CN113340867B - 一种利用比色-sers双读出的传感器检测酪氨酸酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用比色‑SERS双读出的传感器检测酪氨酸酶的方法。该方法利用4‑MPBA作为响应分子,既可作为拉曼信号分子,又可与多巴胺的酚羟基结合。当体系中出现酪氨酸酶时,催化酪胺氧化成多巴胺,随着生成的多巴胺修饰的磁珠的增加,越来越多的4‑MPBA修饰的AuNPs被吸附在磁珠表面,磁分离,引起上清液的颜色和拉曼信号、吸光度的改变,实现对样品中酪氨酸酶的快速、可视化、低成本、高灵敏度的定量分析,得到了很宽的检测区间(0.001U/mL~25U/mL,25U/mL~100U/mL)和很低的检测限(0.0007U/mL),在临床研究和筛选与酪氨酸酶活性相关的潜在抑制剂方面具有很大的潜在前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学分析领域,具体涉及一种利用比色-SERS双读出的传感器检测酪氨酸酶的方法。
背景技术
酪氨酸酶(TYR)是广泛分布在微生物、植物、动物和人类中的一种氧化还原酶,对生物体中黑色素的合成过程中起着至关重要的作用。在临床研究中,由于酪氨酸酶在黑色素瘤癌细胞中的过分表达并且在白癜风中作为自身抗原,因此它被当作皮肤疾病如黑色素瘤癌和白癜风的生物标记。同时,它也与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉淀等疾病的发生有关,并与昆虫的蜕皮和果蔬的褐化有很大关系。因此,酪氨酸酶的测定在临床诊断、化妆品和食品工业中的基础研究和实际应用都有重要意义。
目前,用于检测酪氨酸酶的方法主要有比色法、荧光法、高效液相色谱和电化学等。这些方法或灵敏度不高难以检测低浓度样品,或仪器昂贵,成本高,或特异性不强,实际检测容易受样品介质的干扰。相较之下,荧光法的灵敏度和空间分辨率较高,但检测常常受到生物样品自身荧光背景干扰以及光漂白、光毒性的影响。
而表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)的方法具有操作方便、灵敏度高、检测速度快、重现性好等优点,被认为是一种极具吸引力的生物检测分析技术。与其他光谱分析方法相比,SERS具有独特的优势:(1)拉曼标记分子谱峰窄,分辨率高,可以用于多组分检测;(2)水的拉曼信号极其微弱,SERS可以广泛应用于水溶剂体系(生物体系)的检测;(3)SERS信号几乎不受光漂白影响,不容易发生光猝灭;由于SERS技术独特的优点,SERS纳米探针成为了自然科学研究中的热点,在生化分析和医学研究中有良好的应用前景。
SERS技术已经广泛用于蛋白质等生物分子的检测分析,但由于其本身的拉曼散射截面较小,直接检测时信号较弱;且在复杂生物体系中所得到的拉曼信号十分复杂,SERS谱图的解析较为困难,使得其直接检测受到限制。因此相关的表面增强拉曼光谱检测研究较为少见。而基于化学反应的SERS传感策略则有望克服此类问题,该策略将具有SERS活性和与待测物反应的活性集于传感器或探针,可产生清晰灵敏的SERS信号变化,只需要观察传感器或探针与目标物反应前后产生的光谱变化即可实现检测。但目前SERS检测还存在难以找到既可以作为信号分子又能作为反应分子的化合物,以及易受到样本中复杂介质的干扰。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明首要的目的在于提供一种利用比色-SERS双读出的传感器检测酪氨酸酶的方法。
本发明提供一种比色-SERS双读出的传感器及利用该传感器检测酪氨酸酶的方法。该方法是利用便宜易得的4-MPBA和酪胺分别作为Raman信号分子和酪氨酸酶的底物,设计一种酪氨酸酶响应的探针,然后与磁分离技术结合构建一个比色-SERS双读出的传感器实现对酪氨酸酶的超灵敏和可视化检测。利用4-MPBA对酪胺和酪氨酸酶的催化产物——多巴胺的不同反应能力的特点:4-MPBA的硼酸基团能和多巴胺的邻羟基形成五元环酯。将4-MPBA和酪胺分别修饰在金纳米颗粒和磁珠上,磁分离后,观察上清液的颜色和检测上清液中残留的拉曼信号探针,实现对样品中酪氨酸酶的快速、可视化、低成本、高灵敏度的定量分析,解决现有技术对酪氨酸酶浓度检测的耗时过长、成本昂贵、灵敏度不够、易受样品中其他杂质的干扰等问题。
本发明的方法具有检测过程简单、低成本、灵敏度高、普适性好、定量准确等特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种利用比色-SERS双读出的传感器检测酪氨酸酶的方法,包括如下步骤:
将4-MPBA与金纳米颗粒结合,得到SERS信号探针,记为4-MPBA-AuNPs;然后将酪胺修饰的磁珠与待测物酪氨酸酶进行第一次混合反应,并加入抗氧化剂,磁分离去除上清液;再继续加入4-MPBA-AuNPs进行第二次混合反应,磁分离后,观察其上清液的颜色和检测上清液的拉曼信号、吸光度,基于此实现对酪氨酸酶含量的检测。
具体包括如下步骤:
(1)4-MPBA-AuNPs的制备
选用金纳米颗粒作为基底,4-MPBA作为拉曼信号分子,通过该分子一端的-SH与金纳米颗粒结合,标记后形成SERS信号探针,记为4-MPBA-AuNPs;
(2)酪胺修饰的磁珠
选用羧基磁珠用活化剂活化羧基后,通过酰胺键将酪胺分子接上,得到酪胺修饰的磁珠;
(3)酪氨酸酶的检测
将不同浓度的酪氨酸酶标准样品溶液和步骤(2)中的酪胺修饰的磁珠进行第一次混合反应,酪氨酸酶特异性催化酪胺生成多巴胺,加入抗氧化剂避免多巴胺进一步氧化成多巴醌,磁分离去除上清液后,再将步骤(1)中的4-MPBA-AuNPs加入到溶液中进行第二次混合反应,其中4-MPBA的硼酸基团能和多巴胺的邻羟基形成五元环酯,从而使金纳米颗粒吸附在磁珠表面;磁分离后,观察其上清液的颜色和检测上清液的拉曼信号、吸光度;随着酪氨酸酶的浓度的增加,酪胺修饰的磁珠被氧化成多巴胺修饰的磁珠就越多,磁分离后导致吸附在磁珠表面的金纳米颗粒就越多。因此,测上清液中SERS信号、吸光度就越弱,颜色就越浅。
(4)根据酪氨酸酶的浓度与磁分离后上清液拉曼信号强度(I1072/I520)、吸光度的对应关系建立标准曲线,从而利用上清液的拉曼信号、吸光度对酪氨酸酶进行定量检测。
在上述检测酪氨酸酶的方法中:
所述的酪氨酸酶是从蘑菇中提取。
步骤(1)中所述的4-MPBA是4-巯基苯硼酸,浓度为0.01~1mmol/L;优选为0.1mmol/L;体积为8~14μL;优选为10μL。
步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径为25nm~35nm;优选为30nm;
步骤(1)中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5~1.5mmol/L;优选为1mmol/L。
步骤(2)中所述的羧基磁珠为表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒,进一步为表面修饰有羧基的四氧化三铁Fe3O4。
所述的羧基磁珠的平均粒径为200nm~300nm;优选为250nm。
步骤(2)中所述的酪胺的浓度为1~10mmol/L;优选为10mmol/L。
步骤(2)中所述的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS);
步骤(3)中所述的第一次混合反应的时间为1~10min,优选为5min。
步骤(3)中所述的第二次混合反应的时间为1~10min,优选为5min。
步骤(3)中所述的4-MPBA-AuNPs(4-MPBA功能化的金纳米颗粒)浓度为1~10mmol/L;优选为5mmol/L。
步骤(3)中所述的4-MPBA-AuNPs(4-MPBA功能化的金纳米颗粒)的体积为1~200μL,优选为200μL。
步骤(3)中所述的抗氧化剂为抗坏血酸;
所述的抗坏血酸的浓度为1~10mmol/L;优选为1mmol/L。
步骤(3)中所述的不同浓度的酪氨酸酶标准样品溶液,其浓度分别为0U/mL,0.001U/mL,0.01U/mL,0.1U/mL,1U/mL,2U/mL,5U/mL,10U/mL,25U/mL,50U/mL,100U/mL,其中0U/mL为空白对照;
步骤(3)中所述的磁分离是指利用磁场物理作用分离磁性结合物与上清液,相比于传统的清洗固相基底来去除残留物的步骤,此方法更加高效;
步骤(3)中所述的信号是通过显微拉曼光谱仪测得:所述的显微拉曼光谱仪的操作条件优选为激发光源是波长为785nm的半导体激光器,到达样品的激光功率为400mW,信号收集时间为1~5s(优选为1s);
步骤(3)中所述的信号是选取拉曼信号分子4-MPBA的特征拉曼谱峰(1072cm-1)作为定量峰,并以酪氨酸酶浓度对该谱峰光谱强度与硅片基底的特征峰(520cm-1)拉曼强度比值作图,并以此绘制标准曲线;
步骤(4)中所述的I1072/I520,其中I1072是4-MPBA分子在1072cm-1处的峰强,I520是用于校准的硅片基底的特征峰(520cm-1处)的强度。
步骤(3)、(4)中,所述的吸光度为紫外可见光吸光度。
步骤(4)中,
根据拉曼信号强度建立标准曲线,方程为:
Y=5.5745-2.4531Log[X](25U/mL~100U/mL),
和Y=2.8688-0.51211Log[X](0.001U/mL~25U/mL),
其中,Y为4-巯基苯硼酸的拉曼强度;X为酪氨酸酶的浓度。
根据吸光度建立标准曲线,方程为:
Y=0.4944-0.2370Log[X](25U/mL~100U/mL),
和Y=0.1893-0.0138Log[X](0.001U/mL~25U/mL),
其中,Y为4-MPBA-AuNPs紫外可见过光吸收度;X为酪氨酸酶的浓度。
本发明的机理:在收集时间一定的情况下,对于同一种拉曼信号分子,所测拉曼信号强度与SERS标记的浓度呈负相关的关系;正是在此基础上实现了定量检测。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明公开了一种利用比色-SERS联用传感平台检测酪氨酸酶活性的方法。利用4-巯基苯硼酸(4-MPBA)作为响应分子,4-MPBA既可以作为拉曼信号分子,又可以与多巴胺的酚羟基结合,形成五元环酯。当体系中出现酪氨酸酶(TYR)时,催化酪胺修饰的磁珠氧化成多巴胺修饰的磁珠。随着生成的多巴胺修饰的磁珠的增加,越来越多的4-MPBA修饰的AuNPs被吸附在磁珠的表面,在磁分离的作用下,引起上清液的颜色和拉曼信号、吸光度的改变。4-MPBA的拉曼特征峰1072cm-1信号与硅片520cm-1信号强度的比值(I1072/I520)与酪氨酸酶活性之间存在着良好的线性关系,检测限较低,可达0.0007U/mL。该方法具有灵敏、操作简单,成本低,定量检测,可视化的优点。同时,在人体血清中酪氨酸酶的假表回收率在97%~103%范围内。因此,本发明有望成为临床检测酪氨酸酶活性的一种有效方法;
(2)本发明利用便宜易得的4-巯基苯硼酸作为拉曼信号分子,其不仅可以提供强的拉曼信号还能作为作为响应分子,避免了复杂的有机分子合成过程。
(3)本发明使用磁性纳米颗粒让目标物质能够从复杂的基质中快速分离出来,这大大提高了分析方法的灵敏度和抗干扰能力,达到快速检测的目的;
(4)本发明是通过检测溶液的拉曼光谱信号得到相应的结果,相比于传统的检测固相基底的方法,溶液中的拉曼光谱信号监测数据更加稳定可靠且可大量重复;
(5)本发明检测选择性好,检测灵敏度高,得到了很宽的检测区间(0.001U/mL~25U/mL,25U/mL~100U/mL)和很低的检测限(0.0007U/mL);
(6)本发明操作简单,4-MPBA功能化的金纳米颗粒和酪胺修饰的磁珠可以提前准备好,操作时只需将待测物TYR加入到酪胺修饰的磁珠中,再加入抗坏血酸防止氧化,之后与4-MPBA功能化的金纳米颗粒混合反应,反应结束后通过磁分离可以马上进行检测:收集时间1s,然后立刻从标准曲线上读出浓度,从而实现快速定量检测;该诊断平台可以应用于黑色素瘤和白癜风的临床诊断筛查。
(7)本发明所提出的方法具有具有操作简单,快速、灵敏度高、特异性强,成本低,可视化等优点,综合了SERS的指纹识别能力、比色法的肉眼识别能力和磁珠对复杂生物环境干扰的抗干扰能力,在优化条件下线性检测范围宽,最低检测限可达到0.0007U/mL,并且可以在人血清样品中实现特异性检测。此外,所提出的双模式传感***在临床研究和筛选与酪氨酸酶活性相关的潜在抑制剂方面具有很大的潜在前景,也可以启发其他氧化还原酶分析方法的研究。
附图说明
图1是本发明利用比色-SERS双读出的传感器检测酪氨酸酶活性方法的示意图。
图2是加入和不加入目标物酪氨酸酶的SERS光谱对比图。
图3是加入酪氨酸酶后,吸附在磁珠表面的4-MPBA-AuNPs的透射电镜图。
图4是实施例1的紫外可见光吸收峰与酪氨酸酶浓度的关系图。
图5是实施例1的紫外可见光吸收峰与酪氨酸酶浓度的线性关系示意图,其中,横坐标代表酪氨酸酶的浓度的对数,纵坐标代表不同浓度酪氨酸酶时的紫外可见光吸收度。
图6是实施例1中的检测不同酪氨酸酶浓度的拉曼光谱图;其中,a→k依次表示100U/mL,50U/mL,25U/mL,10U/mL,5U/mL,2U/mL,1U/mL,0.1U/mL,0.01U/mL,0.001U/mL,0U/mL。
图7是实施例1中的I1072/I520与酪氨酸酶浓度的线性关系示意图;其中,横坐标代表酪氨酸酶的浓度的对数,纵坐标代表不同浓度酪氨酸酶时的拉曼信号强度(I1072/I520)。I1072是4-MPBA分子在1072cm-1处的峰强,I520是用于校准的硅片基底的特征峰(520cm-1)的强度。
图8是实施例2酪氨酸酶的特异性检测的拉曼信号强度图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下面实施例中,未注明具体条件和环境的实验方法,通常按照常规条件,或制造厂商所建议的条件。本发明中4-MPBA为拉曼信号分子(4-巯基苯硼酸);MBs表示羧基磁珠;PBS表示磷酸盐缓冲液;EDC表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚氨盐酸盐;NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺;
实施例1
(1)、金纳米颗粒的制备
100mL(1mM)的氯金酸不断搅拌下油浴加热至沸腾(约120℃),然后迅速地加入6mL,38.8mM新配制的柠檬酸钠溶液,此时溶液颜色从黄色转变为无色再转变为深红色,持续加热搅拌20min之后停止加热,自然冷却至室温,即得到粒径约为30nm的金纳米颗粒。
(2)、4-MPBA-AuNPs的制备
取上述1mL 1mM的金纳米颗粒,加入10μL,0.1mmol/L的4-MPBA溶液,常温搅拌10min,反应结束后离心(8000rpm,12min),再以200μL三蒸水重悬,获得拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒,即SERS信号探针,记为4-MPBA-AuNPs,存于4℃环境下。
(3)修饰有酪胺的磁珠的制备
羧基磁珠(magnetic beads,MBs)(羧基磁珠为表面修饰有羧基的四氧化三铁Fe3O4,购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)中的羧基与含氨基的酪胺之间通过形成酰胺键结合在一起,将酪胺接到磁珠上得到捕获探针。首先,100μL的MBs用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2~3次,以降低基质效应,然后用1mL PBS重悬。随后,加入30μL 4mg/mL EDC到MBs溶液中活化10分钟,再加入30μL 1mg/mL NHS活化30分钟。活化的MBs用磁铁分离,在PBS中重新分散。然后,100μL,10mmol/L的酪胺水溶液添加到活化的MBs中培育2h。用磁铁分离去除上清液后,最终得到酪胺修饰的磁珠。
(4)酪氨酸酶的灵敏度检测
取上述酪胺修饰的磁珠和600μL不同浓度的酪氨酸酶标准样品溶液(0U/mL,0.001U/mL,0.01U/mL,0.1U/mL,1U/mL,2U/mL,5U/mL,10U/mL,25U/mL,50U/mL,100U/mL)混合反应5min,为了使酪氨酸酶催化后生成的多巴胺不被进一步氧化成多巴醌,加入25μL1mmol/L抗坏血酸,用磁铁磁分离去除上清液。再加入200μL 5mmol/L 4-MPBA-AuNPs,振荡反应5min后,用磁铁分离,取上清液,观察上清液的颜色,检测上清液的紫外可见光(UV-vis)吸收度和SERS信号。
图1是利用比色-SERS双读出的传感器检测酪氨酸酶活性方法的示意图。4-MPBA作为SERS的信号探针,能与酪胺的氧化产物——多巴胺的酚羟基发生反应形成络合物。酪氨酸酶浓度越多,酪胺被氧化成多巴胺就越多,导致吸附在磁珠表面的金纳米颗粒就越多,磁分离后上清液中残留的4-MPBA功能化的金纳米颗粒也就越少,测得上清液的UV-vis吸收度和拉曼信号也就越弱,所以酪氨酸酶的浓度与拉曼信号成负相关的关系,颜色也越淡。
图2是加入50U/mL和不加入目标物酪氨酸酶的SERS光谱对比图。图3是加入50U/mL酪氨酸酶后,吸附在磁珠表面的4-MPBA-AuNPs的透射电镜图。根据图2、3可知,表明4-MPBA-AuNPs吸附到磁珠表面后,使得上清液中4-MPBA-AuNPs的浓度降低,进而导致测得采集的SERS信号大幅降低。
(5)UV-vis吸收度的测量
图4是检测不同浓度酪氨酸酶的紫外可见光吸收谱图,酪氨酸酶的浓度分别为0U/mL,0.001U/mL,0.01U/mL,0.1U/mL,1U/mL,2U/mL,5U/mL,10U/mL,25U/mL,50U/mL,100U/mL。从图中可以明显地看到,随着样品中TYR浓度的提高,采集的UV-vis吸收度逐渐降低。图5是其对应的线性关系图,从图中可以看出区间0.001U/mL~25U/mL和25U/mL~100U/mL两者关系符合线性关系,表明在这两个区间内可以进行有效的定量分析。
(6)拉曼信号的测量
利用磁铁对磁珠的吸附能力进行待测物的分离,快速便捷。上清液的拉曼信号用显微拉曼光谱仪采集,激发光光源是波长为785nm的半导体激光器,到达样品的激光功率为400mW,信号收集时间为1s。
图6是检测不同浓度酪氨酸酶的拉曼光谱图,酪氨酸酶的浓度分别为0U/mL,0.001U/mL,0.01U/mL,0.1U/mL,1U/mL,2U/mL,5U/mL,10U/mL,25U/mL,50U/mL,100U/mL。从图中可以明显地看到,随着样品中TYR浓度的提高,采集的SERS信号逐渐降低(I1712/I520)。图7是其对应的线性关系图,从图中可以看出区间0.001U/mL~25U/mL和25U/mL~100U/mL两者关系符合线性关系,表明在这两个区间内可以进行有效的定量分析,经计算得到检测限为0.0007U/mL。
实施例2
为了说明本发明的特异性,分别将酪氨酸酶(TYR),牛血清蛋白(BSA),碱性磷酸酶(ALP),500uM尿素(urea),酪胺(trypsin),钾离子(K+),钠离子(Na+),锌离子(Zn2+)标准液作为检测对象以达到对比目的。其中TYR和ALP的浓度为50U mL-1,BSA的浓度为1.5mg mL-1,其余的浓度为500μM。
具体实施步骤参照实施例1,得到的信号强度可参照图8,说明本发明具有很强的特异性。
实施例3
为了检验此酪氨酸酶检测平台在实际样品中的应用效果,我们将酪氨酸酶标准液添加到人血清样品中,来作为真实样品的模拟。在此之前,需要对血清进行一系列的处理(过滤、离心、稀释)以消除基质效应对实验结果可能产生的影响。随后,在处理好的血清中,分别加入不同浓度的酪氨酸酶溶液(0U/mL,0.1U/mL,5U/mL,10U/mL)。这些样品被分别用于检测和分析,具体实施步骤参照实施例1,所得到的结果如表1所示。这些结果表明,在人体血清中酪氨酸酶的假表回收率在97%~103%范围内,该方法能够很好的用于血清中酪氨酸酶的检测。
表1利用本发明的检测平台测定人体血清中酪氨酸酶的结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种利用比色-SERS双读出的传感器检测酪氨酸酶的方法,其特征在于包括如下步骤:
将4-MPBA与金纳米颗粒结合,得到SERS信号探针,记为4-MPBA-AuNPs;然后将酪胺修饰的磁珠与待测物酪氨酸酶进行第一次混合反应,加入抗氧化剂,磁分离去除上清液;再继续加入和4-MPBA-AuNPs进行第二次混合反应,磁分离后,观察其上清液的颜色,检测上清液的拉曼信号和吸光度,基于此实现对酪氨酸酶含量的检测;
具体包括如下步骤:
(1)4-MPBA-AuNPs的制备
选用金纳米颗粒作为基底,4-MPBA作为拉曼信号分子,通过该分子一端的-SH与金纳米颗粒结合,标记后形成SERS信号探针,记为4-MPBA-AuNPs;
(2)酪胺修饰的磁珠
选用羧基磁珠用活化剂活化羧基后,通过酰胺键将酪胺分子接上,得到酪胺修饰的磁珠;
(3)酪氨酸酶的检测
将不同浓度的酪氨酸酶标准样品溶液和步骤(2)中的酪胺修饰的磁珠进行第一次混合反应,加入抗氧化剂,磁分离去除上清液后,再将步骤(1)中的4-MPBA-AuNPs加入到溶液中进行第二次混合反应,磁分离后,观察其上清液的颜色,检测上清液的拉曼信号和吸光度;随着酪氨酸酶的浓度的增加,酪胺修饰的磁珠被氧化成多巴胺修饰的磁珠就越多,磁分离后导致吸附在磁珠表面的金纳米颗粒就越多,因此,测上清液中SERS信号和吸光度就越弱,颜色就越浅;
(4)根据酪氨酸酶的浓度分别与磁分离后上清液拉曼信号强度I1072/I520和吸光度的对应关系建立标准曲线,从而利用上清液的拉曼信号和吸光度对酪氨酸酶进行定量检测;
所述的I1072/I520,其中I1072是4-MPBA分子在1072 cm-1处的峰强,I520是用于校准的硅片基底的特征峰520cm-1处的强度;
步骤(1)中所述的4-MPBA是4-巯基苯硼酸,浓度为0.01~1 mmol/L;
步骤(1)中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5~1.5 mmol/L;
步骤(2)中所述的酪胺的浓度为1~10 mmol/L;
步骤(3)中所述的抗氧化剂为抗坏血酸;所述的抗坏血酸的浓度为1~10 mmol/L;
步骤(3)中所述的4-MPBA-AuNPs浓度为1~10 mmol/L;
步骤(3)中所述的4-MPBA-AuNPs的体积为1~200 μL。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径为25 nm~35 nm。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的羧基磁珠为表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒;
所述的羧基磁珠的平均粒径为200 nm~300 nm;
步骤(2)中所述的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(3)中所述的第一次混合反应的时间为1~10min;
步骤(3)中所述的第二次混合反应的时间为1~10min。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(3)中所述的不同浓度的酪氨酸酶标准样品溶液,其浓度分别为0 U/mL,0.001 U/mL,0.01 U/mL,0.1 U/mL,1 U/mL,2 U/mL,5 U/mL,10 U/mL,25 U/mL,50 U/mL,100 U/mL,其中0 U/mL为空白对照。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(3)中所述的信号是通过显微拉曼光谱仪测得:所述的显微拉曼光谱仪的操作条件为激发光源是波长为785 nm的半导体激光器,到达样品的激光功率为400 mW,信号收集时间为1~5 s。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(3)和(4)中,所述的吸光度为紫外可见光吸光度。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(4)中,
根据拉曼信号强度建立标准曲线,方程为:
Y=5.5745-2.4531Log[X],25 U/mL~100 U/mL,
和Y=2.8688-0.51211Log[X],0.001U/mL~25 U/mL,
其中,Y为4-巯基苯硼酸的拉曼强度;X为酪氨酸酶的浓度;
根据吸光度建立标准曲线,方程为:
Y=0.4944-0.2370Log[X],25 U/mL~100 U/mL,
和Y=0.1893-0.0138Log[X],0.001U/mL~25 U/mL,
其中,Y为4-MPBA-AuNPs紫外可见过光吸收度;X为酪氨酸酶的浓度。
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Silver nanocube coupling with a nanoporous silver film for dual-molecule recognition based ultrasensitive SERS detection of dopamine;Dechan Lu et al.;《Analyst》;20200211;第145卷(第8期);第3009-3016页 * |
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