CN113333460B - 原位修复重金属污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了原位修复重金属污染土壤的方法，涉及土壤修复技术领域。该方法利用具有钙化作用的肠球菌LZU‑1(保藏号为CGMCC 22622)菌液对砷等重金属污染土壤进行诱导固化。能够有效降低砷等重金属的生物有效性，从而达到阻碍重金属向周边土壤、植物、地下水等环境介质的迁移，使重金属污染土壤得到原位修复。该方法具有工艺简单、操作方便、处理成本低、适用范围广和无二次污染等优点。

Description

原位修复重金属污染土壤的方法

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体而言，涉及原位修复重金属污染土壤的方法。

背景技术

城市化、工业化、采矿业及农业集约化的进程加剧了重金属向环境的释放，越来越多的重金属通过大气、土壤、水体等介质直接或间接的危害人体健康。砷(As)是一种有毒的类金属元素，具有致畸、致癌、致突变的性质，土壤中的重金属等污染物通过食物链进入人体和动物体内，富集到一定值后对各脏器机能产生非常大的毒性。

土壤是农业生产的基础，对于干旱少雨、水资源短缺的地区来说，污水灌溉曾是缓解土壤干旱的重要方法，但也是土壤As、Pb、Cd、Cr、Zn等重金属污染的主要来源之一，砷在污灌区土壤污染物中位居前列。我们迫切需要对As、Pb、Cd、Cr、Zn等重金属污染土壤进行治理和修复，至少要先找到一种能够降低其生物有效性的高效、经济实用、环境友好的修复技术，从而阻止其迁移进入地表、地下水及植物体。

目前，利用生物修复技术修复As污染土壤的相关报道已有很多，超富集植物蜈蚣草已被用于很多砷污染地区。但是，植物修复存在一定的局限性，很多植物难以在干旱恶劣的环境中生存，且植物修复周期较长，效率较低，收获的植物体可能会引起二次污染问题等。因此，这些不足就使得我们迫切的需要找到一种经济、高效、实用、无二次污染的土壤原位修复技术。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原位修复重金属污染土壤的方法，旨在有效降低重金属离子的生物有效性，使重金属复合污染土壤得到原位修复。

本发明是这样实现的：

本发明提出一种原位修复重金属污染土壤的方法，其利用具有钙化作用的肠球菌LZU-1菌液对重金属污染土壤进行诱导固化；其中，所述重金属选自As、Pb、Cd、Cr、Zn中的至少一种；肠球菌LZU-1的保藏号为CGMCC 22622。

本发明具有以下有益效果：发明人创造性地将肠球菌LZU-1通过诱导固化的方式对As等重金属复合污染土壤进行原位修复，能够有效降低砷等重金属的生物有效性，从而达到阻碍重金属向周边土壤、植物、地下水等环境介质的迁移，使重金属污染土壤得到原位修复。

需要说明的是，本发明提供的修复方法具有工艺简单、操作方便、处理成本低、适用范围广和无二次污染等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为肠球菌LZU-1在不同砷浓度培养液中的生长曲线；

图2为肠球菌LZU-1对不同砷污染梯度下农田土壤中可交换态砷的固化效果示意图；

图3为肠球菌LZU-1对不同铅污染梯度下农田土壤中可交换态铅的固化效果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供一种原位修复砷等重金属污染土壤的方法，其利用肠球菌LZU-1通过诱导固化的方式对砷污染土壤进行原位修复，发明人发现具有钙化作用的肠球菌LZU-1菌液能够显著降低砷等重金属的生物有效性，阻碍重金属向周边土壤、植物、地下水等环境介质的迁移，使重金属污染土壤得到原位修复。

需要说明的是，具有钙化作用的肠球菌LZU-1菌液是经过富集培养以得到一定浓度的肠球菌LZU-1菌液，然后在含有钙源的培养基中进行二次培养，以使菌液具备钙化作用。

本发明实施例中提供的原位修复砷污染土壤的方法包括如下步骤：

S1、富集培养

富集培养是将肠球菌LZU-1接种于pH值为7-7.2的营养肉汤中进行培养，以使肠球菌LZU-1进行快速生长。

具体地，本发明所使用的肠球菌LZU-1，可以通过常规的方法从干旱区环境中分离纯化鉴定得到，具体的分离纯化方法为现有技术，可以参照蔡红等人在《产脲酶细菌矿化修复Cd和Pb污染土壤效应和机制》中提到的产脲酶菌的分离方法。对得到的产脲酶菌的16SrDNA基因进行BLAST分析得知其为肠球菌，与肠球菌Enterococcus sp.123py(NCBI：txid1095537)具有很近的亲缘关系，它们的16S rDNA基因相似度达99.66％。因此该菌被命名为Enterococcus sp.LZU-1，其基因序列被提交到GenBank获得登录号为MZ 021475，同时，将其保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，获得保藏号为CGMCC22622，保藏日为2021年5月31日。

进一步地，富集培养所采用的营养肉汤培养基不限，可以采用现有的培养基。

在一些实施例中，富集培养所采用的营养肉汤培养基包括蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水；蛋白胨的浓度为8-12g/L，牛肉膏的浓度为2-4g/L，氯化钠的浓度为4-6g/L。通过进一步控制培养基的类型和各组分的浓度，使肠球菌LZU-1能够快速富集生长。

具体地，蛋白胨的浓度可以为8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L，也可以为相邻浓度值之间的任意值；牛肉膏的浓度可以为2g/L、3g/L、4g/L，也可以为相邻浓度值之间的任意值；氯化钠的浓度可以为4g/L、5g/L、6g/L，也可以为相邻浓度值之间的任意值。

在优选的实施例中，富集培养的培养温度为25-35℃，培养时间为12-30h；培养过程中保持转速为100-150rpm/min。通过进一步控制培养温度和时间配合培养基的成分，以经过培养获得较大浓度的肠球菌LZU-1的菌液。

具体地，培养温度可以为25℃、28℃、30℃、32℃、35℃，也可以为相邻温度值之间的任意值。培养时间可以为20h、22h、25h、27h、30h，也可以为相邻时间值之间的任意值。

S2、二次培养

二次培养的过程是将富集培养之后的菌液接种于含有尿素和氯化钙的营养肉汤中进行培养。在培养过程中对肠球菌LZU-1进行驯化，产生自适应能力，能够进一步提升肠球菌LZU-1对砷污染土壤的修复效果。

进一步地，在二次培养所采用的营养肉汤中，尿素的浓度为50-70g/L，氯化钙的浓度为30-50mM/L。通过进一步控制尿素和氯化钙的浓度能够提升钙化的效果，有利于进一步提升肠球菌LZU-1对砷污染土壤的修复效果。

具体地，尿素的浓度可以为50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L，也可以为相邻浓度值之间的任意值；氯化钙的浓度可以为30mM/L、35mM/L、40mM/L，也可以为相邻浓度值之间的任意值。

在优选的实施例中，二次培养的培养温度为25-35℃，培养时间为5-7天，培养过程中保持转速为100-150rpm/min，通过进一步控制二次培养的温度、时间等参数以使肠球菌LZU-1具备较好的钙化能力，以通过诱导固化的方式对砷污染土壤进行原位修复。

具体地，二次培养的培养温度可以为25℃、28℃、30℃、32℃、35℃，也可以为相邻温度值之间的任意值。培养时间可以为5.0天、5.5天、6.0天、6.5天、7.0天，也可以为相邻时间值之间的任意值。

具体地，具有钙化作用的菌液的OD600为0.8-1.0。OD600是常规理解的参数，OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法，以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。

进一步地，富集培养和二次培养所采用的培养基的原料可以相同，均包括蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水。蛋白胨的浓度为8-12g/L，牛肉膏的浓度为2-4g/L，氯化钠的浓度为4-6g/L。

S3、诱导固化

诱导固化是将具有钙化作用的肠球菌LZU-1菌液和砷污染土壤混合培养15-20天，培养温度可以为室温，如15-25℃。通过混合培养可以使砷污染土壤中的砷在肠球菌LZU-1的钙化作用下得以固定，砷污染土壤得到原位修复，从而降低其向周围土壤及地下水或植物体的迁移率。

具体地，培养时间可以为15天、16天、17天、18天、19天、20天，也可以为相邻时间值之间的任意值。

进一步地，每克重金属污染土壤对应肠球菌LZU-1菌液的体积为0.3-0.6mL。肠球菌LZU-1菌液的用量根据土壤的污染程度而定，可以不限于上述范围。

需要说明的是，本发明实施例提供的修复方法所针对的重金属污染土壤主要是砷、铅、镉等污染的土壤，污染土壤中重金属总量为可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态、残渣态的总和，pH在6.5-7.5之间，以砷为主要污染元素，其总砷浓度可以≥30mg·kg^-1。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

需要说明的是，以下实施例中所采用的肠球菌LZU-1是来自于干旱区环境中分离纯化得到的肠球菌LZU-1；以下实施例中所处理的重金属污染土壤取自于甘肃省白银市东大沟流域两岸1000m范围内，经测定污染土壤中砷的总浓度为30mg/kg-360mg/kg。

实施例1

本实施例提供一种原位修复重金属污染土壤的方法，包括：

(1)对肠球菌LZU-1进行富集培养

将肠球菌LZU-1接种至营养肉汤培养基中，在30℃、130rpm的摇床中培养过夜(12h)，菌液的OD₆₀₀为0.98。营养肉汤培养基的配方为：去离子水1L、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g，pH为7.0±0.2。

(2)二次培养

向1L步骤(1)富集得到的菌液中加入60g尿素、5.8804g(40mM)CaCl₂.2H₂O，得到含有60g/L尿素和40mM氯化钙的修复剂菌液，在30℃、130rpm的摇床中培养6天。

(3)称取21g重金属污染土壤至100mL锥形瓶中，取9mL步骤(2)中得到的修复剂菌液添加至锥形瓶中与土壤混合均匀，于室温25℃的条件下放置20天。

实施例2

本实施例提供一种原位修复重金属污染土壤的方法，包括：

(1)对肠球菌LZU-1进行富集培养

将肠球菌LZU-1接种至营养肉汤培养基中，在25℃、100rpm的摇床中培养过夜(24h)。营养肉汤培养基的配方为：去离子水1L、蛋白胨8g、牛肉膏2g、氯化钠4g，pH为7.0±0.2。

(2)二次培养

向1L步骤(1)富集得到的菌液中加入50g尿素、4.41g(30mM)CaCl₂.2H₂O，得到含有60g/L尿素和40mM氯化钙的修复剂菌液，在30℃、100rpm的摇床中培养5天。

(3)称取21g重金属污染土壤至100mL锥形瓶中，取9mL步骤(2)中得到的修复剂菌液添加至锥形瓶中与土壤混合均匀，于室温25℃的条件下放置20天。

实施例3

本实施例提供一种原位修复重金属污染土壤的方法，包括：

(1)对肠球菌LZU-1进行富集培养

将肠球菌LZU-1接种至营养肉汤培养基中，在30℃、150rpm的摇床中培养过夜(30h)。营养肉汤培养基的配方为：去离子水1L、蛋白胨12g、牛肉膏4g、氯化钠6g，pH为7.0±0.2。

(2)二次培养

向1L步骤(1)富集得到的菌液中加入70g尿素、7.35g(50mM)CaCl₂.2H₂O，得到含有60g/L尿素和40mM氯化钙的修复剂菌液，在35℃、150rpm的摇床中培养7天。

(3)称取21g重金属污染土壤至100mL锥形瓶中，取9mL步骤(2)中得到的修复剂菌液添加至锥形瓶中与土壤混合均匀，于室温25℃的条件下放置20天。

对比例1

本对比例提供一种原位修复重金属污染土壤的方法，与实施例1不同之处仅在于：将肠球菌LZU-1替换为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)。

对比例2

本对比例提供一种原位修复重金属污染土壤的方法，与实施例1不同之处仅在于：将肠球菌LZU-1替换为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌和肠球菌LZU-1的混合菌。

注：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌和肠球菌LZU-1以1:1混合。

试验例1

测试肠球菌LZU-1的耐受性研究，营养肉汤组成为：蛋白胨10g/L^-1、牛肉膏3g/L^-1、氯化钠5g/L^-1，溶剂为砷酸氢二钠(Na₂HAsO₄)与去离子水配置而成，pH为7.0±0.2。

将肠球菌LZU-1接种至由砷酸氢二钠(Na₂HAsO₄)与去离子水配制而成的不同砷浓度溶剂制备的营养肉汤培养基中，溶剂中的砷浓度梯度为：0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L。在30℃、130rpm的摇床中培养过夜(12h)，通过肠球菌LZU-1在不同砷浓度下的生长曲线(OD600)图1所示。

从图1可以看出：肠球菌LZU-1在生物有效性砷含量≤400mg/L时都可以正常生长。

试验例2

测试实施例1中的修复方法对重金属污染土壤的修复效果，测试结果见图2和图3。

测试方法：实施例1步骤(3)中称取21g重金属污染土壤至100mL锥形瓶中，一式三份，每一份21g土壤，分别取9mL步骤(2)中的修复剂菌液，添加至锥形瓶中与土壤混合均匀，于室温25℃的条件下放置20天，测定土壤中As、Pb等金属的化学形态的变化和固化率。各金属的化学形态采用Tessier连续提取方法进行提取，使用原子荧光光谱仪检测各形态As含量、用原子火焰吸收光谱仪测定Pb等金属各形态含量。

注：重金属(砷为主要污染物)污染土壤样品采自于甘肃省白银市东大沟流域两岸1000m范围内从上游至下游的不同点。

图2和图3中，横坐标E1至E7依次为甘肃省白银市东大沟自然条件下不同金属污染梯度的土壤样点，括号内的数字分别为该采样点土壤中As或Pb的总浓度(mg/kg)。图2和图3中各采样点的柱状图从左往右依次是：CK-EX、BV-EX、CK-CAB、BV-CAB，分别表示：施加未添加肠球菌LZU-1的修复剂菌液后可交换态As或Pb含量、施加添加了肠球菌LZU-1的修复剂菌液后可交换态As或Pb含量、施加未添加肠球菌LZU-1的修复剂菌液后碳酸盐结合态As或Pb含量、施加添加了肠球菌LZU-1的修复剂菌液后碳酸盐结合态As或Pb含量。

图2结果显示：土壤可交换态As在含有肠球菌LZU-1、尿素和氯化钙的修复剂菌液作用下浓度降低，其固化率用可交换态As降低率表示。

图3结果显示：土壤可交换态Pb在含有肠球菌LZU-1、尿素和氯化钙的修复剂菌液作用下浓度降低，其固化率用可交换态Pb降低率表示。

试验例3

测试实施例1和对比例1-2中的修复方法对重金属污染土壤的修复效果，测试结果见表1。

表1实施例1和对比例1、对比例2的修复方法对污染土壤中可交换As的固化率

综上所述，本发明提供一种原位修复砷等重金属污染土壤的方法，其利用具有钙化作用的肠球菌LZU-1菌液对重金属污染土壤进行诱导固化。能够有效降低砷等重金属的生物有效性，从而达到阻碍重金属向周边土壤、植物、地下水等环境介质的迁移，使重金属污染土壤得到原位修复。本发明提供的修复方法具有工艺简单、操作方便、处理成本低、适用范围广和无二次污染等优点。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，其利用具有钙化作用的肠球菌LZU-1菌液对重金属污染土壤进行诱导固化；

其中，所述重金属选自As、Pb、Cd、Cr、Zn中的至少一种；

肠球菌LZU-1的保藏号为CGMCC 22622。

2.根据权利要求1所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，具有钙化作用的所述肠球菌LZU-1菌液的制备过程包括：将所述肠球菌LZU-1进行富集培养之后，在含有钙源的培养基中进行二次培养，以使菌液具备钙化作用。

3.根据权利要求2所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述重金属包括As。

4.根据权利要求2所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述富集培养是将所述肠球菌LZU-1接种于pH值为7-7.2的35 ml营养肉汤中进行培养。

5.根据权利要求4所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，菌液接种剂量为50-200 μL。

6.根据权利要求4所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述富集培养的培养温度为25-35℃，培养时间为12-30h。

7.根据权利要求6所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，培养过程中保持转速为100-150rpm/min。

8.根据权利要求2所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述二次培养的过程是将富集培养之后的菌液接种于含有尿素和钙源的营养肉汤中进行培养。

9.根据权利要求8所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述钙源为氯化钙。

10.根据权利要求8所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，在所述二次培养所采用的所述营养肉汤中，尿素的浓度为50-70g/L，氯化钙的浓度为30-50mM/L。

11.根据权利要求10所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述二次培养的培养温度为25-35℃，培养时间为5-7天。

12.根据权利要求11所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，具有钙化作用的菌液的OD600为0.8-1.0。

13.根据权利要求10所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述富集培养和所述二次培养所采用的培养基的原料均包括蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水。

14.根据权利要求13所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述蛋白胨的浓度为8-12g/L，所述牛肉膏的浓度为2-4g/L，所述氯化钠的浓度为4-6g/L。

15.根据权利要求1所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述诱导固化是将具有钙化作用的所述肠球菌LZU-1菌液和重金属污染土壤混合培养15-20天。

16.根据权利要求15所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，每克所述重金属污染土壤对应所述肠球菌LZU-1菌液的体积为0.3-0.6 mL。

17.根据权利要求16所述的原位修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，每克所述重金属污染土壤对应所述肠球菌LZU-1菌液的体积为0.45 mL。

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