CN113332452A - pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113332452A
CN113332452A CN202110639519.4A CN202110639519A CN113332452A CN 113332452 A CN113332452 A CN 113332452A CN 202110639519 A CN202110639519 A CN 202110639519A CN 113332452 A CN113332452 A CN 113332452A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcl
icg
cells
peg
polymer vesicle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110639519.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113332452B (zh
Inventor
张琳华
朱敦皖
郭勍
黄晨露
左月月
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Original Assignee
Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC filed Critical Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority to CN202110639519.4A priority Critical patent/CN113332452B/zh
Publication of CN113332452A publication Critical patent/CN113332452A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113332452B publication Critical patent/CN113332452B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/02—Ammonia; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用，该方法包括将PCL‑b‑PEG‑b‑PCL、疏水性ICG、DSPE‑PEG‑Mal和免疫佐剂溶于有机溶剂，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；将薄膜干燥后进行水化，加入NH4HCO3并混匀，超声处理并透析，得到聚合物囊泡溶液；将聚合物囊泡溶液和LHRH进行混合并在三乙胺的催化作用下进行反应，经透析得到所述聚合物囊泡；本发明采用PCL‑b‑PEG‑b‑PCL作为聚合物囊泡的载体材料，在疏水性膜层双载光敏剂ICG和TLR‑7/8激动剂IMQ，在亲水性内腔载入气泡生成剂NH4HCO3，并在聚合物囊泡表面连接LHRH靶向，得到可以通过光热联合免疫***的pH/还原/温度三重刺激响应型并具有靶向作用的共载光敏剂ICG和免疫佐剂IMQ的聚合物囊泡。

Description

pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合 物囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及光热免疫联合疗法***技术领域，具体涉及一种pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
聚合物囊泡作为纳米载药体系具有很高的稳定性。与脂质体纳米粒相比，聚合物囊泡具有更高的稳定性，当其自组装成聚合物囊泡时会形成更厚且刚性更强的双层结构，结构更加完整，可以避免药物的泄漏。与具有核-壳结构的聚合物胶束相比，聚合物囊泡由于具有类似于脂质体的双层结构而可以更有效地同时装载亲水性及疏水性药物。因此聚合物囊泡可有效装载亲水性及疏水性药物，避免其在体内被清除，提高其载药量和稳定性以及全身性递送效果。聚合物囊泡表面还可以用生物配体来修饰，以主动靶向肿瘤细胞，有效递送药物至肿瘤部位，从而提高治疗效果。根据肿瘤微环境设计的纳米载体可以在特定刺激下触发释药，实现聚合物囊泡靶向肿瘤局部触发释药，从而高效治疗癌症。
树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是最有效的抗原呈递细胞(Antigenpresenting cells，APCs)，在先天性免疫和适应性免疫中都起着重要作用。未成熟的DCs可以摄取肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen，TAA)，将其转移到主要组织相容性复合物I(Major histocompatibility complexI，MHCI)上并负载其迁移到次级淋巴器官(如***和脾)，在迁移过程中，DCs从未成熟状态分化为成熟状态。成熟的DCs表面共刺激分子CD40，CD80，CD86以及MHCI和MHCⅡ表达上调，产生各种促炎性和调节性细胞因子。成熟的DCs可以将吞噬的抗原呈递给CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且活化的CD4+T细胞还通过CD40L与CD40的相互作用进一步激活DCs，进而通过MHCI以及CD80/86与幼稚T细胞表达的CD28的结合以促进CD8+T细胞反应，从而产生细胞毒性效应T细胞和记忆性T细胞。
Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)主要在巨噬细胞和树突状细胞上表达，TLR-7主要在APCs上表达，TLR-8主要在髓系细胞上表达，如巨噬细胞、单核细胞以及髓系DCs。TLR激动剂可以增强DCs表面共刺激分子的表达和细胞迁移能力，以促进TAA的加工和提呈，同时可以促进DCs产生细胞因子来刺激CD8+T细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)以及CD4+T细胞增殖分化为辅助性T细胞(Helper Tcells，Th)，促进Th l型细胞应答，激发抗肿瘤应答能力。TLR-7/8激动剂可以通过髓样细胞分化蛋白88(Myeloid differentiation factor 88，My D88)依赖通路诱导DCs成熟并刺激包括白介素6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-12(Interleukin-12，IL-12)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)等细胞因子的产生，并进一步激活CTLs和Th 1细胞。活化的CTLs可以通过直接接触介导细胞毒性杀死肿瘤细胞，也可以分泌介导局部炎症的细胞因子如IFN-γ。同时小部分激活的CD8+T细胞分化为记忆性CD8+T细胞，可以在没有抗原刺激的情况下长期维持，待抗原再次入侵时增殖。CD4+T细胞在免疫应答中也起着至关重要的作用，CD4+Th 1细胞可通过增殖促进记忆性CTLs表型的产生和维持，同时Th 1细胞的活化有利于促进CTLs的激活。
ICG是一种大π共轭体系的两亲性三碳菁染料，这种结构决定其在700-850nm的近红外光谱区域具有强吸收性，并且具有低毒性的特点，是被FDA批准应用临床的近红外显像剂，也是激光介导的光热疗法中有效的NIR光吸收剂。游离的ICG由于共轭链中双键的饱和性，具有在水溶液中容易聚集、降解且光稳定性差的缺点，同时其缺乏靶标特异性，会非特异性地结合蛋白并在人体内被快速清除(半衰期为2-4min)。纳米载药体系可以有效包载药物避免其在体内被清除，提高其载药量和稳定性以及全身性递送效果，聚合物囊泡作为纳米载体具有较高的稳定性，可以有效递送ICG至肿瘤部位，从而提高光热效果。作为FDA批准的免疫调节剂，IMQ已被临床用于治疗***生殖器疣，光化性角化病和浅表性基底细胞癌。此外，IMQ作为TLR-7/8激动剂被多项研究用作免疫佐剂以刺激免疫应答。
光热疗法与免疫疗法作为高效的癌症治疗方法，近年来已被广泛研究。然而单一光热疗法主要用于原位肿瘤的消融治疗，对于体积较大的肿瘤无法彻底根除，也无法有效抑制肿瘤转移和复发。单一免疫疗法杀伤肿瘤细胞速度相对较慢，存在不同程度的免疫逃避现象，降低了免疫治疗的效果，同时考虑到免疫***的差异，肿瘤免疫治疗也会产生副作用及不良反应。因此联合光热疗法与免疫疗法可以提高癌症治疗效果。肿瘤的光热-免疫联合疗法通过光热效应与免疫反应联合作用于肿瘤，在规避癌症单一疗法的副作用的同时也可增强免疫***杀伤肿瘤的特异性能力，是一种毒性更小、更有效、更准确的有前途的癌症治疗策略。因此，根据肿瘤微环境亟需设计一种可共递送光敏剂和免疫调节剂的三重刺激响应型聚合物囊泡以实现靶向光热-免疫联合疗法来有效抑制肿瘤的生长、转移和复发。
发明内容
本发明的目的在于提供pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用，该聚合物囊泡可以在疏水性膜层双载ICG和免疫佐剂，在亲水性内腔载入气泡生成剂NH4HCO3，并在聚合物囊泡表面连接LHRH靶向，得到可以通过光热联合免疫***的pH/还原/温度三重刺激响应型并具有靶向作用的共载光敏剂ICG和免疫佐剂IMQ的聚合物囊泡。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将PCL-b-PEG-b-PCL、疏水性ICG、DSPE-PEG-Mal和免疫佐剂溶于有机溶剂，然后，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜干燥后进行水化，再加入NH4HCO3并混匀，然后，超声处理并透析，得到聚合物囊泡溶液；
(c)将聚合物囊泡溶液和LHRH进行混合并在三乙胺的催化作用下进行反应，再经透析，得到所述pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡。
优选地，所述免疫佐剂包括TLR-7/8激动剂，所述TLR-7/8激动剂为IMQ。
优选地，所述有机溶剂选自二氯甲烷和甲醇中的一种或两种混合物。更优选地，有机溶剂的体积与PCL-ss-PEG-ss-PCL的质量比为(4～6)mL∶(15～25)mg。
优选地，所述干燥为真空干燥，干燥时间为10～24h。
优选地，所述PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为22500；其中PCL疏水链段质量百分数大于33％；所述PCL-b-PEG-b-PCL优选为PCL7500-PEG7500-PCL7500。
优选地，所述水化采用的溶剂为去离子水或PBS溶液；水化温度为60～70℃，时间为5～6h；
所述溶剂的添加体积与PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为(3～10)mL∶20mg。
优选地，所述步骤(a)中，
PCL-b-PEG-b-PCL和疏水性ICG的质量比为(15～25)∶1；
PCL-b-PEG-b-PCL和免疫佐剂的质量比为(15～25)∶1；
PCL-b-PEG-b-PCL和DSPE-PEG-Mal的质量比为(40～60)∶1。
优选地，所述步骤(b)中，
NH4HCO3的添加终浓度为280～320mM；
超声处理为在冰浴条件下超声处理25～35min；
透析采用的透析袋的截留分子量为8000-14000Da；透析时间为3～12h。
优选地，所述步骤(c)中，
PCL-b-PEG-b-PCL和LHRH的质量比为(60～100)∶1；
反应为在搅拌、室温条件下反应10～12h；
透析采用的透析袋的截留分子量为8000-14000Da；透析时间为4～8h。
优选地，所述疏水性ICG通过如下方法制得：
将亲水性ICG和碘化四丁胺溶于有机溶剂于避光室温条件下搅拌反应，得到疏水性光敏剂ICG，其中，所述碘化四丁胺和亲水性ICG质量比为(5～6)：1，有机溶剂可以为二氯甲烷。
本发明第二方面提供一种上述制备方法制得的pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡。
本发明第三方面提供一种上述pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡在制备抗肿瘤光热-免疫联合疗法药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
(1)本发明采用具有良好生物相容性的两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL作为聚合物囊泡的载体材料，利用薄膜水化超声分散法制得粒径均一稳定的聚合物囊泡，可以在疏水性膜层双载光敏剂ICG和TLR-7/8激动剂IMQ，在亲水性内腔载入气泡生成剂NH4HCO3，并在聚合物囊泡表面连接LHRH靶向，得到可以通过光热联合免疫***的pH/还原/温度三重刺激响应型并具有靶向作用的共载光敏剂ICG和免疫佐剂IMQ的聚合物囊泡。
(2)本发明设计了一种聚合物囊泡为载体的纳米递送体系，共载光敏剂ICG和TLR-7/8激动剂IMQ，可以有效增加ICG稳定性和IMQ溶解性。在808nm近红外激光照射下发挥光热作用消融原发肿瘤，在肿瘤酸性环境中NH4HCO3产生CO2气泡，促进药物释放，同时实现溶酶体逃逸，促进BMDCs的活化与成熟，有效激活CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫能力，产生强大T细胞杀伤效应，促进细胞因子的分泌，同时促进记忆性T细胞产生，达到光热联合免疫消除肿瘤并防止肿瘤复发的效果。
(3)本发明设计的pH/还原/温度响应型基于共载光敏剂ICG，免疫佐剂IMQ的具有靶向作用聚合物囊泡通过在疏水膜层共载光敏剂ICG和TLR-7/8激动剂IMQ，并在亲水内腔包载气泡生成剂NH4HCO3，在近红外激光照射下发挥光热杀伤肿瘤作用，同时促进溶酶体逃逸，激活CD8+T细胞和CD4+T细胞的免疫反应，实现光热协同免疫发挥抗肿瘤效应，同时有效防止肿瘤复发和肺转移。
(4)本发明设计的pH/还原/温度响应型基于共载光敏剂ICG，免疫佐剂IMQ的具有靶向作用聚合物囊泡在***过程中通过尾静脉注射方式实现血液长循环，利用肿瘤组织的高通透性和滞留效应以及LHRH靶向作用进入肿瘤细胞，在肿瘤内部酸性和还原环境中以及近红外激光照射下实现光热联合免疫***目的，可有效消除肿瘤，防止肿瘤复发与转移。聚合物囊泡具有良好生物相容性，对正常的组织和细胞无毒性。
(5)本发明设计的pH/还原/温度响应型基于共载光敏剂ICG，免疫佐剂IMQ的具有靶向作用聚合物囊泡制备方法具有过程简单、成本较低且制备周期短的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡的粒径稳定性图，紫外吸收光谱，不同条件下粒径变化图，不同条件下IMQ的体外释放情况以及在808nm激光(1.5W/cm2)照射下DPBF荧光探针半定量PBS、Free ICG、ARL、AIRL的活性氧生成情况图；
图2为本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡AIRL、AIR、IRL、AIL与游离药物的体外光热升温曲线图、冷却-升温循环曲线图、近红外热成像图；
图3为本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡与游离药物的CT26细胞摄取的激光共聚焦图与流式结果图；
图4为本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡与游离药物对CT26细胞的毒性检测结果图；
图5为本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡与游离药物的细胞活性氧检测的激光共聚焦图与流式结果图；
图6本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡与游离药物在BALB/C小鼠体内的ICG荧光成像图和肿瘤局部ICG平均荧光强度柱状图；
图7本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡与游离药物在BALB/C小鼠体内的近红外热成像图、光热升温曲线图；
图8本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡与游离药物对DCs毒性的流式结果图、摄取的流式结果图和激光共聚焦图；
图9为Transwell***评价在激光照射下本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡对BMDCs成熟与活化的作用的流式结果图；
图10为本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡、游离药物对BALB/C小鼠近端和远端肿瘤生长抑制曲线图，生存曲线表征图，体重变化表征图；
图11为在BALB/C小鼠主要器官H&E染色图；
图12为BALB/C小鼠经本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡治疗后***中DCs成熟与活化的流式结果图；
图13为BALB/C小鼠经本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡治疗后小鼠脾细胞增殖的流式结果图；
图14为BALB/C小鼠经本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡治疗后小鼠脾细胞的CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞群分布流式图；
图15为BALB/C小鼠经本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡治疗后小鼠脾脏记忆性T细胞检测的流式结果图；
图16为BALB/C小鼠经本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡治疗后小鼠抗肺转移结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本发明提供一种pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将PCL-b-PEG-b-PCL、疏水性ICG、DSPE-PEG-Mal和免疫佐剂溶于有机溶剂，然后，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜干燥后进行水化，再加入NH4HCO3并混匀，然后，超声处理并透析，得到聚合物囊泡溶液；
(c)将聚合物囊泡溶液和LHRH进行混合并在三乙胺的催化作用下进行反应，再经透析，得到所述pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
疏水性ICG通过如下方法制得：
将亲水性ICG和碘化四丁胺溶于二氯甲烷中于避光室温条件下搅拌反应，得到疏水性光敏剂ICG，其中，二氯甲烷的体积与亲水性ICG的质量的比值为1mL：1mg，碘化四丁胺和亲水性ICG质量比为5.72：1。
实施例1
本实施例为一种pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将PCL7500-PEG7500-PCL7500 20mg、疏水性ICG 1mg、DSPE-PEG-Mal0.4mg和TLR-7/8激动剂IMQ 1mg溶于5mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，然后，旋转蒸发去除二氯甲烷和甲醇并在烧瓶上形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜真空干燥12h后加入5mL去离子水，在恒温干燥箱中65℃水化5h，冷却至室温后，再加入NH4HCO3并混匀，使其终浓度为300mM，然后，在冰浴条件下超声处理30min，采用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析3h，得到聚合物囊泡溶液；
(c)将聚合物囊泡溶液和LHRH 0.25mg进行混合并在1μL三乙胺的催化作用下于室温搅拌下反应10h，再采用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析6h，得到pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡。
为了更好的表征pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡的效果，本发明采用实施例1同样的方法制备了不包载IMQ的pH/还原/温度响应型基于包载光敏剂ICG的具有靶向作用聚合物囊泡ABC@ICG-LHRH(AIL)，不包载NH4HCO3的共载光敏剂ICG，免疫佐剂IMQ的具有靶向作用聚合物囊泡ICG-IMQ-LHRH(IRL)和无靶向修饰的pH/还原/温度响应型基于共载光敏剂ICG，免疫佐剂IMQ的聚合物囊泡ABC@ICG-IMQ(AIR)；具体制备如下：
不包载IMQ的pH/还原/温度三重刺激响应的包载吲哚箐绿的聚合物囊泡的制备方法，该制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于步骤(a)中未添加TLR-7/8激动剂IMQ。
不包载NH4HCO3的pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡的制备方法，该制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于步骤(b)中不添加NH4HCO3。
无靶向修饰的pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡的制备方法，该制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于将步骤(a)中DSPE-PEG-Mal替换为等量的DSPE-PEG-Me；并且无步骤(c)。
实施例2
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的表征，包括粒径大小、电位、PDI、粒径稳定性。
将上述制得的聚合物囊泡AIRL、AIR、IRL、AIL和空白聚合物囊泡混悬液在室温下用去离子水稀释成200μg/mL后进行粒径、PDI和电位的测量，结果如表1所示。
表1.不同聚合物囊泡的粒径、PDI、Zeta电位
Figure BDA0003106703980000101
由表1可知，聚合物囊泡粒径在100-200nm之间，远小于700nm，可通过EPR效应聚集到肿瘤部位。聚合物囊泡分散度良好，可均匀分布，荷负电荷可以延长其在体内的循环半衰期
将实施例1方法制得的聚合物囊泡AIRL混悬液在室温下用去离子水稀释成适宜浓度后，用Nano-ZS粒径分析仪分别测量其6天内的粒径，具体如图1中的A所示；
图1A为本发明实施例1中制备的聚合物囊泡AIRL粒径稳定性图。结果显示表明聚合物囊泡ABC@ICG-IMQ-LHRH的粒径大小没有明显变化，表明聚合物囊泡没有出现聚集情况，较为稳定；
实施例3
本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡的紫外吸收光谱。
将实施例1方法制得的聚合物囊泡AIRL混悬液、Free IMQ溶液、Free ICG溶液在室温下用去离子水稀释成适宜浓度后，通过Lambda 35紫外-可见分光光度计测定其吸收光谱。
图1B为本发明实施例1中制备的聚合物囊泡AIRL、游离ICG和游离IMQ的紫外吸收光谱图。结果证明ICG与IMQ均成功包封在聚合物囊泡的疏水层中。
实施例4
本发明实施例1中制备的聚合物囊泡的载药量和包封率。
将实施例1中(c)高速离心(30min/次，23000rpm/min，去离子水重悬)冷冻干燥，取1mg的纳米粒溶于1mL的二甲基亚砜中，倍比稀释。利用Lambda35紫外-可见分光光度计测量吸光度。ICG和IMQ测量波长分别为790nm和330nm。采用标准曲线法计算样品中ICG的载药量、包封率和IMQ的载药量、包封率。载药量和包封率公式如下：
Figure BDA0003106703980000111
Figure BDA0003106703980000112
结果如表2所示：
表2.不同聚合物囊泡的ICG和IMQ的载药量、包封率
Figure BDA0003106703980000113
由表2可以看出聚合物囊泡载体单载和双载药物的载药量和包封率均很高，表明其作为药物载体具有良好的载药性能。
实施例5
本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡在不同条件下的粒径分布。
将实施例1方法制得的将聚合物囊泡AIRL混悬液分别用pH 7.4PBS、pH5.5PBS、10mM GSH+pH 7.4PBS、10mM GSH+pH 5.5PBS稀释。同时设置激光组，将样品用上述四组不同条件的PBS稀释后再经过808nm近红外激光照射5min。用Nano-ZS粒径分析仪测定以上不同条件下聚合物囊泡的粒径分布情况。
图1C为本发明实施例1中制备的聚合物囊泡AIRL在不同条件下粒径变化图。结果表明在还原、酸性或激光照射下，聚合物囊泡结构被破坏，粒径增大，可产生两个宽峰，分散性增加，稳定性下降。这些结果表明聚合物囊泡AIRL具有pH/还原/温度三重响应性。
实施例6
本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡中IMQ的体外释放。
将实施例1方法制得的将聚合物囊泡AIRL混悬液(332μg/mL)置于MWCO 8000-14000Da透析袋内，释放液分别为0.1％吐温80-PBS(pH 7.4)、0.1％吐温80-PBS(pH 5.5)、0.1％吐温80-10mM GSH-PBS(pH 5.5)。同时为考察近红外激光照射对药物释放的影响，将样品用808nm激光照射(1.5W/cm2，5min)后加入到透析袋内，置于0.1％吐温80-10mM GSH-PBS(pH 5.5)。每组三个平行样，释放液均为20mL，于37℃、120rpm/min的摇床上避光摇动，一定时间后(1h、2h、4h、6h、12h、1d、2d、3d、4d、5d、7d、9d、11d、14d)取出全部释放液，并补充20mL相应释放液。向收集的释放液中加入二氯甲烷和甲醇(V/V＝1:1)混合溶液进行萃取，静置分层后小心吸取有机试剂层，重复三次，将含有IMQ的有机试剂溶液在通风橱中风干，用二氯甲烷和甲醇(V/V＝1:1)混合溶液溶解后，利用Lambda 35紫外-可见分光光度计在330nm波长处检测IMQ的吸光度，结合游离IMQ在释放液中的标准曲线计算聚合物囊泡中IMQ的释放量。
图1D为本发明实施例1中制备的聚合物囊泡AIRL在不同条件下IMQ的体外释放情况。结果表明酸性环境和还原性环境以及激光照射均可以加速聚合物囊泡AIRL中IMQ的释放。
实施例7
本发明实施例1制备的聚合物囊泡活性氧生成情况。
向实施例1方法制得的将聚合物囊泡AIRL混悬液、ARL、Free ICG、PBS(0.5mL，ICG浓度为10μg/mL，各样品均用PBS-乙醇(V/V＝4:6)混合溶液稀释至200μg/mL)加入将1,3二苯基异苯并呋喃(1,3-Diphenylisobenzofuran，DPBF)的乙醇溶液(2mg/mL，40μL)，避光条件下使用808nm近红外激光(1.5W/cm2)分别照射0、1、2、3、4、5min，利用Lambda 35紫外-可见分光光度计测定其在410nm处的吸光度值。
图1E为本发明制备的聚合物囊泡AIRL、ARL、Free ICG在不同条件下的体外光动力效果。结果表明ICG被AIRL包载后依然具有良好的光动力效果。
实施例8
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的体外光热研究。
向实施例1方法制得的将聚合物囊泡AIRL、AIR、IRL、AIL混悬液、Free ICG、PBS(500μL，10μg/mL ICG)加入1.5mL离心管中，在1.5W/cm2的808nm近红外激光下照射5min，同时用近红外热成像仪检测其温度随时间变化情况并记录各组在激光照射下最高温度时的近红外热成像图。
向实施例1方法制得的将聚合物囊泡AIRL混悬液、Free ICG(500μL，10μg/mL ICG)加入1.5mL离心管中，在1.5W/cm2的808nm激光下照射5min，再关闭激光5min，如此循环三次做升温-冷却循环曲线，同时用近红外热成像仪检测其温度随时间变化情况。
图2A、C为在激光照射下不同组样品的温度随时间变化曲线和最高温度时的热成像图。结果表明，药物处理组的最高温度均超过43℃，可以对肿瘤细胞产生杀伤作用。聚合物囊泡组的最高温度高于Free ICG组，具有良好的光热转换效率。由于激光照射下NH4HCO3的产气泡功能使ICG在囊泡内更易于释放，因此聚合物囊泡AIRL体外光热效果优于IRL。
图2B为有无激光照射下样品的升温-冷却循环曲线。结果表明三次升温-冷却后，AIRL的产生的热量仍高于游离ICG，表现出较好的光热性能，这说明聚合物囊泡AIRL的光稳定性强于游离ICG。
实施例9
本发明实施例1中制备得到的聚合物囊泡的CT26细胞摄取的考察。
将CT26细胞用完全培养基稀释成6×104个/mL的单细胞悬液，以每皿1mL的体积在激光共聚焦皿中培养，孵育过夜细胞贴壁后，吸去培养基，每皿分别加入1mL Free ICG+IMQ、AIR、AIRL的药物培养基混合液(ICG和IMQ最终浓度为10μg/mL)。同时设置激光组，同样加入上述药物。激光组在细胞培养2h后，用808nm近红外激光(1.5W/cm2)照射5min，之后再在培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)中孵育2h，非激光组直接孵育至4h。用PBS洗一次，4％组织固定液固定细胞10min，吸去4％组织固定液，用PBS洗两次，加入Hoechst，培养5min。吸去染色液，PBS洗两次，最后加入200μL PBS用CLSM观察细胞对AIRL的摄取。
将CT26细胞用完全培养基稀释成5×105个/mL的单细胞悬液，以每孔1mL的体积接种于12孔板中，孵育过夜细胞贴壁后，吸去培养基，分别加入1mL PBS、Free ICG+IMQ、AIR、AIRL的药物培养基混合液(ICG和IMQ最终浓度为10μg/mL)，孵育2h后用808nm近红外激光(1.5W/cm2)照射5min，再在培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)中孵育培养2h，非激光组直接孵育4h。收集细胞并离心(1500rpm/s，5min)后加300μL PBS重悬细胞过筛于流式管中，利用流式细胞仪定量检测细胞内ICG的摄取量。
图3A为CT26细胞的聚合物囊泡与游离药物摄取的激光共聚焦图。结果表明聚合物囊泡可以促进ICG进入细胞。照射激光产生热量可以增强细胞膜的通透性和流动性，增加肿瘤细胞内药物的积累，同时激光可以破环聚合物囊泡结构成小碎片，促进ICG释放，因此激光照射显著增加CT26细胞对ICG的摄取。LHRH修饰可以促进聚合物囊泡在CT26细胞的积累。图3B为流式细胞仪检测细胞摄取的流式结果图，与激光共聚焦检测结果一致。
实施例10
本发明实施例1制备的聚合物囊泡对CT26细胞的毒性考察。
将CT26细胞用完全培养基稀释成5×104个/mL的单细胞悬液，以每孔100μL的体积接种于96孔板。孵育过夜细胞贴壁后，吸去培养基，加入100μL PBS、Free ICG+IMQ、IRL、AIR、AIRL的药物培养基混合液(IMQ和ICG浓度为5、10、15、20μg/mL)，同时设置激光组，同样加入上述药物，并设置阴性对照组和空白对照组，非激光组每组设6个复孔，激光组每组设3个复孔。激光照射组在加药2h后使用808nm近红外激光(1.5W/cm2)照射5min，继续将96孔板放入培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)孵育至24h，非激光组直接将96孔板放入培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)孵育至24h。每孔中加入100μL混有MTS的RPMI-1640培养液，在培养箱中孵育一定时间后，于酶标仪上490nm处测吸光度值。
Figure BDA0003106703980000151
图4A、B为聚合物囊泡对CT26细胞的毒性检测结果图。结果表明，无论有无激光，AIRL对CT26细胞均无明显毒性,说明纳米制剂载体无细胞毒性。在无激光照射下，聚合物囊泡与游离药物一定浓度范围内(ICG浓度小于20μg/mL)对CT26细胞无毒性。在激光照射条件下,包载ICG的聚合物囊泡对CT26细胞的毒性呈现浓度依赖性。激光照射可以破坏聚合物囊泡结构，AIRL可以逸出CO2气泡，在一定程度上损伤肿瘤细胞，因此AIRL对CT26细胞产生的毒性作用最强。
实施例11
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的CT26细胞活性氧产生情况的考察。
将CT26细胞用完全培养基稀释成4×105个/mL的单细胞悬液，以每皿1mL的体积接种于激光共聚焦皿中，孵育过夜细胞贴壁后，吸去培养基，每皿分别加1mL PBS、Free ICG+IMQ、AIR、AIRL的药物培养基混合液(ICG和IMQ最终浓度为10μg/mL)，孵育4h。PBS轻柔的洗一次细胞,加入600μLcarboxy-H2DCFDA(6μg/mL)，于37℃下孵育细胞15min。PBS轻柔地洗一次细胞，其中激光组用808nm近红外激光(1.5W/cm2)照射5min。4％组织固定液在室温下固定细胞10min，PBS洗去固定液，洗两次，用600μL Hoechst(8μg/mL)染色5min。PBS洗一次细胞，最后加入200μL PBS于CLSM下观察细胞。
将CT26细胞用完全培养基稀释成5×105个/mL的单细胞悬液，以每孔1mL的体积接种于12孔板中，孵育过夜细胞贴壁后，吸去培养基，加入1mL PBS、Free ICG+IMQ、AIR、AIRL药物培养基混合液(ICG和IMQ最终浓度为10μg/mL)，孵育4h。PBS轻柔的洗一次细胞,加入600μL carboxy-H2DCFDA(6μg/mL)，于37℃下孵育细胞15min，PBS轻柔的洗一次细胞。激光组加入1mL PBS后用808nm近红外激光(1.5W/cm2)照射5min，PBS洗一次细胞。收集细胞并离心(1500rpm/s，5min)后加300μL PBS重悬细胞过筛于流式管中，利用流式细胞仪定量检测胞内活性氧的产生情况。
图5A是CT26细胞的活性氧检测的激光共聚焦图。结果显示ICG在无激光时无法产生光动力效应。近红外激光照射下，药物处理组CT26细胞内均出现荧光信号，表明在激光照射下光敏剂ICG可以在细胞内诱导产生ROS。且AIRL由于更多地被细胞摄取，因此具有更好的PDT效果。图5B为细胞的活性氧产生情况的流式结果图，与激光共聚焦检测结果一致。
实施例12
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的体内成像表征。
在雌性BALB/C小鼠皮下接种CT26细胞(1×106个/只)，待肿瘤体积达到200mm3时，将小鼠随机分成4组，各组分别尾静脉注射PBS、Free ICG+IMQ、AIR、AIRL。分别在给药后的6h、24h、48h、72h进行小鼠的近红外活体成像获取ICG的组织分布图(λex 704nm，λem735nm)。
图6A为通过小鼠活体成像检测聚合物囊泡在肿瘤部位不同时间的蓄积情况。给药后，给药组的荧光强度在24h达到最大值。Free ICG+IMQ组荧光信号始终低于聚合物囊泡组，说明聚合物囊泡载药体系可以有效降低ICG的肝脏清除率，具有良好的长循环特性。在72h内，聚合物囊泡AIRL组荧光信号始终强于AIR组，表明LHRH靶向作用可以增强聚合物囊泡在肿瘤部位的蓄积并延长滞留时间，实现肿瘤靶向治疗。这些结果表明，聚合物囊泡AIRL具有优秀载药性能，利用肿瘤高通透性和滞留效应实现药物在肿瘤部位的高蓄积，同时LHRH的修饰实现药物对肿瘤的靶向作用，从而高效发挥抗肿瘤作用。图6B为小鼠肿瘤部位ICG平均荧光强度柱状图，同样证明了上述结论。
实施例13
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的体内光热研究。
在雌性BALB/C小鼠皮下接种CT26细胞(1×106个/只)，待荷瘤小鼠近端肿瘤体积长到50-70mm3时，分别尾静脉注射PBS、Free ICG+IMQ、AIL、IRL、AIR、AIRL(6mg/kg ICG)，给药24h和48h后在肿瘤部位使用1.5W/cm2的808nm激光照射5min。使用近红外热成像仪观察小鼠肿瘤部位最高温度随时间的变化。
图7A显示了各组在给药24h和48h后肿瘤局部最高温度近红外热成像图。图7B、C为给药后24h和48h后光热升温曲线。结果显示给药后24h，游离组的温度虽略高于43℃，但其温度较低，不足以有效抑制肿瘤生长。聚合物囊泡组温度均超过48℃，可以导致肿瘤细胞不可逆转损伤，其可通过体内长循环和EPR效应将ICG富集在肿瘤局部发挥光热作用而有效抑制肿瘤生长。LHRH修饰的AIRL可靶向肿瘤组织，使肿瘤局部药物蓄积更多，因此聚合物囊泡AIRL的光热效果较优于IRL和AIR。给药后48h，聚合物囊泡组均超过43℃，仍可造成肿瘤细胞损伤。
实施例14
本发明实施例1制备的聚合物囊泡对DCs的毒性的评估。
收集培养至第6天BMDCs(1×106个/mL)离心(450g，5min)，重悬细胞后于12孔板中培养(每孔1mL)，2h后向12孔板加入PBS、Free ICG+IMQ、IRL、AIRL聚合物囊泡(ICG浓度为10μg/mL)与细胞共孵育24h，然后收集细胞并离心(450g，5min)，用PBS洗涤一次，用抗体FITC-anti-mouse-CD11c在4℃避光条件下染色30min。根据Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒说明书测定BMDCs的生存力，并用流式细胞仪检测。
图8A为聚合物囊泡与游离药物对DCs毒性检测的流式结果图，结果表明聚合物囊泡与游离药物均不会对BMDCs产生毒性作用。
实施例15
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的DCs摄取情况考察。
将DC 2.4细胞用完全培养基稀释成6×104个/mL的单细胞悬液，以每皿1mL的体积在激光共聚焦皿中培养，孵育过夜细胞贴壁后，吸去培养基，每皿分别加1mL的Free ICG+IMQ、IRL、AIRL的药物培养基混合液(ICG和IMQ最终浓度为10μg/mL)孵育4h。用PBS洗一次，加入配制好的并在37℃预温育的Lyso-Tracker Red染色工作液250μL，与细胞在37℃共孵育60min。吸去染色工作液，用1mL PBS洗涤细胞一次。用4％组织固定液在室温固定细胞10min，PBS洗去固定液。加入200μL Hoechst(8μg/mL)孵育5min，吸去染色液，PBS洗两次，最后加入200μL PBS在激光共聚焦下观察。
将DC 2.4细胞用完全培养基稀释成5×105/mL的单细胞悬液，以每孔1mL的体积接种于12孔板中，孵育过夜细胞贴壁后，吸去培养基，加入1mL Free ICG+IMQ、IRL、AIRL的药物培养基混合液(ICG和IMQ最终浓度为10μg/mL)，孵育4h后收集细胞并离心(450g，5min)，用1mL PBS洗涤一次后加300μLPBS重悬细胞过筛于流式管中，利用流式细胞分析仪测定DCs的纳米粒子吞噬效率。
图8B为DCs对聚合物囊泡与游离药物的摄取的激光共聚焦图。结果表明，游离药物与溶酶体共定位，无溶酶体逃逸现象。与IRL相比，AIRL组中的DCs细胞质中的绿色荧光信号更强，绿色荧光信号与红色溶酶体重叠部分更少，说明包载NH4HCO3的聚合物囊泡AIRL在DCs中发生溶酶体逃逸并促进了药物释放，增强DCs对聚合物囊泡的摄取。图8C为DCs对聚合物囊泡与游离药物的摄取的流式结果图，与激光共聚焦结果一致。
实施例16
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的体外Transwell实验。
将CT26细胞(1×105个/mL)与PBS、AIL、IRL、AIRL聚合物囊泡(ICG和IMQ最终浓度为10μg/mL)在上部隔室中共孵育2h，用1.5W/cm2的808nm近红外激光照射各组CT26细胞5min，且同时设置含药AIRL聚合物囊泡的无激光组。收集培养至第6天BMDCs(1×106个/mL)并离心(450g，5min)，重悬后于Transwell板下层中培养(每孔1mL)，将上部隔室的CT26细胞残余物和药物混合液与下层的BMDCs(1×106个/mL)共培养24h。然后收集下室上层半贴壁的BMDCs并离心(450g，5min)，保存上清液，细胞沉淀用PBS洗涤一次，用抗体Cy5.5-anti-mouse-CD11c、PE-anti-mouse-CD40、APC-anti-mouse-CD80、FITC-anti-mouse-CD86以及APC-anti-mouse-MHCⅠ、FITC-anti-mouse-MHCⅡ分别在4℃避光条件下染色30min，用PBS洗涤一次后加入300μL PBS重悬细胞过筛于流式管中。用流式细胞仪检测BMDCs表面共刺激分子CD40、CD80和CD86以及MHCⅠ和MHCⅡ的表达。根据说明书用小鼠ELISA检测试剂盒检测上清培养液中的细胞因子，包括TNF-α和INF-γ。
图9A-E为DCs表面分子的表达的流式图，结果表明与聚合物囊泡AIL共培养的CT26细胞在激光照射下得到的肿瘤细胞残余物可诱导轻微的BMDCs成熟。相比之下，与聚合物囊泡IRL、AIRL共同培养的CT26细胞在PTT处理后的细胞残余物作为TAA在TLR-7/8激动剂IMQ的作用下可以显著促进BMDCs的成熟，而且AIRL的效果要高于IRL。仅在免疫佐剂IMQ作用下，AIRL对DCs成熟促进作用很弱。图9F-G为细胞因子检测图，结果显示各组IFN-γ，TNF-α的分泌水平的趋势与流式检测细胞表面分子结果基本一致。
实施例17
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的抗肿瘤研究。
首先在BALB/C小鼠右后背部皮下接种CT26细胞(1×106个/只)建立近端瘤模型，给药前一天在其左后背部皮下接种CT26细胞(5×105个/只)建立远端瘤模型。当近端肿瘤体积达到50-70mm3将小鼠随机分9组(每组8只)：(1)PBS；(2)PBS+laser；(3)Free ICG+IMQ；(4)Free ICG+IMQ+laser；(5)AIL+laser；(6)IRL+laser；(7)AIR+laser；(8)AIRL；(9)AIRL+laser，在第0天和第5天各组分别尾静脉注射150μL各组药物(6mg/kg ICG)。在给药后24h和48h，激光组使用1.5W/cm2的808nm近红外激光照射小鼠近端肿瘤部位5min。自给药后每隔一天测量并记录小鼠的体重和两端肿瘤的体积，当肿瘤体积超过3000mm3时，处死小鼠，并绘制小鼠生存曲线。肿瘤体积计算公式如下：
肿瘤大小(mm3)＝(肿瘤长径)×(肿瘤短径)2/2
图10A、B分别为小鼠近端和远端肿瘤生长抑制曲线图。在激光作用下，各聚合物囊泡组在24天内小鼠的近端肿瘤全部消除。在激光照射下，AIL组对于远端肿瘤的生长没有明显的抑制作用，AIRL组在激光照射下可以通过光热-免疫联合治疗更好的延缓远端肿瘤的生长。
图10C为小鼠生存曲线表征图，结果显示了在40天内，激光照射下的AIRL组小鼠全部存活。
图10D为治疗期间小鼠体重变化表征图。结果表明，各组小鼠的体重没有明显减轻，聚合物囊泡具有良好的生物相容性。
实施例18
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的组织病理学研究。
在治疗24天时，处死并解剖小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾并用生理盐水清洗，置于4％组织固定液中固定过夜，将组织在含有无水乙醇的培养皿中用刀片切成合适大小后进行脱水、石蜡包埋、切片。按照苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，H&E)染色试剂盒说明书进行染色，最后使用显微镜进行拍照。
图11小鼠主要器官H&E染色图，结果表明各聚合物囊泡对正常组织器官无明显毒副作用，具有优良生物相容性。
实施例19
本发明实施例1制备的聚合物囊泡的体内抗肿瘤免疫机制的研究。
首先在BALB/C小鼠右后背部皮下接种CT26细胞(1×106个/mL)，在给药前一天在小鼠左后背部皮下接种CT26细胞(5×105个/mL)建立远端瘤模型。当原发肿瘤体积达到50-70mm3将小鼠随机分9组(每组16只)：(1)PBS；(2)PBS+laser；(3)Free ICG+IMQ；(4)FreeICG+IMQ+laser；(5)AIL+laser；(6)IRL+laser；(7)AIR+laser；(8)AIRL；(9)AIRL+laser，分别在第0天和第5天尾静脉注射150μL各组药物(6mg/kg ICG)。激光组分别在两次给药后的第24h和48h利用1.5W/cm2的808nm近红外激光照射小鼠近端肿瘤部位5min。并按照下述方案进行体内免疫机制研究。在给药后第15天脱颈处死小鼠后收集***收集***并染色，使用流式细胞仪分析BMDCs的成熟水平。同时，切除脾脏进行研磨，过滤，与红细胞裂解缓冲液裂解2min，并用10倍体积的PBS洗涤细胞两次。得到的细胞进一步分别用不同抗体染色：1)抗CD4，抗CD8，抗Ki67；2)抗CD3，抗CD4，抗CD8。
图12为不同处理后小鼠***DCs的表面分子的表达的流式结果图。在无激光照射下，Free和AIRL组仅在免疫佐剂的作用下几乎不会刺激DCs成熟。AIL+laser组仅微弱刺激***DCs表面分子的表达，与体外Transwell结果一致。由于LHRH对肿瘤的靶向作用以及NH4HCO3对药物的促进释放作用，与其他激光组相比，AIRL+laser组显著促进***DCs成熟，从而高表达共刺激分子(CD80，CD86)和粘附因子(CD40)，并且将抗原呈递给T淋巴细胞进而激活后续免疫反应。
图13为治疗后的第15天的各组小鼠脾细胞中T细胞的增殖情况的代表性流式图和柱状分析图。IRL+laser组和AIR+laser组及AIRL+laser组CD4+和CD8+T细胞增殖水平较高，并且具有靶向和气泡生成的聚合物囊泡AIRL+laser组CD4+和CD8+T细胞增殖水平更高。其他激光组也有不同程度的CD4+和CD8+T细胞增殖，但增殖水平较低，无激光照射下Free组和AIRL组仅仅在免疫佐剂的作用下CD4+和CD8+T细胞增殖情况不明显。
图14为治疗后的第15天的各组小鼠脾细胞中CD4+T(CD3+CD4+)和CD8+T(CD3+CD8+)细胞活化水平的代表性流式图和柱状分析图。IRL+laser组、AIR+laser组和AIRL+laser组均可以刺激CD4+和CD8+T细胞增殖，且相比于其他激光组，具有靶向作用和气泡生成作用的聚合物囊泡AIRL+laser组的刺激CD4+和CD8+T细胞增殖能力更好。这些结果表明在激光照射下具有靶向作用和气泡生成作用的聚合物囊泡AIRL可以显著诱导CD4+和CD8+T细胞增殖，从而有效促进细胞免疫应答。
实施例20
本发明实施例1制备的聚合物囊泡、游离药物与PBS的记忆性T细胞的检测和抗肺转移评价。
在给药后第21天通过尾静脉注射CT26细胞(1×105个/mL)，给药后第22天脱颈处死小鼠浸泡于75％酒精2min，收集脾细胞以分析记忆性T细胞。将脾细胞悬液离心(450g，5min)，弃去上清后用流式抗体FITC-anti-mouse-CD8、PE-anti-mouse-CD4、Cy5.5-anti-mouse-CD62L、APC-anti-mouse-CD44进行标记，在4℃下避光孵育30min，加入1mL PBS洗一次，最终加入300μL PBS重悬细胞过筛于流式管中，利用流式细胞仪进行测定。
在给药后第21天通过尾静脉注射CT26细胞(1×105个/mL)，给药后第35天脱颈处死小鼠后解剖取肺，用生理盐水冲洗肺组织后固定于Bouin’s溶液中，过夜后取出并进行拍照记录肿瘤结节，随后将组织在含有无水乙醇的培养皿中用刀片切成合适大小后进行脱水、石蜡包埋、切片。按照H&E染色试剂盒说明书进行染色。最后使用显微镜进行拍照。
图15为各组小鼠脾细胞中免疫记忆性CD4+和CD8+T细胞水平的代表性流式图和柱状分析图。流式结果显示AIRL+laser组脾脏中CD4+和CD8+T细胞均表达较高比例的TCM和TEM，说明AIRL+laser组诱导最有效的记忆性CD4+T和CD8+T细胞免疫应答，最强的抗肿瘤记忆免疫效果。
图16为各组小鼠肺组织的照片图和H&E染色图。全肺图和H&E染色图显示除产生有效免疫记忆效应的IRL+laser组，AIR+laser组，AIRL+laser组，其他组均发现肺转移结节。因此，以上结果表面基于聚合物囊泡AIRL的光热联合免疫的治疗可以有效抑制肿瘤的肺转移，预防肿瘤的转移和复发。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (10)

1.一种pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将PCL-b-PEG-b-PCL、疏水性ICG、DSPE-PEG-Mal和免疫佐剂溶于有机溶剂，然后，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜干燥后进行水化，再加入NH4HCO3并混匀，然后，超声处理并透析，得到聚合物囊泡溶液；
(c)将聚合物囊泡溶液和LHRH进行混合并在三乙胺的催化作用下进行反应，再经透析，得到所述pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述免疫佐剂包括TLR-7/8激动剂，所述TLR-7/8激动剂为IMQ。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，其中PCL疏水链段质量百分数大于33％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水化采用的溶剂为去离子水或PBS溶液；水化温度为60～70℃，时间为5～6h；
所述溶剂的添加体积与PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为(3～10)mL∶20mg。
5.根据权利要求1～4任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，
PCL-b-PEG-b-PCL和疏水性ICG的质量比为(15～25)∶1；
PCL-b-PEG-b-PCL和免疫佐剂的质量比为(15～25)∶1；
PCL-b-PEG-b-PCL和DSPE-PEG-Mal的质量比为(40～60)∶1。
6.根据权利要求1～4任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，
NH4HCO3的添加终浓度为280～320mM；
超声处理为在冰浴条件下超声处理25～35min；
透析采用的透析袋的截留分子量为8000-14000Da；透析时间为3～12h。
7.根据权利要求1～4任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，
PCL-b-PEG-b-PCL和LHRH的质量比为(60～100)∶1；
反应为在搅拌、室温条件下反应10～12h；
透析采用的透析袋的截留分子量为8000-14000Da；透析时间为4～8h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述疏水性ICG通过如下方法制得：
将亲水性ICG和碘化四丁胺溶于有机溶剂于避光室温条件下搅拌反应，得到疏水性光敏剂ICG，其中，所述碘化四丁胺和亲水性ICG质量比为(5～6)：1。
9.权利要求1～8任一所述的制备方法制得的pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡。
10.权利要求9所述的pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡在制备抗肿瘤光热-免疫联合疗法药物中的应用。
CN202110639519.4A 2021-06-08 2021-06-08 pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用 Active CN113332452B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110639519.4A CN113332452B (zh) 2021-06-08 2021-06-08 pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110639519.4A CN113332452B (zh) 2021-06-08 2021-06-08 pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113332452A true CN113332452A (zh) 2021-09-03
CN113332452B CN113332452B (zh) 2022-12-06

Family

ID=77475415

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110639519.4A Active CN113332452B (zh) 2021-06-08 2021-06-08 pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113332452B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114712525A (zh) * 2022-04-20 2022-07-08 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种具有抗原双捕获功能的聚合物囊泡及其制备方法和应用
CN114748414A (zh) * 2022-04-20 2022-07-15 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种共负载化疗药和纳米粒的海藻酸钠水凝胶复合体系及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108354901A (zh) * 2018-05-21 2018-08-03 中国医学科学院生物医学工程研究所 用于肿瘤化疗与光热联合治疗的pH/还原双重敏感多功能纳米胶束及其应用
CN108478531A (zh) * 2018-05-21 2018-09-04 中国医学科学院生物医学工程研究所 叶酸靶向还原敏感载药聚合物纳米胶束及其制备方法和应用
CN108653733A (zh) * 2018-05-21 2018-10-16 中国医学科学院生物医学工程研究所 具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡与制备
CN108938568A (zh) * 2018-08-07 2018-12-07 中国医学科学院生物医学工程研究所 基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗及其制备方法与应用
CN108969771A (zh) * 2018-08-07 2018-12-11 中国医学科学院生物医学工程研究所 甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用
WO2019128608A1 (zh) * 2017-12-26 2019-07-04 厦门本素药业有限公司 一种空白混合胶束及其制备方法和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019128608A1 (zh) * 2017-12-26 2019-07-04 厦门本素药业有限公司 一种空白混合胶束及其制备方法和应用
CN108354901A (zh) * 2018-05-21 2018-08-03 中国医学科学院生物医学工程研究所 用于肿瘤化疗与光热联合治疗的pH/还原双重敏感多功能纳米胶束及其应用
CN108478531A (zh) * 2018-05-21 2018-09-04 中国医学科学院生物医学工程研究所 叶酸靶向还原敏感载药聚合物纳米胶束及其制备方法和应用
CN108653733A (zh) * 2018-05-21 2018-10-16 中国医学科学院生物医学工程研究所 具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡与制备
CN108938568A (zh) * 2018-08-07 2018-12-07 中国医学科学院生物医学工程研究所 基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗及其制备方法与应用
CN108969771A (zh) * 2018-08-07 2018-12-11 中国医学科学院生物医学工程研究所 甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIAN CHEN 等: "Photothermal therapy with immune-adjuvant nanoparticles together with checkpoint blockade for effective cancer immunotherapy", 《NATURE COMMUNICATIONS》, vol. 7, 21 August 2016 (2016-08-21) *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114712525A (zh) * 2022-04-20 2022-07-08 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种具有抗原双捕获功能的聚合物囊泡及其制备方法和应用
CN114748414A (zh) * 2022-04-20 2022-07-15 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种共负载化疗药和纳米粒的海藻酸钠水凝胶复合体系及其制备方法和应用
CN114748414B (zh) * 2022-04-20 2024-05-31 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种共负载化疗药和纳米粒的海藻酸钠水凝胶复合体系及其制备方法和应用
CN114712525B (zh) * 2022-04-20 2024-05-31 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种具有抗原双捕获功能的聚合物囊泡及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113332452B (zh) 2022-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Rational design of a minimalist nanoplatform to maximize immunotherapeutic efficacy: Four birds with one stone
Zhu et al. Albumin-biomineralized nanoparticles to synergize phototherapy and immunotherapy against melanoma
CN107158405B (zh) 一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物及其制备方法和应用
Liu et al. Photothermal-triggered immunogenic nanotherapeutics for optimizing osteosarcoma therapy by synergizing innate and adaptive immunity
Wan et al. Combination of PEG-decorated black phosphorus nanosheets and immunoadjuvant for photoimmunotherapy of melanoma
CN113332452B (zh) pH/还原/温度三重刺激响应的共载免疫佐剂和吲哚箐绿聚合物囊泡及其制备方法和应用
CN113368047B (zh) 一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束及其制备方法和应用
CN111344015B (zh) 一种用于癌症治疗的光纳米疫苗及其制备方法和应用
Li et al. Tri-component programmable nanoregulator with Three-pronged penetration boosts immunotherapy of Triple-Negative breast cancer
CN104623646A (zh) 一种双功能配体靶向树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法
CN113679670A (zh) 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用
CN106166141A (zh) 一种用于肿瘤成像与治疗的多功能复合纳米药物及其制备方法
Liu et al. Lipid-hybrid cell-derived biomimetic functional materials: A state-of-the-art multifunctional weapon against tumors
CN113197860A (zh) 聚合物囊泡纳米sting激动剂及其制备方法与应用
CN114225029B (zh) 一种声敏响应的纳米颗粒及其应用
CN114470231B (zh) 一种叶酸-羟烷基淀粉大分子稳定共载光敏剂和小分子前药的纳米载药***、其制备和应用
CN113425842B (zh) 一种细菌和植物来源的融合囊泡、制备方法及其应用
CN109481418A (zh) 抗肿瘤纳米颗粒及其制备方法和应用
CN110279856B (zh) 一种PEG-Peptide光动力-化疗联用给药***及其制备方法和用途
CN114712525B (zh) 一种具有抗原双捕获功能的聚合物囊泡及其制备方法和应用
CN114748414B (zh) 一种共负载化疗药和纳米粒的海藻酸钠水凝胶复合体系及其制备方法和应用
CN115252580B (zh) 一种载药红细胞膜纳米粒及其制备方法和应用
Gowsalya et al. Immune-theranostic gold nanorod-based NIR-responsive nanomedicine for the delivery of TLR7/8 adjuvant-induced effective anticancer therapy
CN117024568A (zh) 一种atp响应型疫苗功能化框架核酸及其应用
CN117752790A (zh) 一种基于新型光动力材料的原位可注射水凝胶抗肿瘤递药***及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant