CN113337416B - 一种生防菌株zl-1及其应用 - Google Patents

Abstract

一种生防菌株ZL‑1及其应用，属于生物技术领域。本发明的一个目的是提供一种生防菌株ZL‑1，本发明的另一目的是提供一种含有生防菌株ZL‑1的生防菌剂以及该生防菌剂在防治水稻真菌病害中的应用。本发明提供的生防菌株ZL‑1及其生防菌剂对多种水稻病原真菌具有广谱抑制作用，且抑菌效果好，防效高，克服了化学杀菌剂容易产生抗性的弊端。

Description

一种生防菌株ZL-1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生防菌株ZL-1及其应用。

背景技术

随着人口的日渐增多，粮食增产的需求也变得更加迫切。当前越来越多的农药被使用，提高作物产量的同时也造成很多环境污染问题。利用作物生长环境中的拮抗微生物来防控病害发生发展成为一种绿色环境友好的途径。在粮食作物的周围存在很多微生物包括内生细菌和外生细菌，帮助植物适应环境促进生长。近来研究报道了很多内生细菌在营养利用，促进生长和调控土传和***性病原侵染方面具有重要作用，比如Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum, Burkholderia, Azospirillum,Bacillus spp.等。

水稻是全球重要的粮食作物，养活着世界上一半以上的人口。水稻病害的常年发生对水稻的稳产高产造成威胁。目前水稻种植过程中主要的真菌病害有稻瘟病，稻曲病，水稻纹枯病，水稻胡麻斑病，水稻穗腐病和水稻恶苗病等。挖掘和利用水稻生长环境中的有益微生物，用以防御水稻病原真菌，是一种具有优势的控制病害策略。

Klebsiella属细菌被报道对寄主植物具有多方面的有益作用比如耐盐作用，固氮作用和促生作用。一株Klebsiella属耐盐根围细菌MBE02对花生的生长具有刺激作用。可以调控植物信号通路中很多基因的表达，包括茉莉酸，乙烯和病原防卫信号通路相关基因的表达，进而调控植物免疫。柑橘小实蝇的胃中鉴定到一株Klebsiella菌株，该菌株中含有213个特有基因，参与氨基酸代谢，辅因子和维他命的代谢，可以为宿主提供必需氨基酸如苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸，两种维他命。根据文献查询，尚未有报道该属在水稻病害具有生防效果。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种生防菌株ZL-1及其应用的技术方案。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

本发明的一个目的是提供一种生防菌株ZL-1，所述生防菌株ZL-1为Klebsiella属，已于2021年1月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏名称为Klebsiella sp.，菌种保藏号为CCTCC M 2021159。

本发明的另一目的是提供一种含有生防菌株ZL-1的生防菌剂。

本发明的另一目的是提供该生防菌剂在防治水稻真菌病害中的应用。

进一步，本发明所述的水稻真菌病害为稻瘟病菌、稻曲病菌、纹枯病菌、穗腐病菌、恶苗病菌或胡麻病菌引起的病害，优选为稻瘟病菌引起的病害。

本发明提供的生防菌株ZL-1及其生防菌剂对多种水稻病原真菌具有广谱抑制作用，且抑菌效果好，防效高，克服了化学杀菌剂容易产生抗性的弊端。

附图说明

图1为本发明中生防菌株ZL-1的BLAST比对分析图；

图2为本发明中生防菌株ZL-1的菌株形态检测图；

图3为本发明中生防菌株ZL-1的平板对峙实验结果图；

图4位本发明中生防菌株ZL-1对稻瘟病菌的抑制效果图。

具体实施方式

以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：生防菌株的筛选

样品收集：本实施例所用样品采自于浙江富阳水稻所基地，采样随机取样法进行取样。在不同地块取水稻植株5株，同时保留水稻根系的土壤。将样品装入灭菌的封口袋中带回实验室进行生防菌筛选。

菌悬液制备：取收集回来的水稻植株根系的土壤、水稻根系、水稻茎秆、水稻叶片、水稻籽粒等组织0.1g，放入已灭菌的1.5 mL离心管中，加入1 mL灭菌ddH2O及小钢珠，放入研磨仪中振荡破碎。放置在离心管架上静置10～20 min。取上清液至新的离心管中，并按1：10（V/V）、1：100（V/V）、1：1000（V/V）进行稀释配置成不同浓度的菌悬液。

细菌的分离：吸取稀释不同浓度的菌悬液各200 μL均匀的涂布在NA（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，蔗糖10 g，琼脂粉15 g，去离子水1L）固体培养基上，待培养皿吹干后放置在25℃培养箱中黑暗倒置培养，24 h后开始挑选单个菌落至新的NA培养皿上进行纯化，并对全部分离出来的菌株按不同部位进行编号。

生防菌株的筛选：采用对峙培养法进行筛选。用无抗的LB液体培养已获得的单克隆细菌，放置在37℃培养箱中进行摇培。过夜培养的细菌取2μL滴在马铃薯葡萄糖培养基（PDA马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g）的一侧，另一侧对称位置放置水稻稻瘟病菌菌块，对照为DH5α。25℃培养箱中黑暗培养7天，测量稻瘟病菌的最长生长直径，作为待测菌株拮抗作用强弱的指标。经过以上实验筛选，获得一株对水稻稻瘟病菌具有显著抑制作用的菌株，编号ZL-1，50%甘油与该菌株菌液1：1（V/V）混合保存在-80℃冰箱中。

实施例2：生防菌株的鉴定

DNA抽提：使用天根细菌基因组提取试剂盒提取ZL-1的基因组DNA。收集过夜培养的菌液2ml，10000rpm离心1 min，弃上清。向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。向管中加入20μL Proteinase K 溶液，颠倒混匀。再加入220μL缓冲液B，振荡混匀，70℃放置10 min，加入220μL无水乙醇，振荡混匀，并快速离心去除管盖内壁的水珠。将管中溶液全部转移至吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入500μL缓冲液GD（需提前加适当比例的无水乙醇），12000 rpm离心30 s,弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入600μL漂洗液PW（需提前加适当比例的无水乙醇）, 12000rpm离心30 s, 弃废液，将吸附柱放回收集管中。重复漂洗一次。弃废液，将吸附柱放回收集管中，12000 rpm离心2 min。将吸附柱室温静置2 min后转入干净的离心管中，并加入100μL去离子水，室温静置2 min。12000 rpm离心2 min，将溶液收集至离心管中，溶液为ZL-1基因组DNA。

以ZL-1基因组DNA为模板，引物63F：CAGGCCTAACACATGCAAGTC（如SEQ ID NO.2）和13897R: GGGCGGTGATGTACAAGGC（如SEQ ID NO.3）扩增16S rRNA序列。

PCR反应体系（50μL）：包括25μL 2×PCR mix、2μL 100 ng/μL的DNA模板、10 µM引物63F/13897R各2.5μL，余量为ddH₂O。反应条件为：预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30 sec，退火55℃ 30 sec，延伸72℃30 sec，扩增35个循环，最后72℃延伸5 min。反应结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测有一条约1300bp大小的条带。并将剩余扩增产物进行测序分析（委托杭州有康生物科技有限公司）。通过测序获得1306 bp大小的DNA片段，该DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

对该序列通过NCB网站进行BLAST比对分析，如图1所示，可知其与克雷伯克氏菌（Klebsiella sp.）同源性最高。

对ZL-1菌株形态检测：在LB无抗培养基上划线培养，菌落特征如图2所示：在LB平板培养基上，菌落形态光滑，边缘整齐，初期为乳白色菌落，后期淡黄色，菌落不透明。微观观察发现菌体圆形或者粗短杆状，杆状菌体两侧平直，有的菌体稍膨大，菌体单个存在。

同时，将该ZL-1菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2021159，保藏时间为：2021年1月26日，分类命名为Klebsiella sp.。

实施例3：ZL-1菌株与其他水稻病原真菌的平板对峙实验

将过夜培养的ZL-1菌株吸取2μL滴在PDA固体培养基距离边缘2 cm处，在另一个的PDA固体培养基上相同位置滴DH5α作为对照。用内径6mm的打孔器打取已活化的水稻稻瘟病菌，水稻稻曲病菌，水稻纹枯病菌，水稻恶苗病菌，水稻穗腐病菌和水稻胡麻斑病菌的菌落边缘菌丝块，分别接种在菌株ZL-1对称位置。25℃培养7天后观察菌落生长情况，并测量最大生长直径。菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落生长最大直径-处理菌落生长最大直径）/对照菌落生长最大直径×100%，每次实验重复3次，进行3次平行实验。实验结果如图3和表1。

表1 ZL-1对多种重要的水稻病原真菌的抑制率

病原菌

稻瘟病菌

稻曲病菌

纹枯病菌

穗腐病菌

恶苗病菌

胡麻病菌

抑制率（%）

63.47±1.30

48.57±3.71

13.08±0.79

19.73±1.31

19.55±1.67

17.73±2.57

对峙结果如图3和表1所示，克雷伯克氏菌ZL-1对多种重要的植物病原真菌具有显著的抑制作用，其中，对稻瘟病菌的抑制效率最高，抑制率可达63%以上，因此，ZL-1菌株为一株对多种水稻病原真菌具有广谱抑制作用的菌株。

实施例4：水稻喷雾接种

在无菌条件下将已培养7天的稻瘟病菌野生型菌株B157用无菌水洗去表面菌丝，用已灭菌的三层擦镜纸过滤后收集到1.5mL离心管中，并将孢子叶浓度调整为1×105个/mL，并用移液枪枪头蘸取无抗LB培养基上的ZL-1菌株加入到孢子液中，对照为不加菌株ZL-1的孢子液和灭菌水，用于喷雾接种。

选用生长至4叶期的感病水稻品种CO39，将PVC膜卷成圆筒状套住水稻，并用水液封以防止漏气。将已调整好浓度的稻瘟病菌孢子液用气压泵均匀的喷在水稻叶片表面，喷完孢子液后迅速用保鲜膜封住上口。并将其放置在培养箱中，先22℃黑暗处理2天，在25℃光交替处理6天，取下水稻叶片贴在粘有双面胶的A4纸上。拍照扫描并保存。根据水稻叶片病斑面积计算抑制效果。结果如图4所示，ZL-1菌株对稻瘟病菌具有显著的抑制效果。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种生防菌株ZL-1及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1306

<212> DNA

<213> 克雷伯克氏菌(Klebsiella sp.)

<400> 1

gactatcgag agcttgctct cgggtgacga gcggcggacg ggtgagtaat gtctgggaaa 60

ctgcctgatg gagggggata actactggaa acggtagcta ataccgcata acgtcgcaag 120

accaaagtgg gggaccttcg ggcctcatgc catcagatgt gcccagatgg gattagctgg 180

taggtggggt aacggctcac ctaggcgacg atccctagct ggtctgagag gatgaccagc 240

cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca 300

caatgggcgc aagcctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa 360

agcactttca gcggggagga aggcggtgag gttaataacc tcatcgattg acgttacccg 420

cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt 480

taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg caggcggtct gtcaagtcgg atgtgaaatc 540

cccgggctca acctgggaac tgcattcgaa actggcaggc tagagtcttg tagagggggg 600

tagaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg 660

cggccccctg gacaaagact gacgctcagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 720

ataccctggt agtccacgct gtaaacgatg tcgatttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg 780

gcttccggag ctaacgcgtt aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact 840

caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg 900

cgaagaacct tacctggtct tgacatccac agaactttcc agagatggat tggtgccttc 960

gggaactgtg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt 1020

aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag cggttcggcc gggaactcaa 1080

aggagactgc cagtgataaa ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct 1140

tacgaccagg gctacacacg tgctacaatg gcatatacaa agagaagcga cctcgcgaga 1200

gcaagcggac ctcataaagt atgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg 1260

aagtcggaat cgctagtaat cgtagatcag aatgctacgt atgagg 1306

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 2

caggcctaac acatgcaagt c 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

gggcggtgat gtacaaggc 19

Claims (4)

1.一种生防菌株ZL-1，其保藏号为：CCTCC M 2021159。

2.一种含有如权利要求1所述的生防菌株ZL-1的生防菌剂。

3.如权利要求2所述的生防菌剂在防治水稻真菌病害中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的水稻真菌病害为稻瘟病菌、稻曲病菌、纹枯病菌、穗腐病菌、恶苗病菌或胡麻病菌引起的病害。

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