaaa ggtttatcca ggaaagcatt 720
tttggtatct gtcctcatat gacagaagac aataaagatt tgatacagag caaggactta 780
cttacagcct actatgatgt tgactatgaa aagaatgcta aaggttccaa ctattggaga 840
aacagagtga tgatggtggc aaaaaaattc ctggatgctg gacacaaact caactttgct 900
gtagctagcc gtaaaacctt tagccatgag ctgtccgact ttggcttaga aagcactact 960
ggagaggttc ctgttgtagc aatcagaact gctaaaggag agaagtttgt catgcaggaa 1020
gagttctcga gggacgggaa ggctctggag cggttcctgc aggattactt tgatggcaac 1080
ctgaagagat acctcaagtc tgaacctatc ccagagacca acgatgggcc tgtcaaggtt 1140
gtggtagcag aaaattttga tgacatagtg aataatgaag ataaggatgt gctgattgaa 1200
ttttatgccc cttggtgtgg tcactgtaag aatctggagc ccaaatataa agaactggga 1260
gagaaactca gcaaagaccc aaatattgtt atagccaaga tggatgccac agctaatgat 1320
gtgccttctc catatgaagt caaaggtttt cctaccatct acttttcacc agccaacaag 1380
aagctaaatc caaagaagta tgaaggtggc cgtgaattaa atgattttat taactatcta 1440
caacgagaag ctacaacccc ccctataatt caagaagaaa aacccaagaa gaagaagaag 1500
gcacaagagg acctc 1515
<210> 38
<211> 615
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 38
atgaccgagc gccgcgtccc cttctcgctc ctgcggggcc ccagctggga ccccttccgc 60
gactggtacc cgcatagccg cctcttcgac caggccttcg ggctgccccg gctgccggag 120
gagtggtcgc agtggttagg cggcagcagc tggccaggct acgtgcgccc cctgcccccc 180
gccgccatcg agagccccgc agtggccgcg cccgcctaca gccgcgcgct cagccggcaa 240
ctcagcagcg gggtctcgga gatccggcac actgcggacc gctggcgcgt gtccctggat 300
gtcaaccact tcgccccgga cgagctgacg gtcaagacca aggatggcgt ggtggagatc 360
accggcaagc acgaggagcg gcaggacgag catggctaca tctcccggtg cttcacgcgg 420
aaatacacgc tgccccccgg tgtggacccc acccaagttt cctcctccct gtcccctgag 480
ggcacactga ccgtggaggc ccccatgccc aagctagcca cgcagtccaa cgagatcacc 540
atcccagtca ccttcgagtc gcgggcccag cttgggggcc cagaagctgc aaaatccgat 600
gagactgccg ccaag 615
<210> 39
<211> 708
<212> DNA
<213> 大肠杆菌( Escherichia coli)
<400> 39
atgaagaaag gttttatgtt gtttactttg ttagcggcgt tttcaggctt tgctcaggct 60
gatgacgcgg caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag 120
cccgcgcctg tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc 180
gatgatggta aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc 240
aatgtcacca ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt 300
tataaagcgc cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac 360
tgccacaaac tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat 420
cttgctttcc cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg 480
tgtgcgaaag ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca 540
gccagttgcg acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc 600
ggtactccgg cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca gccgccgaaa 660
gagatgaaag aattcctcga cgaacaccaa aaaatgacca gcggtaaa 708
<210> 40
<211> 810
<212> DNA
<213> 大肠杆菌( Escherichia coli)
<400> 40
atgaaatcac tgtttaaagt aacgctgctg gcgaccacaa tggccgttgc cctgcatgca 60
ccaatcactt ttgctgctga agctgcaaaa cctgctacag ctgctgacag caaagcagcg 120
ttcaaaaatg acgatcagaa atcagcttat gcactgggtg cctcgctggg tcgttacatg 180
gaaaactctc taaaagaaca agaaaaactg ggcatcaaac tggataaaga tcagctgatc 240
gctggtgttc aggatgcatt tgctgataag agcaaactct ccgaccaaga gatcgaacag 300
actctacaag cattcgaagc tcgcgtgaag tcttctgctc aggcgaagat ggaaaaagac 360
gcggctgata acgaagcaaa aggtaaagag taccgcgaga aatttgccaa agagaaaggt 420
gtgaaaacct cttcaactgg tctggtttat caggtagtag aagccggtaa aggcgaagca 480
ccgaaagaca gcgatactgt tgtagtgaac tacaaaggta cgctgatcga cggtaaagag 540
ttcgacaact cttacacccg tggtgaaccg ctttctttcc gtctggacgg tgttatcccg 600
ggttggacag aaggtctgaa gaacatcaag aaaggcggta agatcaaact ggttattcca 660
ccagaactgg cttacggcaa agcgggtgtt ccggggatcc caccgaattc taccctggtg 720
tttgacgtag agctgctgga tgtgaaacca gcgccgaagg ctgatgcaaa gccggaagct 780
gatgcgaaag ccgcagattc tgctaaaaaa 810
<210> 41
<211> 483
<212> DNA
<213> 大肠杆菌( Escherichia coli)
<400> 41
atgaaaaagt ggttattagc tgcaggtctc ggtttagcac tggcaacttc tgctcaggcg 60
gctgacaaaa ttgcaatcgt caacatgggc agcctgttcc agcaggtagc gcagaaaacc 120
ggtgtttcta acacgctgga aaatgagttc aaaggccgtg ccagcgaact gcagcgtatg 180
gaaaccgatc tgcaggctaa aatgaaaaag ctgcagtcca tgaaagcggg cagcgatcgc 240
actaagctgg aaaaagacgt gatggctcag cgccagactt ttgctcagaa agcgcaggct 300
tttgagcagg atcgcgcacg tcgttccaac gaagaacgcg gcaaactggt tactcgtatc 360
cagactgctg tgaaatccgt tgccaacagc caggatatcg atctggttgt tgatgcaaac 420
gccgttgctt acaacagcag cgatgtaaaa gacatcactg ccgacgtact gaaacaggtt 480
aaa 483
<210> 42
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 42
atggaagggt ctaagacgtc caacaacagc accatgcagg tgagcttcgt gtgccagcgc 60
tgcagccagc ccctgaaact ggacacgagt ttcaagatcc tggaccgtgt caccatccag 120
gaactcacag ctccattact taccacagcc caggcgaaac caggagagac ccaggaggaa 180
gagactaact caggagagga gccatttatt gaaactcctc gccaggatgg tgtctctcgc 240
agattcatcc ccccagccag gatgatgtcc acagaaagtg ccaacagctt cactctgatt 300
ggggaggcat ctgatggcgg caccatggag aacctcagcc gaagactgaa ggtcactggg 360
gacctttttg acatcatgtc gggccagaca gatgtggatc acccactctg tgaggaatgc 420
acagatactc ttttagacca gctggacact cagctcaacg tcactgaaaa tgagtgtcag 480
aactacaaac gctgtttgga gatcttagag caaatgaatg aggatgacag tgaacagtta 540
cagatggagc taaaggagct ggcactagag gaggagaggc tgatccagga gctggaagac 600
gtggaaaaga accgcaagat agtggcagaa aatctcgaga aggtccaggc tgaggctgag 660
agactggatc aggaggaagc tcagtatcag agagaataca gtgaatttaa acgacagcag 720
ctggagctgg atgatgagct gaagagtgtt gaaaaccaga tgcgttatgc ccagacgcag 780
ctggataagc tgaagaaaac caacgtcttt aatgcaacct tccacatctg gcacagtgga 840
cagtttggca caatcaataa cttcaggctg ggtcgcctgc ccagtgttcc cgtggaatgg 900
aatgagatta atgctgcttg gggccagact gtgttgctgc tccatgctct ggccaataag 960
atgggtctga aatttcagag ataccgactt gttccttacg gaaaccattc atatctggag 1020
tctctgacag acaaatctaa ggagctgccg ttatactgtt ctggggggtt gcggtttttc 1080
tgggacaaca agtttgacca tgcaatggtg gctttcctgg actgtgtgca gcagttcaaa 1140
gaagaggttg agaaaggcga gacacgtttt tgtcttccct acaggatgga tgtggagaaa 1200
ggcaagattg aagacacagg aggcagtggc ggctcctatt ccatcaaaac ccagtttaac 1260
tctgaggagc agtggacaaa agctctcaag ttcatgctga cgaatcttaa gtggggtctt 1320
gcttgggtgt cctcacaatt ttataacaaa 1350
<210> 43
<211> 1815
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 43
atggcggggc tgtactcgct gggagtgagc gtcttctccg accagggcgg gaggaagtac 60
atggaggacg ttactcaaat cgttgtggag cccgaaccga cggctgaaga aaagccctcg 120
ccgcggcggt cgctgtctca gccgttgcct ccgcggccgt cgccggccgc ccttcccggc 180
ggcgaagtct cggggaaagg cccagcggtg gcagcccgag aggctcgcga ccctctcccg 240
gacgccgggg cctcgccggc acctagccgc tgctgccgcc gccgttcctc cgtggccttt 300
ttcgccgtgt gcgacgggca cggcgggcgg gaggcggcac agtttgcccg ggagcacttg 360
tggggtttca tcaagaagca gaagggtttc acctcgtccg agccggctaa ggtttgcgct 420
gccatccgca aaggctttct cgcttgtcac cttgccatgt ggaagaaact ggcggaatgg 480
ccaaagacta tgacgggtct tcctagcaca tcagggacaa ctgccagtgt ggtcatcatt 540
cggggcatga agatgtatgt agctcacgta ggtgactcag gggtggttct tggaattcag 600
gatgacccga aggatgactt tgtcagagct gtggaggtga cacaggacca taagccagaa 660
cttcccaagg aaagagaacg aatcgaagga cttggtggga gtgtaatgaa caagtctggg 720
gtgaatcgtg tagtttggaa acgacctcga ctcactcaca atggacctgt tagaaggagc 780
acagttattg accagattcc ttttctggca gtagcaagag cacttggtga tttgtggagc 840
tatgatttct tcagtggtga atttgtggtg tcacctgaac cagacacaag tgtccacact 900
cttgaccctc agaagcacaa gtatattata ttggggagtg atggactttg gaatatgatt 960
ccaccacaag atgccatctc aatgtgccag gaccaagagg agaaaaaata cctgatgggt 1020
gagcatggac aatcttgtgc caaaatgctt gtgaatcgag cattgggccg ctggaggcag 1080
cgtatgctcc gagcagataa cactagtgcc atagtaatct gcatctctcc agaagtggac 1140
aatcagggaa actttaccaa tgaagatgag ttatacctga acctgactga cagcccttcc 1200
tataatagtc aagaaacctg tgtgatgact ccttccccat gttctacacc accagtcaag 1260
tcactggagg aggatccatg gccaagggtg aattctaagg accatatacc tgccctggtt 1320
cgtagcaatg ccttctcaga gaatttttta gaggtttcag ctgagatagc tcgagagaat 1380
gtccaaggtg tagtcatacc ctcaaaagat ccagaaccac ttgaagaaaa ttgcgctaaa 1440
gccctgactt taaggataca tgattctttg aataatagcc ttccaattgg ccttgtgcct 1500
actaattcaa caaacactgt catggaccaa aaaaatttga agatgtcaac tcctggccaa 1560
atgaaagccc aagaaattga aagaacccct ccaacaaact ttaaaaggac attagaagag 1620
tccaattctg gccccctgat gaagaagcat agacgaaatg gcttaagtcg aagtagtggt 1680
gctcagcctg caagtctccc cacaacctca cagcgaaaga actctgttaa actcaccatg 1740
cgacgcagac ttaggggcca gaagaaaatt ggaaatcctt tacttcatca acacaggaaa 1800
actgtttgtg tttgc 1815
<210> 44
<211> 468
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 44
atgggcgcct ccaggctcta taccctggtg ctggtcctgc agcctcagcg agttctcctg 60
ggcatgaaaa agcgaggctt cggggccggc cggtggaatg gctttggggg caaagtgcaa 120
gaaggagaga ccatcgagga tggggctagg agggagctgc aggaggagag cggtctgaca 180
gtggacgccc tgcacaaggt gggccagatc gtgtttgagt tcgtgggcga gcctgagctc 240
atggacgtgc atgtcttctg cacagacagc atccagggga cccccgtgga gagcgacgaa 300
atgcgcccat gctggttcca gctggatcag atccccttca aggacatgtg gcccgacgac 360
agctactggt ttccactcct gcttcagaag aagaaattcc acgggtactt caagttccag 420
ggtcaggaca ccatcctgga ctacacactc cgcgaggtgg acacggtc 468
<210> 45
<211> 492
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 45
atgacggcca gcgcacagcc gcgcgggcgg cggccaggag tcggagtcgg agtcgtggtg 60
accagctgca agcatccgcg ttgcgtcctc ctggggaaga ggaaaggctc ggttggagct 120
ggcagtttcc aactccctgg aggtcatctg gagttcggtg aaacctggga agaatgtgct 180
caaagggaaa cctgggaaga agcagctctt cacctgaaaa atgttcactt tgcctcagtt 240
gtgaattctt tcattgagaa ggagaattac cattatgtta ctatattaat gaaaggagaa 300
gtggatgtga ctcatgattc agaaccaaag aatgtagagc ctgaaaaaaa tgaaagttgg 360
gagtgggttc cttgggaaga actacctccc ctggaccagc ttttctgggg actgcgttgt 420
ttaaaagaac aaggctatga tccatttaaa gaagatctga accatctggt gggatacaaa 480
ggaaatcatc tc 492
<210> 46
<211> 969
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 46
atggcctcgg agggcctggc gggggcgctg gcttccgtgc tggctggcca ggggtccagc 60
gtgcacagct gcgactcggc gccggccggg gagccgccgg cgcccgtgcg gctgcggaag 120
aacgtgtgct acgtggtgct ggccgtgttc ctcagcgagc aggatgaggt gctactgatc 180
caggaggcca agagggagtg ccgggggtcg tggtacctgc ctgcggggag aatggagcca 240
ggggagacca tcgtggaggc gctgcagcgg gaggtgaagg aggaggcggg gctgcactgt 300
gagcccgaga cactgctgtc cgtggaggag cggggcccct cctgggtccg cttcgtgttc 360
ctcgctcgcc ccacaggtgg aattctcaag acttccaagg aggccgatgc ggagtccctg 420
caggctgcct ggtacccacg gacctccctg cccactccgc tgcgagccca tgacatcctg 480
cacctggttg aactagccgc ccagtatcgc cagcaagcca ggcaccctct cattctgccc 540
caagagctac cctgtgatct ggtctgccag cggctcgtgg ctacctttac cagcgcccag 600
acagtgtggg tgttagtggg cacagtgggg atgcctcact tgcctgtcac tgcctgtggc 660
ctcgacccta tggagcagag gggtggcatg aagatggccg tcctgcggct gctgcaggag 720
tgtctgaccc tgcaccactt ggtggtggag atcaaggggt tgcttggact gcagcacctg 780
ggccgagatc acagtgatgg catctgtttg aatgtgctgg tgaccgtggc ttttcggagc 840
ccagggatcc aggatgaacc cccaaaagtt cggggtgaga acttctcttg gtggaaggtg 900
atggaggaag acctgcaaag ccagctcctc cagcggcttc agggatcctc tgttgtccca 960
gtgaacaga 969
<210> 47
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 47
atggtggaca cggaaagccc actctgcccc ctctccccac tcgaggccgg cgatctagag 60
agcccgttat ctgaagagtt cctgcaagaa atgggaaaca tccaagagat ttcgcaatcc 120
atcggcgagg atagttctgg aagctttggc tttacggaat accagtattt aggaagctgt 180
cctggctcag atggctcggt catcacggac acgctttcac cagcttcgag cccctcctcg 240
gtgacttatc ctgtggtccc cggcagcgtg gacgagtctc ccagtggagc attgaacatc 300
gaatgtagaa tctgcgggga caaggcctca ggctatcatt acggagtcca cgcgtgtgaa 360
ggctgcaagg gcttctttcg gcgaacgatt cgactcaagc tggtgtatga caagtgcgac 420
cgcagctgca agatccagaa aaagaacaga aacaaatgcc agtattgtcg atttcacaag 480
tgcctttctg tcgggatgtc acacaacgcg attcgttttg gacgaatgcc aagatctgag 540
aaagcaaaac tgaaagcaga aattcttacc tgtgaacatg acatagaaga ttctgaaact 600
gcagatctca aatctctggc caagagaatc tacgaggcct acttgaagaa cttcaacatg 660
aacaaggtca aagcccgggt catcctctca ggaaaggcca gtaacaatcc accttttgtc 720
atacatgata tggagacact gtgtatggct gagaagacgc tggtggccaa gctggtggcc 780
aatggcatcc agaacaagga ggcggaggtc cgcatctttc actgctgcca gtgcacgtca 840
gtggagaccg tcacggagct cacggaattc gccaaggcca tcccaggctt cgcaaacttg 900
gacctgaacg atcaagtgac attgctaaaa tacggagttt atgaggccat attcgccatg 960
ctgtcttctg tgatgaacaa agacgggatg ctggtagcgt atggaaatgg gtttataact 1020
cgtgaattcc taaaaagcct aaggaaaccg ttctgtgata tcatggaacc caagtttgat 1080
tttgccatga agttcaatgc actggaactg gatgacagtg atatctccct ttttgtggct 1140
gctatcattt gctgtggaga tcgtcctggc cttctaaacg taggacacat tgaaaaaatg 1200
caggagggta ttgtacatgt gctcagactc cacctgcaga gcaaccaccc ggacgatatc 1260
tttctcttcc caaaacttct tcaaaaaatg gcagacctcc ggcagctggt gacggagcat 1320
gcgcagctgg tgcagatcat caagaagacg gagtcggatg ctgcgctgca cccgctactg 1380
caggagatct acagggacat gtac 1404
<210> 48
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 48
atgaccatgg ttgacacaga gatgccattc tggcccacca actttgggat cagctccgtg 60
gatctctccg taatggaaga ccactcccac tcctttgata tcaagccctt cactactgtt 120
gacttctcca gcatttctac tccacattac gaagacattc cattcacaag aacagatcca 180
gtggttgcag attacaagta tgacctgaaa cttcaagagt accaaagtgc aatcaaagtg 240
gagcctgcat ctccacctta ttattctgag aagactcagc tctacaataa gcctcatgaa 300
gagccttcca actccctcat ggcaattgaa tgtcgtgtct gtggagataa agcttctgga 360
tttcactatg gagttcatgc ttgtgaagga tgcaagggtt tcttccggag aacaatcaga 420
ttgaagctta tctatgacag atgtgatctt aactgtcgga tccacaaaaa aagtagaaat 480
aaatgtcagt actgtcggtt tcagaaatgc cttgcagtgg ggatgtctca taatgccatc 540
aggtttgggc ggatgccaca ggccgagaag gagaagctgt tggcggagat ctccagtgat 600
atcgaccagc tgaatccaga gtccgctgac ctccgggccc tggcaaaaca tttgtatgac 660
tcatacataa agtccttccc gctgaccaaa gcaaaggcga gggcgatctt gacaggaaag 720
acaacagaca aatcaccatt cgttatctat gacatgaatt ccttaatgat gggagaagat 780
aaaatcaagt tcaaacacat cacccccctg caggagcaga gcaaagaggt ggccatccgc 840
atctttcagg gctgccagtt tcgctccgtg gaggctgtgc aggagatcac agagtatgcc 900
aaaagcattc ctggttttgt aaatcttgac ttgaacgacc aagtaactct cctcaaatat 960
ggagtccacg agatcattta cacaatgctg gcctccttga tgaataaaga tggggttctc 1020
atatccgagg gccaaggctt catgacaagg gagtttctaa agagcctgcg aaagcctttt 1080
ggtgacttta tggagcccaa gtttgagttt gctgtgaagt tcaatgcact ggaattagat 1140
gacagcgact tggcaatatt tattgctgtc attattctca gtggagaccg cccaggtttg 1200
ctgaatgtga agcccattga agacattcaa gacaacctgc tacaagccct ggagctccag 1260
ctgaagctga accaccctga gtcctcacag ctgtttgcca agctgctcca gaaaatgaca 1320
gacctcagac agattgtcac ggaacacgtg cagctactgc aggtgatcaa gaagacggag 1380
acagacatga gtcttcaccc gctcctgcag gagatctaca aggacttgta c 1431
<210> 49
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 49
atgggtgaaa ctctgggaga ttctcctatt gacccagaaa gcgattcctt cactgataca 60
ctgtctgcaa acatatcaca agaaatgacc atggttgaca cagagatgcc attctggccc 120
accaactttg ggatcagctc cgtggatctc tccgtaatgg aagaccactc ccactccttt 180
gatatcaagc ccttcactac tgttgacttc tccagcattt ctactccaca ttacgaagac 240
attccattca caagaacaga tccagtggtt gcagattaca agtatgacct gaaacttcaa 300
gagtaccaaa gtgcaatcaa agtggagcct gcatctccac cttattattc tgagaagact 360
cagctctaca ataagcctca tgaagagcct tccaactccc tcatggcaat tgaatgtcgt 420
gtctgtggag ataaagcttc tggatttcac tatggagttc atgcttgtga aggatgcaag 480
ggtttcttcc ggagaacaat cagattgaag cttatctatg acagatgtga tcttaactgt 540
cggatccaca aaaaaagtag aaataaatgt cagtactgtc ggtttcagaa atgccttgca 600
gtggggatgt ctcataatgc catcaggttt gggcggatgc cacaggccga gaaggagaag 660
ctgttggcgg agatctccag tgatatcgac cagctgaatc cagagtccgc tgacctccgg 720
gccctggcaa aacatttgta tgactcatac ataaagtcct tcccgctgac caaagcaaag 780
gcgagggcga tcttgacagg aaagacaaca gacaaatcac cattcgttat ctatgacatg 840
aattccttaa tgatgggaga agataaaatc aagttcaaac acatcacccc cctgcaggag 900
cagagcaaag aggtggccat ccgcatcttt cagggctgcc agtttcgctc cgtggaggct 960
gtgcaggaga tcacagagta tgccaaaagc attcctggtt ttgtaaatct tgacttgaac 1020
gaccaagtaa ctctcctcaa atatggagtc cacgagatca tttacacaat gctggcctcc 1080
ttgatgaata aagatggggt tctcatatcc gagggccaag gcttcatgac aagggagttt 1140
ctaaagagcc tgcgaaagcc ttttggtgac tttatggagc ccaagtttga gtttgctgtg 1200
aagttcaatg cactggaatt agatgacagc gacttggcaa tatttattgc tgtcattatt 1260
ctcagtggag accgcccagg tttgctgaat gtgaagccca ttgaagacat tcaagacaac 1320
ctgctacaag ccctggagct ccagctgaag ctgaaccacc ctgagtcctc acagctgttt 1380
gccaagctgc tccagaaaat gacagacctc agacagattg tcacggaaca cgtgcagcta 1440
ctgcaggtga tcaagaagac ggagacagac atgagtcttc acccgctcct gcaggagatc 1500
tacaaggact tgtac 1515
<210> 50
<211> 2241
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 50
atggcggacg aggcggccct cgcccttcag cccggcggct ccccctcggc ggcgggggcc 60
gacagggagg ccgcgtcgtc ccccgccggg gagccgctcc gcaagaggcc gcggagagat 120
ggtcccggcc tcgagcggag cccgggcgag cccggtgggg cggccccaga gcgtgaggtg 180
ccggcggcgg ccaggggctg cccgggtgcg gcggcggcgg cgctgtggcg ggaggcggag 240
gcagaggcgg cggcggcagg cggggagcaa gaggcccagg cgactgcggc ggctggggaa 300
ggagacaatg ggccgggcct gcagggccca tctcgggagc caccgctggc cgacaacttg 360
tacgacgaag acgacgacga cgagggcgag gaggaggaag aggcggcggc ggcggcgatt 420
gggtaccgag ataaccttct gttcggtgat gaaattatca ctaatggttt tcattcctgt 480
gaaagtgatg aggaggatag agcctcacat gcaagctcta gtgactggac tccaaggcca 540
cggataggtc catatacttt tgttcagcaa catcttatga ttggcacaga tcctcgaaca 600
attcttaaag atttattgcc ggaaacaata cctccacctg agttggatga tatgacactg 660
tggcagattg ttattaatat cctttcagaa ccaccaaaaa ggaaaaaaag aaaagatatt 720
aatacaattg aagatgctgt gaaattactg caagagtgca aaaaaattat agttctaact 780
ggagctgggg tgtctgtttc atgtggaata cctgacttca ggtcaaggga tggtatttat 840
gctcgccttg ctgtagactt cccagatctt ccagatcctc aagcgatgtt tgatattgaa 900
tatttcagaa aagatccaag accattcttc aagtttgcaa aggaaatata tcctggacaa 960
ttccagccat ctctctgtca caaattcata gccttgtcag ataaggaagg aaaactactt 1020
cgcaactata cccagaacat agacacgctg gaacaggttg cgggaatcca aaggataatt 1080
cagtgtcatg gttcctttgc aacagcatct tgcctgattt gtaaatacaa agttgactgt 1140
gaagctgtac gaggagatat ttttaatcag gtagttcctc gatgtcctag gtgcccagct 1200
gatgaaccgc ttgctatcat gaaaccagag attgtgtttt ttggtgaaaa tttaccagaa 1260
cagtttcata gagccatgaa gtatgacaaa gatgaagttg acctcctcat tgttattggg 1320
tcttccctca aagtaagacc agtagcacta attccaagtt ccatacccca tgaagtgcct 1380
cagatattaa ttaatagaga acctttgcct catctgcatt ttgatgtaga gcttcttgga 1440
gactgtgatg tcataattaa tgaattgtgt cataggttag gtggtgaata tgccaaactt 1500
tgctgtaacc ctgtaaagct ttcagaaatt actgaaaaac ctccacgaac acaaaaagaa 1560
ttggcttatt tgtcagagtt gccacccaca cctcttcatg tttcagaaga ctcaagttca 1620
ccagaaagaa cttcaccacc agattcttca gtgattgtca cacttttaga ccaagcagct 1680
aagagtaatg atgatttaga tgtgtctgaa tcaaaaggtt gtatggaaga aaaaccacag 1740
gaagtacaaa cttctaggaa tgttgaaagt attgctgaac agatggaaaa tccggatttg 1800
aagaatgttg gttctagtac tggggagaaa aatgaaagaa cttcagtggc tggaacagtg 1860
agaaaatgct ggcctaatag agtggcaaag gagcagatta gtaggcggct tgatggtaat 1920
cagtatctgt ttttgccacc aaatcgttac attttccatg gcgctgaggt atattcagac 1980
tctgaagatg acgtcttatc ctctagttct tgtggcagta acagtgatag tgggacatgc 2040
cagagtccaa gtttagaaga acccatggag gatgaaagtg aaattgaaga attctacaat 2100
ggcttagaag atgagcctga tgttccagag agagctggag gagctggatt tgggactgat 2160
ggagatgatc aagaggcaat taatgaagct atatctgtga aacaggaagt aacagacatg 2220
aactatccat caaacaaatc a 2241
<210> 51
<211> 4323
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 51
atggcgacgg cggcggcagc ggcggcggtg atggctcctc cgggctgccc gggttcgtgc 60
cccaacttcg ccgtagtctg ctccttcttg gagcgctacg ggccgctgct agacctgcct 120
gagttgccgt tccctgagct ggagcgggtg ctgcaggcgc cgccgccgga cgtcggcaac 180
ggagaagtac caaaagaatt ggtggagctc catttgaagc tgatgaggaa aattggcaaa 240
tctgttactg cagacagatg ggaaaaatat ttgatcaaga tatgccaaga gtttaacagt 300
acctgggcat gggagatgga gaagaagggc tatcttgaaa tgagtgttga atgcaaacta 360
gcactcttaa agtacctctg tgagtgtcag tttgatgaca atctcaaatt caagaatatt 420
attaatgagg aggatgccga tactatgcgt ctccagccaa ttggtcgaga caaagatggc 480
ctcatgtact ggtaccaatt ggatcaagat cacaatgtca gaatgtacat agaagaacaa 540
gatgatcaag atggctcttc atggaaatgc attgtcagaa atcgaaacga gttggctgag 600
actcttgcac tcctgaaagc acaaattgat cctgtactat tgaaaaactc tagccaacaa 660
gacaactctt ctcgggaaag tcccagctta gaggatgagg agactaaaaa agaggaagaa 720
acacctaaac aagaggaaca gaaagaaagt gaaaagatga aaagtgagga gcagcctatg 780
gatttagaaa accgttctac agccaatgtt ctagaagaga ctactgtgaa aaaagaaaaa 840
gaagatgaaa aggaacttgt gaaactgcca gtcatagtga agctagaaaa acctttgcca 900
gaaaatgaag aaaaaaagat tatcaaagaa gaaagtgatt ccttcaagga aaatgtcaaa 960
cccattaaag ttgaggtgaa ggaatgtaga gcagatccta aagataccaa aagtagcatg 1020
gagaagccag tggcacagga gcctgaaagg atcgaatttg gtggcaatat taaatcttct 1080
cacgaaatta ctgagaaatc tactgaagaa actgagaaac ttaaaaatga ccagcaggcc 1140
aagataccac taaaaaaacg agaaattaaa ctgagtgatg attttgacag tccagtcaag 1200
ggacctttgt gtaaatcagt tactccaaca aaagagtttt tgaaagatga aataaaacaa 1260
gaggaagaga cttgtaaaag gatctctaca atcactgctt tgggtcatga agggaaacag 1320
ctggtaaatg gagaagttag tgatgaaagg gtagctccaa attttaagac agaaccaata 1380
gagacaaagt tttatgagac aaaggaagag agctatagcc cctctaagga cagaaatatc 1440
atcacggagg gaaatggaac agagtcctta aattctgtca taacaagtat gaaaacaggt 1500
gagcttgaga aagaaacagc ccctttgagg aaagatgcag atagttcaat atcagtctta 1560
gagatccata gtcaaaaagc acaaatagag gaacccgatc ctccagaaat ggaaacttct 1620
cttgattctt ctgagatggc aaaagatctc tcttcaaaaa ctgctttatc ttccaccgag 1680
tcgtgtacca tgaaaggtga agagaagtct cccaaaacta agaaggataa gcgcccacca 1740
atcctagaat gtcttgaaaa gttagagaag tccaaaaaga cttttcttga taaggacgca 1800
caaagattga gtccaatacc agaagaagtt ccaaagagta ctctagagtc agaaaagcct 1860
ggctctcctg aggcagctga aacttctcca ccatctaata tcattgacca ctgtgagaaa 1920
ctagcctcag aaaaagaagt ggtagaatgc cagagtacaa gtactgttgg tggccagtct 1980
gtgaaaaaag tagacctaga aaccctaaaa gaggattctg agttcacaaa ggtagaaatg 2040
gataatctgg acaatgccca gacctctggc atagaggagc cttctgagac aaagggttct 2100
atgcaaaaaa gcaaattcaa atataagttg gttcctgaag aagaaaccac tgcctcagaa 2160
aatacagaga taacctctga aaggcagaaa gagggcatca aattaacaat caggatatca 2220
agtcggaaaa agaagcccga ttctcccccc aaagttctag aaccagaaaa caagcaagag 2280
aagacagaaa aggaagagga gaaaacaaat gtgggtcgta ctttaagaag atctccaaga 2340
atatctagac ccactgcaaa agtggctgag atcagagatc agaaagctga taaaaaaaga 2400
ggggaaggag aagatgaggt ggaagaagag tcaacagctt tgcaaaaaac tgacaaaaag 2460
gaaattttga aaaaatcaga gaaagataca aattctaaag taagcaaggt aaaacccaaa 2520
ggcaaagttc gatggactgg ttctcggaca cgtggcagat ggaaatattc cagcaatgat 2580
gaaagtgaag ggtctggcag tgaaaaatca tctgcagctt cagaagagga ggaagaaaag 2640
gaaagtgaag aagccatcct agcagatgat gatgaaccat gcaaaaaatg tggccttcca 2700
aaccatcctg agctaattct tctgtgtgac tcttgcgata gtggatacca tactgcctgc 2760
cttcgccctc ctctgatgat catcccagat ggagaatggt tctgcccacc ttgccaacat 2820
aaactgctct gtgaaaaatt agaggaacag ttgcaggatt tggatgttgc cttaaagaag 2880
aaagagcgtg ccgaacgaag aaaagaacgc ttggtgtatg ttggtatcag tattgaaaac 2940
atcattcctc cacaagagcc agacttttct gaagatcaag aagaaaagaa aaaagattca 3000
aaaaaatcca aagcaaactt gcttgaaagg aggtcaacaa gaacaaggaa atgtataagc 3060
tacagatttg atgagtttga tgaagcaatt gatgaagcta ttgaagatga catcaaagaa 3120
gccgatggag gaggagttgg ccgaggaaaa gatatctcca ccatcacagg tcatcgtggg 3180
aaagacatct ctactatttt ggatgaagaa agaaaagaaa ataaacgacc ccagagggca 3240
gctgctgctc gaaggaagaa acgccggcga ttaaatgatc tggacagtga tagcaacctg 3300
gatgaagaag agagcgagga tgaattcaag atcagtgatg gatctcaaga tgagtttgtt 3360
gtgtctgatg aaaacccaga tgaaagtgaa gaagatccgc catctaatga tgacagtgac 3420
actgactttt gtagccgtag actgaggcga cacccctctc ggccaatgag gcagagcagg 3480
cgtttgcgaa gaaagacccc aaagaaaaaa tattccgatg atgatgaaga ggaggaatct 3540
gaggagaata gtagagactc tgaaagtgac ttcagtgatg attttagtga tgattttgta 3600
gaaactcggc gaaggcggtc aaggagaaat cagaaaagac aaattaacta caaagaagac 3660
tcagaaagtg acggttccca gaagagtttg cgacgtggta aagaaataag gcgagtacac 3720
aagcgaagac tttccagctc agagagtgaa gagagctatt tgtccaagaa ctctgaagat 3780
gatgagctag ctaaagaatc aaagcggtca gttcgaaagc ggggccgaag cacagacgag 3840
tattcagaag cagatgagga ggaggaggaa gaggaaggca aaccatcccg caaacggcta 3900
caccggattg agacggatga ggaggagagt tgtgacaatg ctcatggaga tgcaaatcag 3960
cctgcccgtg acagccagcc tagggtcctg ccctcagaac aagagagcac caagaagccc 4020
taccggatag aaagtgatga ggaagaggac tttgaaaatg taggcaaagt ggggagccca 4080
ttggactata gcttagtgga cttaccttca accaatggac agagccctgg caaagccatt 4140
gagaacttga ttggcaagcc tactgagaag tctcagaccc ccaaggacaa cagcacagcc 4200
agtgcaagcc tagcctccaa tgggacaagt ggtgggcagg aggcaggagc accagaagag 4260
gaggaagatg agcttttgag agtgactgac cttgttgatt atgtctgtaa cagtgaacag 4320
tta 4323
<210> 52
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 52
atgtcaaggg ttccaagtcc tccacctccg gcagaaatgt cgagtggccc cgtagctgag 60
agttggtgct acacacagat caaggtagtg aaattctcct acatgtggac catcaataac 120
tttagctttt gccgggagga aatgggtgaa gtcattaaaa gttctacatt ttcatcagga 180
gcaaatgata aactgaaatg gtgtttgcga gtaaacccca aagggttaga tgaagaaagc 240
aaagattacc tgtcacttta cctgttactg gtcagctgtc caaagagtga agttcgggca 300
aaattcaaat tctccatcct gaatgccaag ggagaagaaa ccaaagctat ggagagtcaa 360
cgggcatata ggtttgtgca aggcaaagac tggggattca agaaattcat ccgtagagat 420
tttcttttgg atgaggccaa cgggcttctc cctgatgaca agcttaccct cttctgcgag 480
gtgagtgttg tgcaagattc tgtcaacatt tctggccaga ataccatgaa catggtaaag 540
gttcctgagt gccggctggc agatgagtta ggaggactgt gggagaattc ccggttcaca 600
gactgctgct tgtgtgttgc cggccaggaa ttccaggctc acaaggctat cttagcagct 660
cgttctccgg tttttagtgc catgtttgaa catgaaatgg aggagagcaa aaagaatcga 720
gttgaaatca atgatgtgga gcctgaagtt tttaaggaaa tgatgtgctt catttacacg 780
gggaaggctc caaacctcga caaaatggct gatgatttgc tggcagctgc tgacaagtat 840
gccctggagc gcttaaaggt catgtgtgag gatgccctct gcagtaacct gtccgtggag 900
aacgctgcag aaattctcat cctggccgac ctccacagtg cagatcagtt gaaaactcag 960
gcagtggatt tcatcaacta tcatgcttcg gatgtcttgg agacctctgg gtggaagtca 1020
atggtggtgt cacatcccca cttggtggct gaggcatacc gctctctggc ttcagcacag 1080
tgcccttttc tgggaccccc acgcaaacgc ctgaagcaat cc 1122
<210> 53
<211> 738
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 53
atgggacccc agcatttgag acttgtgcag ctgttctgcc ttctaggggc catctccact 60
ctgcctcggg ctggagctct tttgtgctat gaagcaacag cctcaagatt cagagctgtt 120
gctttccata actggaagtg gcttctgatg aggaacatgg tgtgtaagct gcaagagggc 180
tgcgaggaga cgctagtgtt cattgagaca gggactgcaa ggggagtcgt gggctttaaa 240
ggctgcagct cgtcttcgtc ttaccctgcg caaatctcct accttgtttc cccacccgga 300
gtgtccattg cctcctacag tcgcgtctgc cggtcttatc tctgcaacaa cctcaccaat 360
ttggagcctt ttgtgaaact caaggccagc actcctaagt ctatcacatc tgcgtcctgt 420
agctgcccga cctgtgtggg cgagcacatg aaggattgcc tcccaaattt tgtcaccact 480
aattcttgcc ccttggctgc ttctacgtgt tacagttcca ccttaaaatt tcaggcaggg 540
tttctcaata ccaccttcct cctcatgggg tgtgctcgtg aacataacca gcttttagca 600
gattttcatc atattgggag catcaaagtg actgaggtcc tcaacatctt agagaagtct 660
cagattgttg gtgcagcatc ctccaggcaa gatcctgctt ggggtgtcgt cttaggcctc 720
ctgtttgcct tcagggac 738
<210> 54
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 54
atggtcagaa agcctgttgt gtccaccatc tccaaaggag gttacctgca gggaaatgtt 60
aacgggaggc tgccttccct gggcaacaag gagccacctg ggcaggagaa agtgcagctg 120
aagaggaaag tcactttact gaggggagtc tccattatca ttggcaccat cattggagca 180
ggaatcttca tctctcctaa gggcgtgctc cagaacacgg gcagcgtggg catgtctctg 240
accatctgga cggtgtgtgg ggtcctgtca ctatttggag ctttgtctta tgctgaattg 300
ggaacaacta taaagaaatc tggaggtcat tacacatata ttttggaagt ctttggtcca 360
ttaccagctt ttgtacgagt ctgggtggaa ctcctcataa tacgccctgc agctactgct 420
gtgatatccc tggcatttgg acgctacatt ctggaaccat tttttattca atgtgaaatc 480
cctgaacttg cgatcaagct cattacagct gtgggcataa ctgtagtgat ggtcctaaat 540
agcatgagtg tcagctggag cgcccggatc cagattttct taaccttttg caagctcaca 600
gcaattctga taattatagt ccctggagtt atgcagctaa ttaaaggtca aacgcagaac 660
tttaaagacg ccttttcagg aagagattca agtattacgc ggttgccact ggctttttat 720
tatggaatgt atgcatatgc tggctggttt tacctcaact ttgttactga agaagtagaa 780
aaccctgaaa aaaccattcc ccttgcaata tgtatatcca tggccattgt caccattggc 840
tatgtgctga caaatgtggc ctactttacg accattaatg ctgaggagct gctgctttca 900
aatgcagtgg cagtgacctt ttctgagcgg ctactgggaa atttctcatt agcagttccg 960
atctttgttg ccctctcctg ctttggctcc atgaacggtg gtgtgtttgc tgtctccagg 1020
ttattctatg ttgcgtctcg agagggtcac cttccagaaa tcctctccat gattcatgtc 1080
cgcaagcaca ctcctctacc agctgttatt gttttgcacc ctttgacaat gataatgctc 1140
ttctctggag acctcgacag tcttttgaat ttcctcagtt ttgccaggtg gctttttatt 1200
gggctggcag ttgctgggct gatttatctt cgatacaaat gcccagatat gcatcgtcct 1260
ttcaaggtgc cactgttcat cccagctttg ttttccttca catgcctctt catggttgcc 1320
ctttccctct attcggaccc atttagtaca gggattggct tcgtcatcac tctgactgga 1380
gtccctgcgt attatctctt tattatatgg gacaagaaac ccaggtggtt tagaataatg 1440
tcagagaaaa taaccagaac attacaaata atactggaag ttgtaccaga agaagataag 1500
tta 1503
<210> 55
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 55
atgcatcctg ccgtcttcct atccttaccc gacctcagat gctcccttct gctcctggta 60
acttgggttt ttactcctgt aacaactgaa ataacaagtc ttgatacaga gaatatagat 120
gaaattttaa acaatgctga tgttgcttta gtaaattttt atgctgactg gtgtcgtttc 180
agtcagatgt tgcatccaat ttttgaggaa gcttccgatg tcattaagga agaatttcca 240
aatgaaaatc aagtagtgtt tgccagagtt gattgtgatc agcactctga catagcccag 300
agatacagga taagcaaata cccaaccctc aaattgtttc gtaatgggat gatgatgaag 360
agagaataca ggggtcagcg atcagtgaaa gcattggcag attacatcag gcaacaaaaa 420
agtgacccca ttcaagaaat tcgggactta gcagaaatca ccactcttga tcgcagcaaa 480
agaaatatca ttggatattt tgagcaaaag gactcggaca actatagagt ttttgaacga 540
gtagcgaata ttttgcatga tgactgtgcc tttctttctg catttgggga tgtttcaaaa 600
ccggaaagat atagtggcga caacataatc tacaaaccac cagggcattc tgctccggat 660
atggtgtact tgggagctat gacaaatttt gatgtgactt acaattggat tcaagataaa 720
tgtgttcctc ttgtccgaga aataacattt gaaaatggag aggaattgac agaagaagga 780
ctgccttttc tcatactctt tcacatgaaa gaagatacag aaagtttaga aatattccag 840
aatgaagtag ctcggcaatt aataagtgaa aaaggtacaa taaacttttt acatgccgat 900
tgtgacaaat ttagacatcc tcttctgcac atacagaaaa ctccagcaga ttgtcctgta 960
atcgctattg acagctttag gcatatgtat gtgtttggag acttcaaaga tgtattaatt 1020
cctggaaaac tcaagcaatt cgtatttgac ttacattctg gaaaactgca cagagaattc 1080
catcatggac ctgacccaac tgatacagcc ccaggagagc aagcccaaga tgtagcaagc 1140
agtccacctg agagctcctt ccagaaacta gcacccagtg aatataggta tactctattg 1200
agggatcgag atgagctt 1218
<210> 56
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 56
atgcgcctcc gccgcctagc gctgttcccg ggtgtggcgc tgcttcttgc cgcggcccgc 60
ctcgccgctg cctccgacgt gctagaactc acggacgaca acttcgagag tcgcatctcc 120
gacacgggct ctgcgggcct catgctcgtc gagttcttcg ccccctggtg tggacactgc 180
aagagacttg cacctgagta tgaagctgca gctaccagat taaaaggaat agtcccatta 240
gcaaaggttg attgcactgc caacactaac acctgtaata aatatggagt cagtggatat 300
ccaaccctga agatatttag agatggtgaa gaagcaggtg cttatgatgg acctaggact 360
gctgatggaa ttgtcagcca cttgaagaag caggcaggac cagcttcagt gcctctcagg 420
actgaggaag aatttaagaa attcattagt gataaagatg cctctatagt aggttttttc 480
gatgattcat tcagtgaggc tcactccgag ttcctaaaag cagccagcaa cttgagggat 540
aactaccgat ttgcacatac gaatgttgag tctctggtga acgagtatga tgataatgga 600
gagggtatca tcttatttcg tccttcacat ctcactaaca agtttgagga caagactgtg 660
gcatatacag agcaaaaaat gaccagtggc aaaattaaaa agtttatcca ggaaaacatt 720
tttggtatct gccctcacat gacagaagac aataaagatt tgatacaggg caaggactta 780
cttattgctt actatgatgt ggactatgaa aagaacgcta aaggttccaa ctactggaga 840
aacagggtaa tgatggtggc aaagaaattc ctggatgctg ggcacaaact caactttgct 900
gtagctagcc gcaaaacctt tagccatgaa ctttctgatt ttggcttgga gagcactgct 960
ggagagattc ctgttgttgc tatcagaact gctaaaggag agaagtttgt catgcaggag 1020
gagttctcgc gtgatgggaa ggctctggag aggttcctgc aggattactt tgatggcaat 1080
ctgaagagat acctgaagtc tgaacctatc ccagagagca atgatgggcc tgtgaaggta 1140
gtggtagcag agaattttga tgaaatagtg aataatgaaa ataaagatgt gctgattgaa 1200
ttttatgccc cttggtgtgg tcactgtaag aacctggagc ccaagtataa agaacttggc 1260
gagaagctca gcaaagaccc aaatatcgtc atagccaaga tggatgccac agccaatgat 1320
gtgccttctc catatgaagt cagaggtttt cctaccatat acttctctcc agccaacaag 1380
aagctaaatc caaagaaata tgaaggtggc cgtgaattaa gtgattttat tagctatcta 1440
caaagagaag ctacaaaccc ccctgtaatt caagaagaaa aacccaagaa gaagaagaag 1500
gcacaggagg atctc 1515
<210> 57
<211> 822
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 57
atggaagctg ccccgtccag gttcatgttc ctcttatttc tcctcacgtg tgagctggct 60
gcagaagttg ctgcagaagt tgagaaatcc tcagatggtc ctggtgctgc ccaggaaccc 120
acgtggctca cagatgtccc agctgccatg gaattcattg ctgccactga ggtggctgtc 180
ataggcttct tccaggattt agaaatacca gcagtgccca tactccatag catggtgcaa 240
aaattcccag gcgtgtcatt tgggatcagc actgattctg aggttctgac acactacaac 300
atcactggga acaccatctg cctctttcgc ctggtagaca atgaacaact gaatttagag 360
gacgaagaca ttgaaagcat tgatgccacc aaattgagcc gtttcattga gatcaacagc 420
ctccacatgg tgacagagta caaccctgtg actgtgattg ggttattcaa cagcgtaatt 480
cagattcatc tcctcctgat aatgaacaag gcctccccag agtatgaaga gaacatgcac 540
agataccaga aggcagccaa gctcttccag gggaagattc tctttattct ggtggacagt 600
ggtatgaaag aaaatgggaa ggtgatatca tttttcaaac taaaggagtc tcaactgcca 660
gctttggcaa tttaccagac tctagatgac gagtgggata cactgcccac agcagaagtt 720
tccgtagagc atgtgcaaaa cttttgtgat ggattcctaa gtggaaaatt gttgaaagaa 780
aatcgtgaat cagaaggaaa gactccaaag gtggaactct ga 822
<210> 58
<211> 1872
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 58
atgcagccag atcccaggcc tagcggggct ggggcctgct gccgattcct gcccctgcag 60
tcacagtgcc ctgagggggc aggggacgcg gtgatgtacg cctccactga gtgcaaggcg 120
gaggtgacgc cctcccagca tggcaaccgc accttcagct acaccctgga ggatcatacc 180
aagcaggcct ttggcatcat gaacgagctg cggctcagcc agcagctgtg tgacgtcaca 240
ctgcaggtca agtaccagga tgcaccggcc gcccagttca tggcccacaa ggtggtgctg 300
gcctcatcca gccctgtctt caaggccatg ttcaccaacg ggctgcggga gcagggcatg 360
gaggtggtgt ccattgaggg tatccacccc aaggtcatgg agcgcctcat tgaattcgcc 420
tacacggcct ccatctccat gggcgagaag tgtgtcctcc acgtcatgaa cggtgctgtc 480
atgtaccaga tcgacagcgt tgtccgtgcc tgcagtgact tcctggtgca gcagctggac 540
cccagcaatg ccatcggcat cgccaacttc gctgagcaga ttggctgtgt ggagttgcac 600
cagcgtgccc gggagtacat ctacatgcat tttggggagg tggccaagca agaggagttc 660
ttcaacctgt cccactgcca actggtgacc ctcatcagcc gggacgacct gaacgtgcgc 720
tgcgagtccg aggtcttcca cgcctgcatc aactgggtca agtacgactg cgaacagcga 780
cggttctacg tccaggcgct gctgcgggcc gtgcgctgcc actcgttgac gccgaacttc 840
ctgcagatgc agctgcagaa gtgcgagatc ctgcagtccg actcccgctg caaggactac 900
ctggtcaaga tcttcgagga gctcaccctg cacaagccca cgcaggtgat gccctgccgg 960
gcgcccaagg tgggccgcct gatctacacc gcgggcggct acttccgaca gtcgctcagc 1020
tacctggagg cttacaaccc cagtgacggc acctggctcc ggttggcgga cctgcaggtg 1080
ccgcggagcg gcctggccgg ctgcgtggtg ggcgggctgt tgtacgccgt gggcggcagg 1140
aacaactcgc ccgacggcaa caccgactcc agcgccctgg actgttacaa ccccatgacc 1200
aatcagtggt cgccctgcgc ccccatgagc gtgccccgta accgcatcgg ggtgggggtc 1260
atcgatggcc acatctatgc cgtcggcggc tcccacggct gcatccacca caacagtgtg 1320
gagaggtatg agccagagcg ggatgagtgg cacttggtgg ccccaatgct gacacgaagg 1380
atcggggtgg gcgtggctgt cctcaatcgt ctcctttatg ccgtgggggg ctttgacggg 1440
acaaaccgcc ttaattcagc tgagtgttac tacccagaga ggaacgagtg gcgaatgatc 1500
acagcaatga acaccatccg aagcggggca ggcgtctgcg tcctgcacaa ctgtatctat 1560
gctgctgggg gctatgatgg tcaggaccag ctgaacagcg tggagcgcta cgatgtggaa 1620
acagagacgt ggactttcgt agcccccatg aagcaccggc gaagtgccct ggggatcact 1680
gtccaccagg ggagaatcta cgtccttgga ggctatgatg gtcacacgtt cctggacagt 1740
gtggagtgtt acgacccaga tacagacacc tggagcgagg tgacccgaat gacatcgggc 1800
cggagtgggg tgggcgtggc tgtcaccatg gagccctgcc ggaagcagat tgaccagcag 1860
aactgtacct gt 1872
<210> 59
<211> 2274
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 59
atggcggtgt ctgccgggtc cgcgcggacc tcgcccagct cagataaagt acagaaagac 60
aaggctgaac tgatctcagg gcccaggcag gacagccgaa tagggaaact cttgggtttt 120
gagtggacag atttgtccag ttggcggagg ctggtgaccc tgctgaatcg accaacggac 180
cctgcaagct tagctgtctt tcgttttctt tttgggttct tgatggtgct agacattccc 240
caggagcggg ggctcagctc tctggaccgg aaataccttg atgggctgga tgtgtgccgc 300
ttccccttgc tggatgccct acgcccactg ccacttgact ggatgtatct tgtctacacc 360
atcatgtttc tgggggcact gggcatgatg ctgggcctgt gctaccggat aagctgtgtg 420
ttattcctgc tgccatactg gtatgtgttt ctcctggaca agacatcatg gaacaaccac 480
tcctatctgt atgggttgtt ggcctttcag ctaacattca tggatgcaaa ccactactgg 540
tctgtggacg gtctgctgaa tgcccatagg aggaatgccc acgtgcccct ttggaactat 600
gcagtgctcc gtggccagat cttcattgtg tacttcattg cgggtgtgaa aaagctggat 660
gcagactggg ttgaaggcta ttccatggaa tatttgtccc ggcactggct cttcagtccc 720
ttcaaactgc tgttgtctga ggagctgact agcctgctgg tcgtgcactg gggtgggctg 780
ctgcttgacc tctcagctgg tttcctgctc ttttttgatg tctcaagatc cattggcctg 840
ttctttgtgt cctacttcca ctgcatgaat tcccagcttt tcagcattgg tatgttctcc 900
tacgtcatgc tggccagcag ccctctcttc tgctcccctg agtggcctcg gaagctggtg 960
tcctactgcc cccgaaggtt gcaacaactg ttgcccctca aggcagcccc tcagcccagt 1020
gtttcctgtg tgtataagag gagccggggc aaaagtggcc agaagccagg gctgcgccat 1080
cagctgggag ctgccttcac cctgctctac ctcctggagc agctattcct gccctattct 1140
cattttctca cccagggcta taacaactgg acaaatgggc tgtatggcta ttcctgggac 1200
atgatggtgc actcccgctc ccaccagcac gtgaagatca cctaccgtga tggccgcact 1260
ggcgaactgg gctaccttaa ccctggggta tttacacaga gtcggcgatg gaaggatcat 1320
gcagacatgc tgaagcaata tgccacttgc ctgagccgcc tgcttcccaa gtataatgtc 1380
actgagcccc agatctactt tgatatttgg gtctccatca atgaccgctt ccagcagagg 1440
atttttgacc ctcgtgtgga catcgtgcag gccgcttggt caccctttca gcgcacatcc 1500
tgggtgcaac cactcttgat ggacctgtct ccctggaggg ccaagttaca ggaaatcaag 1560
agcagcctag acaaccacac tgaggtggtc ttcattgcag atttccctgg actgcacttg 1620
gagaattttg tgagtgaaga cctgggcaac actagcatcc agctgctgca gggggaagtg 1680
actgtggagc ttgtggcaga acagaagaac cagactcttc gagagggaga aaaaatgcag 1740
ttgcctgctg gtgagtacca taaggtgtat acgacatcac ctagcccttc ttgctacatg 1800
tacgtctatg tcaacactac agagcttgca ctggagcaag acctggcata tctgcaagaa 1860
ttaaaggaaa aggtggagaa tggaagtgaa acagggcctc tacccccaga gctgcagcct 1920
ctgttggaag gggaagtaaa agggggccct gagccaacac ctctggttca gacctttctt 1980
agacgccaac aaaggctcca ggagattgaa cgccggcgaa atactccttt ccatgagcga 2040
ttcttccgct tcttgttgcg aaagctctat gtctttcgcc gcagcttcct gatgacttgt 2100
atctcacttc gaaatctgat attaggccgt ccttccctgg agcagctggc ccaggaggtg 2160
acttatgcaa acttgagacc ctttgaggca gttggagaac tgaatccctc aaacacggat 2220
tcttcacatt ctaatcctcc tgagtcaaat cctgatcctg tccactcaga gttc 2274
<210> 60
<211> 2103
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 60
atggcggtgt ctgccgggtc cgcgcggacc tcgcccagct cagggttctt gatggtgcta 60
gacattcccc aggagcgggg gctcagctct ctggaccgga aataccttga tgggctggat 120
gtgtgccgct tccccttgct ggatgcccta cgcccactgc cacttgactg gatgtatctt 180
gtctacacca tcatgtttct gggggcactg ggcatgatgc tgggcctgtg ctaccggata 240
agctgtgtgt tattcctgct gccatactgg tatgtgtttc tcctggacaa gacatcatgg 300
aacaaccact cctatctgta tgggttgttg gcctttcagc taacattcat ggatgcaaac 360
cactactggt ctgtggacgg tctgctgaat gcccatagga ggaatgccca cgtgcccctt 420
tggaactatg cagtgctccg tggccagatc ttcattgtgt acttcattgc gggtgtgaaa 480
aagctggatg cagactgggt tgaaggctat tccatggaat atttgtcccg gcactggctc 540
ttcagtccct tcaaactgct gttgtctgag gagctgacta gcctgctggt cgtgcactgg 600
ggtgggctgc tgcttgacct ctcagctggt ttcctgctct tttttgatgt ctcaagatcc 660
attggcctgt tctttgtgtc ctacttccac tgcatgaatt cccagctttt cagcattggt 720
atgttctcct acgtcatgct ggccagcagc cctctcttct gctcccctga gtggcctcgg 780
aagctggtgt cctactgccc ccgaaggttg caacaactgt tgcccctcaa ggcagcccct 840
cagcccagtg tttcctgtgt gtataagagg agccggggca aaagtggcca gaagccaggg 900
ctgcgccatc agctgggagc tgccttcacc ctgctctacc tcctggagca gctattcctg 960
ccctattctc attttctcac ccagggctat aacaactgga caaatgggct gtatggctat 1020
tcctgggaca tgatggtgca ctcccgctcc caccagcacg tgaagatcac ctaccgtgat 1080
ggccgcactg gcgaactggg ctaccttaac cctggggtat ttacacagag tcggcgatgg 1140
aaggatcatg cagacatgct gaagcaatat gccacttgcc tgagccgcct gcttcccaag 1200
tataatgtca ctgagcccca gatctacttt gatatttggg tctccatcaa tgaccgcttc 1260
cagcagagga tttttgaccc tcgtgtggac atcgtgcagg ccgcttggtc accctttcag 1320
cgcacatcct gggtgcaacc actcttgatg gacctgtctc cctggagggc caagttacag 1380
gaaatcaaga gcagcctaga caaccacact gaggtggtct tcattgcaga tttccctgga 1440
ctgcacttgg agaattttgt gagtgaagac ctgggcaaca ctagcatcca gctgctgcag 1500
ggggaagtga ctgtggagct tgtggcagaa cagaagaacc agactcttcg agagggagaa 1560
aaaatgcagt tgcctgctgg tgagtaccat aaggtgtata cgacatcacc tagcccttct 1620
tgctacatgt acgtctatgt caacactaca gagcttgcac tggagcaaga cctggcatat 1680
ctgcaagaat taaaggaaaa ggtggagaat ggaagtgaaa cagggcctct acccccagag 1740
ctgcagcctc tgttggaagg ggaagtaaaa gggggccctg agccaacacc tctggttcag 1800
acctttctta gacgccaaca aaggctccag gagattgaac gccggcgaaa tactcctttc 1860
catgagcgat tcttccgctt cttgttgcga aagctctatg tctttcgccg cagcttcctg 1920
atgacttgta tctcacttcg aaatctgata ttaggccgtc cttccctgga gcagctggcc 1980
caggaggtga cttatgcaaa cttgagaccc tttgaggcag ttggagaact gaatccctca 2040
aacacggatt cttcacattc taatcctcct gagtcaaatc ctgatcctgt ccactcagag 2100
ttc 2103
<210> 61
<211> 528
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 61
atggcggctc ccgtcctgct aagagtgtcg gtgccgcggt gggagcgggt ggcccggtat 60
gcagtgtgcg ctgccggaat cctgctctcc atctacgcct accacgtgga gcgggagaag 120
gagcgggacc ccgagcaccg ggccctctgc gacctggggc cctgggtgaa gtgctccgcc 180
gcccttgcct ccagatgggg tcgaggattt ggtcttttgg gttccatttt tggaaaggat 240
ggtgtattaa accagccaaa cagtgtcttt ggacttatat tttatatact acagttatta 300
cttggcatga cagcaagcgc tgtggcggct ttgatcctca tgacgtcctc catcatgtcg 360
gtcgtggggt ccctgtacct ggcctacatt ctgtactttg tgctgaagga gttctgcatc 420
atctgcatcg tcacgtacgt gctgaacttc cttcttctca ttatcaacta caaacgacta 480
gtttacttga acgaggcctg gaagcggcag ctgcaaccca agcaggac 528
<210> 62
<211> 240
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 62
atgaaactgt caggcatgtt tctgctcctc tctctggctc ttttctgctt tttaacaggt 60
gtcttcagtc agggaggaca ggttgactgt ggtgagttcc aggaccccaa ggtctactgc 120
actcgggaat ctaacccaca ctgtggctct gatggccaga catatggcaa taaatgtgcc 180
ttctgtaagg ccatagtgaa aagtggtgga aagattagcc taaagcatcc tggaaaatgc 240
<210> 63
<211> 1296
<212> DNA
<213> 大肠杆菌( Escherichia coli)
<400> 63
atgcaagttt cagttgaaac cactcaaggc cttggccgcc gtgtaacgat tactatcgct 60
gctgacagca tcgagaccgc tgttaaaagc gagctggtca acgttgcgaa aaaagtacgt 120
attgacggct tccgcaaagg caaagtgcca atgaatatcg ttgctcagcg ttatggcgcg 180
tctgtacgcc aggacgttct gggtgacctg atgagccgta acttcattga cgccatcatt 240
aaagaaaaaa tcaatccggc tggcgcaccg acttatgttc cgggcgaata caagctgggt 300
gaagacttca cttactctgt agagtttgaa gtttatccgg aagttgaact gcagggtctg 360
gaagcgatcg aagttgaaaa accgatcgtt gaagtgaccg acgctgacgt tgacggcatg 420
ctggatactc tgcgtaaaca gcaggcgacc tggaaagaaa aagacggcgc tgttgaagca 480
gaagaccgcg taaccatcga cttcaccggt tctgtagacg gcgaagagtt cgaaggcggt 540
aaagcgtctg atttcgtact ggcgatgggc cagggtcgta tgatcccggg ctttgaagac 600
ggtatcaaag gccacaaagc tggcgaagag ttcaccatcg acgtgacctt cccggaagaa 660
taccacgcag aaaacctgaa aggtaaagca gcgaaattcg ctatcaacct gaagaaagtt 720
gaagagcgtg aactgccgga actgactgca gaattcatca aacgtttcgg cgttgaagat 780
ggttccgtag aaggtctgcg cgctgaagtg cgtaaaaaca tggagcgcga gctgaagagc 840
gccatccgta accgcgttaa gtctcaggcg atcgaaggtc tggtaaaagc taacgacatc 900
gacgtaccgg ctgcgctgat cgacagcgaa atcgacgttc tgcgtcgcca ggctgcacag 960
cgtttcggtg gcaacgaaaa acaagctctg gaactgccgc gcgaactgtt cgaagaacag 1020
gctaaacgcc gcgtagttgt tggcctgctg ctgggcgaag ttatccgcac caacgagctg 1080
aaagctgacg aagagcgcgt gaaaggcctg atcgaagaga tggcttctgc gtacgaagat 1140
ccgaaagaag ttatcgagtt ctacagcaaa aacaaagaac tgatggacaa catgcgcaat 1200
gttgctctgg aagaacaggc tgttgaagct gtactggcga aagcgaaagt gactgaaaaa 1260
gaaaccactt tcaacgagct gatgaaccag caggcg 1296
<210> 64
<211> 453
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 64
atgatggcag aagagcacac agatctcgag gcccagatcg tcaaggatat ccactgcaag 60
gagattgacc tggtgaaccg agaccccaag aacattaacg aggacatagt caaggtggat 120
tttgaagacg tgatcgcaga gcctgtgggc acctacagct ttgacggcgt gtggaaggtg 180
agctacacca ccttcactgt ctccaagtac tggtgctacc gtctgttgtc cacgctgctg 240
ggcgtcccac tggccctgct ctggggcttc ctgttcgcct gcatctcctt ctgccacatc 300
tgggcggtgg tgccatgcat taagagctac ctgatcgaga tccagtgcat cagccacatc 360
tactcactct gcatccgcac cttctgcaac ccactcttcg cggccctggg ccaggtctgc 420
agcagcatca aggtggtgct gcggaaggag gtc 453
<210> 65
<211> 2238
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 65
atgctggtgc tcgggctgct ggtagccgga gcggcggacg gatgcgagct tgtgccccgg 60
cacctccgcg ggcggcgggc gactggctct gccgcaactg ccgcctcctc tcccgccgcg 120
gcggccggcg atagcccggc gctcatgaca gatccctgca tgtcactgag tccaccatgc 180
tttacagaag aagacagatt tagtctggaa gctcttcaaa caatacataa acaaatggat 240
gatgacaaag atggtggaat tgaagtagag gaaagtgatg aattcatcag agaagatatg 300
aaatataaag atgctactaa taaacacagc catctgcaca gagaagataa acatataacg 360
attgaggatt tatggaaacg atggaaaaca tcagaagttc ataattggac ccttgaagac 420
actcttcagt ggttgataga gtttgttgaa ctaccccaat atgagaagaa ttttagagac 480
aacaatgtca aaggaacgac acttcccagg atagcagtgc acgaaccttc atttatgatc 540
tcccagttga aaatcagtga ccggagtcac agacaaaaac ttcagctcaa ggcattggat 600
gtggttttgt ttggacctct aacacgccca cctcataact ggatgaaaga ttttatcctc 660
acagtttcta tagtaattgg tgttggaggc tgctggtttg cttatacgca gaataagaca 720
tcaaaagaac atgttgcaaa aatgatgaaa gatttagaga gcttacaaac tgcagagcaa 780
agtctaatgg acttacaaga gaggcttgaa aaggcacagg aagaaaacag aaatgttgct 840
gtagaaaagc aaaatttaga gcgcaaaatg atggatgaaa tcaattatgc aaaggaggag 900
gcttgtcggc tgagagagct aagggaggga gctgaatgtg aattgagtag acgtcagtat 960
gcagaacagg aattggaaca ggttcgcatg gctctgaaaa aggccgaaaa agaatttgaa 1020
ctgagaagca gttggtctgt tccagatgca cttcagaaat ggcttcagtt aacacatgaa 1080
gtagaagtgc aatactacaa tattaaaaga caaaacgctg aaatgcagct agctattgct 1140
aaagatgagg cagaaaaaat taaaaagaag agaagcacag tctttgggac tctgcacgtt 1200
gcacacagct cctccctaga tgaggtagac cacaaaattc tggaagcaaa gaaagctctc 1260
tctgagttga caacttgttt acgagaacga ctttttcgct ggcaacaaat tgagaagatc 1320
tgtggctttc agatagccca taactcagga ctccccagcc tgacctcttc cctttattct 1380
gatcacagct gggtggtgat gcccagagtc tccattccac cctatccaat tgctggagga 1440
gttgatgact tagatgaaga cacaccccca atagtgtcac aatttcccgg gaccatggct 1500
aaacctcctg gatcattagc cagaagcagc agcctgtgcc gttcacgccg cagcattgtg 1560
ccgtcctcgc ctcagcctca gcgagctcag cttgctccac acgcccccca cccgtcacac 1620
cctcggcacc ctcaccaccc gcaacacaca ccacactcct tgccttcccc tgatccagat 1680
atcctctcag tgtcaagttg ccctgcgctt tatcgaaatg aagaggagga agaggccatt 1740
tacttctctg ctgaaaagca atgggaagtg ccagacacag cttcagaatg tgactcctta 1800
aattcttcca ttggaaggaa acagtctcct cctttaagcc tcgagatata ccaaacatta 1860
tctccgcgaa agatatcaag agatgaggtg tccctagagg attcctcccg aggggattcg 1920
cctgtaactg tggatgtgtc ttggggttct cccgactgtg taggtctgac agaaactaag 1980
agtatgatct tcagtcctgc aagcaaagtg tacaatggca ttttggagaa atcctgtagc 2040
atgaaccagc tttccagtgg catcccggtg cctaaacctc gccacacatc atgttcctca 2100
gctggcaacg acagtaaacc agttcaggaa gccccaagtg ttgccagaat aagcagcatc 2160
ccacatgacc tttgtcataa tggagagaaa agcaaaaagc catcaaaaat caaaagcctt 2220
tttaagaaga aatctaag 2238
<210> 66
<211> 2262
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 66
atgctggtgc tcgggctgct ggtagccgga gcggcggacg gatgcgagct tgtgccccgg 60
cacctccgcg ggcggcgggc gactggctct gccgcaactg ccgcctcctc tcccgccgcg 120
gcggccggcg atagcccggc gctcatgaca gatccctgca tgtcactgag tccaccatgc 180
tttacagaag aagacagatt tagtctggaa gctcttcaaa caatacataa acaaatggat 240
gatgacaaag atggtggaat tgaagtagag gaaagtgatg aattcatcag agaagatatg 300
aaatataaag atgctactaa taaacacagc catctgcaca gagaagataa acatataacg 360
attgaggatt tatggaaacg atggaaaaca tcagaagttc ataattggac ccttgaagac 420
actcttcagt ggttgataga gtttgttgaa ctaccccaat atgagaagaa ttttagagac 480
aacaatgtca aaggaacgac acttcccagg atagcagtgc acgaaccttc atttatgatc 540
tcccagttga aaatcagtga ccggagtcac agacaaaaac ttcagctcaa ggcattggat 600
gtggttttgt ttggacctct aacacgccca cctcataact ggatgaaaga ttttatcctc 660
acagtttcta tagtaattgg tgttggaggc tgctggtttg cttatacgca gaataagaca 720
tcaaaagaac atgttgcaaa aatgatgaaa gatttagaga gcttacaaac tgcagagcaa 780
agtctaatgg acttacaaga gaggcttgaa aaggcacagg aagaaaacag aaatgttgct 840
gtagaaaagc aaaatttaga gcgcaaaatg atggatgaaa tcaattatgc aaaggaggag 900
gcttgtcggc tgagagagct aagggaggga gctgaatgtg aattgagtag acgtcagtat 960
gcagaacagg aattggaaca ggttcgcatg gctctgaaaa aggccgaaaa agaatttgaa 1020
ctgagaagca gttggtctgt tccagatgca cttcagaaat ggcttcagtt aacacatgaa 1080
gtagaagtgc aatactacaa tattaaaaga caaaacgctg aaatgcagct agctattgct 1140
aaagatgagg ttgctgcttc atatctgatt caggcagaaa aaattaaaaa gaagagaagc 1200
acagtctttg ggactctgca cgttgcacac agctcctccc tagatgaggt agaccacaaa 1260
attctggaag caaagaaagc tctctctgag ttgacaactt gtttacgaga acgacttttt 1320
cgctggcaac aaattgagaa gatctgtggc tttcagatag cccataactc aggactcccc 1380
agcctgacct cttcccttta ttctgatcac agctgggtgg tgatgcccag agtctccatt 1440
ccaccctatc caattgctgg aggagttgat gacttagatg aagacacacc cccaatagtg 1500
tcacaatttc ccgggaccat ggctaaacct cctggatcat tagccagaag cagcagcctg 1560
tgccgttcac gccgcagcat tgtgccgtcc tcgcctcagc ctcagcgagc tcagcttgct 1620
ccacacgccc cccacccgtc acaccctcgg caccctcacc acccgcaaca cacaccacac 1680
tccttgcctt cccctgatcc agatatcctc tcagtgtcaa gttgccctgc gctttatcga 1740
aatgaagagg aggaagaggc catttacttc tctgctgaaa agcaatggga agtgccagac 1800
acagcttcag aatgtgactc cttaaattct tccattggaa ggaaacagtc tcctccttta 1860
agcctcgaga tataccaaac attatctccg cgaaagatat caagagatga ggtgtcccta 1920
gaggattcct cccgagggga ttcgcctgta actgtggatg tgtcttgggg ttctcccgac 1980
tgtgtaggtc tgacagaaac taagagtatg atcttcagtc ctgcaagcaa agtgtacaat 2040
ggcattttgg agaaatcctg tagcatgaac cagctttcca gtggcatccc ggtgcctaaa 2100
cctcgccaca catcatgttc ctcagctggc aacgacagta aaccagttca ggaagcccca 2160
agtgttgcca gaataagcag catcccacat gacctttgtc ataatggaga gaaaagcaaa 2220
aagccatcaa aaatcaaaag cctttttaag aagaaatcta ag 2262
<210> 67
<211> 2055
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 67
atggatgtat gcgtccgtct tgccctgtgg ctcctctggg gactcctcct gcaccagggc 60
cagagcctca gccatagtca cagtgagaag gcgacaggaa ccagctcggg ggccaactct 120
gaggagtcca ctgcagcaga gttttgccga attgacaagc ccctgtgtca cagtgaggat 180
gagaaactca gcttcgaggc agtccgtaac atccacaaac tgatggacga tgatgccaat 240
ggtgatgtgg atgtggaaga aagtgatgag ttcctgaggg aagacctcaa ttaccatgac 300
ccaacagtga aacacagcac cttccatggt gaggataagc tcatcagcgt ggaggacctg 360
tggaaggcat ggaagtcatc agaagtatac aattggaccg tggatgaggt ggtacagtgg 420
ctgatcacat atgtggagct gcctcagtat gaggagacct tccggaagct gcagctcagt 480
ggccatgcca tgccaaggct ggctgtcacc aacaccacca tgacagggac tgtgctgaag 540
atgacagacc ggagtcatcg gcagaagctg cagctgaagg ctctggatac agtgctcttt 600
gggcctcctc tcttgactcg ccataatcac ctcaaggact tcatgctggt ggtgtctatc 660
gttattggtg tgggcggctg ctggtttgcc tatatccaga accgttactc caaggagcac 720
atgaagaaga tgatgaagga cttggagggg ttacaccgag ctgagcagag tctgcatgac 780
cttcaggaaa ggctgcacaa ggcccaggag gagcaccgca cagtggaggt ggagaaggtc 840
catctggaaa agaagctgcg cgatgagatc aaccttgcta agcaggaagc ccagcggctg 900
aaggagctgc gggagggtac tgagaatgag cggagccgcc aaaaatatgc tgaggaggag 960
ttggagcagg ttcgggaggc cttgaggaaa gcagagaagg agctagaatc tcacagctca 1020
tggtatgctc cagaggccct tcagaagtgg ctgcagctga cacatgaggt ggaggtgcaa 1080
tattacaaca tcaagaagca aaatgctgag aagcagctgc tggtggccaa ggagggggct 1140
gagaagataa aaaagaagag aaacacactc tttggcacct tccacgtggc ccacagctct 1200
tccctggatg atgtagatca taaaattcta acagctaagc aagcactgag cgaggtgaca 1260
gcagcattgc gggagcgcct gcaccgctgg caacagatcg agatcctctg tggcttccag 1320
attgtcaaca accctggcat ccactcactg gtggctgccc tcaacataga ccccagctgg 1380
atgggcagta cacgccccaa ccctgctcac ttcatcatga ctgacgacgt ggatgacatg 1440
gatgaggaga ttgtgtctcc cttgtccatg cagtccccta gcctgcagag cagtgttcgg 1500
cagcgcctga cggagccaca gcatggcctg ggatctcaga gggatttgac ccattccgat 1560
tcggagtcct ccctccacat gagtgaccgc cagcgtgtgg cccccaaacc tcctcagatg 1620
agccgtgctg cagacgaggc tctcaatgcc atgacttcca atggcagcca ccggctgatc 1680
gagggggtcc acccagggtc tctggtggag aaactgcctg acagccctgc cctggccaag 1740
aaggcattac tggcgctgaa ccatgggctg gacaaggccc acagcctgat ggagctgagc 1800
ccctcagccc cacctggtgg ctctccacat ttggattctt cccgttctca cagccccagc 1860
tccccagacc cagacacacc atctccagtt ggggacagcc gagccctgca agccagccga 1920
aacacacgca ttccccacct ggctggcaag aaggctgtgg ctgaggagga taatggctct 1980
attggcgagg aaacagactc cagcccaggc cggaagaagt ttcccctcaa aatctttaag 2040
aagcctctta agaag 2055
<210> 68
<211> 903
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 68
atgcatccgg agcccgcccc gcccccgagc cgcagcagtc ccgagcttcc cccaagcggc 60
ggcagcacca ccagcggcag ccgccggagc cgccgccgca gcggggacgg ggagcccccg 120
ggggccccgc caccgccgcc gtccgccgtc acctacccgg actggatcgg ccagagttac 180
tccgaggtga tgagcctcaa cgagcactcc atgcaggcgc tgtcctggcg caagctctac 240
ttgagccgcg ccaagcttaa agcctccagc cggacctcgg ctctgctctc cggcttcgcc 300
atggtggcaa tggtggaggt gcagctggac gctgaccacg actacccacc ggggctgctc 360
atcgccttca gtgcctgcac cacagtgctg gtggctgtgc acctgtttgc gctcatgatc 420
agcacctgca tcctgcccaa catcgaggcg gtgagcaacg tgcacaatct caactcggtc 480
aaggagtccc cccatgagcg catgcaccgc cacatcgagc tggcctgggc cttctccacc 540
gtcatcggca cgctgctctt cctagctgag gtggtgctgc tctgctgggt caagttcttg 600
cccctcaaga agcagccagg ccagccaagg cccaccagca agccccccgc cagtggcgca 660
gcagccaacg tcagcaccag cggcatcacc ccgggccagg cagctgccat cgcctcgacc 720
accatcatgg tgcccttcgg cctgatcttt atcgtcttcg ccgtccactt ctaccgctca 780
ctggttagcc ataagactga ccgacagttc caggagctca acgagctggc ggagtttgcc 840
cgcttacagg accagctgga ccacagaggg gaccaccccc tgacgcccgg cagccactat 900
gcc 903
<210> 69
<211> 762
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 69
atgagtgctg agcttaacgt gcctatcgac ccctctgctc ctgcctgccc tgagcccggc 60
cataagggca tggattaccg ggactgggtc cgccgcagct acctggaact ggtcacctct 120
aaccaccact cggtacaggc cctgtcgtgg cggaagctct acctgagcag ggccaagctg 180
aaggcctcca gcaggacctc cgccctcctc tccggctttg ccatggtggc catggtggag 240
gtgcagctgg agacgcagta ccagtacccg cggccgctgc tgattgcctt cagcgcctgc 300
accacggtgc tggtggccgt gcacctgttc gccctcctca tcagcacctg catcctgccc 360
aatgtggagg ccgtgagcaa catccacaac ctgaactcca tcagcgagtc cccgcatgag 420
cgcatgcacc cctacatcga gctggcctgg ggcttctcca ccgtgcttgg catcctactc 480
ttcctggccg aggtggtgct gctctgctgg atcaagttcc tccccgtgga tgcccggcgc 540
cagcctggcc ccccacctgg ccctgggagt cacacgggct ggcaggccgc cctggtgtcc 600
accatcatca tggtgcccgt gggcctcatc ttcgtggtct tcaccatcca cttctaccgc 660
tccctggtgc gccacaaaac ggagcgccac aaccgcgaga tcgaggagct ccacaagctc 720
aaggtccagc tggacgggca tgagcgcagc ctgcaggtct tg 762
<210> 70
<211> 885
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 70
atgaagggcg gcgaggggga cgcgggcgag caggccccgc tgaaccctga gggcgagagc 60
cctgcaggct cggccacgta ccgggagttc gtgcaccgcg gctacctgga cctcatgggg 120
gccagtcagc actcgctgcg ggcgctcagc tggcgccgcc tctacctcag ccgggccaag 180
ctcaaagctt ccagccgcac gtctgccttg ctctcgggct tcgccatggt ggccatggtg 240
gaggtgcagc tggagagtga ccacgagtac ccaccaggcc tgctggtggc cttcagtgcc 300
tgcaccaccg tgctggtggc tgtgcacctc tttgcactca tggtctccac gtgtctgctg 360
ccccacattg aagctgtgag caacatccac aacctcaact ctgtccacca gtcgccacac 420
cagagactgc accgctacgt ggagctggcc tggggcttct ccactgccct gggcaccttt 480
ctcttccttg ctgaagttgt cctggttggt tgggtcaagt ttgtgcccat tggggctccc 540
ttggacacac cgacccccat ggtgcccaca tcccgggtgc ccgggactct ggcaccagtg 600
gctacctccc ttagtccagc ttccaatctc ccacggtcct ctgcgtctgc agcaccgtcc 660
caggctgagc cagcctgccc accccggcaa gcctgtggtg gtggtggggc ccatgggcca 720
ggctggcaag cagccatggc ctccacagcc atcatggtac ccgtggggct cgtgtttgtg 780
gcctttgccc tgcatttcta ccgctccttg gtggcacaca agacagaccg ctacaagcag 840
gaactagagg aactgaatcg cctgcagggg gagctgcagg ctgtg 885
<210> 71
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 71
atgaagatga tgctggtgcg ccggttccgc gtgctcatcc tgatggtgtt cctggtggcc 60
tgcgcgctgc acatcgccct ggacctgctg cccaggctgg agcgacgcgg cgcgcggccc 120
tcgggggagc ccggctgttc gtgcgcgcag cccgccgccg aggtggccgc gcccggctgg 180
gcccaggttc ggggccgccc cggggagccc ccggccgcct cctccgccgc cggcgacgcg 240
ggctggccca acaagcacac gctccgcatc ctgcaggact tcagctccga cccctcctcc 300
aacctctcgt cccactcgct ggagaaactg ccgcccgcgg ccgagccggc cgagcgcgcc 360
ttgcgggggc gggatcccgg cgccctaaga ccccacgacc ccgcgcaccg gccgctgctg 420
cgagaccccg gcccgcgtcg gtccgagtcg ccccccggcc ccggcggaga cgcctccctc 480
ctggccaggc tgttcgagca cccgctttac cgggtggcgg ttccgccgct cacggaggag 540
gacgtcctgt tcaatgtgaa cagcgacacc aggctcagcc ccaaagcggc ggagaacccg 600
gactggccgc atgcgggtgc tgaaggtgca gaattcctct cccccgggga ggcggccgtg 660
gactcctatc ccaactggct caagttccac attggtatca accggtacga gctgtactcc 720
agacacaacc cggccatcga ggccctgctg cacgacctca gctcccagag gatcaccagc 780
gtggccatga agtcgggggg cacgcagctg aagctcatca tgaccttcca gaattacggg 840
caagcgctgt tcaaacccat gaaacaaacg agggagcagg agacaccccc tgactttttt 900
tatttctctg actacgagag gcacaatgcg gagattgctg ccttccacct ggacaggatc 960
ctggacttcc gccgggtccc tcccgtggcc ggcaggatgg tcaacatgac caaggagatc 1020
cgggacgtca cacgggacaa gaagctctgg aggaccttct tcatctctcc agccaacaac 1080
atctgcttct acggcgagtg ttcctactac tgctccacgg agcacgccct gtgcgggaag 1140
ccagaccaga tcgagggctc gctggcggcc ttcctgcccg acctgtccct ggccaagagg 1200
aagacctggc ggaacccttg gcggcgttcc taccacaagc gcaagaaggc cgagtgggag 1260
gtggaccctg actactgcga ggaggtgaag cagacaccgc cctacgacag cagccaccgc 1320
atcctggacg tcatggacat gacgatcttc gacttcctca tgggaaacat ggaccgtcac 1380
cactacgaga cttttgagaa gtttgggaat gaaacgttca tcatccactt agacaatgga 1440
agagggtttg ggaagtattc gcacgacgag ctctccatcc tggtgccgct acagcagtgc 1500
tgcaggatcc ggaagtccac ctacctgcgt ctgcagctcc tggccaagga ggagtacaag 1560
ctgagcctgc tgatggccga gtctctgcgg ggggaccagg tggcacccgt gctgtaccag 1620
ccgcacctgg aggccctgga ccggcggctc cgcgtcgtgc taaaggccgt ccgggactgc 1680
gtggagagga acgggctcca cagcgtggtg gatgacgacc tggacactga gcacagagcc 1740
gcctcggcga gg 1752
<210> 72
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 72
atgcggcctc aggacagcac cggggtcgcg gagctccagg agcccgggct gccgctaacg 60
gacgatgcac ccccgggcgc cactgaggag ccggcggccg ccgaggcagc tggggcgcca 120
gaccgcggta ggtgctggct ctgcctttcc tcgccgtgtt gctcccgcac cgagccggaa 180
gccaagaaga aagcaccctg tcctggactt ggcttgtttt acacattatt gtctgccttc 240
cttttctcag tgggctcttt atttgttaaa aaagtgcaag acgtccatgc tgtagagatt 300
agtgcgtttc gatgtgtgtt ccaaatgcta gttgttatcc cttgcttaat atacagaaaa 360
actgggttta taggcccaaa aggtcaacga attttcctca ttctcagagg agtccttggt 420
tctaccgcca tgatgcttat atactatgct taccagacaa tgtccctcgc tgatgccaca 480
gttatcacgt ttagcagtcc agtgtttacg tccatatttg cttggatatg tctcaaggaa 540
aaatatagcc cttgggatgc tcttttcacc gtgttcacaa tcactggagt gatccttatc 600
gtgagaccac catttttgtt tggttccgac acttcgggga tggaagaaag ctattcaggc 660
caccttaagg gaacattcgc agcaattgga agtgccgtat ttgctgcatc gactctagtt 720
atcctaagaa aaatgggaaa atctgtggac tactttctga gcatttggta ttatgtagta 780
cttggcctcg ttgaaagtgt catcatcctc tctgtattag gagagtggag tctgccttac 840
tgtgggttgg acaggctatt tctcatattc attgggctct ttggtttggg gggtcagata 900
tttatcacaa aagcacttca aatagaaaaa gcagggccag tagcaataat gaagacaatg 960
gatgtggtct ttgcttttat ctttcagatt attttcttta ataatgtgcc aacgtggtgg 1020
acagtgggtg gtgctctctg cgtagtagcc agtaatgttg gagcggccat tcgtaaatgg 1080
taccaaagtt ccaaa 1095
<210> 73
<211> 2295
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 73
atgagtgggg accacctcca caacgattcc cagatcgaag cggatttccg attgaatgat 60
tctcataaac acaaagataa acacaaagat cgagaacacc ggcacaaaga acacaagaag 120
gagaaggacc gggaaaagtc caagcatagc aacagtgaac ataaagattc tgaaaagaaa 180
cacaaagaga aggagaagac caaacacaaa gatggaagct cagaaaagca taaagacaaa 240
cataaagaca gagacaagga aaaacgaaaa gaggaaaagg ttcgagcctc tggggatgca 300
aaaataaaga aggagaagga aaatggcttc tctagtccac cacaaattaa agatgaacct 360
gaagatgatg gctattttgt tcctcctaaa gaggatataa agccattaaa gagacctcga 420
gatgaggatg atgctgatta taaacctaag aaaattaaaa cagaagatac caagaaggag 480
aagaaaagaa aactagaaga agaagaggat ggtaaattga aaaaacccaa gaataaagat 540
aaagataaaa aagttcctga gccagataac aagaaaaaga agccgaagaa agaagaggaa 600
cagaagtgga aatggtggga agaagagcgc tatcctgaag gcatcaagtg gaaattccta 660
gaacataaag gtccagtatt tgccccacca tatgagcctc ttccagagaa tgtcaagttt 720
tattatgatg gtaaagtcat gaagctgagc cccaaagcag aggaagtagc tacgttcttt 780
gcaaaaatgc tcgaccatga atatactacc aaggaaatat ttaggaaaaa tttctttaaa 840
gactggagaa aggaaatgac taatgaagag aagaatatta tcaccaacct aagcaaatgt 900
gattttaccc agatgagcca gtatttcaaa gcccagacgg aagctcggaa acagatgagc 960
aaggaagaga aactgaaaat caaagaggag aatgaaaaat tactgaaaga atatggattc 1020
tgtattatgg ataaccacaa agagaggatt gctaacttca agatagagcc tcctggactt 1080
ttccgtggcc gcggcaacca ccccaagatg ggcatgctga agagacgaat catgcccgag 1140
gatataatca tcaactgtag caaagatgcc aaggttcctt ctcctcctcc aggacataag 1200
tggaaagaag tccggcatga taacaaggtt acttggctgg tttcctggac agagaacatc 1260
caaggttcca ttaaatacat catgcttaac cctagttcac gaatcaaggg tgagaaggac 1320
tggcagaaat acgagactgc tcggcggctg aaaaaatgtg tggacaagat ccggaaccag 1380
tatcgagaag actggaagtc caaagagatg aaagtccggc agagagctgt agccctgtac 1440
ttcatcgaca agcttgctct gagagcaggc aatgaaaagg aggaaggaga aacagcggac 1500
actgtgggct gctgctcact tcgtgtggag cacatcaatc tacacccaga gttggatggt 1560
caggaatatg tggtagagtt tgacttcctc gggaaggact ccatcagata ctataacaag 1620
gtccctgttg agaaacgagt ttttaagaac ctacaactat ttatggagaa caagcagccc 1680
gaggatgatc tttttgatag actcaatact ggtattctga ataagcatct tcaggatctc 1740
atggagggct tgacagccaa ggtattccgt acatacaatg cctccatcac gctacagcag 1800
cagctaaaag aactgacagc cccggatgag aacatcccag cgaagatcct ttcttataac 1860
cgtgccaatc gagctgttgc aattctttgt aaccatcaga gggcaccacc aaaaactttt 1920
gagaagtcta tgatgaactt gcaaactaag attgatgcca agaaggaaca gctagcagat 1980
gcccggagag acctgaaaag tgctaaggct gatgccaagg tcatgaagga tgcaaagacg 2040
aagaaggtag tagagtcaaa gaagaaggct gttcagagac tggaggaaca gttgatgaag 2100
ctggaagttc aagccacaga ccgagaggaa aataaacaga ttgccctggg aacctccaaa 2160
ctcaattatc tggaccctag gatcacagtg gcttggtgca agaagtgggg tgtcccaatt 2220
gagaagattt acaacaaaac ccagcgggag aagtttgcct gggccattga catggctgat 2280
gaagactatg agttt 2295
<210> 74
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 74
atggcggcac agggagctgc tgcggcggtt gcggcgggga cttcaggggt cgcgggggag 60
ggcgagcccg ggcccgggga gaatgcggcc gctgagggga ccgccccatc cccgggccgc 120
gtctctccgc cgaccccggc gcgcggcgag ccggaagtca cggtggagat cggagaaacg 180
tacctgtgcc ggcgaccgga tagcacctgg cattctgctg aagtgatcca gtctcgagtg 240
aacgaccagg agggccgaga ggaattctat gtacactacg tgggctttaa ccggcggctg 300
gacgagtggg tagacaagaa ccggctggcg ctgaccaaga cagtgaagga tgctgtacag 360
aagaactcag agaagtacct gagcgagctc gcagagcagc ctgagcgcaa gatcactcgc 420
aaccaaaagc gcaagcatga tgagatcaac catgtgcaga agacttatgc agagatggac 480
cccaccacag cagccttgga gaaggagcat gaggcgatca ccaaggtgaa gtatgtggac 540
aagatccaca tcgggaacta cgaaattgat gcctggtatt tctcaccatt ccccgaagac 600
tatgggaaac agcccaagct ctggctctgc gagtactgcc tcaagtacat gaaatatgag 660
aagagctacc gcttccactt gggtcagtgc cagtggcggc agccccccgg gaaagagatc 720
taccgcaaga gcaacatctc cgtgtacgaa gttgatggca aagaccataa gatttactgt 780
cagaacctgt gtctgctggc caagcttttc ctggaccata agacactgta ctttgacgtg 840
gagccgttcg tcttttacat cctgactgag gtggaccggc agggggccca cattgttggc 900
tacttctcca aggagaagga gtccccggat ggaaacaatg tggcctgcat cctgaccttg 960
cccccctacc aacgccgcgg ctacgggaag ttcctcatcg ctttcagtta tgagctctcc 1020
aagctggaga gcacagtcgg ctccccggag aagccactgt ctgacctggg caagctcagc 1080
taccgcagct actggtcctg ggtgctgcta gagatcctgc gggacttccg gggcacactg 1140
tccatcaagg acctcagcca gatgaccagt atcacccaaa atgacatcat cagtaccctg 1200
caatccctca atatggtcaa gtactggaag ggccagcacg tgatctgtgt cacacccaag 1260
ctggtggagg agcacctcaa aagtgcccag tataagaaac cacccatcac agtggactcc 1320
gtctgcctca agtgggcacc ccccaagcac aagcaagtca agctctccaa gaag 1374
<210> 75
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 75
atggaaaggc ggatgcagct ggtaaagaag gataacgaga aagaaaggca caagctgttt 60
cagggctatg aaactgaaga gagagaggaa acagagctat ctgagaaaat taaactggag 120
tgccagccgg agctttccga gacatcccag actctgcctc ccaagccctt ctcatgtggg 180
cggagtggaa agggacataa aaggaaatcc ccatttggaa gtacagaaag aaagactcct 240
gttaaaaagc tggctcctga attttcaaaa gtcaaaacaa aaactcctaa gcactctcct 300
attaaagagg aaccctgtgg ttccttatct gaaactgttt gtaaacgtga attgaggagc 360
caagaaaccc cagaaaagcc ccggtcttca gtggacaccc caccaagact ctccactccc 420
caaaagggac ccagcaccca tcccaaggag aaagccttct caagtgagat agaagatttg 480
ccgtaccttt ccaccacaga aatgtatttg tgtcgttggc accagcctcc cccatcaccg 540
ttaccattac gggaatcctc tccaaagaag gaggagactg tagcaaggtg tctgatgcca 600
tcaagtgttg caggagaaac ttcagtcttg gctgttcctt cttggaggga ccactcagta 660
gagcctctaa gggacccaaa tccttcagac cttttggaga acctggatga cagtgtgttt 720
tcgaagcggc atgcaaaact ggagctggat gagaagagaa ggaaaagatg ggatattcag 780
aggatcaggg aacaaagaat tttacagcga ctgcagctca gaatgtataa aaagaaagga 840
attcaggaat ctgagcctga ggttacctca tttttccctg agccagatga tgttgaaagt 900
ttgatgatta cccccttctt gcctgttgta gcatttggac gaccattacc aaaattaact 960
ccacagaatt ttgagctacc ctggttggat gagcgtagcc gatgcagatt ggagatccag 1020
aagaagcaaa cacctcaccg gacgtgtagg aaa 1053
<210> 76
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 76
atggctgcgc ccgcactagg gctggtgtgt ggacgttgcc ctgagctggg tctcgtcctc 60
ttgctgctgc tgctctcgct gctgtgtgga gcggcaggga gccaggaggc cgggaccggt 120
gcgggcgcgg ggtcccttgc gggttcttgc ggctgcggca cgccccagcg gcctggcgcc 180
catggcagtt cggcagccgc tcaccgatac tcgcgggagg ctaacgctcc gggccccgta 240
cccggagagc ggcaactcgc gcactcaaag atggtcccca tccctgctgg agtatttaca 300
atgggcacag atgatcctca gataaagcag gatggggaag cacctgcgag gagagttact 360
attgatgcct tttacatgga tgcctatgaa gtcagtaata ctgaatttga gaagtttgtg 420
aactcaactg gctatttgac agaggctgag aagtttggcg actcctttgt ctttgaaggc 480
atgttgagtg agcaagtgaa gaccaatatt caacaggcag ttgcagctgc tccctggtgg 540
ttacctgtga aaggcgctaa ctggagacac ccagaagggc ctgactctac tattctgcac 600
aggccggatc atccagttct ccatgtgtcc tggaatgatg cggttgccta ctgcacttgg 660
gcagggaagc ggctgcccac ggaagctgag tgggaataca gctgtcgagg aggcctgcat 720
aatagacttt tcccctgggg caacaaactg cagcccaaag gccagcatta tgccaacatt 780
tggcagggcg agtttccggt gaccaacact ggtgaggatg gcttccaagg aactgcgcct 840
gttgatgcct tccctcccaa tggttatggc ttatacaaca tagtggggaa cgcatgggaa 900
tggacttcag actggtggac tgttcatcat tctgttgaag aaacgcttaa cccaaaaggt 960
cccccttctg ggaaagaccg agtgaagaaa ggtggatcct acatgtgcca taggtcttat 1020
tgttacaggt atcgctgtgc tgctcggagc cagaacacac ctgatagctc tgcttcgaat 1080
ctgggattcc gctgtgcagc cgaccgcctg cccactatgg ac 1122
<210> 77
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 77
atggccacct ttagccgcca ggaatttttc cagcagctac tgcaaggctg tctcctgcct 60
actgcccagc agggccttga ccagatctgg ctgctccttg ccatctgcct cgcctgccgc 120
ctcctctgga ggctcgggtt gccatcctac ctgaagcatg caagcaccgt ggcaggcggg 180
ttcttcagcc tctaccactt cttccagctg cacatggttt gggtcgtgct gctcagcctc 240
ctgtgctacc tcgtgctgtt cctctgccga cattcctccc atcgaggcgt cttcctatcc 300
gtcaccatcc tcatctacct actcatgggt gagatgcaca tggtagacac cgtgacatgg 360
cacaagatgc gaggggcaca gatgattgtg gccatgaagg cagtgtctct gggcttcgac 420
ctggaccggg gcgaggtggg tacggtgccc tcgccagtgg agttcatggg ctacctctac 480
ttcgtgggca ccatcgtctt cgggccctgg atatccttcc acagctacct acaagctgtc 540
caaggccgcc cactgagctg ccggtggctg cagaaggtgg cccggagcct ggcactggcc 600
ctgctgtgcc ttgtgctgtc cacttgcgtg ggcccctacc tcttcccgta cttcatcccc 660
ctcaacggtg accgcctcct tcgcaagtgg ctgcgagcct acgagagtgc tgtctccttc 720
cacttcagca actattttgt gggctttctt tccgaggcca cggccacgtt ggcgggggct 780
ggctttaccg aggagaagga tcacctggaa tgggacctga cggtgtccaa gccactgaat 840
gtggagctgc ctcggtcaat ggtggaagtt gtcacaagct ggaacctgcc catgtcttat 900
tggctaaata actatgtttt caagaatgct ctccgcctgg ggaccttctc ggctgtgctg 960
gtcacctatg cagccagcgc cctcctacat ggcttcagtt tccacctggc tgcggtcctg 1020
ctgtccctgg cttttatcac ttacgtggag catgtcctcc ggaagcgcct ggctcggatc 1080
ctcagtgcct gtgtcttgtc aaagcggtgc ccgccagact gttcgcacca gcatcgcttg 1140
ggcctggggg tgcgagcctt aaacttgctc tttggagctc tggccatctt ccacctggcc 1200
tacctgggct ccctgtttga tgtcgatgtg gatgacacca cagaggagca gggctacggc 1260
atggcataca ctgtccacaa gtggtcagag ctcagctggg ccagtcactg ggtcactttt 1320
ggatgctgga tcttctaccg tctcataggc 1350
<210> 78
<211> 1845
<212> DNA
<213> 大肠杆菌( Escherichia coli)
<400> 78
atgccaattc aggtcttacc gccacaactg gcgaaccaga ttgccgcagg tgaggtggtc 60
gagcgacctg cgtcggtagt caaagaacta gtggaaaaca gcctcgatgc aggtgcgacg 120
cgtatcgata ttgatatcga acgcggtggg gcgaaactta tccgcattcg tgataacggc 180
tgcggtatca aaaaagatga gctggcgctg gcgctggctc gtcatgccac cagtaaaatc 240
gcctctctgg acgatctcga agccattatc agcctgggct ttcgcggtga ggcgctggcg 300
agtatcagtt cggtttcccg cctgacgctc acttcacgca ccgcagaaca gcaggaagcc 360
tggcaggcct atgccgaagg gcgcgatatg aacgtgacgg taaaaccggc ggcgcatcct 420
gtggggacga cgctggaggt gctggatctg ttctacaaca ccccggcgcg gcgcaaattc 480
ctgcgcaccg agaaaaccga atttaaccac attgatgaga tcatccgccg cattgcgctg 540
gcgcgtttcg acgtcacgat caacctgtcg cataacggta aaattgtgcg tcagtaccgc 600
gcagtgccgg aaggcgggca aaaagaacgg cgcttaggcg cgatttgcgg caccgctttt 660
cttgaacaag cgctggcgat tgaatggcaa cacggcgatc tcacgctacg cggctgggtg 720
gccgatccaa atcacaccac gcccgcactg gcagaaattc agtattgcta cgtgaacggt 780
cgcatgatgc gcgatcgcct gatcaatcac gcgatccgcc aggcctgcga agacaaactg 840
ggggccgatc agcaaccggc atttgtgttg tatctggaga tcgacccaca tcaggtggac 900
gtcaacgtgc accccgccaa acacgaagtg cgtttccatc agtcgcgtct ggtgcatgat 960
tttatctatc agggcgtgct gagcgtgcta caacagcaac tggaaacgcc gctaccgctg 1020
gacgatgaac cccaacctgc accgcgttcc attccggaaa accgcgtggc ggcggggcgc 1080
aatcactttg cagaaccggc agctcgtgag ccggtagctc cgcgctacac tcctgcgcca 1140
gcatcaggca gtcgtccggc tgccccctgg ccgaatgcgc agccaggcta ccagaaacag 1200
caaggtgaag tgtatcgcca gcttttgcaa acgcccgcgc cgatgcaaaa attaaaagcg 1260
ccggaaccgc aggaacctgc acttgcggcg aacagtcaga gttttggtcg ggtactgact 1320
atcgtccatt ccgactgtgc gttgctggag cgcgacggca acatttcact tttatccttg 1380
ccagtggcag aacgttggct gcgtcaggca caattgacgc cgggtgaagc gcccgtttgc 1440
gcccagccgc tgctgattcc gttgcggcta aaagtttctg ccgaagaaaa atcggcatta 1500
gaaaaagcgc agtctgccct ggcggaattg ggtattgatt tccagtcaga tgcacagcat 1560
gtgaccatca gggcagtgcc tttaccctta cgccaacaaa atttacaaat cttgattcct 1620
gaactgatag gctacctggc gaagcagtcc gtattcgaac ctggcaatat tgcgcagtgg 1680
attgcacgaa atctgatgag cgaacatgcg cagtggtcaa tggcacaggc cataaccctg 1740
ctggcggacg tggaacggtt atgtccgcaa cttgtgaaaa cgccgccggg tggtctgtta 1800
caatctgttg atttacatcc ggcgataaaa gccctgaaag atgag 1845
<210> 79
<211> 2022
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 79
atggccccag gccaagcacc ccatcaggct accccgtgga gggatgccca ccctttcttc 60
ctcctgtccc cagtgatggg cctcctcagc cgcgcctgga gccgcctgag gggcctggga 120
cctctagagc cctggctggt ggaagcagta aaaggagcag ctctggtaga agctggcctg 180
gagggagaag ctaggactcc tctggcaatc ccccataccc cttggggcag acgccctgaa 240
gaggaggctg aagacagtgg aggccctgga gaggacagag aaacactggg gctgaaaacc 300
agcagttccc ttcctgaagc ctggggactt ttggatgatg atgatggcat gtatggtgag 360
cgagaggcaa ccagtgtccc tagagggcag ggaagtcaat ttgcagatgg ccagcgtgct 420
cccctgtctc ccagccttct gataaggaca ctgcaaggtt ctgataagaa cccaggggag 480
gagaaagccg aggaagaggg agttgctgaa gaggagggag ttaacaagtt ctcttatcca 540
ccatcacacc gggagtgttg tccagccgtg gaggaggagg acgatgaaga agctgtaaag 600
aaagaagctc acagaacctc tacttctgcc ttgtctccag gatccaagcc cagcacttgg 660
gtgtcttgcc caggggagga agagaatcaa gccacggagg ataaaagaac agaaagaagt 720
aaaggagcca ggaagacctc cgtgtccccc cgatcttcag gctccgaccc caggtcctgg 780
gagtatcgtt caggagaggc gtccgaggag aaggaggaaa aggcacacaa agaaactggg 840
aaaggagaag ctgccccagg gccgcaatcc tcagccccag cccagaggcc ccagctcaag 900
tcctggtggt gccaacccag tgatgaagag gagggtgagg tcaaggcttt gggggcagct 960
gagaaggatg gagaagctga gtgtcctccc tgcatccccc caccaagtgc cttcctgaag 1020
gcctgggtgt attggccagg agaggacaca gaggaagagg aagatgagga agaagatgag 1080
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gaagatgagg acagtgatac aggatcagcc gaggatgaaa gagaagctga gacttctgct 1260
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gctgctgcag cggctgccct ggacctcagt gggaggcgtg gc 2022
<210> 80
<211> 2370
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 80
atggctgaac aagtccttcc tcaggctttg tatttgagca atatgcggaa agctgtgaag 60
atacgggaga gaactccaga agacattttt aaacctacta atgggatcat tcatcatttt 120
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<210> 81
<211> 2931
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 81
atgccggccc ggcggctgct gctgctgctg acgctgctgc tgcccggcct cgggattttt 60
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<210> 82
<211> 2196
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 82
atgacggagg gcacgtgtct gcggcgccga gggggcccct acaagaccga gcccgccacc 60
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<210> 83
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 83
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<210> 84
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 84
atggtggtgg tggcagccgc gccgaacccg gccgacggga cccctaaagt tctgcttctg 60
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cgacagcgcc tcacgcacct gagccccgag gagaaggcgc tgaggaggaa actgaaaaac 240
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tgggaggaca cttttgccaa tgaactcttt ccccagctga ttagtgtc 1128
<210> 85
<211> 561
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 85
atggtggcgg cgacggtggc agcggcgtgg ctgctcctgt gggctgcggc ctgcgcgcag 60
caggagcagg acttctacga cttcaaggcg gtcaacatcc ggggcaaact ggtgtcgctg 120
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acctggaact tctggaagta cctagtagcc ccagatggaa aggtggtagg ggcttgggac 480
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 86
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gtaatgggcc tggtgtctgt taattgtgaa agccttcata atagacttcg tttcttgcaa 720
aactctcttg gagcagttcc atctcctatt gattgttacc tctgcaatcg aggtctgaag 780
actctacatg tccgaatgga aaagcatttc aaaaacggaa tggcagttgc ccagttcctg 840
gaatctaatc cttgggtaga aaaggttatt tatcctgggc tgccctctca tccacagcat 900
gagttggtga agcgtcagtg tacaggttgt acagggatgg tcacctttta tattaagggc 960
actcttcagc atgctgagat tttcctcaag aacctaaagc tatttactct ggccgagagc 1020
ttgggaggat tcgaaagcct tgctgagctt ccggcaatca tgactcatgc atcagttctt 1080
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agtggaagtc acagc 1215
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<211> 1653
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 87
atgccttctg agacccccca ggcagaagtg gggcccacag gctgccccca ccgctcaggg 60
ccacactcgg cgaaggggag cctggagaag gggtccccag aggataagga agccaaggag 120
cccctgtgga tccggcccga tgctccgagc aggtgcacct ggcagctggg ccggcctgcc 180
tccgagtccc cacatcacca cactgccccg gcaaaatctc caaaaatctt gccagatatt 240
ctgaagaaaa tcggggacac ccctatggtc agaatcaaca agattgggaa gaagttcggc 300
ctgaagtgtg agctcttggc caagtgtgag ttcttcaacg cgggcgggag cgtgaaggac 360
cgcatcagcc tgcggatgat tgaggatgct gagcgcgacg ggacgctgaa gcccggggac 420
acgattatcg agccgacatc cgggaacacc gggatcgggc tggccctggc tgcggcagtg 480
aggggctatc gctgcatcat cgtgatgcca gagaagatga gctccgagaa ggtggacgtg 540
ctgcgggcac tgggggctga gattgtgagg acgcccacca atgccaggtt cgactccccg 600
gagtcacacg tgggggtggc ctggcggctg aagaacgaaa tccccaattc tcacatccta 660
gaccagtacc gcaacgccag caaccccctg gctcactacg acaccaccgc tgatgagatc 720
ctgcagcagt gtgatgggaa gctggacatg ctggtggctt cagtgggcac gggcggcacc 780
atcacgggca ttgccaggaa gctgaaggag aagtgtcctg gatgcaggat cattggggtg 840
gatcccgaag ggtccatcct cgcagagccg gaggagctga accagacgga gcagacaacc 900
tacgaggtgg aagggatcgg ctacgacttc atccccacgg tgctggacag gacggtggtg 960
gacaagtggt tcaagagcaa cgatgaggag gcgttcacct ttgcccgcat gctgatcgcg 1020
caagaggggc tgctgtgcgg tggcagtgct ggcagcacgg tggcggtggc cgtgaaggcc 1080
gcgcaggagc tgcaggaggg ccagcgctgc gtggtcattc tgcccgactc agtgcggaac 1140
tacatgacca agttcctgag cgacaggtgg atgctgcaga agggctttct gaaggaggag 1200
gacctcacgg agaagaagcc ctggtggtgg cacctccgtg ttcaggagct gggcctgtca 1260
gccccgctga ccgtgctccc gaccatcacc tgtgggcaca ccatcgagat cctccgggag 1320
aagggcttcg accaggcgcc cgtggtggat gaggcggggg taatcctggg aatggtgacg 1380
cttgggaaca tgctctcgtc cctgcttgcc gggaaggtgc agccgtcaga ccaagttggc 1440
aaagtcatct acaagcagtt caaacagatc cgcctcacgg acacgctggg caggctctcg 1500
cacatcctgg agatggacca cttcgccctg gtggtgcacg agcagatcca gtaccacagc 1560
accgggaagt ccagtcagcg gcagatggtg ttcggggtgg tcaccgccat tgacttgctg 1620
aacttcgtgg ccgcccagga gcgggaccag aag 1653
<210> 88
<211> 618
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 88
atgtcggggc ccgggacggc cgcggtagcg ctgctcccgg cggtcctgct ggccttgctg 60
gcgccctggg cgggccgagg gggcgccgcc gcacccactg cacccaacgg cacgctggag 120
gccgagctgg agcgccgctg ggagagcctg gtggcgctct cgttggcgcg cctgccggtg 180
gcagcgcagc ccaaggaggc ggccgtccag agcggcgccg gcgactacct gctgggcatc 240
aagcggctgc ggcggctcta ctgcaacgtg ggcatcggct tccacctcca ggcgctcccc 300
gacggccgca tcggcggcgc gcacgcggac acccgcgaca gcctgctgga gctctcgccc 360
gtggagcggg gcgtggtgag catcttcggc gtggccagcc ggttcttcgt ggccatgagc 420
agcaagggca agctctatgg ctcgcccttc ttcaccgatg agtgcacgtt caaggagatt 480
ctccttccca acaactacaa cgcctacgag tcctacaagt accccggcat gttcatcgcc 540
ctgagcaaga atgggaagac caagaagggg aaccgagtgt cgcccaccat gaaggtcacc 600
cacttcctcc ccaggctg 618
<210> 89
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 89
atgctgaaga agcagtctgc agggcttgtg ctgtggggcg ctatcctctt tgtggcctgg 60
aatgccctgc tgctcctctt cttctggacg cgcccagcac ctggcaggcc accctcagtc 120
agcgctctcg atggcgaccc cgccagcctc acccgggaag tgattcgcct ggcccaagac 180
gccgaggtgg agctggagcg gcagcgtggg ctgctgcagc agatcgggga tgccctgtcg 240
agccagcggg ggagggtgcc caccgcggcc cctcccgccc agccgcgtgt gcctgtgacc 300
cccgcgccgg cggtgattcc catcctggtc atcgcctgtg accgcagcac tgttcggcgc 360
tgcctggaca agctgctgca ttatcggccc tcggctgagc tcttccccat catcgttagc 420
caggactgcg ggcacgagga gacggcccag gccatcgcct cctacggcag cgcggtcacg 480
cacatccggc agcccgacct gagcagcatt gcggtgccgc cggaccaccg caagttccag 540
ggctactaca agatcgcgcg ccactaccgc tgggcgctgg gccaggtctt ccggcagttt 600
cgcttccccg cggccgtggt ggtggaggat gacctggagg tggccccgga cttcttcgag 660
tactttcggg ccacctatcc gctgctgaag gccgacccct ccctgtggtg cgtctcggcc 720
tggaatgaca acggcaagga gcagatggtg gacgccagca ggcctgagct gctctaccgc 780
accgactttt tccctggcct gggctggctg ctgttggccg agctctgggc tgagctggag 840
cccaagtggc caaaggcctt ctgggacgac tggatgcggc ggccggagca gcggcagggg 900
cgggcctgca tacgccctga gatctcaaga acgatgacct ttggccgcaa gggtgtgagc 960
cacgggcagt tctttgacca gcacctcaag tttatcaagc tgaaccagca gtttgtgcac 1020
ttcacccagc tggacctgtc ttacctgcag cgggaggcct atgaccgaga tttcctcgcc 1080
cgcgtctacg gtgctcccca gctgcaggtg gagaaagtga ggaccaatga ccggaaggag 1140
ctgggggagg tgcgggtgca gtatacgggc agggacagct tcaaggcttt cgccaaggct 1200
ctgggtgtca tggatgacct taagtcgggg gttccgagag ctggctaccg gggtattgtc 1260
accttccagt tccggggccg ccgtgtccac ctggcgcccc caccgacgtg ggagggctat 1320
gatcctagct ggaat 1335
<210> 90
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 90
atgaggttcc gcatctacaa acggaaggtg ctaatcctga cgctcgtggt ggccgcctgc 60
ggcttcgtcc tctggagcag caatgggcga caaaggaaga acgaggccct cgccccaccg 120
ttgctggacg ccgaacccgc gcggggtgcc ggcggccgcg gtggggacca cccctctgtg 180
gctgtgggca tccgcagggt ctccaacgtg tcggcggctt ccctggtccc ggcggtcccc 240
cagcccgagg cggacaacct gacgctgcgg taccggtccc tggtgtacca gctgaacttt 300
gatcagaccc tgaggaatgt agataaggct ggcacctggg ccccccggga gctggtgctg 360
gtggtccagg tgcataaccg gcccgaatac ctcagactgc tgctggactc acttcgaaaa 420
gcccagggaa ttgacaacgt cctcgtcatc tttagccatg acttctggtc gaccgagatc 480
aatcagctga tcgccggggt gaatttctgt ccggttctgc aggtgttctt tcctttcagc 540
attcagttgt accctaacga gtttccaggt agtgacccta gagattgtcc cagagacctg 600
ccgaagaatg ccgctttgaa attggggtgc atcaatgctg agtatcccga ctccttcggc 660
cattatagag aggccaaatt ctcccagacc aaacatcact ggtggtggaa gctgcatttt 720
gtgtgggaaa gagtgaaaat tcttcgagat tatgctggcc ttatactttt cctagaagag 780
gatcactact tagccccaga cttttaccat gtcttcaaaa agatgtggaa actgaagcag 840
caagagtgcc ctgaatgtga tgttctctcc ctggggacct atagtgccag tcgcagtttc 900
tatggcatgg ctgacaaggt agatgtgaaa acttggaaat ccacagagca caatatgggt 960
ctagccttga cccggaatgc ctatcagaag ctgatcgagt gcacagacac tttctgtact 1020
tatgatgatt ataactggga ctggactctt caatacttga ctgtatcttg tcttccaaaa 1080
ttctggaaag tgctggttcc tcaaattcct aggatctttc atgctggaga ctgtggtatg 1140
catcacaaga aaacctgtag accatccact cagagtgccc aaattgagtc actcttaaat 1200
aataacaaac aatacatgtt tccagaaact ctaactatca gtgaaaagtt tactgtggta 1260
gccatttccc cacctagaaa aaatggaggg tggggagata ttagggacca tgaactctgt 1320
aaaagttata gaagactgca g 1341
<210> 91
<211> 954
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 91
atgccgaagc gtgggaaaaa gggagcggtg gcggaagacg gggatgagct caggacagag 60
ccagaggcca agaagagtaa gacggccgca aagaaaaatg acaaagaggc agcaggagag 120
ggcccagccc tgtatgagga ccccccagat cagaaaacct cacccagtgg caaacctgcc 180
acactcaaga tctgctcttg gaatgtggat gggcttcgag cctggattaa gaagaaagga 240
ttagattggg taaaggaaga agccccagat atactgtgcc ttcaagagac caaatgttca 300
gagaacaaac taccagctga acttcaggag ctgcctggac tctctcatca atactggtca 360
gctccttcgg acaaggaagg gtacagtggc gtgggcctgc tttcccgcca gtgcccactc 420
aaagtttctt acggcatagg cgatgaggag catgatcagg aaggccgggt gattgtggct 480
gaatttgact cgtttgtgct ggtaacagca tatgtaccta atgcaggccg aggtctggta 540
cgactggagt accggcagcg ctgggatgaa gcctttcgca agttcctgaa gggcctggct 600
tcccgaaagc cccttgtgct gtgtggagac ctcaatgtgg cacatgaaga aattgacctt 660
cgcaacccca aggggaacaa aaagaatgct ggcttcacgc cacaagagcg ccaaggcttc 720
ggggaattac tgcaggctgt gccactggct gacagcttta ggcacctcta ccccaacaca 780
ccctatgcct acaccttttg gacttatatg atgaatgctc gatccaagaa tgttggttgg 840
cgccttgatt actttttgtt gtcccactct ctgttacctg cattgtgtga cagcaagatc 900
cgttccaagg ccctcggcag tgatcactgt cctatcaccc tatacctagc actg 954
<210> 92
<211> 387
<212> DNA
<213> 大肠杆菌( Escherichia coli)
<400> 92
atgctggttt cttgcgcaat gcgacttcac tcgggcgttt ttccagatta tgctgaaaaa 60
ttacctcagg aagaaaagat ggaaaaagaa gattcatttc cccaacgcgt ctggcaaatc 120
gtcgccgcta ttcccgaagg ctatgtcacc acttacggtg atgtggcgaa actggcggga 180
tcgccccgcg ccgcgcgcca ggtgggcggt gtgttaaagc gtctccctga aggcagcacc 240
ttaccctggc accgggtggt taatcgccac ggcacaattt cgctaaccgg accggattta 300
cagcgtcagc gacaggcatt actggcagaa ggtgtgatgg tatcgggaag cgggcaaatc 360
gacttgcagc gttatcgctg gaactac 387
<210> 93
<211> 1851
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 93
atgttccgca cggcagtgat gatggcggcc agcctggcgc tgaccggggc tgtggtggct 60
cacgcctact acctcaaaca ccagttctac cccactgtgg tgtacctgac caagtccagc 120
cccagcatgg cagtcctgta catccaggcc tttgtccttg tcttccttct gggcaaggtg 180
atgggcaagg tgttctttgg gcaactgagg gcagcagaga tggagcacct tctggaacgt 240
tcctggtacg ccgtcacaga gacttgtctg gccttcaccg tttttcggga tgacttcagc 300
ccccgctttg ttgcactctt cactcttctt ctcttcctca aatgtttcca ctggctggct 360
gaggaccgtg tggactttat ggaacgcagc cccaacatct cctggctctt tcactgccgc 420
attgtctctc ttatgttcct cctgggcatc ctggacttcc tcttcgtcag ccacgcctat 480
cacagcatcc tgacccgtgg ggcctctgtg cagctggtgt ttggctttga gtatgccatc 540
ctgatgacga tggtgctcac catcttcatc aagtatgtgc tgcactccgt ggacctccag 600
agtgagaacc cctgggacaa caaggctgtg tacatgctct acacagagct gtttacaggc 660
ttcatcaagg ttctgctgta catggccttc atgaccatca tgatcaaggt gcacaccttc 720
ccactctttg ccatccggcc catgtacctg gccatgagac agttcaagaa agctgtgaca 780
gatgccatca tgtctcgccg agccatccgc aacatgaaca ccctgtatcc agatgccacc 840
ccagaggagc tccaggcaat ggacaatgtc tgcatcatct gccgagaaga gatggtgact 900
ggtgccaaga gactgccctg caaccacatt ttccatacca gctgcctgcg ctcctggttc 960
cagcggcagc agacctgccc cacctgccgt atggatgtcc ttcgtgcatc gctgccagcg 1020
cagtcaccac cacccccgga gcctgcggat caggggccac cccctgcccc ccacccccca 1080
ccactcttgc ctcagccccc caacttcccc cagggcctcc tgcctccttt tcctccaggc 1140
atgttcccac tgtggccccc catgggcccc tttccacctg tcccgcctcc ccccagctca 1200
ggagaggctg tggctcctcc atccaccagt gcagcagccc tttctcggcc cagtggagca 1260
gctacaacca cagctgctgg caccagtgct actgctgctt ctgccacagc atctggccca 1320
ggctctggct ctgccccaga ggctggccct gcccctggtt tccccttccc tcctccctgg 1380
atgggtatgc ccctgcctcc accctttgcc ttccccccaa tgcctgtgcc ccctgcgggc 1440
tttgctgggc tgaccccaga ggagctacga gctctggagg gccatgagcg gcagcacctg 1500
gaggcccggc tgcagagcct gcgtaacatc cacacactgc tggacgccgc catgctgcag 1560
atcaaccagt acctcaccgt gctggcctcc ttggggcccc cccggcctgc cacttcagtc 1620
aactccactg aggagactgc cactacagtt gttgctgctg cctcctccac cagcatccct 1680
agctcagagg ccacgacccc aaccccagga gcctccccac cagcccctga aatggaaagg 1740
cctccagctc ctgagtcagt gggcacagag gagatgcctg aggatggaga gcccgatgca 1800
gcagagctcc gccggcgccg cctgcagaag ctggagtctc ctgttgccca c 1851
<210> 94
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 94
atggaggaag gaggcggcgg cgtacggagt ctggtcccgg gcgggccggt gttactggtc 60
ctctgcggcc tcctggaggc gtccggcggc ggccgagccc ttcctcaact cagcgatgac 120
atccctttcc gagtcaactg gcccggcacc gagttctctc tgcccacaac tggagtttta 180
tataaagaag ataattatgt catcatgaca actgcacata aagaaaaata taaatgcata 240
cttccccttg tgacaagtgg ggatgaggaa gaagaaaagg attataaagg ccctaatcca 300
agagagcttt tggagccact atttaaacaa agcagttgtt cctacagaat tgagtcttat 360
tggacttacg aagtatgtca tggaaaacac attcggcagt accatgaaga gaaagaaact 420
ggtcagaaaa taaatattca cgagtactac cttgggaata tgttggccaa gaaccttcta 480
tttgaaaaag aacgagaagc agaagaaaag gaaaaatcaa atgagattcc cactaaaaat 540
atcgaaggtc agatgacacc atactatcct gtgggaatgg gaaatggtac accttgtagt 600
ttgaaacaga accggcccag atcaagtact gtgatgtaca tatgtcatcc tgaatctaag 660
catgaaattc tttcagtagc tgaagttaca acttgtgaat atgaagttgt cattttgaca 720
ccactcttgt gcagtcatcc taaatatagg ttcagagcat ctcctgtgaa tgacatattt 780
tgtcaatcac tgccaggatc tccatttaag cccctcaccc tgaggcagct ggagcagcag 840
gaagaaatac taagggtgcc ttttaggaga aataaagagg aagatttgca atcaactaaa 900
gaagagagat ttccagcgat ccacaagtcg attgctattg gctctcagcc agtgctcact 960
gttgggacaa cccacatatc caaattgaca gatgaccaac tcataaaaga gtttcttagt 1020
ggttcttact gctttcgtgg gggtgtcggt tggtggaaat atgaattctg ctatggcaaa 1080
catgtacatc aataccatga ggacaaggat agtgggaaaa cctctgtggt tgtcgggaca 1140
tggaaccaag aagagcatat tgaatgggct aagaagaata ctgctagagc ttatcatctt 1200
caagacgatg gtacccagac agtcaggatg gtgtcacatt tttatggaaa tggagatatt 1260
tgtgatataa ctgacaaacc aagacaggtg actgtaaaac taaagtgcaa agaatcagat 1320
tcacctcatg ctgttactgt atatatgcta gagcctcact cctgtcaata tattcttggg 1380
gttgaatctc cagtgatctg taaaatctta gatacagcag atgaaaatgg acttctttct 1440
ctccccaac 1449
<210> 95
<211> 2184
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 95
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540
cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600
tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660
ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720
caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780
cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840
gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900
gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960
tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020
cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080
gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140
ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200
ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260
gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320
cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380
tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440
gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500
acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560
ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620
ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680
tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740
ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800
aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860
ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920
aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980
gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040
caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100
aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160
ttaacatata aggtaccaca gtca 2184
<210> 96
<211> 312
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 96
atggctggca aagcacacag gctgagcgct gaggagaggg accagctgct gccaaacctg 60
agggctgtgg ggtggaatga gctggaaggc cgtgatgcca tcttcaagca gtttcatttc 120
aaagacttca acagggcctt tgggttcatg acaagagtgg ccctgcaggc tgagaaactg 180
gaccaccatc ctgaatggtt taacgtgtac aacaaggtcc acatcacgct gagcacccat 240
gagtgtgccg gcctttcaga acgggacata aacctggcca gcttcatcga acaagtagca 300
gtgtccatga ca 312
<210> 97
<211> 444
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 97
atggcccggg ccctgtgccg cctcccgcgg cgcggcctct ggctgctcct ggcccatcac 60
ctcttcatga ccactgcctg ccaggaggct aactacggtg ccctcctccg ggagctctgc 120
ctcacccagt tccaggtaga catggaggcc gtcggggaga cgctgtggtg tgactggggc 180
aggaccatca ggagctacag ggagctggcc gactgcacct ggcacatggc ggagaagctg 240
ggctgcttct ggcccaatgc agaggtggac aggttcttcc tggcagtgca tggccgctac 300
ttcaggagct gccccatctc aggcagggcc gtgcgggacc cgcccggcag catcctctac 360
cccttcatcg tggtccccat cacggtgacc ctgctggtga cggcactggt ggtctggcag 420
agcaagcgca ctgagggcat tgtg 444
<210> 98
<211> 525
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 98
atggcctcgc tccgggtgga gcgcgccggc ggcccgcgtc tccctaggac ccgagtcggg 60
cggccggcag cgctccgcct cctcctcctg ctgggcgctg tcctgaatcc ccacgaggcc 120
ctggctcagc ctcttcccac cacaggcaca ccagggtcag aaggggggac ggtgaagaac 180
tatgagacag ctgtccaatt ttgctggaat cattataagg atcaaatgga tcctatcgaa 240
aaggattggt gcgactgggc catgattagc aggccttata gcaccctgcg agattgcctg 300
gagcactttg cagagttgtt tgacctgggc ttccccaatc ccttggcaga gaggatcatc 360
tttgagactc accagatcca ctttgccaac tgctccctgg tgcagcccac cttctctgac 420
cccccagagg atgtactcct ggccatgatc atagccccca tctgcctcat ccccttcctc 480
atcactcttg tagtatggag gagtaaagac agtgaggccc aggcc 525
<210> 99
<211> 444
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 99
atggagactg gagcgctgcg gcgcccgcaa cttctcccgt tgctgctgct gctctgcggt 60
gggtgtccca gagcaggcgg ctgcaacgag acaggcatgt tggagaggct gcccctgtgt 120
gggaaggctt tcgcagacat gatgggcaag gtggacgtct ggaagtggtg caacctgtcc 180
gagttcatcg tgtactatga gagtttcacc aactgcaccg agatggaggc caatgtcgtg 240
ggctgctact ggcccaaccc cctggcccag ggcttcatca ccggcatcca caggcagttc 300
ttctccaact gcaccgtgga cagggtccac ttggaggacc ccccagacga ggttctcatc 360
ccgctgatcg ttatacccgt cgttctgact gtcgccatgg ctggcctggt ggtgtggcgc 420
agcaaacgca ccgacacgct gctg 444
<210> 100
<211> 1644
<212> DNA
<213> 大肠杆菌( Escherichia coli)
<400> 100
atggattcgc aacgcaatct tttagtcatc gctttgctgt tcgtgtcttt catgatctgg 60
caagcctggg agcaggataa aaacccgcaa cctcaggccc aacagaccac gcagacaacg 120
accaccgcag cgggtagcgc cgccgaccag ggcgtaccgg ccagtggcca ggggaaactg 180
atctcggtta agaccgacgt gcttgatctg accatcaaca cccgtggtgg tgatgttgag 240
caagctctgc tgcctgctta cccgaaagag ctgaactcta cccagccgtt ccagctgttg 300
gaaacttcac cgcagtttat ttatcaggca cagagcggtc tgaccggtcg tgatggcccg 360
gataacccgg ctaacggccc gcgtccgctg tataacgttg aaaaagacgc ttatgtgctg 420
gctgaaggtc aaaacgaact gcaggtgccg atgacgtata ccgacgcggc aggcaacacg 480
tttaccaaaa cgtttgtcct gaaacgtggt gattacgctg tcaacgtcaa ctacaacgtg 540
cagaacgctg gcgagaaacc gctggaaatc tcctcgtttg gtcagttgaa gcaatccatc 600
actctgccac cgcatctcga taccggaagc agcaacttcg cactgcacac cttccgtggc 660
gcggcgtact ccacgcctga cgagaagtat gagaaataca agttcgatac cattgccgat 720
aacgaaaacc tgaacatctc ttcgaaaggt ggttgggtgg cgatgctgca acagtatttc 780
gcgacggcgt ggatcccgca taacgacggt accaacaact tctataccgc taatctgggt 840
aacggcatcg ccgctatcgg ctataaatct cagccggtac tggttcagcc tggtcagact 900
ggcgcgatga acagcaccct gtgggttggc ccggaaatcc aggacaaaat ggcagctgtt 960
gctccgcacc tggatctgac cgttgattac ggttggttgt ggttcatctc tcagccgctg 1020
ttcaaactgc tgaaatggat ccatagcttt gtgggtaact ggggcttctc cattatcatc 1080
atcaccttta tcgttcgtgg catcatgtac ccgctgacca aagcgcagta cacctccatg 1140
gcgaagatgc gtatgttgca gccgaagatt caggcaatgc gtgagcgtct gggcgatgac 1200
aaacagcgta tcagccagga aatgatggcg ctgtacaaag ctgagaaggt taacccgctg 1260
ggcggctgct tcccgctgct gatccagatg ccaatcttcc tggcgttgta ctacatgctg 1320
atgggttccg ttgaactgcg tcaggcaccg tttgcactgt ggatccacga cctgtcggca 1380
caggacccgt actacatcct gccgatcctg atgggcgtaa cgatgttctt cattcagaag 1440
atgtcgccga ccacagtgac cgacccgatg cagcagaaga tcatgacctt tatgccggtc 1500
atcttcaccg tgttcttcct gtggttcccg tcaggtctgg tgctgtacta tatcgtcagc 1560
aacctggtaa ccattattca gcagcagctg atttaccgtg gtctggaaaa acgtggcctg 1620
catagccgcg agaagaaaaa atcc 1644
<210> 101
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 101
atgaggcttc gggagccgct cctgagcggc agcgccgcga tgccaggcgc gtccctacag 60
cgggcctgcc gcctgctcgt ggccgtctgc gctctgcacc ttggcgtcac cctcgtttac 120
tacctggctg gccgcgacct gagccgcctg ccccaactgg tcggagtctc cacaccgctg 180
cagggcggct cgaacagtgc cgccgccatc gggcagtcct ccggggagct ccggaccgga 240
ggggcccggc cgccgcctcc tctaggcgcc tcctcccagc cgcgcccggg tggcgactcc 300
agcccagtcg tggattctgg ccctggcccc gctagcaact tgacctcggt cccagtgccc 360
cacaccaccg cactgtcgct gcccgcctgc cctgaggagt ccccgctgct tgtgggcccc 420
atgctgattg agtttaacat gcctgtggac ctggagctcg tggcaaagca gaacccaaat 480
gtgaagatgg gcggccgcta tgcccccagg gactgcgtct ctcctcacaa ggtggccatc 540
atcattccat tccgcaaccg gcaggagcac ctcaagtact ggctatatta tttgcaccca 600
gtcctgcagc gccagcagct ggactatggc atctatgtta tcaaccaggc gggagacact 660
atattcaatc gtgctaagct cctcaatgtt ggctttcaag aagccttgaa ggactatgac 720
tacacctgct ttgtgtttag tgacgtggac ctcattccaa tgaatgacca taatgcgtac 780
aggtgttttt cacagccacg gcacatttcc gttgcaatgg ataagtttgg attcagccta 840
ccttatgttc agtattttgg aggtgtctct gctctaagta aacaacagtt tctaaccatc 900
aatggatttc ctaataatta ttggggctgg ggaggagaag atgatgacat ttttaacaga 960
ttagttttta gaggcatgtc tatatctcgc ccaaatgctg tggtcgggag gtgtcgcatg 1020
atccgccact caagagacaa gaaaaatgaa cccaatcctc agaggtttga ccgaattgca 1080
cacacaaagg agacaatgct ctctgatggt ttgaactcac tcacctacca ggtgctggat 1140
gtacagagat acccattgta tacccaaatc acagtggaca tcgggacacc gagc 1194
<210> 102
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 102
atgccaccag cagttggagg tccagttgga tacacccccc cagatggagg ctggggctgg 60
gcagtggtaa ttggagcttt catttccatc ggcttctctt atgcatttcc caaatcaatt 120
actgtcttct tcaaagagat tgaaggtata ttccatgcca ccaccagcga agtgtcatgg 180
atatcctcca taatgttggc tgtcatgtat ggtggaggtc ctatcagcag tatcctggtg 240
aataaatatg gaagtcgtat agtcatgatt gttggtggct gcttgtcagg ctgtggcttg 300
attgcagctt ctttctgtaa caccgtacag caactatacg tctgtattgg agtcattgga 360
ggtcttgggc ttgccttcaa cttgaatcca gctctgacca tgattggcaa gtatttctac 420
aagaggcgac cattggccaa cggactggcc atggcaggca gccctgtgtt cctctgtact 480
ctggcccccc tcaatcaggt tttcttcggt atctttggat ggagaggaag ctttctaatt 540
cttgggggct tgctactaaa ctgctgtgtt gctggagccc tcatgcgacc aatcgggccc 600
aagccaacca aggcagggaa agataagtct aaagcatccc ttgagaaagc tggaaaatct 660
ggtgtgaaaa aagatctgca tgatgcaaat acagatctta ttggaagaca ccctaaacaa 720
gagaaacgat cagtcttcca aacaattaat cagttcctgg acttaaccct attcacccac 780
agaggctttt tgctatacct ctctggaaat gtgatcatgt tttttggact ctttgcacct 840
ttggtgtttc ttagtagtta tgggaagagt cagcattatt ctagtgagaa gtctgccttc 900
cttctttcca ttctggcttt tgttgacatg gtagcccgac catctatggg acttgtagcc 960
aacacaaagc caataagacc tcgaattcag tatttctttg cggcttccgt tgttgcaaat 1020
ggagtgtgtc atatgctagc acctttatcc actacctatg ttggattctg tgtctatgcg 1080
ggattctttg gatttgcctt cgggtggctc agctccgtat tgtttgaaac attgatggac 1140
cttgttggac cccagaggtt ctccagcgct gtgggattgg tgaccattgt ggaatgctgt 1200
cctgtcctcc tggggccacc acttttaggt cggctcaatg acatgtatgg agactacaaa 1260
tacacatact gggcatgtgg cgtcgtccta attatttcag gtatctatct cttcattggc 1320
atgggcatca attatcgact tttggcaaaa gaacagaaag caaacgagca gaaaaaggaa 1380
agtaaagagg aagagaccag tatagatgtt gctgggaagc caaatgaagt taccaaagca 1440
gcagaatctc cggaccagaa agacacagat ggagggccca aggaggagga aagtccagtc 1500
<210> 103
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 103
atgaccacct cagcaagttc ccacttaaat aaaggcatca agcaggtgta catgtccctg 60
cctcagggtg agaaagtcca ggccatgtat atctggatcg atggtactgg agaaggactg 120
cgctgcaaga cccggaccct ggacagtgag cccaagtgtg tggaagagtt gcctgagtgg 180
aatttcgatg gctctagtac tttacagtct gagggttcca acagtgacat gtatctcgtg 240
cctgctgcca tgtttcggga ccccttccgt aaggacccta acaagctggt gttatgtgaa 300
gttttcaagt acaatcgaag gcctgcagag accaatttga ggcacacctg taaacggata 360
atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggcatgg agcaggagta taccctcatg 420
gggacagatg ggcacccctt tggttggcct tccaacggct tcccagggcc ccagggtcca 480
tattactgtg gtgtgggagc agacagagcc tatggcaggg acatcgtgga ggcccattac 540
cgggcctgct tgtatgctgg agtcaagatt gcggggacta atgccgaggt catgcctgcc 600
cagtgggaat ttcagattgg accttgtgaa ggaatcagca tgggagatca tctctgggtg 660
gcccgtttca tcttgcatcg tgtgtgtgaa gactttggag tgatagcaac ctttgatcct 720
aagcccattc ctgggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaacttcag caccaaggcc 780
atgcgggagg agaatggtct gaagtacatc gaggaggcca ttgagaaact aagcaagcgg 840
caccagtacc acatccgtgc ctatgatccc aagggaggcc tggacaatgc ccgacgtcta 900
actggattcc atgaaacctc caacatcaac gacttttctg ctggtgtagc caatcgtagc 960
gccagcatac gcattccccg gactgttggc caggagaaga agggttactt tgaagatcgt 1020
cgcccctctg ccaactgcga ccccttttcg gtgacagaag ccctcatccg cacgtgtctt 1080
ctcaatgaaa ccggcgatga gcccttccag tacaaaaat 1119
<210> 104
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 104
atgagcgccg ccacccactc gcccatgatg caggtggcgt ccggcaacgg tgaccgcgac 60
cctttgcccc ccggatggga gatcaagatc gacccgcaga ccggctggcc cttcttcgtg 120
gaccacaaca gccgcaccac tacgtggaac gacccgcgcg tgccctctga gggccccaag 180
gagactccat cctctgccaa tggcccttcc cgggagggct ctaggctgcc gcctgctagg 240
gaaggccacc ctgtgtaccc ccagctccga ccaggctaca ttcccattcc tgtgctccat 300
gaaggcgctg agaaccggca ggtgcaccct ttccatgtct atccccagcc tgggatgcag 360
cgattccgaa ctgaggcggc agcagcggct cctcagaggt cccagtcacc tctgcggggc 420
atgccagaaa ccactcagcc agataaacag tgtggacagg tggcagcggc ggcggcagcc 480
cagcccccag cctcccacgg acctgagcgg tcccagtctc cagctgcctc tgactgctca 540
tcctcatcct cctcggccag cctgccttcc tccggcagga gcagcctggg cagtcaccag 600
ctcccgcggg ggtacatctc cattccggtg atacacgagc agaacgttac ccggccagca 660
gcccagccct ccttccacca agcccagaag acgcactacc cagcgcagca gggggagtac 720
cagacccacc agcctgtgta ccacaagatc cagggggatg actgggagcc ccggcccctg 780
cgggcggcat ccccgttcag gtcatctgtc cagggtgcat cgagccggga gggctcacca 840
gccaggagca gcacgccact ccactccccc tcgcccatcc gtgtgcacac cgtggtcgac 900
aggcctcagc agcccatgac ccatcgagaa actgcacctg tttcccagcc tgaaaacaaa 960
ccagaaagta agccaggccc agttggacca gaactccctc ctggacacat cccaattcaa 1020
gtgatccgca aagaggtgga ttctaaacct gtttcccaga agcccccacc tccctctgag 1080
aaggtagagg tgaaagttcc ccctgctcca gttccttgtc ctcctcccag ccctggccct 1140
tctgctgtcc cctcttcccc caagagtgtg gctacagaag agagggcagc ccccagcact 1200
gcccctgcag aagctacacc tccaaaacca ggagaagccg aggctccccc aaaacatcca 1260
ggagtgctga aagtggaagc catcctggag aaggtacagg ggctggagca ggctgtagac 1320
aactttgaag gcaagaagac tgacaaaaag tacctgatga tcgaagagta tttgaccaaa 1380
gagctgctgg ccctggattc agtggacccc gagggacgag ccgatgtgcg tcaggccagg 1440
agagacggtg tcaggaaggt tcagaccatc ttggaaaaac ttgaacagaa agccattgat 1500
gtcccaggtc aagtccaggt ctatgaactc cagcccagca accttgaagc agatcagcca 1560
ctgcaggcaa tcatggagat gggtgccgtg gcagcagaca agggcaagaa aaatgctgga 1620
aatgcagaag atccccacac agaaacccag cagccagaag ccacagcagc agcgacttca 1680
aaccccagca gcatgacaga cacccctggt aacccagcag caccg 1725
<210> 105
<211> 420
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 105
atggccgtag tgttgccggc ggttgtggag gagctcctga gcgagatggc ggcggcggtg 60
caggagagcg cgcgaattcc tgatgaatat ctgttatcgc tgaagtttct ctttggctca 120
tcagccaccc aggccttgga cctagttgat cgacagtcca tcaccttaat ctcatcaccc 180
agtggaaggc gtgtttacca ggtccttgga agttccagta aaacatacac atgtttggct 240
tcttgtcatt actgttcatg tcctgcattt gcattctcag tgctacggaa gagtgacagc 300
atcctgtgca agcatctctt ggcagtttac ctgagtcagg ttatgaggac ctgtcagcag 360
ctaagtgtct ctgacaagca gttgactgac atattattga tggagaagaa acaagaagca 420
<210> 106
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 106
atggctgccc cgagagacaa tgtcacttta ttattcaagt tatactgctt ggcagtgatg 60
accctgatgg ctgcagtcta taccatagct ttaagataca caaggacatc agacaaagaa 120
ctctactttt caaccacagc cgtgtgtatc acagaagtta taaagttatt gctaagtgtg 180
ggaattttag ctaaagaaac tggtagtctg ggtagattca aagcatcttt aagagaaaat 240
gtcttgggga gccccaagga actgttgaag ttaagtgtgc catcgttagt gtatgctgtt 300
cagaacaaca tggctttcct agctcttagc aatctggatg cagcagtgta ccaggtgacc 360
taccagttga agattccgtg tactgcttta tgcactgttt taatgttaaa ccggacactc 420
agcaaattac agtgggtttc agtttttatg ctgtgtgctg gagttacgct tgtacagtgg 480
aaaccagccc aagctacaaa agtggtggtg gaacaaaatc cattattagg gtttggcgct 540
atagctattg ctgtattgtg ctcaggattt gcaggagtat attttgaaaa agttttaaag 600
agttcagata cttctctttg ggtgagaaac attcaaatgt atctatcagg gattattgtg 660
acattagctg gcgtctactt gtcagatgga gctgaaatta aagaaaaagg atttttctat 720
ggttacacat attatgtctg gtttgtcatc tttcttgcaa gtgttggtgg cctctacact 780
tctgttgtgg ttaagtacac agacaacatc atgaaaggct tttctgcagc agcggccatt 840
gtcctttcca ccattgcttc agtaatgctg tttggattac agataacact cacctttgcc 900
ctgggtactc ttcttgtatg tgtttccata tatctctatg gattacccag acaagacact 960
acatccatcc aacaaggaga aacagcttca aaggagagag ttattggtgt g 1011
<210> 107
<211> 2196
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 107
atgtctttct catgctctcc aggccagcag gtggccatca aaaagatacc caatgctttt 60
gatgtggtga ccaatgccaa acggaccctc agggaactga agatcctcaa acacttcaaa 120
catgacaata tcatcgccat caaggacatc ctgaggccca ctgtgcccta tggagagttc 180
aaatctgtct atgtagtact ggacctcatg gagagtgacc tacaccagat catccactcc 240
tcacagccac tcacactgga gcatgtgcga tacttcttgt accagctgct tcggggcctc 300
aagtatatgc actctgctca ggtcatccac cgtgacctta aaccctctaa ccttttggtg 360
aatgagaact gtgagctcaa gattggtgac tttggaatgg cccgtgggct gtgtacctcc 420
cctgctgaac accagtactt catgactgag tacgtggcca ctcgctggta ccgtgcccct 480
gaactcatgc tttccctgca tgagtacaca caggctattg acctctggtc tgtgggctgc 540
atctttggtg agatgctggc tcggcgacaa ctcttcccag gcaaaaacta tgtgcaccag 600
ttacagctga tcatgatggt gttgggaacc ccatcaccag ctgtgattca ggctgtgggg 660
gctgaaaggg tgcgggcata tatccagagc ctgccaccac ggcagcctgt accctgggag 720
acagtatacc caggtgctga ccgccaggcc ctctcactgc tgggccgcaa gaagccattt 780
gaacccagtg cccggatctc agctgctgct gcccttcgtc accccttcct ggctaagtac 840
catgaccctg atgatgagcc tgattgtgcc ccaccttttg actttgcttt tgaccgtgaa 900
gcccttacta gggagcgcat taaggaagcc attgtggctg agattgagga cttccatgca 960
cgacgggagg gcatccgcca acaaatccgc ttccagcctt ctctgcagcc tgtggctagt 1020
gagcctgtgt gtccagatgt tgagatgccc agtccctggg ctccaagtgg agactgtgcc 1080
atggagtcac ctcctccagc accaccacca tgctctggcc ctgcacctga cactgttgat 1140
ctgactctga agcctgcgcc cccagccagt gagcttgccc caccaaaaag agagggtgcc 1200
atctcagaca acaccaaagc agccctcaaa gctgccctgc tcaagtccct gaggagccga 1260
ctcagagatg gccccagtgc acccttggag gcacctgaac ctcgaaagcc tgtgacagct 1320
caggaacgcc agcgagagcg agaagagaag cgtaggaggc gacaagagag agccaaggag 1380
agggagaagc gacgacaaga gagggaacgc aaggagagag gagctggtgc cttggggggg 1440
ccctctactg accctctggc tggactggtg cttagtgaca atgaccgaag cctgctagag 1500
cgtcgccctc ctgccccaac tccagcccca gccccagctc catcccctgc ccaacctgct 1560
agtcctccca ctggccctgt atctcagtct gctggtcctc ctctacagcc tgcaggctct 1620
attcctggtc ctgcctccca gcctgtttgc ccacccactg gccctgctcc ccagccttct 1680
ggccctcctg gacctatccc tgccccactc caaactgccc cttccactag ccttctggcc 1740
tctcagtcac ttgtgccaac tagtgggttg cctggctcca gtgccccaga agttctctca 1800
tacttcccat ctggcccacc acctccagat cctgggggcc cccctcagcc ttctacatca 1860
gagtcaccag atgtcaacct ggtgacccag caactgtcta agtctcaggt ggaggacccc 1920
ctgcctcctg tgttttcagg cactccaaag ggcagtgggg ctggctacgg tgttggcttt 1980
gacctagagg aattcttaaa ccaatctttc gatatgggtg tggctgatgg gccacaggat 2040
ggccaggcag actcagcttc actctcagcc tccctcctgg ctgactggct tgagggccac 2100
ggcatgaacc cggctgacat cgagtctctg cagcgtgaaa tccagatgga ctccccaatg 2160
ctgctggctg acctgcctga cctccaggag ccctga 2196
<210> 108
<211> 1683
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 108
atgcccatcc agatcttttg ctctgtgtca ttctcctctg gagaagaggc cccaggatcc 60
atgggagata tctggggtcc tcatcaccac cggcagcagc aggacagctc agaatcagaa 120
gaggaagagg aagagaagga aaaagaggca ctgaagaggg agcttgatga cggagactca 180
cctagggact tggtggcctt cgccaacagt tgtaccctcc atggtgccag ccatgtcttt 240
gtggaagggg gcccagggcc aaggcaggcc ctgtgggcag tggcttttgt catagcactg 300
ggtgccttcc tgtgccaggt aggggaccga gttgcttatt acctcagcta tccacatgtg 360
actttgctag atgaagtcgc caccacagag ctggtcttcc cggcggtcac attctgtaac 420
accaatgccg tgcggttgtc ccagctcagc taccctgatc tgctctacct ggcccccatg 480
ctagggctgg atgaaagtga tgatcctggg gtgccccttg ctccaccggg gccagaggcc 540
ttctccgggg agccttttaa tctccatcgt ttctacaatc gctcctgcca ccggctggag 600
gacatgctgc tctattgttc ctactgtggg ggcccctgtg gtccccacaa cttctcagtg 660
gtcttcacac ggtatgggaa gtgttacaca ttcaactcgg gccaagatgg gcggccacgg 720
ctgaagacaa tgaaaggtgg gactggcaat ggcctggaga tcatgctgga catccagcaa 780
gatgaatacc tgcctgtgtg gggagagacc gacgagacat ccttcgaagc aggtatcaaa 840
gtgcagatcc acagccagga tgaacctcct ttcatcgacc agctgggctt tggtgtggcc 900
ccaggcttcc agacctttgt gtcttgccag gagcagaggc tcatctacct gccctcaccc 960
tggggcacct gcaatgctgt taccatggac tcggatttct tcgactccta cagtatcacc 1020
gcctgccgca ttgattgtga gacacgttac ctggtggaaa actgcaactg ccgtatggta 1080
cacatgccag gggatgctcc atactgcact ccagagcagt acaaggagtg tgcagatcct 1140
gccctggact tcctagtgga gaaagaccag gaatactgcg tgtgtgaaat gccctgcaac 1200
ctgacacgct atggcaagga gctgtccatg gtcaagatac ccagcaaagc ctcagccaag 1260
tacctggcca agaagttcaa caaatctgag cagtacatag gggagaacat cctggtgctg 1320
gatattttct ttgaagtcct caactatgag accatcgagc agaaaaaggc ctatgagatc 1380
gcagggctct tgggtgacat cgggggccag atggggttgt tcatcggggc cagcatcctc 1440
acagtgctgg aactctttga ctatgcctat gaggtcatta agcaccgttt gtgtagacga 1500
gggaaatgcc agaaggaggc caagaggagc agcgcagata agggcgtagc gctcagcctg 1560
gacgacgtca aaagacacaa tccctgcgag agcctccggg gacaccctgc cgggatgaca 1620
tacgctgcca acatcctacc tcaccatcct gctcgaggca cctttgagga ctttacctgc 1680
taa 1683
<210> 109
<211> 1974
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 109
atggcgctgc tgaatggact tgcctccggg gctgtgccgt cagtgcggct gcgcgcgagc 60
cgggtgccgc ggtacttaag ttggctgcac acactgtcag aggtagccat gaggagagca 120
gatcccgagc agcccgctaa gcggcctcgc tgcgacagca gcccaagaac gccacagaga 180
acccctcctg cagcggccag cgcgtctccc ggctccgagc tccacatcga cctccagacc 240
tgggaagtgg aggacgtgtg ctcctaccta aagggatgcg gcttccaaga caagaaagtg 300
ctggacagct tcaaagaaaa tgaaatcact ggtccatttt tgccctttct cgatgagtca 360
cgtcttgaaa aacttggagt aagttccttg gaggagagga agaacatgat tgcatgtatc 420
caagaactga gtcaatctca agtagagcta atgaaggtat ttaatgatcc tattcatggc 480
catattgagt tccaccctct ccttatccga atcattgaca cacctcagtt tcagcggctt 540
cgatacatca aacagctggg aggcggctac tatgttttcc caggagcttc acacaatcgc 600
tttgaacaca gtctaggggt tgggtaccta gcaggctacc tcgttcgaac acttgcagaa 660
aaacagccag agctaaagat cagtgagcga gatatgctct gtgttcagat tgccggactc 720
tgccatgacc ttggtcatgg gccattttct catatgtttg atggaagatt tatcccatct 780
gctcgccgag gtgaaacgtg gaagcatgaa cagggatcag ctaagatgtt tgaacatctg 840
gttaattcta atgaactcgg acctatcatg aaaaactatg ggctcaaccc tgaagaagat 900
attgtcttca ttaaggaaca aattgaggga ccaacttcaa ctccaatcaa ggactgctca 960
tggccatata aaggacgccc tgccgagaag agcttccttt atgagatagt gtctaacaaa 1020
agaaatggca ttgatgtgga caaatgggat tattttgcca gggactgtca ccatcttgga 1080
atccaaaaca attttgatta caagcgctat gttaagtttg tccgtgtctg tgaggtggaa 1140
gaatcttgtg gctgcaagat gaagcacatt tgtaccagag aaaaggaggt tgggaatctg 1200
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<210> 110
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<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 110
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<211> 1155
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
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<210> 112
<211> 981
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 117
atggtgtggg ttcctgaagg ggggatgctg aagatcacca accggatctt gcaggctcaa 60
gctcctggtg tccgagccga ggacatcatc tacaagatca cacacggcca cccccagttt 120
ggggaggtgg tcctcctgat ggatctgcct gcagacagcc ctgccggccc tgctggtcct 180
gctgctggtc ctaccagccc tgccgaggaa gggcagcacc tgcctgatgg aagaatggcc 240
acacccacca gcaccttcac ccagcaggac atcgatgatg gcatagtgtg gtacagacac 300
tcaggagccc tgacccagag tgatgccttc cacttccagg tgtctagtgc cgctgatgcc 360
cacacccacc tggaaagtca catgttcaac attgcaatct tacctcaggc acctgaggca 420
cctaaactct ccttggggac atctctccat atgaccgctc gggaagatgg cctaactgtc 480
attcagcctc actccttgtc ctttgtgaac tcaaagagtc ccatcggaaa gattatatac 540
aacatcaccg tacctctgca tccaaatcaa ggtgccattg agcacagaga ccagcctcac 600
tctcccatcc agtatttctc ccaggaagat attaaccagg gcaaaatcgt gtatcgccct 660
cccgctgcgg cctcccacct ccaggagatc atggcctact cctttgttgg tctcccagaa 720
tcagtgagag tttacttcac agtttctgac ggacatcaca cgagtccaga gatggccctc 780
accattcact tacttcactc tgatcggcag ccacccgcat ttcagataag ggcgcccctg 840
ttggaggtta gccctggagg ccgcacctct ctaggcctgc agttggtagt gagagatgct 900
cagatggtac cagaagaact cttcttccag cttcagaagc cgccacagca tggctctctc 960
ctgaagtcca cagcagagtc ctcagggccc atggcagcag gtgacacttt cacatacggt 1020
gaagtcgaga ggaatgctct gcagtacgta cacgatgggt cctctgcctg ggaggacagc 1080
atggtgatct cagtctcaga tggcctgaca gtgacaacat cagaagtaaa agtggacgtg 1140
tccctgtcag agaacagagg gcctcggctg gccccaggtt cctccctcag catgactgtt 1200
gctagtcaac ggacagccat aatcaccagg tcaaaccttg cctatgtgga cgattcttcc 1260
cctgacccag agatctggat tcagttaagt tctctgccca tgtatggtgt gctcttagtg 1320
gatgagggag gcagggcacc actctccctc caccatttct ttgctacgga tgatcacgac 1380
aaccttcagg gtgatgctgt cattaaacta agcgctctac ccaagtatgg ctgcattgag 1440
aacacaggaa caggagatcg ctttggcccg ggagctacca gtgacccaga ggcatcattc 1500
cctattcaag atgtcctaga aaactatatt tactactttc agagtgttca tgaaagcatc 1560
gaaccaaccc atgatgtgtt cagtttttat gtgagtgacg gaagcagtcg ctctgaaatt 1620
cacagcatca atgtcaccat tgagaggaag aatgatgagc ctcccaggat gaccttgtgg 1680
cccctcagag tccggctgag ctcgggagtg gtgataagca attcttcctt gagcctgcaa 1740
gacctggaca ccccagataa tgagctggtt tttgtgttga tgaaaaagcc tgaccacggc 1800
cgcctacttc agaggcccac tgcttctgac cctctagaga atgggactgt tttagaccaa 1860
ggctcctcct tcacctacca ggatgtcctg gctgggctgg ttgggttctt acctaatgac 1920
aatggtatga ccgtagatga gtttcggttc tctctcactg atggccttca tgtagacatg 1980
ggaaggatgg agatctacat agaactgcct acaggcgaca gcccccactt ggtgattaac 2040
caaggacttc agctccccgc agggtctgta gcacgcatca cagagcagca cttgagagtg 2100
acagatgctg actcagaaga tggacagatt ctgtacatca tgaaggagga ccctggtgca 2160
ggacgcctgc agatggtgaa gcctgactac ccagagcaga tctctgttag aggccccatc 2220
cggagcttca cccaggcaga cattaaccaa gggcagatag aatacagcca tggaccagga 2280
gaacctctcg ggagctttgc ttttaaattt gatgtgattg atagagaagg caataagttg 2340
gctgaccagt catttgctat cagtgtttta gaagccgaat tcccaccagt cattatcacc 2400
aataaagggc ttgtcttgga tgagaactca gggaagaaaa tcacccctgc acagctcttg 2460
gccactgacc aggacagcaa ggctgcagag ctgatctaca gaatcactgc ccagccccag 2520
ctaggccgcc tggaacatgt ggcatcacca ggggtccaga ttagttcctt tactcaagct 2580
gacctgactt caggaaatgt tcagtatgtc cattccagtg agactaggaa gtactccgac 2640
gccttcagct ttttgttgtc tgatggcgtg catgaggtga cacagacctt ccacatcact 2700
attcaccctg tggatgactc actgcccctt gtgcagaacc agggcatgcg tgtgcaggag 2760
ggcgtgagga agaccatcac agagtttgag ctgaaggcag tggatttgga cacggaggct 2820
gagtctatca ccttcaccat tgtgcagccc ccacgccatg gcgccattga gagagcagcc 2880
agggggcagc atttccacct cacctcctcc ttcactatgg aagacatcta ccagaaccgg 2940
gtcagctata gccatgatgg cagcaactcc ctcaaagacc gatttacctt caccgtttct 3000
gatgggacca accccttctt tatgatagag gaaggaggaa aagagattat gaccgcagca 3060
cctcagcagt tccatgtgga catcctcccg gtagatgatg gcacccctag aattgtcacc 3120
aacctgggtc tgcagtggct ggagtatatg gatggcaagg caaccaacct gatcaccaag 3180
aaggaactgc tgaccatgga cccagacaca gaggactcac agcttgtcta tgaggtcacc 3240
gtgggcccca tgcacggcta tgtggagaac aagctgcaac caggaagagc tgcagccacc 3300
ttcacccagg aggatgtgaa cttggggttg attcgttatg tgttgcatga ggagaagatc 3360
cagaaagtaa tggatagttt tcagtttctg gtgaaagaca gtaaacccaa cgtggtcagc 3420
aacaatatct tccatatcca gtggtctctc atcagcttca aatataccag ctataacgtc 3480
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gccatcgtcc tgtgtcgcac cgaacaaggc acagccagct ccagctctag agtcagctct 3600
catcctggac agcaagacta catggagtac gctggccagg tgcagtttga tgaacgagag 3660
gacacaaagt cctgcaccat tgtcatcaat gatgatgatg tatttgagag tgttgaaagt 3720
ttcaccgtgg agctcagcat gccagcctac gccctgctcg gagagttcac ccaggcaaag 3780
gttgtcatca gtgacactga ggatgagccc acactggagt ttgataagaa gacctaccgg 3840
gtcaatgaga gcgctggttt tctgtttgca cccattgaaa gaaaaggaga ctcaagcagc 3900
attgtgtctg ccatttgcta cacagtccct aaatcggcta tgggaagtag tctgtatgct 3960
ctggaatcag gttctgattt taagtccaga gggaggtctc ctgagagtcg tgtgatattt 4020
ggacctggta tcaccatgtc tacgtgtgat gtcatgatca ttgatgacag cgagtatgaa 4080
gaggaagagg agtttgagat tgccctggct gattcttctg ataatgcccg aattggaagg 4140
ctggcagtgg ccaaggtgct cattagtggt cccaatgatg cctcgactgt ctccctgggc 4200
aacacagctt tcacgatcag tgaggatgca ggcacagtga aaattccagt tatccgccat 4260
gggactgatc ttactacctt cacatctgtc tggtgtgcaa cacgaccctc agatccagct 4320
tctgccactc caggagttga ctatgtccct agctcaagga aggtggaatt tggaccaggt 4380
gtcaccgaac agtactgtac cttgactatc ttggatgata cgcaataccc agtaattgaa 4440
ggactggaga catttgtggt tttcctcagc tcagcacaag gagctgaact gaccaaaccc 4500
tttcaggctg tcattgcgat aaatgacaca ttccaagacg ttcccagcat gcagtttgcc 4560
aaggatttgc ttctagtgaa ggagaaagag ggtgtcctgc acgttcctat catccggagt 4620
ggggacctga gctatgagtc atcagtgagg tgctacactc agagccactc agctcaggtc 4680
atggaggact ttgaggagag aagaaatgca gactcttcac ggattacgtt tctgaaaggg 4740
gagaaggcga agaactgcac tgtctacatc catgatgact ccatgtttga gcctgaggag 4800
cagttcaggg tctaccttgg ccatcccctt gggaaccact ggagtggagc cagagtcggg 4860
aagaacagtg tggccactgt gaccatatcc aatgacgaag atgctcctac cattgagttt 4920
gaagaagctg cctaccaagt gcgggaacct gcagggccag atgccattgc agttctgagc 4980
atcaaggtca tccgcagagg cgatcaaaat aggacttcta agatccgctg cagcactcga 5040
gacgggtctg cccagtctgg tgtggattat taccccaaga gcagagtcct gaaattcagt 5100
cctggtgtgg atcacatctt cttcaaagtt gagatcctgt ccaatgaaga tcgggaatgg 5160
cacgaatcct tttctctagt ccttggccca gatgacccag tggaagcagt gcttggggac 5220
gtgaccacag cgactgtgac aattctagac caagaggcag caggaagtct catattgcca 5280
gcaccaccca ttgtcgtcac ccttgctgac tatgatcatg tggaagaggt tacaaaggaa 5340
ggaatcaaga aagccccatc tccaggctac ccactggtct gtgtcactcc ctgtgacccc 5400
cacttcccta ggtatgctgt catgaaggag cgctgtagcg aggctggcat caaccaaaca 5460
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cataccccag tggtggccgg gacagctcga ggcttccagg cacagtcctt cattgcaacc 5760
ttgaaatacc tggacgtcaa acacaaagag catccaaaca gaatccacat ctcggtgcag 5820
attccccacc aggacggaat gctgcctctc atctccacaa tgcccttaca caacttgcat 5880
ttcctgttgt ccgagtccat ctacagacac cagcacgttt gctccaactt agtcactgcc 5940
cgtgacctgc gaggactctc agaggcaggg ttcctagatg attcaggctt ccatagtact 6000
gctctgggcc ctggctatga ccgccccttc cagtttgacc caagtgtccg ggagcctaag 6060
accatccagc tgtacagaca cctgaacctg aagagctgtg tatggacctt tgatgcgtac 6120
tatgacatga cagagctgat tgacgtgtgt gggggctccg tgactgctga cttccaggtg 6180
agggactctg ctcagtcatt cctaacagta catgtgcctc tctatgtgtc ctacatctat 6240
gtgacagcgc ccaggggctg ggcctccttg gagcaccaca cagagatgga attttctttc 6300
ttctatgaca cggttctttg gagaacaggg atccagacag acagtgtgct ctctgccagg 6360
cttcagatca taagaatcta cattagagag gatggccgtc tcgtcattga gttcaagacc 6420
catgccaaat tcagaggaca gttcgtgatg gagcatcaca ctctcccaga tgtgaaatct 6480
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gctcagacgt ttgactctcc acatcaactc tggagagcca caagctctta caacagaaag 6600
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tgggtggacc caggagagaa gtctttggct tgcactgcac atgctccaga aaggttcctg 6720
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gaatttcagc tctgcaataa tgagaaggta ttcttgatgg atcccaacac gtctgatatg 6840
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gtcctttgga atccggaaca gaaccttcat tctgcttaca aactgcagct ggagaaagtc 6960
tatctttgta ctggcaagga tggctacgtg cctttctttg atcctactgg gacaatctac 7020
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ttcatcacca gaaaatgcca gaagcagaag aagaaacagc ccccagagga cactctggag 7620
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tcttacacat tcaaaggtgc taaagttaaa aggatgaatc tggaagtcag agtccacaac 7800
aatttacaag atggaacaga agtttaa 7827
<210> 118
<211> 2394
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 118
atggaggcca gagaggagtg ctttcttaaa caaaggcaag tcttgcttct ttttgttttt 60
ctaggtgggt ctctggctgg gtctgggtct aggcgctatt ctgtggtcga ggaaaaagag 120
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gagagagaaa ttaaggaaag tccccactgc aggagtagct ttgtagtccg ctaa 2394
<210> 119
<211> 1665
<212> DNA
<213> 黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 119
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> source
<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"
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<212> DNA
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<212> DNA
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gcccaccatc ctacgaagag 20
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gtnwayattn atnnr 15
Claims (24)
1.一种真核表达***，包括：
至少一种代谢影响产物(MIP)表达载体，其包括至少一个处于至少一个调控序列的控制下编码所述至少一个MIP的核酸。
2.权利要求1的真核表达***，其中所述编码的MIP为：
-至少一个转录因子，优选为先锋转录因子，如Foxa1(叉头盒蛋白A1)或至少一个参与脂肪酸代谢的转录因子，如至少一个PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)，
-至少一个调节RNA翻译的因子，如Casc3和/或
-至少一个结构蛋白，如肌动蛋白和/或蛋白质折叠蛋白，如Erp27(内质网蛋白27)，或与相应蛋白质折叠蛋白相互作用的蛋白如Erp57(内质网蛋白57)，
-至少一个参与信号转导、囊泡运输和/或细胞粘附活动的蛋白，如Tagap(T细胞激活GTP酶激活蛋白)、Rassf9(RAS相关结构域家族成员9)和/或Clstn3(钙同线蛋白3)，
-至少一个参与细胞存活和/或增殖的蛋白，如CDK15(细胞周期蛋白依赖性激酶15)或Ca3(碳酸酐酶3)，
-至少一个参与细胞凋亡的蛋白，如CFLAR(CASP8和FADD样凋亡调节因子)或SOD1(超氧化物歧化酶1)，和/或
-至少一个参与谷胱甘肽分解代谢的蛋白，如GCLM(谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基)或GGCT(γ-谷氨酰环化转移酶)。
3.权利要求1或2的真核表达***，其中所述至少一个MIP包括至少一个PPAR，特别是PPARα、PPARβ/δ或PPARγ。
4.前述权利要求中任一项的真核表达***，其中所述至少一个MIP包括Foxa1和/或Foxa1的次级MIP，如Ca3、Rassf9、Tagap或它们的组合。
5.上述权利要求中任一项的真核表达***，其中所述至少一个MIP为肌动蛋白。
6.上述权利要求中任一项的真核表达***，其中所述至少一个MIP是包括Erp27和任选的Erp57的蛋白质折叠蛋白。
7.上述权利要求中任一项的真核表达***，其中所述至少一个调控序列是选自CMV、EF1α、CMV/EF1α、SV40、RSV和PGK的启动子，具有CMV、EF1α、CMV/EF1α、SV40、RSV和PGK的表达水平的启动子以及它们的组合。
8.上述权利要求中任一项的真核表达***，其中所述至少一个MIP包括至少一个初级MIP和至少一个或两个或三个既不是初级MIP也不是次级MIP的另外的MIP。
9.上述权利要求中任一项的真核表达***，包括至少2个、3个、4个、5个或更多个MIP。
10.上述权利要求中任一项的真核表达***，其中所述MIP表达载体还包括编码所述MIP的核酸上游的第一ITR(末端反向重复)和下游的第二ITR。
11.上述权利要求中任一项的真核表达***，其中所述至少一个调控序列包括MAR元件或MAR构建体，如MAR 1-68和/或MARX-29，包括单个MAR元件或MAR构建体，任选在第一ITR和第二ITR之间。
12.上述权利要求中任一项的真核表达***，其中所述MIP表达载体是转座子供体载体，并且其中所述表达***还包括转座酶表达辅助载体或mRNA。
13.上述权利要求中任一项的真核表达***，包括载体质粒，所述载体质粒包括至少一个适于***编码目的蛋白的核酸的限制酶切割位点，任选还包括抗生素抗性基因和/或维生素转运蛋白，如钠-多维生素转运体SLC5A6。
14.权利要求12或13的真核表达***，其中所述转座酶表达辅助载体包括编码PB转座酶的序列，任选在上游和下游侧接有非翻译末端区(UTR)。
15.一种方法，包括：
(a)用上述权利要求中任一项的表达***的所述表达载体转染细胞和/或
向所述真核细胞中加入表达MIP的基因的蛋白产物的至少一种激活剂，以及
(b)用包括目的蛋白的载体质粒转染所述细胞。
16.权利要求15的方法，其中加入所述真核细胞的所述至少一个激活剂是至少一个、两个或所有PPAR，特别是PPARα、PPARβ/δ或PPARγ，的激活剂，如苯扎贝特。
17.权利要求15或16的方法，其中所述目的蛋白的MA/EL(最大抑制/表达水平)大于所述ML(最大水平)的1.5倍、大于所述ML的2倍或甚至大于所述ML的2.5倍或3倍。
18.一种试剂盒，包括在一个容器中的前述权利要求中任一项的所述真核表达***和在第二容器中的如何使用所述***的说明书。
19.权利要求18的试剂盒，还包括所述至少一个MIP的至少一个激活剂，其中所述MIP优选为至少一个PPAR，特别是PPARα、PPARβ/δ或PPARγ，并且所述激活剂是至少一个、两个或所有PPAR的激活剂，例如苯扎贝特。
20.一种重组真核细胞，包括权利要求1至14中任一项的真核表达***。
21.根据权利要求20的重组真核细胞，其中所述细胞至少稳定地被所述MIP表达载体或其包括所述至少一个MIP的部分转染，所述细胞优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
22.一种重组真核细胞，包括至少一个内源MIP，所述内源MIP处于选自CMV、EF1α、CMV/EF1α、SV40、RSV和PGK的至少一个外源启动子，具有CMV、EF1α、CMV/EF1α、SV40、RSV和PGK的表达水平的外源或重组内源启动子以及它们的组合的控制下。
23.根据权利要求22的重组真核细胞，其中所述至少一个MIP处于启动子阶梯的启动子组合的控制下。
24.权利要求1至14中任一项的表达***在产生表达编码目的蛋白的转基因的重组真核细胞中的用途。
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