CN113337555A - 一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的方法 - Google Patents

一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的方法 Download PDF

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聂开立
武秋阳
许夕淼
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Abstract

本发明公开了一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的新方法，涉及生物合成技术领域。本发明制备方法可以有效的仅利用一种酶催化葡萄糖基衍生物来生产葡萄糖二酸，在常温常压下反应6‑24h产率可达1‑4g/L。克服了目前化学生产中能耗高、产生较多有害物质的缺陷，以及目前文献报道中多酶联合体系生产葡萄糖二酸工艺流程中操作繁琐，中间产物较多，下游分离困难等不足。本发明的工艺流程简便，绿色环保，中间产物少，产物易于分离。

Description

一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸 的方法
技术领域
本发明涉及生物合成技术领域，具体涉及一种基于单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的合成方法。
背景技术
葡萄糖二酸是葡萄糖的一种氧化物，被誉为12种“最有价值的生物炼制产品”之一，在许多领域如材料、医药、食品和能源利用等有着极为重要的意义。在医药方面，葡萄糖二酸具有其清理毒素、降低患癌风险、降低胆固醇水平、降低心脑血管疾病风险、促进肝肠循环等功能；它在动物体内还会与金属离子络合形成金属螯合物，聚集在病灶，用于药物递送或造影显像。在工业方面，葡萄糖二酸和金属的络合反应还可以应用于废水处理、作为腐蚀抑制剂以及具有合成功能性材料前体的潜力，具有很大的研究价值以及经济效益。
葡萄糖二酸的合成方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法主要有硝酸氧化法和2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)催化法等。硝酸氧化法方法简单产率较高，但需要高压高放热反应，并且存在竞争性副反应产生小分子有机酸及有害气体；而反应条件较为温和的TEMPO催化法也存在催化剂昂贵，很难一直维持最佳反应条件等不足。生物酶催化具有技术潜力与绿色环保的优点，有望替代化学合成成为工业生产葡萄糖二酸的新工艺。
2009年，Moon成功在大肠杆菌中构建了葡萄糖二酸的人工合成途径，具体过程是：葡萄糖在大肠杆菌自身的磷酸激酶作用下转化为6-磷酸葡萄糖，接着来自酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合酶(INO1)将6-磷酸葡萄糖催化成肌醇，肌醇被来自小鼠的肌醇加氧酶(MIOX)催化生成葡萄糖醛酸，最后，在辅因子NAD+作用下，来自丁香假单胞菌的尿酸脱氢酶(Udh)催化葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸。之后经过Roman、Zheng等人多项研究对其中各种酶进行优化，并补加肌醇产率可达1～4g/L。也有报道利用酵母、红茶菌等生产葡萄糖二酸或其衍生物。但是该方法存在着多酶联合体系下操作繁琐，中间产物较多，产率低且不稳定，下游分离困难的缺陷。
尽管此前的生物合成法仍存在一定的缺陷，但在众多酶与原料之中，还存在的许多的合成的可能途径，因此，关于“如何寻找可行的酶与原料设计合成葡萄糖二酸”成为当前的重要任务。
发明内容
本发明的目的是克服现有多酶联合体系下生产葡萄糖二酸，操作繁琐，中间产物较多，下游分离困难等问题而提供一种基于单酶催化合成葡萄糖二酸的方法，采用工程菌表达的黄素蛋白氧化酶、结合常压常温催化合成葡萄糖二酸，实现从葡萄糖或葡萄糖基衍生物到葡萄糖二酸的高效转化。
一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的新方法，其特征在于，包括以下步骤：以葡萄糖及其系列酸为底物；构建工程菌，诱导表达获得酶液；向底物中添加酶液及过氧化氢催化剂进行反应；分离纯化得葡萄糖二酸。
在本发明实施方式中，底物可以为葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸等葡萄糖基衍生物，浓度为10～100mM。
在本发明实施方式中，所用酶为来自Methylovorus sp.strain MP688中的一种黄素蛋白氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有80％以上相同的同源酶。
在本发明实施方式中，所用酶液获得方法如下：可将所用酶的基因序列转入载体质粒，导入感受态大肠杆菌构建工程菌；将工程菌在培养基中增殖培养至OD600为0.6～0.8，加入浓度为0.1～5mM的IPTG诱导剂，诱导12～48h后，收集菌体破胞，镍柱纯化得到HMFO酶液。
在本发明实施方式中，可在反应体系中加入0.1％～5％(V/V)过氧化氢催化剂以反应掉中间产物过氧化氢，避免HMFO酶活受到影响并生成氧气以供后续氧化反应继续进行。
在本发明实施方式中，反应体系在pH为6～8的缓冲液中进行，转化反应的温度为20～35℃，反应时间6-24h，反应结束后经弱碱性环氧树脂吸附分离后即可得葡萄糖二酸。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明仅采用一种黄素蛋白氧化酶在常温常压下实现从葡萄糖及葡萄糖基衍生物到葡萄糖二酸的转换，过克服了目前化学生产中能耗高、产生较多有害物质的缺陷，以及目前文献报道中多酶联合体系生产葡萄糖二酸工艺流程中操作繁琐，中间产物较多，下游分离困难等不足。本发明的工艺流程简便，绿色环保，中间产物少，产物易于分离。
附图说明
图1为葡萄糖及葡萄糖醛酸经HMFO催化为葡萄糖二酸的反应流程图，1为葡萄糖，2为葡萄糖醛酸，3为葡萄糖二酸。
图2为葡萄糖酸经HMFO催化为葡萄糖二酸的反应程图流，1为葡萄糖酸，2为葡萄糖二酸。
具体实施方式
以下介绍本发明制备方法的具体实施例，但以下实施是用于说明本发明的示例，并不构成对本发明权利要求的任何限定。
实施例1
由北京金唯智合成来自Methylovorus sp.strain MP688中的一种黄素蛋白氧化酶HMFO-pET-22b(+)质粒，将质粒转化宿主E.coli BL21(DE3)中构建工程菌，在TB培养基中37℃增殖培养至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导剂，17℃诱导24h。4℃、11000rpm下离心3min收集菌体，用pH7.2～7.4的1×PBS缓冲液清洗3次，等体积PBS缓冲液重悬菌体。置冰水浴中超声破碎获得破碎液，在4℃、13000rpm条件下离心15min，取上清即得HMFO的粗酶液。粗酶液经镍柱纯化得HMFO酶液。
以pH7.2～7.4的1×PBS溶液为缓冲液，配置反应体系如下：30mM(5.40g/L)葡萄糖，10％(V/V)HMFO酶液，1％(V/V)1mg/ml过氧化氢酶溶液，25℃，220rpm反应12h，测得产率为71％，反应结束后反应液经弱碱性环氧树脂吸附分离后即可得葡萄糖二酸。反应式如图1所示。
实施例2
由北京金唯智合成来自Methylovorus sp.strain MP688中的一种黄素蛋白氧化酶突变体HMFO-V367K-pET-22b(+)质粒，将质粒转化宿主E.coli BL21(DE3)中构建工程菌，在TB培养基中37℃增殖培养至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.3mM的IPTG诱导剂，30℃诱导12h。4℃、11000rpm下离心3min收集菌体，用pH7.0的10mM Tris-HCl缓冲液清洗3次，等体积Tris-HCl缓冲液重悬菌体。高压均浆破胞获得破碎液，在4℃、13000rpm条件下离心15min，取上清即得HMFO的粗酶液。粗酶液经镍柱纯化得HMFO酶液。
以pH7.0的10mM Tris-HCl溶液为缓冲液，配置反应体系如下：10mM(1.96g/L)葡萄糖酸，10％(V/V)HMFO酶液，1％(V/V)1mg/ml过氧化氢酶溶液，25℃，220rpm反应24h，测得产率为84％。反应结束后反应液经弱碱性环氧树脂吸附分离后即可得葡萄糖二酸。反应式如图2所示。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 656
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln
1 5 10 15
Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile
20 25 30
Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys
35 40 45
Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln
50 55 60
Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile
65 70 75 80
Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile
85 90 95
Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Met Thr Asp Thr Ile Phe
100 105 110
Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Ser Val Leu Ala Asn
115 120 125
Arg Leu Ser Ala Arg Pro Glu Asn Arg Val Leu Leu Ile Glu Ala Gly
130 135 140
Ile Asp Thr Pro Glu Asn Asn Ile Pro Pro Glu Ile His Asp Gly Leu
145 150 155 160
Arg Pro Trp Leu Pro Arg Leu Ser Gly Asp Lys Phe Phe Trp Pro Asn
165 170 175
Leu Thr Ile His Arg Ala Ala Glu His Pro Gly Ile Thr Arg Glu Pro
180 185 190
Gln Phe Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Gly Gly Gly Ser Ser Val Asn
195 200 205
Met Val Val Ser Asn Arg Gly Leu Pro Arg Asp Tyr Asp Glu Trp Gln
210 215 220
Ala Leu Gly Ala Asp Gly Trp Asp Trp Gln Gly Val Leu Pro Tyr Phe
225 230 235 240
Ile Lys Thr Glu Arg Asp Ala Asp Tyr Gly Asp Asp Pro Leu His Gly
245 250 255
Asn Ala Gly Pro Ile Pro Ile Gly Arg Val Asp Ser Arg His Trp Ser
260 265 270
Asp Phe Thr Val Ala Ala Thr Gln Ala Leu Glu Ala Ala Gly Leu Pro
275 280 285
Asn Ile His Asp Gln Asn Ala Arg Phe Asp Asp Gly Tyr Phe Pro Pro
290 295 300
Ala Phe Thr Leu Lys Gly Glu Glu Arg Phe Ser Ala Ala Arg Gly Tyr
305 310 315 320
Leu Asp Ala Ser Val Arg Val Arg Pro Asn Leu Ser Leu Trp Thr Glu
325 330 335
Ser Arg Val Leu Lys Leu Leu Thr Thr Gly Asn Ala Ile Thr Gly Val
340 345 350
Ser Val Leu Arg Gly Arg Glu Thr Leu Gln Val Gln Ala Arg Glu Val
355 360 365
Ile Leu Thr Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro Ala Ile Leu Leu Arg Thr
370 375 380
Gly Ile Gly Pro Ala Ala Asp Leu His Ala Leu Gly Ile Pro Val Leu
385 390 395 400
Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu Trp Glu His Ser Ser Ile
405 410 415
Gly Val Val Ala Pro Leu Thr Glu Gln Ala Arg Ala Asp Ala Ser Thr
420 425 430
Gly Lys Ala Gly Ser Arg His Gln Leu Gly Ile Arg Ala Ser Ser Gly
435 440 445
Val Asp Pro Ala Thr Pro Ser Asp Leu Phe Leu His Ile Gly Ala Asp
450 455 460
Pro Val Ser Gly Leu Ala Ser Ala Val Phe Trp Val Asn Lys Pro Ser
465 470 475 480
Ser Thr Gly Trp Leu Lys Leu Lys Asp Ala Asp Pro Phe Ser Tyr Pro
485 490 495
Asp Val Asp Phe Asn Leu Leu Ser Asp Pro Arg Asp Leu Gly Arg Leu
500 505 510
Lys Ala Gly Leu Arg Leu Ile Thr His Tyr Phe Ala Ala Pro Ser Leu
515 520 525
Ala Lys Tyr Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ser Arg Phe Ala Ala Pro Gln
530 535 540
Pro Gly Gly Pro Leu Leu Asn Asp Leu Leu Gln Asp Glu Ala Ala Leu
545 550 555 560
Glu Arg Tyr Leu Arg Thr Asn Val Gly Gly Val Trp His Ala Ser Gly
565 570 575
Thr Ala Arg Ile Gly Arg Ala Asp Asp Ser Gln Ala Val Val Asp Lys
580 585 590
Ala Gly Arg Val Tyr Gly Val Thr Gly Leu Arg Val Ala Asp Ala Ser
595 600 605
Ile Met Pro Thr Val Pro Thr Ala Asn Thr Asn Leu Pro Thr Leu Met
610 615 620
Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu Thr Gln Ala Leu Gln Glu
625 630 635 640
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Gly Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
645 650 655

Claims (5)

1.一种使用单酶催化葡萄糖及葡萄糖基衍生物制备葡萄糖二酸的新方法，其特征在于，包括以下步骤：以葡萄糖及其系列酸为底物；构建工程菌，诱导表达获得酶液；向底物中添加酶液及过氧化氢催化剂进行反应；分离纯化得葡萄糖二酸。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，其底物可以为葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸等葡萄糖基衍生物，浓度为10～100mM。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，酶为来自Methylovorus sp.strain MP688中的一种黄素蛋白氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有80％以上相同的同源酶。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，反应体系中加入过氧化氢催化剂以反应掉中间产物过氧化氢，避免HMFO酶活受到影响并生成氧气以供后续氧化反应继续进行。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，反应体系在pH为6～8的缓冲液中进行，转化反应的温度为20～35℃，反应时间6-24h。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106554946A (zh) * 2015-09-30 2017-04-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种糖基化的5-羟甲基糠醛氧化酶及其制备

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106554946A (zh) * 2015-09-30 2017-04-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种糖基化的5-羟甲基糠醛氧化酶及其制备

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EWING,T.A.等: "《5-(hydroxymethyl)furfural oxidase [Methylovorus sp.MP688]》", 《NCBI REFERENCE SEQUENCE: WP_013440946.1》 *
WILLEM P. DIJKMAN等: "《enzyme-Catalyzed Oxidation of 5-Hydroxymethylfurfural to Furan2,5-dicarboxylic Acid》", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 *
WILLEM P. DIJKMAN等: "《Structure-Based Enzyme Tailoring of 5‑Hydroxymethylfurfural Oxidase》", 《ACS CATALYSIS》 *
袁海波等: "《基于***生物学和合成生物学的重要平台化学品生物制造的研究进展》", 《化工学报》 *

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